CN105441394A - 一种禽流感病毒稀释液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种禽流感病毒稀释液及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。该稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮氨酸和抗坏血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得到。本发明所制备的稀释液，接种低日龄鸡胚，收获的尿囊液体积大幅增加，与现有技术相比，所获得的尿囊液体积提高了30～40%。

Description

一种禽流感病毒稀释液及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒稀释液及其制备方法。

背景技术

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒。AIV感染禽类后可引起一种以呼吸系统乃至全身性败血症为特征的传染性疾病,即禽流感(Avianinfluenza，AI)。AI不仅可以在家禽中传播，严重影响畜牧养殖业的生存和发展；而且还可以由家禽传给人类，直接威胁人类的健康，对人类造成极大危害。在20世纪，人类历史上共暴发了4次世界性流感大流行，其中以1918年暴发的“西班牙流感”对人类社会的危害最大。据不完全统计，那次世界性流感大流行至少夺去了2000多万人的生命，被感染者多达2亿。禽流感之所以能多次大流行与禽流感病毒表面抗原成份频发的变异有很大关系，抗原的变异使得禽流感病毒可以逃逸机体的免疫防御，而且使许多应用中的疫苗失去防御效果。随着分子生物学的发展，人们对禽流感病毒分子结构、免疫原性及抗原变异的分子基础都有了较深入的认识，并且随着对禽流感病毒分子生物学特性的了解及深入，相应的开发出了一些更加安全有效的疫苗，由于禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异频繁，使得机体不能有效防御病毒的侵袭，同时这也为疫苗的研究开发提出了严峻的考验。目前虽然已有多种疫苗应用于禽流感的防治，但他们的防御效果距离人们的期望水平还有差距，所以人们还在不断研发更加行之有效的产品。但无论那种疫苗都有其自身的优缺点。

目前商品化抗禽流感疫苗大都为灭活疫苗，该种疫苗具有制备工艺简单、免疫效果确实、免疫持续时间较长等特点，已被许多国家地区使用，并且在预防和控制禽流感暴发中起到一定的积极作用。

到目前为止我国对家禽疫病的预防措施仍然是以疫苗接种为主，辅以其它方法但是所用的疫苗以常规疫苗占主导，包括灭活苗和弱毒或无毒活苗，而且多为单苗，在规定的免疫程序中需进行多次免疫接种，这不仅浪费人力物力，而且易引起家禽的应激反应，造成生产力的下降和抗病力降低。

目前病毒的培养有动物接种、组织培养和鸡胚培养3种方法。其中鸡胚培养是病毒培养中最常用的方法之一。鸡胚是正在发育中的机体，多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代。鸡胚的优点在于胚胎的组织分化程度低，而且可以选择不同的日龄和接种途径，病毒在鸡胚中易于增殖，部分病毒感染鸡胚以后可以产生豆瓣，引起充血、出血、坏死灶和死亡等特异性的感染指征。感染病毒的鸡胚组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。

当前国内生产的禽流感疫苗基本都是采用鸡胚接种病毒后进行增殖，收获尿囊液制备而成。研究表明，鸡胚日龄和种毒接种量与收获时的鸡胚尿囊液量呈负相关。即随着接种鸡胚日龄的增加和种毒接种量的提高，收获的鸡胚尿囊液会减少。通常选用10日龄鸡胚进行新城疫病毒接种培养繁殖，一般在培养96～120小时收获鸡胚液，即14～15日龄，此时日龄偏大，尿囊液含量不高（鸡胚发育的13～14日龄尿囊液含量最高）；若提高尿囊液含量必须提前收获，但此时病毒含量并未达到峰值，造成毒价降低同样得不偿失。另外日龄越低鸡胚的组织分化程度越低，越有利于病毒的增殖，但按通常手段采用低日龄（如9日龄）鸡胚进行病毒的接种培养，因鸡胚抵抗力差，过早死亡等导致鸡胚尿囊液中病毒毒价较低，尿囊液含量也较低。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种禽流感病毒稀释液及其制备方法。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮氨酸和抗坏血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得到。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于该稀释液的pH为6.5～7.5。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中得到。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合6～8g、复方中药黄酮10～15g和脂质体14～16g。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的氨基酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～60%和抗坏血酸10～30%。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的复方中药黄酮按以下步骤制得：

a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到复方中药黄酮。

所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的步骤a中按黄连25～35份、苦参10～15份、椿白皮15～25份、白薇10～15份、龙胆草15～25份和夏枯草15～25份称取各中药原料。

所述的一种禽流感病毒稀释液制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）磷酸缓冲溶液的配制：按氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用；

2）复方中药黄酮的制备

a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮；

3）脂质体的制备

按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体；

4）接种鸡胚用病毒稀释液配制

按氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g称取各原料，溶解于步骤1）制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.5～7.5之间，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用，所述的氨基酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～60%和抗坏血酸10～30%。

本发明有益效果是：

（1）本发明所制备的稀释液，在接种鸡胚时能够同时提供给鸡胚必需的营养，可解决鸡胚低日龄培养难题。

（2）本发明所制备的稀释液，可接种低日龄鸡胚，因低日龄鸡胚组织分化程度较低，与现有技术相比，病毒更易在鸡胚组织中增殖。

（3）本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时间，即延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度8倍以上。

（4）本发明所制备的稀释液，接种低日龄鸡胚，收获的尿囊液体积大幅增加，与现有技术相比，所获得的尿囊液体积提高了30～40%。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有：氨基酸组合6g（甘氨酸0.6g、烟酰胺1.8g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸1.2g）、复方中药黄酮15g、脂质体15g，该稀释液pH为6.9。

一种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤是：

（1）磷酸缓冲溶液的配制：按上述磷酸盐缓冲液配方准确称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用。

（2）复方中药黄酮的制备

a、按黄连30份、苦参20份、椿白皮10份、白薇20份、龙胆草10份和夏枯草20份称取所述中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次。

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清。

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

（3）脂质体制备

按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液（每L缓冲溶液中含有0.1m的枸橼酸和0.1m的枸橼酸钾），将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。

（4）病毒稀释液配制：按上述优选稀释液组分数准确称取甘氨酸0.6g、烟酰胺1.8g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸1.2g、复方中药黄酮15g、脂质体15g，按比例溶解于步骤（1）中的1000ml磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.9，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用。

实施例2

一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有:氨基酸组合8g（甘氨酸1.6g、烟酰胺1.6g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸2.4g）、复方中药黄酮18g（从黄连20份、苦参15份、椿白皮10份、白薇25份、龙胆草15份和夏枯草15份中提取得到）、脂质体20g（按实施例1制得），该稀释液pH为7.2。

一种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。

实施例3

一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有:氨基酸组合10g（甘氨酸2.5g、烟酰胺3.0g、亮氨酸3.0g、抗坏血酸1.5g）、复方中药黄酮5g（从黄连35份、苦参5份、椿白皮15份、白薇10份、龙胆草20份和夏枯草15份中提取得到）、脂质体10g（按实施例1制得），该稀释液pH为7.5。

一种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。

实施例4：一种禽流感病毒稀释液的使用方法

1）接种鸡胚用病毒稀释液及其配制，方法同实施例1。

2）禽流感病毒的鸡胚接种与培养繁殖

（1）接种鸡胚的选择

选择发育良好的9日龄SPF鸡胚，1000枚。

（2）接种

取生产用毒种，用实施例1中病毒稀释液将禽流感病毒稀释500～5000倍，在4℃孵育30分钟后，每胚尿囊腔内接种0.1ml。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

（3）孵育和观察

鸡胚接种后，每日照蛋一次，将在48小时前死亡的鸡胚弃去。48小时后，每4～8小时照蛋一次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。

（4）收获

将冷却4～24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（勿使卵黄破裂），吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组。收获后的胚液置于灭菌容器中，加入适宜的抗生素，在2～8℃冰库处理。留样后，结冻保存。在收获胚液的同时，逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。

（5）病毒悬液检验

无菌检验：经处理过的胚液，每组分别取样，按《无菌检验或纯粹检验操作规程》进行无菌检验，应无细菌生长。

病毒含量测定：按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作10倍系列稀释至10^-9，取3个适宜稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育6日。48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:160（微量法1:128）者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应不低于10⁷EID₅₀。

比较例1：采用上述稀释液稀释病毒接种鸡胚与常用稀释液稀释病毒接种鸡胚各项指标的比较。

1）取实施例1得到的禽流感病毒稀释液。

2）常用病毒稀释液及其配制，即生理盐水，按常规技术进行配制。

3）鸡胚接种与培养繁殖

（1）接种鸡胚的选择：选择发育良好的9日龄SPF鸡胚，2000枚；

（2）接种：将本例（1）中的2000枚9日龄SPF鸡胚分为2组，第一组采用本发明病毒稀释液进行操作接种，第二组采用常规技术配制的病毒稀释液进行病毒稀释和接种，两组稀释倍数相同。

（3）孵育和观察、收获、病毒悬液检验同实施例4。

4）两组方法接种鸡胚后死亡集中时间与数量，见表1。

第一组：为本发明组，采用9日龄鸡胚接种。

第二组：为常规技术稀释液组，采用9日龄鸡胚接种。

5）两组方法接种鸡胚后病毒收获量及其病毒含量，见表2。

综上所述，与传统技术相比，采用本发明方法可提高病毒含量8倍以上，同时还提高了鸡胚液收获量30%～40%。

实施例2和3中得到的稀释液进行比较例1、比较例2相同的试验，其最终结果也能够达到与比较例1相同的技术效果，可提高病毒含量8倍以上，同时还提高了鸡胚液收获量30%～40%。

Claims (9)

1.一种禽流感病毒稀释液，其特征在于每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮氨酸和抗坏血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得到。

2.如权利要求1所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于该稀释液的pH为6.5～7.5。

3.如权利要求1所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中得到。

4.如权利要求1所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：氨基酸组合6～8g、复方中药黄酮10～15g和脂质体14～16g。

5.如权利要求1所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的氨基酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～60%和抗坏血酸10～30%。

6.如权利要求1所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。

7.如权利要求1所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的复方中药黄酮按以下步骤制得：

a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到复方中药黄酮。

8.如权利要求7所述的一种禽流感病毒稀释液，其特征在于所述的步骤a中按黄连25～35份、苦参10～15份、椿白皮15～25份、白薇10～15份、龙胆草15～25份和夏枯草15～25份称取各中药原料。

9.一种禽流感病毒稀释液制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）磷酸缓冲溶液的配制：按氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌备用；

2）复方中药黄酮的制备

a、按黄连20～40份、苦参5～20份、椿白皮10～30份、白薇5～20份、龙胆草10～30份和夏枯草10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮；

3）脂质体的制备

按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；配制pH值为7.0～8.0、浓度为0.1m/l的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体；

4）接种鸡胚用病毒稀释液配制

按氨基酸组合5～10g、复方中药黄酮5～20g和脂质体10～20g称取各原料，溶解于步骤1）制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至6.5～7.5之间，无菌条件下通过0.22μm滤膜，过滤除菌后置4℃保存备用，所述的氨基酸组合含有以下重量百分比含量的氨基酸：甘氨酸10～40%、烟酰胺20～40%、亮氨酸30～60%和抗坏血酸10～30%。