CN102533679A - 一种病毒释放缓冲液的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种病毒释放缓冲液及用所述病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度的方法，分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；将病毒胚液中速离心，分离沉淀一和上清液一；向所得沉淀中加入所述病毒释放缓冲液，混合均匀后，在2-8℃以1000-5000r/min的搅拌速率，搅拌10-30min，然后再次中速离心，分离沉淀二和上清液二；所得上清液二和所得上清液一混合后横向切流浓缩；或将所得上清液二和所得上清液一分别横向切流浓缩后混合；横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为10-500KDa，胚液浓缩倍数为浓缩2-10倍；得到病毒胚液的浓缩液。该方法能够提高胚液禽类病毒的检测病毒滴度，处理病毒后能够提高病毒颗粒的稳定性，对病毒抗原没什么影响，且可大量处理胚液病毒，处理速度快。
Description
技术领域
本发明属于兽用疫苗领域，具体地，涉及一种病毒释放缓冲液及用该病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度和制备多联苗的方法。
背景技术
禽类疫苗主要通过鸡胚繁殖病毒而生产。该种疫苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续时间较长等特点，已被许多国家地区在家禽中使用，并在预防和控制禽流感暴发中起到一定积极作用。但灭活疫苗存在免疫效率低下，免疫剂量较大，监测中难于区分疫病的疫苗免疫与野度感染，并且还存在散毒的危险等缺点。另外，采用传统的灭活疫苗对禽流感进行预防，往往由于新的禽流感变异株的出现而导致免疫失败。尽管如此，用疫苗预防仍是禽病防治的主要措施和关键环节，在许多国家禽病防治中都起到了极其重要的作用。在规模化生产禽流感油乳剂灭活苗中，通过对原辅材料、生产过程关键技术地控制和工艺改进等措施，生产出高效、稳定的产品。生产过程的关键技术直接关系到产品的质量，是生产高效优质产品的保障。
目前，有许多研究致力于从胚液中纯化病毒或者生产相应产品。有人通过乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒提高病毒产量。提取病毒的目的在于，病毒颗粒与细胞碎片或者块状物质分离开。有人通过离子交换层析分离病毒；也有人通过，通过中等速度离心去除胚液中的大块物质，然后通过CaHPO4凝胶吸附澄清胚液中的病毒颗粒，达到纯化病毒的目的。也有通过低速离心去除胚液中的大块物质，然后通过高速离心回收病毒并且溶于磷酸盐缓冲液中保存。也有人发现如果在感染病毒的细胞或者胚液中加入高浓度的盐溶液，最终能够提高病毒的产量和纯度。有人研究发现，流感病毒液中加入0.3MNaCl降低纯化后的流感病毒聚集。虽然有不少人对采用了不同方法对禽流感病毒进行了分离纯化，但是这些方法明显存在以下缺点：处理量小，例如高速离心；价格贵例如采用离子交换层析；对病毒抗原纯在影响，例如使用乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒。这些因素均不利于产业化。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术不足之处，提供一种病毒释放缓冲液及用该病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度和制备多联苗的方法，该方法能够提高胚液禽类病毒的检测病毒滴度，处理病毒后能够提高病毒颗粒的稳定性，对病毒抗原没什么影响，且可大量处理胚液病毒，处理速度快。
本发明是通过下述技术方案实现的：一种病毒释放缓冲液，所含组分及各组分的质量含量如下：
氯化钠(NaCl)：7-25g；
氯化钾(KCl)：0.00-5.0g；
氯化镁(MgCl2)：0.5-2.5g；
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：0.1-3.0g；
乙二胺四乙酸(EDTA)：0.15-1.5g；
甘氨酸：1-6.0g；
谷氨酰胺：1-5.0g；
组氨酸：0.5-2.0g；
丝氨酸：1-10g；
赖氨酸：1-10g；
精氨酸：5-8g；
吐温-80：0.5-2.0g；
曲拉通X-100：0.1-20g；
甘油：2-18g；
按配方称量以上试剂，全部溶解于蒸馏水中，调整pH为7.0-7.5，最终溶液体积定容为1L，即得所述病毒释放缓冲液。
用所述病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度的方法，包括如下具体步骤：
步骤A：分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；
步骤B：将病毒胚液中速离心，即以6000-9000r/min的速率离心15-60min，分离沉淀一和上清液一；
步骤C：按沉淀质量：病毒释放缓冲液质量1∶10-100向所得沉淀中加入所述病毒释放缓冲液，混合均匀后，在2-8℃以1000-5000r/min的搅拌速率，搅拌10-30min，然后再次中速离心，分离沉淀二和上清液二，沉淀一中80％以上的病毒已经进入上清液二；
步骤D：所得上清液二和所得上清液一混合后横向切流浓缩；或将所得上清液二和所得上清液一分别横向切流浓缩后混合；横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为10-500KDa，胚液浓缩倍数为浓缩2-10倍；得到病毒胚液的浓缩液。
考虑到过滤速度和病毒损失率，较佳地，采用为30-150KDa孔径的滤膜，更佳地，采用为50-100KDa孔径的滤膜最好。
用所述病毒释放缓冲液制备多联苗的方法，包括如下具体步骤：
步骤A：分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；
步骤B：将病毒胚液中速离心，即以6000-9000r/min的速率离心15-60min，分离沉淀一和上清液一；
步骤C：按沉淀质量：病毒释放缓冲液质量1∶10-100向所得沉淀中加入所述病毒释放缓冲液，混合均匀后，在2-8℃以1000-5000r/min的搅拌速率，搅拌10-30min，然后再次中速离心，分离沉淀二和上清液二，沉淀一中80％以上的病毒已经进入上清液二；
步骤D：所得上清液二和所得上清液一混合后横向切流浓缩；或将所得上清液二和所得上清液一分别横向切流浓缩后混合；横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为10-500KDa，胚液浓缩倍数为浓缩2-10倍；得到病毒胚液的浓缩液。
步骤E：将按步骤A、B、C和D制备的多个不同病毒胚液的浓缩液混合，即得多联苗。
本发明提供了一种病毒释放缓冲液病毒释放缓冲液及用该病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度和制备多联苗的方法。通过中速离心的方式使胚液澄清，然后通过病毒释放缓冲液把胚液病毒与细胞碎片等大块物质分离，离心回收释放的病毒，并与首次离心获得澄清胚液混合在一起；然后进行浓缩。也可以把首次获得的澄清胚液，先进浓缩，最后和病毒释放缓冲液释放沉淀获得的病毒液混合，就可以用于生产联苗了。制备方法简单，能够提高胚液禽类病毒的检测病毒滴度，处理病毒后能够提高病毒颗粒的稳定性，对病毒抗原没什么影响，且可大量处理胚液病毒，处理速度快。
具体实施方式
本发明实施例所用试剂及方法说明如下：
所述病毒释放缓冲液，所含组分及各组分的质量含量如下：
氯化钠(NaCl)：15.0g；
氯化钾(KCl)：5.0g；
氯化镁(MgCl2)：2.5g；
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：2.0g；
乙二胺四乙酸(EDTA)：1.0g；
甘氨酸：5.0g；
谷氨酰胺：4.0g；
组氨酸：1.5g；
丝氨酸：10g；
赖氨酸：8g；
精氨酸：5g；
吐温-80：2.0g；
曲拉通X-100：10.0g；
甘油：15.0g；
共计：86g
按配方称量以上试剂，全部溶解于蒸馏水中，调整pH为7.0-7.5，最终溶液体积定容为1L，即得所述病毒释放缓冲液。
6.1 胚液离心后很多病毒都存在于沉淀中。
实验一：验证胚液中病毒颗粒多数与细胞碎片等发块物质相互结合在一起的实验
材料：H5，禽流感病毒，H5毒株为H5(Re-4)株；H9，是禽流感病毒，H9毒株为H9(SS)株；ND是鸡新城疫病毒，上述毒株均为国家禽类疫苗生产用毒株。
分别取2毫升的H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液各两份，离心前检测各样品病毒HA价，并记录入表1。然后将其中一份H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液以8000rpm/min的速率离心20分钟，另一份以8000rpm/min的速率离心30分钟，离心后分离上上清液和沉淀，沉淀用2毫升的PBS溶解；分别检测各样品的离心后上清液中病毒HA价和离心后沉淀用2毫升的PBS溶解后病毒的HA价，并记录入表1
表1 H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液离心前，离心后上清液和离心后沉淀HA价检测结果
注：不同胚液，胚液浑浊度不同，离心后的结果不同；但相同的是50％以上的病毒被随着细胞碎片等大块物质一起离心下来。这就通过常规方法不论是离心还是微孔过滤去除细胞碎片等大块物质后在浓缩病毒的过程中病毒的损失量很大。这也是以前胚液浓缩倍数与胚液病毒HA价提高的倍数不一致的根本原因。
分析表1中数据可知：离心后，50％以上的病毒被随着细胞碎片等大块物质沉淀，从而表明胚液中病毒颗粒多数与细胞碎片等发块物质相互结合在一起。
6.2沉淀加入病毒释放缓冲液后能够把沉淀中的病毒绝大多数释放到溶液中。
试验二：病毒释放液处理胚液沉淀后对病毒释放的研究
分别取2毫升的H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液各两份，离心前检测各样品病毒HA价，并记录入表1。将各样品以8000rpm/min的速率离心20分钟，离心后分离上清液一和沉淀一。
其中一份沉淀一用2毫升的PBS溶解，并检测各样品病毒HA价，结果记录入表2；而后将各样品8000rpm离心15分钟，分离上清液和沉淀，记为上清液二和沉淀二；检测各样品上清液二中的病毒HA价，结果记录入表2；沉淀二用2毫升的PBS溶解，而后将各样品8000rpm离心15分钟，分离上清液和沉淀，记为上清液三和沉淀三；检测各样品上清液三中的病毒HA价，结果记录入表2。
另一份沉淀一加入2ml病毒释放缓冲液，沉淀质量：病毒释放缓冲液质量为1∶10-100，在2-8℃搅拌10-30分钟，搅拌速度为5000转/分，(用1ml的枪反复吹打20次左右，在室温静置5分钟左右，期间轻轻摇晃离心管)，然后8000rpm离心15分钟，并检测各样品病毒HA价，结果记录入表2；而后将各样品8000rpm离心15分钟，分离上清液和沉淀，记为上清液四和沉淀四；检测各样品上清液二中的病毒HA价，结果记录入表2；沉淀四用2ml病毒释放缓冲液溶解，沉淀质量：病毒释放缓冲液质量为1∶10-100，在2-8℃搅拌30分钟，搅拌速度为5000转/分，而后将各样品8000rpm离心15分钟，分离上清液和沉淀，记为上清液五和沉淀五；检测各样品上清液三中的病毒HA价，结果记录入表2。
表2 病毒释放液处理胚液沉淀后对病毒释放的研究
分析表2可知：病毒释放缓冲液能够有效的使胚液中与细胞碎片等大块物质结合的病毒释放出来，并且稳定存在于释放缓冲液中而不被离心下来，而PBS不具备释放病毒的功能。
6.3 病毒释放缓冲液对病毒抗原造成的影响
实验三：不同病毒释放缓冲液对胚液病毒的稳定性影响
取两份2毫升的H5病毒胚液，分别直接加入2毫升的病毒释放缓冲液或PBS，然后至于37℃培养箱中，每隔24小时，取样测定病毒HA价，结果记录入表3：
表3 病毒释放缓冲液和PBS对H5病毒胚液的稳定性影响
分析表3可知：病毒释放缓冲液不影响病胚液病毒的稳定性。病毒释放缓冲液不影响病毒抗原造成。
6.4 该方法制得的三联苗及其免疫效果
实验四：三联苗的制备和免疫实验
将实验二方法制备得到的H5病毒胚液上清液二，H9病毒胚液上清液二和ND病毒胚液上清液二分别横向切流浓缩得到三种病毒胚液的浓缩液，滤膜的孔径为30KDa，浓缩倍数为浓缩4倍，使浓缩液中病毒HA达到10.5点，然后将三种病毒胚液的浓缩液混合，即得三联苗，多联苗中，H5病毒，H9病毒、ND病毒的HA分别不低于10个点。
取50-60天的鸡60只，分三组，每组20只鸡，三组分别免疫0.25ml，0.5ml和1ml三联疫苗。另取5只鸡作为正常对照组。然后采取在14天、21天、28天采血分别检测H9、H5、ND的HI价，取平均值，记录入下表：
表4、三联苗对鸡的免疫效果
分析表4中的数据可知，采用该法浓缩所制成的三联疫苗，免疫鸡后，能够在14天产生较高的抗体水平，但根据实验结果，大鸡最好免疫0.5ml疫苗。
下面用具体实施例对本发明进一步加以说明，实施例只是本发明的一部分，并不包括本发明的全部，不构成对本发明的限制，凡在本发明内容之内，所作的任何修改、替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种病毒释放缓冲液, 其特征在于，所含组分及各组分的质量含量如下：
氯化钠(NaCl): 7-25g；
氯化钾(KCl): 0.00-5.0g；
氯化镁（MgCl2）： 0.5-2.5g；
磷酸氢二钠(Na2HPO4): 0.1-3.0g；
乙二胺四乙酸（EDTA）: 0.15-1.5g；
甘氨酸： 1-6.0g；
谷氨酰胺： 1-5.0g；
组氨酸： 0.5-2.0g；
丝氨酸： 1-10g；
赖氨酸： 1-10g；
精氨酸： 5-8g；
吐温-80： 0.5-2.0 g；
曲拉通X-100： 0.1-20g；
甘油： 2-18g；
按配方称量以上试剂，全部溶解于蒸馏水中，调整pH为7.0-7.5，最终溶液体积定容为1L，即得所述病毒释放缓冲液。
2.用权利要求1所述的病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤A：分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；
步骤B：将病毒胚液中速离心，即以6000-9000r/min的速率离心15-60min，分离沉淀一和上清液一；
步骤C：按沉淀质量：病毒释放缓冲液质量1：10-100向所得沉淀中加入所述病毒释放缓冲液，混合均匀后，在2-8℃以1000-5000r/min的搅拌速率，搅拌10-30min，然后再次中速离心，分离沉淀二和上清液二；
步骤D:所得上清液二和所得上清液一混合后横向切流浓缩；或将所得上清液二和所得上清液一分别横向切流浓缩后混合；横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为10-500KDa，胚液浓缩倍数为浓缩2-10倍；得到病毒胚液的浓缩液。
3.如权利要求2所述的提高胚液病毒滴度的方法，其特征在于，横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为30-150KDa。
4.如权利要求2所述的提高胚液病毒滴度的方法，其特征在于，横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为50-100KDa。
5.用权利要求1所述的病毒释放缓冲液所述病毒释放缓冲液制备多联苗的方法，包括如下具体步骤：
步骤A：分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；
步骤B：将病毒胚液中速离心，即以6000-9000r/min的速率离心15-60min，分离沉淀一和上清液一；
步骤C：按沉淀质量：病毒释放缓冲液质量1：10-100向所得沉淀中加入所述病毒释放缓冲液，混合均匀后，在2-8℃以1000-5000r/min的搅拌速率，搅拌10-30min，然后再次中速离心，分离沉淀二和上清液二；
步骤D:所得上清液二和所得上清液一混合后横向切流浓缩；或将所得上清液二和所得上清液一分别横向切流浓缩后混合；横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为10-500KDa，胚液浓缩倍数为浓缩2-10倍；得到病毒胚液的浓缩液。
6.步骤E:将按步骤A、B、C和D制备的多个不同病毒胚液的浓缩液混合，即得多联苗。
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