CN114106114B - 利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法,包括对收获的口蹄疫病毒液进行灭活和过滤后,依次进行PEG沉淀,复溶,离子交换层析的等步骤。其中,离子交换层析包括:采用流穿工艺,将复溶后溶液穿过层析柱后,收取流穿组分。采用本工艺对口蹄疫AKT‑III、O/Mya 98、OHM02三种亚型灭活抗原的收率均大于90%,纯度大于70%,大幅度降低了抗原中杂蛋白的含量,可去除50%以上总蛋白,且工艺放大稳定,耗时短,可用于高品质口蹄疫疫苗的制备,提高了口蹄疫疫苗的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域,具体地说,涉及一种利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的偶蹄动物感染性疾病,传染性强且传播速度快,一旦爆发将造成巨大的经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类人兽共患病之首。
口蹄疫病毒属于小RNA病毒科,口蹄疫病毒属。目前已知有7个血清型,A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、ASIA1,每个血清型又包括很多亚型,不同毒株间的遗传变异可导致抗原性差异。我国主要流行3的血清型为A型、O型和ASIA1型。
疫苗接种是预防FMD的有效手段,目前用于预防口蹄疫的疫苗为灭活口蹄疫病毒疫苗。传统的口蹄疫疫苗的制备方法是利用BHK21细胞进行活病毒悬浮培养,收获病毒液离心或过滤,去除细胞碎片,再对收获的口蹄疫病毒液进行灭活处理,将灭活后的口蹄疫病毒液直接用作口蹄疫疫苗。该方法生产的疫苗抗原纯度低,杂质含量高,免疫动物存在严重的副反应甚至死亡。因此,亟需改良现有的口蹄疫病毒抗原纯化工艺以最大限度地去除可能会导致副反应的杂质成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法。
为了实现本发明目的,本发明提供一种利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法,包括对收获的口蹄疫病毒液进行灭活和过滤后,依次进行PEG沉淀,复溶,离子交换层析的等步骤。
其中,所述离子交换层析包括:采用流穿工艺,将复溶后溶液穿过层析柱后,收取流穿组分。
前述的方法,所述离子交换层析还包括用平衡缓冲液平衡层析柱的步骤,所述平衡缓冲液为:10-50mM HEPES,8-20mM MgCl2,100-200mM NaCl,pH7.8-8.2。
优选地,所述平衡缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,140mM NaCl,pH7.8-8.0。
前述的方法,所述离子交换层析为强阴离子交换层析柱。
所述填料可以是Giga Cap Q 650M、Cap Q 650M、Capto Q Impres中的任一种,优选为Giga Cap Q 650M。
进一步地,所述离子交换层析具体如下:
(1)用0.1-0.5M NaOH溶液洗柱,2个柱体积;
(2)纯化水清洗填料,2个柱体积;
(3)高盐缓冲液洗柱,5个柱体积;
(4)用平衡液缓冲液平衡层析柱,4个柱体积;
(5)层析料液上样,上样体积不超过10个柱体积,监测紫外260nm吸收值,大于10mAU时收集流穿产物;
(6)平衡缓冲液清洗,4个柱体积,当紫外260nm小于10mAU时停止收集;
(7)高盐缓冲液清洗,3个柱体积,纯化水清洗,2个柱体积,0.1M NaOH溶液保存填料。
其中,所述高盐缓冲液为:10-50mM HEPES,8-20mM MgCl2,0.8-1M NaCl,pH7.8-8.2。
优选地,层析柱中填料装填高度10-15cm,流速120-150cm/h。
本发明中所述的离子交换层析中清洗、平衡、上样等步骤中,溶液的流速均为120-150cm/h。
前述的方法,进行离子交换层析前,还包含将复溶产物经过超滤换液至平衡缓冲液中的步骤。
本工艺对A型或O型口蹄疫病毒的灭活抗原适用,特别是口蹄疫AKT-III、O/Mya98或OHM02三种亚型。三种亚型参见如下文献:
Application of Heparin Affinity Chromatography to Produce aDifferential Vaccine without Eliciting Antibodies against the NonstructuralProteins of the Serotype O Foot-and-Mouth Disease Viruses Viruses.2020Dec;12(12):1405.
Sun Young Park,1,2,Jung-Min Lee,1,Ah-Young Kim,1Sang Hyun Park,1Jae-Seok Kim,1Hyejin Kim,1,2Jung-Won Park,1Jong-Hyeon Park,1Young-Joon Ko,1,andChoi-Kyu Park2.
Improving stability of virus-like particles by ion-exchangechromatographic supports with large pore size:Advantages of gigaporous mediabeyond enhanced binding capacity Journal of Chromatography A,1331(2014)69–79Mengran Yu a,b,c,Yan Li a,b,Songping Zhang a,b,,Xiunan Li a,b,Yanli Yang a,b,c,Yi Chen a,b,c,Guanghui Ma a,b,Zhiguo Su a,b.
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
常规纯化工艺中,PEG沉淀步骤可去除较多杂蛋白,经过中空纤维滤柱超滤置换缓冲液时也可去除小于100kDa分子量的杂蛋白,但仍有部分杂蛋白无法去除,纯度仅20-30%。
现有工艺普遍采用结合洗脱工艺来解决收率问题,但在该工艺中,需要将PEG复溶后的超滤缓冲液置换需将料液的电导率降低至5mS/cm以下,才能保证料液中完整病毒颗粒被填料吸附,洗脱时需使用200-250mM NaCl,才能保证有较高收率,但渗透环境苛刻的同时还会将一部分杂蛋白洗脱,导致产物纯度大幅度下降(纯度不足70%),降低洗脱液NaCl浓度则又会损失收率,同时,该方法洗脱产物中病毒含量较高,不利于疫苗保存。
本发明提供的口蹄疫病毒抗原纯化方法,利用特定电导率的平衡缓冲液置换超滤产物后,经过特定工艺和特定缓冲液的优化,可有效去除前段工艺无法去除的杂蛋白,可将纯度提高至大于70%,且采用本工艺对口蹄疫AKT-III、O/Mya 98、OHM02三种不同亚型灭活抗原的纯化均可适用,均能达到收率大于90%,纯度大于70%,大幅度降低了抗原中杂蛋白的含量,可去除50%以上总蛋白,且工艺放大稳定,耗时短,可用于高品质口蹄疫疫苗的制备,提高了口蹄疫疫苗的安全性和有效性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的生物材料、试剂及仪器设备:
HEPES购自Sigma,货号V900477。
AKTA Pure快速蛋白纯化系统。
强阴离子交换层析柱的直径为16mm,高度20cm,层析柱直径可根据处理料液体积进行放大或缩小。
层析填料为Giga Cap Q 650M(日本东曹公司),填料粒径70μm,孔径100nm。
实施例1利用离子交换层析纯化口蹄疫AKT-III病毒抗原的方法
本实施例中利用离子交换层析纯化口蹄疫AKT-III病毒抗原的方法,依次包括活病毒悬浮培养,收毒并去除细胞碎片,对收获的口蹄疫病毒液进行灭活处理,离心澄清,超滤浓缩,深层过滤,PEG沉淀,复溶,离子交换层析等步骤。具体如下:
BHK21细胞悬浮培养至一定细胞密度,接入口蹄疫AKT-III病毒种毒,待细胞裂解后离心去除细胞碎片;收集上清液加入灭活剂,灭活抗原后通过深层过滤澄清,进行PEG沉淀,沉淀用复溶液复溶,使用中空纤维柱超滤置换缓冲液至平衡缓冲液中,即可进行离子交换层析。
进行离子交换层析前,复溶产物经过超滤换液至平衡缓冲液中,使层析料液的pH为7.9。
离子交换层析的步骤如下:
(1)0.1M NaOH溶液洗柱,2个柱体积;
(2)纯化水清洗填料2个柱体积;
(3)高盐缓冲液洗柱,5个柱体积;
(4)用平衡液缓冲液平衡层析柱,4个柱体积;
(5)层析料液上样,上样体积10个柱体积,监测紫外260nm吸收值,大于10mAU时收集流穿产物;
(6)平衡缓冲液清洗4个柱体积,当紫外260nm小于10mAU时停止收集;
(7)高盐缓冲液清洗3个柱体积,纯化水清洗2个柱体积,0.1M NaOH溶液保存填料。
其中,高盐缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,1M NaCl,pH7.8。
平衡缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,100mM NaCl,pH7.8。
实施例2利用离子交换层析纯化口蹄疫O/Mya98病毒抗原的方法
本实施例中利用离子交换层析纯化口蹄疫O/Mya98病毒抗原的方法,依次包括活病毒悬浮培养,收毒并去除细胞碎片,对收获的口蹄疫病毒液进行灭活处理,离心澄清,超滤浓缩,深层过滤,PEG沉淀,复溶,离子交换层析等步骤。具体如下:
BHK21细胞悬浮培养至一定细胞密度,接入口蹄疫O/Mya98病毒种毒,待细胞裂解后离心去除细胞碎片;收集上清液加入灭活剂,灭活抗原后通过深层过滤澄清,进行PEG沉淀,沉淀用复溶液复溶,使用中空纤维柱超滤置换缓冲液至平衡缓冲液中,即可进行离子交换层析。
进行离子交换层析前,复溶产物经过超滤换液至平衡缓冲液中,使层析料液的pH为7.8,电导率为17mS/cm。
离子交换层析的步骤如下:
(1)0.1M NaOH溶液洗柱,2个柱体积;
(2)纯化水清洗填料2个柱体积;
(3)高盐缓冲液洗柱,5个柱体积;
(4)用平衡液缓冲液平衡层析柱,4个柱体积;
(5)层析料液上样,上样体积10个柱体积,监测紫外260nm吸收值,大于10mAU时收集流穿产物;
(6)平衡缓冲液清洗4个柱体积,当紫外260nm小于10mAU时停止收集;
(7)高盐缓冲液清洗3个柱体积,纯化水清洗2个柱体积,0.1M NaOH溶液保存填料。
其中,高盐缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,1M NaCl,pH7.9。
平衡缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,100mM NaCl,pH7.9。
实施例3利用离子交换层析纯化口蹄疫OHM02病毒抗原的方法
本实施例中利用离子交换层析纯化口蹄疫OHM02病毒抗原的方法,依次包括活病毒悬浮培养,收毒并去除细胞碎片,对收获的口蹄疫病毒液进行灭活处理,离心澄清,超滤浓缩,深层过滤,PEG沉淀,复溶,离子交换层析等步骤。具体如下:
BHK21细胞悬浮培养至一定细胞密度,接入口蹄疫OHM02病毒种毒,待细胞裂解后离心去除细胞碎片;收集上清液加入灭活剂,灭活抗原后通过深层过滤澄清,进行PEG沉淀,沉淀用复溶液复溶,使用中空纤维柱超滤置换缓冲液至平衡缓冲液中,即可进行离子交换层析。
进行离子交换层析前,复溶产物经过超滤换液至平衡缓冲液中,使层析料液的pH为8.0,电导率为16mS/cm。
离子交换层析的步骤如下:
(1)0.1M NaOH溶液洗柱,2个柱体积;
(2)纯化水清洗填料2个柱体积;
(3)高盐缓冲液洗柱,5个柱体积;
(4)用平衡液缓冲液平衡层析柱,4个柱体积;
(5)层析料液上样,上样体积10个柱体积,监测紫外260nm吸收值,大于10mAU时收集流穿产物;
(6)平衡缓冲液清洗4个柱体积,当紫外260nm小于10mAU时停止收集;
(7)高盐缓冲液清洗3个柱体积,纯化水清洗2个柱体积,0.1M NaOH溶液保存填料。
其中,高盐缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,1M NaCl,pH 8.0。
平衡缓冲液为:10mM HEPES,8mM MgCl2,100mM NaCl,pH 8.0。
实施例4缓冲液中氯化钠浓度的优化
按照实施例1~3分别进行AKT-III、O/Mya98、OHM02三种亚型的层析工艺测试,调整平衡缓冲液中各组分浓度,可得到不同的纯化效果,具体浓度调整和纯化结果见表1。
表1
从表1可知,随氯化钠浓度升高,抗原收率下降趋势不明显,但纯度结果下降显著;随氯化钠浓度降低,抗原纯度变化不明显,但抗原收率呈显著下降趋势。综合收率和纯度变化情况,当氯化镁浓度在8-20mM、氯化钠浓度在100-200mM之间时,抗原收率和纯度均在60%以上,并且发明人意外地发现,当氯化镁浓度在8mM、氯化钠浓度在140mM时,三种抗原的收率均能达到90%以上,纯度均能达到70%以上,取得了预料不到的技术效果。
本发明还对采用上述最优浓度,对平衡缓冲液的pH值进行了优化,分别测试pH7.6、pH7.8、pH8.0、pH8.2、pH8.4对A型和O型病毒料液分别层析试验,试验结果表明,在pH7.8-8.2范围内,流穿模式层析产物的纯度最高,可大于70%,超出该范围后,纯度有所下降。
实施例5不同层析填料和工艺的纯化效果比较
采用不同的层析填料,分别采用流穿工艺和结合洗脱工艺对O/Mya 98亚型的口蹄疫病毒抗原进行层析纯化,并分析其收率和纯度,结果见表2。
其中流穿工艺按照实施例2步骤进行,结合洗脱工艺步骤的方法,依次包括活病毒悬浮培养,收毒并去除细胞碎片,对收获的口蹄疫病毒液进行灭活处理,离心澄清,超滤浓缩,深层过滤,PEG沉淀,复溶,离子交换层析等步骤。具体如下:
BHK21细胞悬浮培养至一定细胞密度,接入口蹄疫病毒种毒,待细胞裂解后离心去除细胞碎片;收集上清液加入灭活剂,灭活抗原后通过深层过滤澄清,进行PEG沉淀,沉淀用复溶液复溶,使用中空纤维柱超滤置换缓冲液至结合缓冲液中,即可进行离子交换层析。
进行离子交换层析前,复溶产物经过超滤换液至结合缓冲液中,使层析料液的pH为7.9。
离子交换层析的步骤如下:
(1)0.1M NaOH溶液洗柱,2个柱体积;
(2)纯化水清洗填料2个柱体积;
(3)高盐缓冲液洗柱,5个柱体积;
(4)用结合液缓冲液平衡层析柱,4个柱体积;
(5)层析料液上样,上样体积10个柱体积;
(6)平衡缓冲液清洗4个柱体积;
(7)洗脱缓冲液洗脱4个柱体积,监测UV260nm吸收值,大于10mAU时收集洗脱产物,小于10mAU时停止;
(8)高盐缓冲液清洗3个柱体积,纯化水清洗2个柱体积,0.1M NaOH溶液保存填料。
其中结合缓冲液成分为10mM HEPES,8mM MgCl2,40mM NaCl,pH7.8-8.0,洗脱缓冲液成分为10mM HEPES,8mM MgCl2,250mM NaCl,pH7.8-8.0。
表2
生产厂家 | 填料名称 | 层析模式 | 收率 | 纯度 |
东曹 | Giga Cap 650M | 流穿 | 80% | 71% |
东曹 | Giga Cap 650M | 结合洗脱 | 70% | 60% |
东曹 | Super Q 650M | 流穿 | 85% | 50% |
东曹 | Super Q 650M | 结合洗脱 | 60% | 55% |
思拓凡 | Capto Q Impres | 流穿 | 70% | 50% |
思拓凡 | Capto Q Impres | 结合洗脱 | 60% | 60% |
以上结果表明,东曹Giga Cap 650M填料以流穿模式层析后结果最优。
如前所述,本发明采用流穿模式处理时,层析前用平衡缓冲液进行置换,置换后氯化钠浓度为100mM-200mM,而结合洗脱模式层析前需要用低盐缓冲液进行置换,如本实施例置换后缓冲液中氯化钠浓度为40mM,然而病毒颗粒在低盐浓度下容易发生沉淀,因此本发明的层析环境更有利于完整病毒颗粒的保存。
实施例6流穿条件参数的优化
结合使用的层析设备及层析柱规格,层析柱高度,过程中系统压力测试流穿工艺流速,优化工艺线性流速为120-150cm/h,根据不同层析柱大小做线性放大后,仍能满足工艺需要。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法,其特征在于,包括对收获的口蹄疫病毒液进行灭活和过滤后,依次进行PEG沉淀,复溶,离子交换层析的步骤;
其中,所述离子交换层析包括:采用流穿工艺,将复溶后溶液穿过层析柱后,收取流穿组分;
所述离子交换层析还包括用平衡缓冲液平衡层析柱的步骤,所述平衡缓冲液为:10-50mM HEPES,8-20mM MgCl2,100-200mM NaCl,pH7.8-8.2;
所述离子交换层析具体如下:
(1)用0.1-0.5M NaOH溶液洗柱,2个柱体积;
(2)纯化水清洗填料,2个柱体积;
(3)高盐缓冲液洗柱,5个柱体积;
(4)用平衡液缓冲液平衡层析柱,4个柱体积;
(5)层析料液上样,上样体积不超过10个柱体积,监测紫外260nm吸收值,大于10mAU时收集流穿产物;
(6)平衡缓冲液清洗,4个柱体积,当紫外260nm小于10mAU时停止收集;
(7)高盐缓冲液清洗,3个柱体积,纯化水清洗,2个柱体积,0.1M NaOH溶液保存填料;
其中,所述高盐缓冲液为:10-50mM HEPES,8-20mM MgCl2,0.8-1M NaCl,pH7.8-8.2。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述平衡缓冲液为:10mM HEPES,8mMMgCl2,140mM NaCl,pH7.8-8.0。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述离子交换层析为强阴离子交换层析柱。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述填料为Giga Cap Q 650M、Cap Q650M、Capto Q Impres中的任一种。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述填料为Giga Cap Q 650M。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,层析柱中填料装填高度10-15cm,流速120-150cm/h。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,进行离子交换层析前,还包含将复溶产物经过超滤换液至平衡缓冲液中的步骤,换液后溶液的pH为7.8-8.2。
8.根据权利要求1-6任一项所述的方法,其特征在于,所述口蹄疫病毒的血清型为A型或O型。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述口蹄疫病毒为AKT-III、O/Mya98或OHM02亚型。
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