CN102327608B

CN102327608B - 一种乙型脑炎疫苗的纯化方法

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Publication number: CN102327608B
Application number: CN2010102642175A
Authority: CN
Inventors: 刘钿莲; 沈名锋; 艾文
Original assignee: LIVZON GROUP VACCINE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: LIVZON GROUP VACCINE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: CN102327608A

Abstract

本发明提供一种乙型脑炎疫苗的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：将灭活的乙型脑炎病毒浓缩液经聚丙烯葡聚糖分子筛柱层析，洗脱溶剂为pH为7.5～8.5的磷酸缓冲液，紫外检测器波长280nm处检测；收集第一洗脱峰，以带有季胺阳离子的醋酸纤维素膜进行离子交换层析膜层析，采用线性洗脱且洗脱溶剂由体积比为缓冲液A∶缓冲液B＝0～100％匀速变化至缓冲液A∶缓冲液B＝100％～0，其中缓冲液A为pH为7.5～8.5的磷酸缓冲液，缓冲液B为包含500mM/L氯化钠的pH 7.5～8.0的磷酸缓冲液，洗脱速度为200～600厘米/小时；收集NaCl浓度为70～250mM之间的洗脱液。该纯化方法能够在保护疫苗的免疫原性基础上有效地去除杂质，尤其是对产品安全性有重要影响的DNA，同时缩短了乙型脑炎疫苗的纯化时间，降低了生产成本。

Description

一种乙型脑炎疫苗的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种乙型脑炎疫苗的纯化方法，具体涉及一种利用分子筛层析和离子交换膜层析纯化灭活病毒乙型脑炎疫苗的方法。

背景技术

用现代生物技术改造传统疫苗产品，提高传统疫苗的安全性、保护效果并使疫苗生产过程的控制和产品质量的控制完全达到现代制药管理要求是国家重点支持的高新技术的发展方向(《高新技术产业化“十一五”规划》国家发展与改革委员会)。采用以大规模动物细胞培养技术、大规模层析纯化技术和新型制剂技术为核心的疫苗生产工艺是实现该目标的主要途径。然而，这些新技术还有待于进一步发展。以纯化技术为例，由于新疫苗生产工艺的基础是传代细胞，如何去除产品中的残留DNA是疫苗安全性的重要因素，也是国家疫苗质量标准的关键指标。

现有的灭活病毒乙型脑炎疫苗的纯化工艺流程一般是将病毒培养液通过过滤或者离心沉淀澄清后，经超滤浓缩至一定体积，再加入一定浓度的甲醛或者β-丙内酯灭活得到灭活病毒浓缩液，然后进一步提纯抗原活性组分；或者是将病毒培养液通过过滤或者离心沉淀澄清后，首先加入一定浓度的甲醛或者β-丙内酯灭活病毒，经超滤浓缩至一定体积，然后进一步提纯抗原活性组分。其中，获得灭活的病毒浓缩液的工艺比较通用，而对灭活的病毒浓缩液进一步提纯的方法却有多种方法：

方法一：向灭活的病毒浓缩液加入硫酸鱼精蛋白后离心沉淀去除DNA，然后采用蔗糖密度梯度区带离心方法进行提纯；

方法二：灭活的病毒浓缩液经硫酸鱼精蛋白沉淀后离心去除DNA，采用一种或多种分子筛层析柱一次或多次层析进行提纯；

方法三：将灭活的病毒浓缩液经蔗糖密度梯度区带离心后，经一步或多步离子交换柱去除DNA；

方法四：灭活的病毒浓缩液经分子筛层析后，再采用离子交换柱进一步提纯抗原。

由此可见，传统的生产提纯的乙脑疫苗多采用超速离心技术进行纯化，但由于超速离心设备昂贵，不易保养维修，一旦出现故障，问题往往比较严重，操作繁琐，且不易保持无菌，在设备与人力的投入上都大大超过了使用层析技术所需的投入，不适于大规模的工业化生产。采用超速离心法提纯抗原在纯化效果上也无法有效地去除与病毒性质相近的DNA，而DNA含量又是影响产品安全性的一个重要因素。单步分子筛法是指得到灭活病毒浓缩液后，通过一种或多种分子筛填料进行层析提纯。这种方法仅仅通过分子量大小不同的单一原理来分离杂质，只能分开不同分子量的物质，而对于相近分子量的物质就算经过更长的层析路径也无法分离，对于与抗原分子量相近的杂质，特别是DNA无法做到有效的去除。而且为了追求一步实现更高的蛋白去除率需要将抗原通过更长的层析路径，病毒表面的蛋白难免受到破坏，降低了抗原的免疫原性，而为了保障足够的效力，每次则需要加入更高含量的抗原，结果造成接种时出现更高概率的不良反应。

传统的离子交换层析采用离子交换填料作为柱层析介质，而离子交换填料是在琼脂糖或葡聚糖等颗粒的骨架上连接阳离子或者阴离子等基团，90％的基团是位于填料颗粒内部，在分离纯化例如病毒等大分子物质时，大分子物质无法进入颗粒胶的小孔内，无法与孔内的基团结合，造成了传统填料载量无法满足层析工艺的要求或者造成了90％以上的浪费。

因此，进一步探索灭活病毒乙型脑炎疫苗的纯化方法具有重要的实际意义。

发明内容

因此，本发明的目的在提供一种改进的乙型脑炎疫苗的纯化方法，该纯化方法将分子筛层析和离子交换膜层析技术相结合对灭活的病毒浓缩液进行纯化，能够在保护疫苗的免疫原性的基础上有效地去除杂质，尤其是对产品安全性有重要影响的DNA，同时缩短了乙型脑炎疫苗的纯化时间，降低了生产成本。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种乙型脑炎疫苗的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：

(1)将灭活的乙型脑炎病毒浓缩液经聚丙烯葡聚糖分子筛柱层析，洗脱溶剂为pH为7.5～8.5的磷酸缓冲液，紫外检测器波长280nm处检测；

(2)收集第一洗脱峰，以带有季铵阳离子的醋酸纤维素膜进行离子交换层析膜层析，采用线性洗脱且洗脱溶剂由体积比为缓冲液A∶缓冲液B＝0～100％匀速变化至缓冲液A∶缓冲液B＝100％～0，其中缓冲液A为pH7.5～8.5的磷酸缓冲液，缓冲液B为包含500mM/L氯化钠的pH 7.5～8.0的磷酸缓冲液，洗脱速度为200～600厘米/小时；

(3)收集NaCl浓度为70～250mM之间的洗脱液。

在上述纯化方法中，优选地，灭活的乙型脑炎病毒浓缩液的浓度为5～30mg/ml。优选地，分子筛柱层析之前以2倍柱体积的洗脱溶剂平衡层析柱。优选地，分子筛柱层析的柱高为20～60厘米。优选地，分子筛柱层析的上样体积为柱体积的8～12％。优选地，分子筛柱层析的洗脱溶剂的流速为20～50厘米/小时。

在上述纯化方法中，优选地，离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。优选地，离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。优选地，离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

将灭活的病毒浓缩液经过两步层析，即分子筛层析后再经离子交换层析可有效去除病毒培养液中的杂质，特别是DNA、小牛血清及残留的宿主蛋白等物质。由于加入离子交换层析提纯这一步骤，可大大减轻分子筛层析的压力，有效保障了抗原的免疫原性，只需要很低含量的抗原即可达到足够的效力，大大降低了接种的副反应。更重要的是，本发明经研究发现与离子交换柱层析相比，离子交换层析膜为微孔膜结构，其孔径(＞3μm)远远大于传统层析胶骨架结构，在进行大分子分离时能充分利用孔内的功能基团。由于在大分子物质上动态载量上的巨大区别，为了完成相同量的样品的纯化，柱层析需要的柱床体积是膜层析的多倍。在层析流速方面，传统颗粒胶只能耐受较低的流速，而层析膜为大孔膜结构，可实现极高的流速。更大的柱床体积与较小的流速使得在工业生产中柱层析所需的硬件投资、耗材投资、人力成本及时间成本都大大超过了膜层析。为此，本发明经过大量地实验筛选，确定了用于上述分子筛层析和离子交换层析膜层析的操作条件，从而保障实现上述分子筛层析和离子交换层析膜层析相结合所产生的技术效果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

1、VERO种子细胞的复苏

1.1VERO细胞株的来源

VERO细胞的原始来源为ATCC(编号为F-12313)，经传代扩增建立了主细胞库和工作细胞库，并保存于液氮中。主细胞为129代，工作细胞为133代，冻存密度为4×10⁶/ml。

1.2VERO种子细胞的复苏

取液氮罐内保存工作库细胞一支，39℃温水迅速融化后，将细胞悬液按约1×10⁵/cm²接种密度转入175cm²方瓶中，逐步滴加培养基(含10％(体积/体积)胎牛血清的M199培养基(M199干粉培养基组成成分见GIBCO培养基手册)至60mL，37℃和5％CO₂培养箱培养。

2、在175cm²方瓶中培养一级种子细胞

复苏的细胞培养3～4天后生长至致密单层，使用0.25％(g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1∶4(体积/体积)的接种比例将细胞悬液分到新培养基中，加入适当量的培养液(60ml)，37℃、5％CO₂培养箱中培养3～4天后以1∶4(体积/体积)比例再放大培养一次。

3、在2L转瓶中培养二级种子细胞

3.1培养基

M199培养基9.55g/L，NaHCO₃ 1.8g/L，葡萄糖1.5g/L，谷氨酰胺0.2g/L，10％(体积/体积)胎牛血清。

3.2转瓶培养

选择2L转瓶和四层转瓶机，保持接种密度为1.0～2.0×10⁵/cm²，加入500～600ml的培养基，设置温度为37℃，转速为1/8转/分，培养3～4天。

4、在14L生物反应器中培养三级种子细胞

4.1培养液

M199培养基9.55g/L，NaHCO₃ 2.2g/L，葡萄糖1.5g/L，谷氨酰胺0.2g/L，10％(体积/体积)胎牛血清。

4.2反应器选择

选择NBS或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为14L，工作体积为10L。

4.3微载体选择

Cytodex 1微载体(GE公司)，用量为5.0g/L。

4.4上罐接种

将转瓶中培养3～4天的VERO细胞经消化后，转移至蓝盖瓶中，吹打分散均匀，一并接入14L生物反应器，添加培养基至10L。

4.5参数控制

搅拌转速：35-40RPM；pH：7.2～7.4；溶解氧量(DO)：40-50％饱和度；温度：36.5～37.5℃。

4.6灌流控制

接种12小时后开启灌流，灌流量为每天1.5工作体积，培养5～6天。

5、在75L生物反应器中培养四级种子细胞

5.1培养基同4.1.

5.2反应器选择

选择NBS或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为75L，工作体积为50L。

5.3微载体的使用方法及用量同4.3

5.4转罐接种

将14L生物反应器中培养5-6天的细胞用0.25％(g/ml)胰酶消化液(含0.01％(g/ml)的EDTA)罐外消化，搅拌振荡分散均匀，用胰酶抑制剂(Gibco)终止反应后，通过管道将细胞连同微载体一并转入75L生物反应器，定容至50L。

5.5参数控制

搅拌转速：35～40RPM；pH：7.2-7.4；溶解氧量(DO)：40～50％饱和度；温度：36.5-37.5℃，

5.6灌流控制

接种12小时后开启灌流，灌流量为每天1.5工作体积，培养5-6天。

6、在300L生物反应器中大规模培养VERO细胞和制备病毒液

6.1培养基和维持液配方

培养基同4.1.

维持液：M199培养基9.55g/L，NaHCO₃2.2g/L，蔗糖1.0g/L，人血白蛋白0.1g/L。

6.2反应器选择

选择比欧或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为300L，工作体积为210L。

6.3微载体用量同4.3

6.4转罐

将75L生物反应器中培养5～6天的细胞用0.25％(g/ml)胰酶消化液(含0.01％(g/ml)的EDTA)罐外消化，搅拌振荡分散均匀，用胰酶抑制剂(Gibco)终止反应后，通过管道将细胞连同微载体一并转入300L生物反应器，定容至210L。

6.5培养参数同4.5。

6.6灌流控制

接种24小时后开启灌流，灌流量为每天1.5工作体积，培养5～6天。

7、接种乙脑P3株病毒培养

7.1接毒方法

暂停控制参数，沉降微载体和细胞，抽掉上清培养液，更换为维持液，待参数稳定后按照MOI为0.01接种病毒。

7.2参数控制

搅拌转速：35～40RPM；pH：7.5～7.6；溶解氧量(DO)：40～50％饱和度；温度：33.5～34.5℃

7.3以连续灌流方式收获病毒培养液

接毒12小时后开始灌流，灌流量为每天1.5工作体积，从接毒48小时起开始收获病毒液，连续收获8天。

8、病毒收获液的澄清过滤和超滤浓缩

8.1澄清过滤

选择膜面积为1平方米(20英寸)的1μm和0.5μm的聚醚砜滤芯串联，先经1μm的滤膜再经0.45μm的滤膜过滤。

8.2超滤浓缩

8.2.1缓冲液选择

选择pH7.2-8.0无菌磷酸缓冲液冲洗平衡好超滤系统。

8.2.2设备选择

使用Millipore公司的0.5平方米PELLICON 2超滤系统，安装2块PELLICON 2超滤膜包，截留分子量为300KD滤膜。

8.2.3操作参数

设定进液口压力为10～20psi，回流口压力为5～10psi，2～4小时内完成80～120L病毒液的收获；样品浓缩20～40倍，得到2～6L浓缩液。

9、病毒灭活：

9.1灭活试剂的准备

先将β-丙内酯用注射用水稀释成40倍的母液，再经0.22μm膜过滤除菌。

9.2灭活操作

将预稀释的β-丙内酯母液加入浓缩液中至终浓度为1/4000，2～8℃下放置灭活，24小时后在37℃下水解2小时。

10、分子筛层析

10.1缓冲液选择

pH 7.5～8.5磷酸缓冲液。

10.2填料选择

GE公司的Sephacryl S-300层析填料，装柱高度为20～60cm。

10.3层析操作

首先使用2倍柱体积的缓冲液平衡层析柱，流速为20～50cm/小时，上样样品体积为8％-12％柱体积，收获第一峰(波长280nm，紫外检测器)。

11、离子交换膜层析：

11.1缓冲液的选择

缓冲液A：pH 7.5～8.5磷酸缓冲液，缓冲液B：pH 7.5～8.0磷酸缓冲液加500mMol/L氯化钠。

11.2离子交换膜的选择

Sartorius公司的Sartobind Q离子交换层析膜

11.3层析操作

先用10倍体积缓冲液A平衡层析膜，上样经分子筛层析纯化后的抗原样品，用缓冲液A(体积比为100％～0％)和缓冲液B(体积比为0％～100％)形成线性梯度洗脱，收集NaCl浓度为70mM至250mM之间的洗脱液为纯化后原液；

12、铝佐剂原位吸附抗原方法

12.1试剂准备

1mol/L的NaOH溶液，1mol/L pH8.5的磷酸盐缓冲溶液，0.2mol/L的AlCl₃溶液，1mol/L的NaCl溶液，过滤除菌。

12.2吸附方法

将纯化后的抗原过滤除菌后，加入1mol/L pH8.5磷酸盐缓冲溶液使其磷酸盐浓度为0.05mol/L，然后搅拌加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl₃溶液，反应过程中保持体系pH为7.0左右，反应体系中的Al(OH)₃量为2.0～2.5mg/ml时止。

12.3稀释

用1mol/L的NaCl溶液和注射用水稀释至补结抗原量为1∶2～1∶4，Al(OH)₃含量为0.5～0.75mg/ml，NaCl浓度为0.154mol/L。

12.4加入添加剂：1％(g/ml)甘氨酸和5％(g/ml)蔗糖。

12.5半成品检测：无菌试验。

实施例2

膜层析与柱层析的纯化效果比较

处理1000ml的分子筛层析纯化后的抗原样品，比较各批次的纯化效果。根据以下结果可知，膜层析只需要70ml的柱床体积及30分钟的层析时间，而柱层析需要560毫升的柱床体积及2个小时的层析时间。除了柱床体积和层析时间等的差别外，产品的纯度也有很大区别，膜层析提纯得到的抗原所含蛋白均不高于5μg每剂，DNA不高于10pg/ml，而柱层析提纯得到的抗原所含蛋白在15μg每剂左右，DNA含量也只能达到＜100pg/ml的水平(参见表9)。

表9膜层析和柱层析的纯化效果比较

4、膜层析与柱层析使用比较

膜层析不管在层析效果上还是在生产投入成本上都大大优于传统柱层析(参见表10)。

表10膜层析与柱层析的使用比较

Claims

1.一种乙型脑炎疫苗的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：

（1）将灭活的乙型脑炎病毒浓缩液经聚丙烯葡聚糖分子筛柱层析，洗脱溶剂为pH为7.5～8.5的磷酸缓冲液，以紫外检测器280nm处检测；

（2）收集第一洗脱峰，以带有季铵阳离子的醋酸纤维素膜进行离子交换层析膜层析，采用线性洗脱且洗脱溶剂由体积比为缓冲液A：缓冲液B=0～100%匀速变化至缓冲液A：缓冲液B=100%～0，其中缓冲液A为pH7.5～8.5的磷酸缓冲液，缓冲液B为包含500mM/L氯化钠的pH 7.5～8.0的磷酸缓冲液，洗脱速度为200～600厘米/小时；

（3）收集NaCl浓度为70～250mM之间的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述灭活的乙型脑炎病毒浓缩液的浓度为5～30mg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析之前以2倍柱体积的洗脱溶剂平衡层析柱。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的柱高为20～60厘米。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的柱高为20～60厘米。

6.根据权利要求1-2和5中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的上样体积为柱体积的8～12%。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的上样体积为柱体积的8～12%。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的上样体积为柱体积的8～12%。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的洗脱溶剂的流速为20～50厘米/小时。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的洗脱溶剂的流速为20～50厘米/小时。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的洗脱溶剂的流速为20～50厘米/小时。

12.根据权利要求1-2、5和7-8所述的方法，其特征在于，所述分子筛柱层析的洗脱溶剂的流速为20～50厘米/小时。

13.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。

14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。

15.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。

16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。

17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。

18.根据权利要求1-2、5、7-8和10-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析之前以10倍柱体积的缓冲液A平衡层析膜。

19.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

20.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

21.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

22.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

23.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

24.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

25.根据权利要求1-2、5、7-8、10-11和13-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的上样量为0.2～1ml/cm²。

26.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

27.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

28.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

29.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

30.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

31.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

32.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。

33.根据权利要求1-2、5、7-8、10-11、13-17和19-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析膜层析的孔径为3～10μm。