CN101732708A - 一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法,包括细胞培养、病毒繁殖和疫苗制备工艺。细胞长满单层后接入毒种和培养液,毒种使用量为每100cm2细胞接种1ml毒种。病毒培养液主要包括:MEM培养液90-95%,小牛血清3-5%,7.5%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6。经澄清过滤后加入终浓度为0.3%人血白蛋白制成。本发明采用SA14-14-2减毒株生产乙脑纯化疫苗,该减毒株比P3毒株生产的疫苗更加安全有效。本发明的优点在于:1、用减毒株制备纯化疫苗安全性好。2、用β-丙内酯灭活病毒灭活效果好,灭活剂自然降解无残留。3、柱层析纯化性质温和,对病毒损伤小。
Description
所属技术领域
本发明属于疫苗的制备方法,主要是一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法。
背景技术
流行性乙型脑炎国际上统称日本脑炎,以往称日本乙型脑炎,在我国称流行性乙型脑炎(乙脑)。我国之前用鸡胚和鼠脑制成灭活疫苗,但鸡胚疫苗免疫原性差,而鼠脑疫苗由于含有较多的鼠脑组织成分,疫苗的副反应和免疫性不够满意,之后选用地鼠肾细胞培养病毒制备疫苗,不仅副反应轻,效果也较好。
目前上市的乙脑疫苗主要有活疫苗和死疫苗(即纯化疫苗)两类。活疫苗主要由培养SA14-14-2减毒株生产,死疫苗主要由P3强毒株生产。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的不足,而提供一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明是提出以下技术方案实现的:这种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法,步骤如下:
(1)、选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠,使用乙醚处死,清洗并消毒鼠尸;无菌取肾,剪碎,经胰蛋白酶消化,用培养液分散细胞,制备细胞悬液,分装培养瓶,置37℃±1℃培养3-4天;
(2)、选择细胞生长良好的细胞瓶,弃去培养液,用缓冲液冲洗去除小牛血清,缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶,冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液,立即置32-34℃温室继续培养;
(3)、种毒16-18小时后进行换液,加入维持液1500-2500ml/瓶,置32-34℃温室继续培养48-72小时;收获前检查细胞病变,选择细胞瓶内细胞病变75%以上的细胞瓶进行收集,将细胞瓶进行超声,使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内,摇匀即为病毒收获液;
(4)、病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心,流速为1500-2000ml/min,然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤,按1∶4000的重量比例加入β-丙内酯置2-8℃7天灭活;
(5)、将病毒收获液浓缩60倍左右,通过凝胶柱层析,0.02M pH7.2的PBS洗脱,检测波长为280nm,收集第一峰,即为纯化后原液;用0.22um的膜除菌过滤,然后加入0.3-0.5%人血白蛋白作为保护剂,加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐,病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml,按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。
所述的病毒培养液包括:MEM培养液90-95%,小牛血清3-5%,7.5%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6,经澄清过滤后加入终浓度为0.3%人血白蛋白制成。
本发明中的百分比均为重量百分比。
本发明的优点在于:1、用减毒株制备纯化疫苗安全性好。2、用β-丙内酯灭活病毒灭活效果好,灭活剂自然降解无残留。3、柱层析纯化性质温和,对病毒损伤小。
具体实施方式
下面结合实施例对发明作进一步说明:
本专利采用SA14-14-2减毒株生产乙型脑炎纯化疫苗,为灭活疫苗。母株病毒为1954年分离自西安蚊幼虫的JEV SA14株,经动物神经外组织多次传代增殖提高免疫力的方法,最终获得毒力低而免疫性高的生产用毒株(SA14-14-2)。SA14-14-2减毒株对热稳定性高,在50℃加热2小时-4小时,病毒未完全灭活,与SA14原株无差别。其基因型也相当稳定,在地鼠肾细胞17代病毒中仍保持稳定不变。
本发明涉及流行性乙脑疫苗的方法,其步骤如下:
选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠,使用乙醚处死,清洗并消毒鼠尸;无菌取肾,剪碎,经胰蛋白酶消化,用培养液分散细胞,制备细胞悬液,分装培养瓶,置37℃±1℃培养3-4天。
细胞长满单层后接入毒种和培养液,毒种使用量为每100cm2细胞接种1ml毒种。病毒培养液主要包括:MEM培养液90-95%,小牛血清3-5%,7.5%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6。经澄清过滤后加入终浓度为0.3%人血白蛋白制成。
选择细胞生长良好的细胞瓶,弃去培养液,用缓冲液冲洗去除小牛血清,缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶,冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液,立即置32-34℃温室继续培养。
种毒16-18小时后进行换液,加入维持液1500-2500ml/瓶,置32-34℃温室继续培养48-72小时。收获前检查细胞病变,选择细胞瓶内细胞病变75%以上的细胞瓶进行收集,将细胞瓶进行超声,使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内,摇匀即为病毒收获液。
病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心,流速为1500-2000ml/min,然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤。按1∶4000的比例加入β-丙内酯置2-8℃7天灭活。
将病毒收获液浓缩60倍左右,通过凝胶柱层析,0.02M pH7.2的PBS洗脱,检测波长为280nm,收集第一峰,即为纯化后原液。用0.22um的膜除菌过滤,然后加入0.3-0.5%人血白蛋白作为保护剂,加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐。病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml,按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。
各项检验项目经检测后,结果显示均符合国家药典标准。
三种方法制备乙脑疫苗的工艺异同点如下:
以上对本发明的描述不具有限制性,如果本领域的普通技术人员受其启示,在不脱离本发明权利要求的保护的情况,作出本发明的其它结构变形和实施方式,均属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种流行性乙型脑炎疫苗的制备方法,其特征在于:步骤如下:
(1)、选用10-14日龄、重量在12-15克的健康地鼠,使用乙醚处死,清洗并消毒鼠尸;无菌取肾,剪碎,经胰蛋白酶消化,用培养液分散细胞,制备细胞悬液,分装培养瓶,置37℃±1℃培养3-4天;
(2)、选择细胞生长良好的细胞瓶,弃去培养液,用缓冲液冲洗去除小牛血清,缓冲液冲洗量800-1000ml/瓶,冲洗完毕后每瓶加入1000ml病毒感染液,立即置32-34℃温室继续培养;
(3)、种毒16-18小时后进行换液,加入维持液1500-2500ml/瓶,置32-34℃温室继续培养48-72小时;收获前检查细胞病变,选择细胞瓶内细胞病变75%以上的细胞瓶进行收集,将细胞瓶进行超声,使细胞从瓶壁上脱落下来收集到10-15万不锈钢罐内,摇匀即为病毒收获液;
(4)、病毒收获后用14000r/min的连续流冷冻离心机进行离心,流速为1500-2000ml/min,然后用0.5um及0.22um的滤芯过滤,按1∶4000的重量比例加入β-丙内酯置2-8℃7天灭活;
(5)、将病毒收获液浓缩60倍左右,通过凝胶柱层析,0.02M pH7.2的PBS洗脱,检测波长为280nm,收集第一峰,即为纯化后原液;用0.22um的膜除菌过滤,然后加入0.3-0.5%人血白蛋白作为保护剂,加入总浓度为60ug/ml的硫柳汞防腐,病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml,按抗原含量不少于收获液的四倍配制半成品。
2.根据权利要求1所述的流行性乙型脑炎疫苗的制备方法,其特征在于:所述的病毒培养液包括:MEM培养液90-95%,小牛血清3-5%,7.5%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2-7.6,经澄清过滤后加入终浓度为0.3%人血白蛋白制成。
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CN102327609A (zh) * | 2010-08-27 | 2012-01-25 | 丽珠集团疫苗工程股份有限公司 | 一种乙型脑炎疫苗的生产方法 |
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