CN102671192B - 一种人二倍体细胞狂犬病疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人二倍体细胞狂犬病疫苗及其制备方法,属于疫苗领域,该疫苗是在人二倍体细胞WI-38上接种CDKHBP-1毒株,经分离纯化得到狂犬病疫苗。本发明采用的人二倍体细胞不含任何污染因子和致瘤性,明显优于动物细胞作为生产疫苗的基质,且适合于大规模工业化生产,纯化工艺更完善,疫苗含杂质更少,纯度和免疫原性更高。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域,具体是涉及人二倍体细胞灭活疫苗,特别是在人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株得到的狂犬病灭活纯化疫苗及其制备方法。
背景技术
狂犬病即疯狗症,又名恐水症,是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病,所有温血动物包括人类,都可能被感染。它多由染病的动物咬人而得。由于狂犬病尚无有效的治疗手段,发病死亡率极高,因此,疫苗的预防接种是防止狂犬病发生、保证人民健康的唯一有效手段。
目前世界大量生产的狂犬病疫苗有四种:第一种以美国为代表的人二倍体细胞,经过浓缩超离制备的狂犬病疫苗;第二种以法国为代表的Vero细胞为培养基质的,生产冻干灭活疫苗,但不能保证细胞基质的致瘤和细胞DNA的安全性。第三种和第四种以中国为代表的地鼠肾和日本的鸡胚、鸭胚;这几种疫苗细胞来源于普通动物,无法保证细胞不携带外源因子,也不能保证细胞基质的致瘤性和细胞DNA的安全性。
原代细胞培养疫苗:
地鼠肾细胞疫苗(PHKCV):将SAD狂犬病固定毒适应到地鼠肾细胞(PHKC)上生产灭活的疫苗。我国的PHKCV由卫生部武汉生物制品研究所研制而成。疫苗规定效价1.3~2.5IU,经超滤浓缩后,浓缩疫苗效价须≥2.5IU。经临床试验证明,各种剂型的PHKCV在人体中的抗体反应均优于羊脑Semple疫苗。我国生产的PHKCV是世界上累计生产量最大的狂犬病疫苗,高峰年份每年此类疫苗的产销量超过500万人份。目前,我国各生产单位正逐步采用改进的浓缩-精制PHKCV。
鸡胚细胞疫苗(PCECV):将Flary HEP株适应到鸡胚细胞,培养病毒经β-丙内酯灭活、区带离心纯化、浓缩、冻干制备成疫苗。从上述疫苗分化出一种用Flary LEP株适应到鸡胚细胞上的纯化PCECV。人体暴露前后的临床试验结果表明,疫苗的免疫效果和HDCV相当,并且不会诱生针对鸡细胞蛋白的抗体,使用该疫苗仅产生轻微的局部反应。PCECV现已在欧、亚、非、南美20多个国家获准使用。
上述原代细胞培养疫苗具有的一个优点是不必冷冻保存细胞种。但每批疫苗需检查培养器官源的杂质(细菌、支原体、病毒),并且动物器官的可用量是限制工业化生产的因素。
传代细胞系疫苗:
Vero细胞疫苗:1984年由法国Merieun研究所研制成功。制备过程中采用了使细胞贴附在微载体上悬浮培养的微载体技术以便进行工业化大罐培养。该疫苗使用的病毒株与人二倍体细胞疫苗相同,为PM1503-3M。收获的病毒经超滤浓缩、密度梯度离心、β-丙内酯灭活制成冻干疫苗。由于该疫苗进口价相对较高,我国使用适应到Vero细胞的狂犬病毒(CDKHBP-1V),色谱纯化人用Vero细胞疫苗。目前已有包括卫生部上海生物制品研究所在内的多家生物制品研究所研制成功,并得到生产文号,以逐步取代我国现行的PHKCV。
Vero细胞能生产较高的狂犬病毒滴度,并可利用微载体技术进行工业化大罐培养。目前使用Vero细胞已累积生产1亿剂脊髓灰质炎疫苗,2000万剂狂犬病疫苗和100万剂口服脊髓灰质炎疫苗,证实该细胞疫苗的安全性。但是用Vero细胞制备疫苗须在低细胞代数使用,以确保无致瘤性,且残余细胞DNA量须小于100pg/剂,这就为更安全有效的狂犬疫苗的开发提出了更严格的要求。
人二倍体细胞疫苗(HDCV):
人二倍体细胞(Human Diploid Cell,HDC)狂犬病疫苗是将狂犬病病毒固定毒株在人二倍体细胞上适应、传代增殖、浓缩、纯化而来。因为所用细胞来源于人类,具有副反应小、免疫起效时间短、抗体滴度高等优点,尤其对狂犬病这种高致死性疾病,能够使个体尽快获得保护性抗体是至关重要的。
法国的德梅里厄公司,美国的Wyeth公司在疫苗开发完成后,首先进行了小量的动物试验,动物试验显示,在注射一剂该疫苗后几小时,用“街毒”狂犬病毒攻击动物,即可对动物产生保护作用。这说明HDCV对动物具有良好的保护效果。在动物试验获得成功后,又先后在美国、泰国、法国、伊朗等国进行了大面积的免疫效果观察。试验结果显示,HDCV和其它疫苗比较,具有更好的免疫原性,而且疫苗的安全性好。
HDCV的问世使人们对传统疫苗免疫原性的评价有了根据。研究者通过对HDCV和DEV(鸭胚疫苗)的比较,证实了后者仅具有限的效力。Bahmanyar在当时得出的结论是,在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和HDCV相比。人二倍体细胞(HDC)为正常核型细胞,无致癌性,并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性,目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用,这使其成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。
HDCV的缺点在于HDC不太容易培养,而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低,仅能在空间有限的细胞瓶内培养,这使得疫苗的价格比较昂贵。在美国,用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达一千多美元,这样就限制了该疫苗在发展中国家的使用。由于狂犬病疫苗的特殊性和复杂性,制备该疫苗具有相当的难度,特别是在分离和纯化方面。
我国尚未有该类狂犬病疫苗,目前的纯化疫苗都是地鼠肾细胞和Vero细胞,本发明经过研究,找到了一种在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株得到的狂犬病纯化疫苗,这些人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1、MRC-5,所得到的疫苗,价格低廉,使用方便,纯度高,适合大规模生产和大规模应用。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种人二倍体细胞狂犬病灭活纯化疫苗,本疫苗是在人二倍体细胞上接种狂犬病毒株得到的狂犬病纯化疫苗。本发明的另一目的是生产一种纯度更高、免疫原性更强的狂犬病疫苗及其制备方法。
本发明的技术方案为:一种人二倍体细胞狂犬病疫苗,该疫苗是在人二倍体细胞WI-38上接种CDKHBP-1毒株,经分离纯化得到狂犬病疫苗。
进一步地,具有纳米氢氧化铝佐剂。
本发明还提供了一种人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法:其包括以下步骤:
1) 人二倍体细胞的复苏、培养及扩增;
2) 在人二倍体细胞上接种CDKHBP-1毒株;
3) 收获病毒液,灭活、浓缩;
4) 纯化;
进一步地 ,所述纯化包括以下步骤:
1) 超滤纯化;
2) 蔗糖密度区带离心;
3)Sepharose4FF柱层析纯化;
4) 佐剂吸附,加保护剂人血白蛋白。
进一步地,佐剂为纳米氢氧化铝。
本发明采用的人二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-IP5、KMB-17、IMB-90、MRC-5、2BS,优选的是WI-38。经过研究鉴定,WI-38细胞具有胞核学稳定,没有外源因子和致瘤性对病毒敏感的优点。
本工艺使用的人二倍体细胞种来源于中国疾病预防控制中心,先建立人二倍体细胞种子库和工作库,并对细胞库细胞进行系统的鉴定,在制备疫苗前,先进行细胞的复苏、培养和扩增,以达到生产批量的需要。可使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞培养液,所述的培养液可以选择199培养液、平衡盐培养液,其中优选199培养液,细胞培养液中含2~10%的牛血清和卡那霉素或庆大霉素26~30U/ml,p H7.0~7.5,其培养温度为35~37℃,培养方式为转瓶培养、细胞工厂培养或微载体反应器培养。
培养过程中,细胞分种率根据生产批量的需要确定,一般可以是1:2~1:4当细胞长成致密单层后,即可接种狂犬病病毒,细胞维持液中最好加入0.3~0.5%(W/W)的人血白蛋白,同时调整pH7.0~7.5,培养温度35~37℃,并可加入抗生素适量,可使用的培养液包括199液、平恒盐液等,接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面,去除残留的牛血清,然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株CDKHBP-1毒株MOL0.1~0.01及上述细胞维持液,培养66~79小时,即可收获病毒液。
狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间,病毒的收获可采取多次收取的方式,最好是3~5天收获一次,要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8.0LgLD50/ml。
本工艺在人二倍体细胞上接种的狂犬病毒为在传代的人二倍体细胞狂犬病毒,实验结果显示,狂犬病毒在人二倍体细胞上能很好生长繁殖,在人二倍体细胞上传代狂犬病毒10代以内很稳定,10代以上的毒株免疫原性则有明显下降。即接种人二倍体细胞上的狂犬病毒最好是10代以内的。
收获的病毒液用?-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗,本工艺选用超滤浓缩的方法对粗疫苗进行浓缩,一般是用截留10万~30万的超滤器浓缩疫苗,浓缩至20倍以上,然后纯化疫苗。
所述纯化包括以下步骤:病毒液先经超滤纯化除去部分杂蛋白,再经过蔗糖密度区带离心,然后经过Sepharose4FF柱层析。
本工艺的纯化方法中:超滤纯化即把疫苗超滤浓缩到一定倍数,然后加入适量的PBS冲洗,再浓缩到原倍数,再加入适量的PBS冲洗反复如此6~7次,牛血清残量可以去除95%以上,再经过蔗糖密度梯度离心,用38%和45%(W/W)的蔗糖密度梯度,21000~24000rpm超速离心4小时,经紫外吸收峰检测抗原含量,蛋白浓度的分析,确定病毒所在位置,收集病毒。再经Sepharose4FF柱层析纯化。经三步层析柱纯化后,疫苗总蛋白的减少约99%,残留血清量比2010版药典规程所规定的更低。
采用超滤纯化初步纯化,蔗糖密度梯度离心法和Sepharose4FF凝胶过滤层析进行进一步提纯。测试结果表明,经过本发明的三步提纯后,可使疫苗细菌内毒素去除率可达87.5%~98.7%,总蛋白含量减少约99%以上,牛血清残余用量等均符合中国药典2010版关于生物制品规程的要求,加入纳米氢氧化铝佐剂后可使疫苗的稳定性大大提高,且效价提高25%,接种时减缓病毒释放的速度,保持良好的抗体水平,通过纯化疫苗持久刺激机体产生抗体。
CDKHBP-1毒株为市售,来自于成都康华生物制品有限公司。狂犬病属于弹状病毒科狂犬病属,病毒基因组由约12kb的单股负链RNA组成,由3‘端至5’端依次排列着N、P、M、G和L5个结构基因,分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶蛋白。其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的本体,倡导了病毒与靶细胞的结合及在神经系统的分布,免疫方面主要保护作用,刺激机体产生中和抗体,保护机体抵抗病毒的感染。当前疫苗的效价主要取决于疫苗制剂中的糖蛋白含量。
通过转基因技术,在巴斯德PM株全基因组3’-N-P-M-G-L-5’的G和L之间插入一个G基因,构建了携带双G基因的毒株,命名为CDKHBP-1。
狂犬病毒CDKHBP-1株在WI-38细胞上多次进行传代接种病毒,观察细胞形态、透明度、折光性与接种狂犬病毒PM株无明显差异,故CDKHBP-1株适应人二倍体细胞。
WI-38细胞接种CDKHBP-1毒株后收获的多批次病毒液,通过噬斑法测定病毒滴度,平均滴度达到106.5FFU/ml,高于PM株106.2/ml的平均滴度。将CDKHBP-1病毒收获液经超滤浓缩,病毒纯化后制成冻干疫苗,接种小白鼠,小白鼠产生高水平中和抗体时间大体在11天左右,较PM株14天产生高水平中和抗体提前了2-3天.,其效价平均水平达到6.0IU,高于PM株平均效力。注射豚鼠,豚鼠无异常现象,生长状况良好。
综上,CDKHBP-1株糖蛋白表达量优于PM株,从而提高了机体的免疫力,产生的抗体水平较高,疫苗的效价较高,接种豚鼠无毒性异常现象发生。
本工艺与目前使用动物细胞疫苗相比,优点如下:
1) 人二倍体细胞不含任何污染因子和致瘤性,明显优于动物细胞作为生产疫苗的基质。
2) 适合于大规模工业化生产。
3) 纯化工艺更完善,疫苗含杂质更少,纯度和免疫原性更高。
具体实施方式:
以下通过实施进一步说明本发明,不能理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
先对人二倍体细胞WI-38进行细胞的复苏、培养和扩增,以达到生产批量的需要。使用动物细胞培养液199培养液,细胞培养液中加入2%的牛血清和卡那霉素26U/ml,p H7.0,其培养温度为37℃,培养方式为转瓶培养。
培养过程中,细胞分种率根据生产批量的需要确定,本实施例选择1:2,当细胞长成致密单层后,即可接种狂犬病病毒,细胞维持液中加入0.3%(W/W)的人血白蛋白,同时调整pH7.0,培养温度37℃,并可加入抗生素适量,接种时先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面,去除残留的牛血清,然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株CDKHBP-1毒株0.1mol,培养66小时,即可收获病毒液。
狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间,病毒的收获可采取多次收取的方式,最好是3~5天收获一次,要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8.0LgLD50/ml。
收获的病毒液用?-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗,
超滤纯化即把疫苗超滤浓缩到一定倍数,然后加入适量的PBS冲洗,再浓缩到原倍数,再加入适量的PBS冲洗反复如此6次,牛血清残量可以去除95%以上,再经过蔗糖密度梯度离心,用38%和45%(W/W)的蔗糖密度梯度,21000rpm超速离心4小时,经紫外吸收峰检测抗原含量,蛋白浓度的分析,确定病毒所在位置,收集病毒。再经Sepharose4FF柱层析纯化。经三步层析柱纯化后,疫苗总蛋白的减少约99%,并加入纳米氢氧化铝佐剂。
实施例2
先对人二倍体细胞WI-38进行细胞的复苏、培养和扩增,以达到生产批量的需要。使用动物细胞培养液199培养液,细胞培养液中加入10%的牛血清和庆大霉素30U/ml,p H7.5,其培养温度为35℃,培养方式为微载体反应器培养。
培养过程中,细胞分种率根据生产批量的需要确定,本实施例选择1:4,当细胞长成致密单层后,即可接种狂犬病病毒,细胞维持液中最好加入0.5%(W/W)的人血白蛋白,同时调整pH7.5,培养温度35℃,并可加入抗生素适量,可使用的培养液包括199液、平恒盐液等,接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面,去除残留的牛血清,然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株CDKHBP-1毒株0.01mol,培养79小时,即可收获病毒液。
狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间,病毒的收获可采取多次收取的方式,最好是3~5天收获一次,要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8.0LgLD50/ml。
收获的病毒液用?-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗,
超滤纯化即把疫苗超滤浓缩到一定倍数,然后加入适量的PBS冲洗,再浓缩到原倍数,再加入适量的PBS冲洗反复如此7次,牛血清残量可以去除95%以上,再经过蔗糖密度梯度离心,用38%和45%(W/W)的蔗糖密度梯度, 24000rpm超速离心4小时,经紫外吸收峰的抗原含量,蛋白浓度的分析,确定病毒所在位置,再经Sepharose4FF柱层析纯化。经三步层析柱纯化后,疫苗总蛋白的减少约99%,残留血清量比2010版药典规程所规定的更低。
本发明的狂犬病纯化疫苗的制备工艺中,采用超滤纯化初步纯化,蔗糖密度梯度离心法和Sepharose4FF凝胶过滤层析进行进一步提纯。测试结果表明,经过本发明的三步提纯后,可使疫苗细菌内毒素去除率可达87.5%~98.7%,总蛋白含量减少约99%以上,牛血清残余用量等均符合中国药典2010版关于生物制品规程的要求,加入纳米氢氧化铝佐剂后可使疫苗的稳定性大大提高,且效价提高25%,接种时减缓病毒释放的速度,保持良好的抗体水平,通过纯化疫苗持久刺激机体产生抗体。
实验例
将本发明的方法制备的狂犬病疫苗给未接种过狂犬病疫苗的人接种此疫苗15天后,中和抗体阳转率高于98%,且无副反应发生。
Claims (9)
1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗,其特征在于:该疫苗是在人二倍体细胞WI-38上接种CDKHBP-1毒株,经分离纯化得到狂犬病疫苗;所述CDKHBP-1毒株为通过转基因技术,在巴斯德PM株全基因组3’-N-P-M-G-L-5’的G和L之间插入一个G基因,构建的携带双G基因的毒株。
2.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞狂犬病疫苗,其特征在于:具有纳米氢氧化铝佐剂。
3.一种权利要求2所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法:其包括以下步骤:
1) 人二倍体细胞的复苏、扩增培养;
2) 在人二倍体细胞上接种CDKHBP-1毒株;
3) 收获病毒液,灭活、浓缩;
4) 纯化。
4. 根据权利要求3所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:所述纯化包括以下步骤:
1) 超滤纯化;
2) 蔗糖密度区带离心;
3)Sepharose4FF柱层析纯化;
4) 佐剂吸附,加保护剂人血白蛋白。
5.根据权利要求3所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:所述人二倍体细胞为WI-38。
6.根据权利要求3所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:步骤1)中细胞培养液为199培养液,且该细胞培养液中含牛血清的体积分数为2~10%、卡那霉素或庆大霉素26~30U/ml,并调pH至7.0~7.5,其培养温度为35~37℃,扩增培养方式为转瓶培养、细胞工厂培养、微载体反应器培养中的一种。
7.根据权利要求3所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:灭活采用?-丙内酯灭活,用截留10万~30万的超滤器浓缩疫苗,浓缩至20倍以上。
8.根据权利要求4所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于: 所述纯化的具体方法为:加入适量的PBS冲洗,再浓缩到原倍数,再加入适量的PBS冲洗反复如此6~7次;再经过蔗糖密度梯度离心,用38%和45%(W/W)的蔗糖密度梯度,21000~24000rpm超速离心4小时,经紫外吸收峰检测抗原含量,蛋白浓度的分析,确定病毒所在位置,收集病毒。再经Sepharose4FF柱层析纯化。
9.根据权利要求4所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于:所述佐剂为纳米氢氧化铝。
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