CN103255102B - 一种利用人胚肺成纤维二倍体细胞株slf-1制备病毒液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人胚肺成纤维二倍体细胞株SLF-1及其应用。该SLF-1细胞的保藏编号为CGMCC？No.4875，该细胞特征明显，生长旺盛，生命期长，平均达67代次，且纯净无污染，培养方法简单，对多种病毒具有敏感性，可用于水痘带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病毒、轮状病毒的培养，进一步可用于制备针对上述病毒的疫苗，成本低廉，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

一种利用人胚肺成纤维二倍体细胞株SLF-1制备病毒液的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1制备病毒液的方法。

背景技术

人二倍体细胞来源于正常人组织，可以进行体外有限寿命的传代培养，保留原体内的细胞特征，具有正常人二倍体染色体数目，核型正常，无肿瘤原性。作为疫苗生产用细胞基质，人二倍体细胞能够解决原代细胞和传代细胞系的很多问题，通过全面检定可以建立质量均一、数量充足的细胞库；无内外源因子污染；无致肿瘤性风险，故无须考虑细胞蛋白和DNA残留量。人二倍体细胞与人抗原性一致，能将疫苗过敏反应的可能性降到最低。尤其对于青少年和婴幼儿的计划免疫，其能大大提高疫苗的安全性。目前国际上用于疫苗生产的人二倍体细胞主要有WI-38和MRC-5，其均为上世纪60年代分离，目前欧美等发达国家市场上使用这两种细胞生产的疫苗产品主要有冻干人用狂犬病疫苗、麻疹减毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、甲肝灭活疫苗、水痘减毒活疫苗和脊髓灰质炎灭活疫苗等，由于MRC-5细胞的生长性状和病毒敏感性均优于WI-38，故其拥有更广泛的应用。国内用于疫苗生产的人二倍体细胞主要有2BS和KMB-17，其均为上世纪70年代分离，国内市场上使用这两种细胞生产的疫苗产品主要有麻疹减毒活疫苗风疹减毒活疫苗、甲肝减毒活疫苗、甲肝灭活疫苗、水痘减毒活疫苗，脊髓灰质炎减毒活疫苗等。以人二倍体细胞为基质生产的疫苗产品近40年的使用经验充分证明了人二倍体细胞作为疫苗生产用细胞基质具备良好的安全性和有效性。在疫苗产品安全性越来越受到关注的今天，人二倍体细胞以其自身的优势成为疫苗生产用细胞基质的重要选择之一。

人二倍体细胞也存在一些缺点阻碍其在疫苗生产中的广泛应用，主要是疫苗生产成本较高，具体表现在细胞繁殖代次有限，培养条件要求较高，生产时间较长，培养规模难于放大，生产时病毒产量较低。目前国内外使用的人二倍体细胞存在的主要问题体现在两个方面：

一是缺乏较早代次的原始细胞种子，细胞极限寿命较短，细胞培养难度大，培养成本高且病毒敏感性不理想。作为国际认可用于疫苗生产的人二倍体细胞株MRC-5和WI-38来说，其均为上世纪60年代分离培养制得，两株细胞的极限寿命均为50代左右，故其生产使用代次应控制在33代以内。目前能从美国菌种保藏中心(ATCC)购买到的MRC-5细胞最早代次为10代，因此在18代间隔内，要制备工作细胞库并用于生产，细胞很难增殖到较大的生产规模，也正因为细胞代次较高，细胞培养的难度加大，细胞数量直接影响病毒的活性和产量；培养成本增加直接影响产品的售价。以巴斯德公司的冻干狂犬病疫苗为例，其拥有人二倍体细胞基质和vero细胞基质的两种疫苗产品。由于MRC-5细胞的培养成本高，病毒产量少导致疫苗价格昂贵，因此安全性更高的人二倍体细胞基质的狂犬病疫苗只在欧美等发达国家内销售。由此可见，拥有原始细胞库从而能够有较多使用代次的细胞对于疫苗的生产来说至关重要。

另一个问题是细胞的使用权限和范围的限制。MRC-5细胞虽然是国际认可的疫苗生产用人二倍体细胞株，但从ATCC购买来的细胞一般仅可以用于研究，如果用于生产则需要支付高昂的国际生产许可费，即使通过WHO获得可用于生产的该细胞株数量也是非常有限的，严重阻碍更多品种疫苗的开发和生产。国内主要用于疫苗生产的两株人二倍体细胞2BS和KMB-17也有各自的使用权限，且未获得国际认可，使用范围受到限制。

因此，现有的这些人二倍体细胞株已经无法满足目前疫苗生产的需求。近几十年科技的发展使得细胞培养和检定技术有了很大的进步。本发明涉及的人二倍体细胞株作为生产疫苗的细胞基质，不仅可以提高疫苗的质量、降低生产成本，还可以快速推动以新人二倍体细胞为基质的新型疫苗的开发和产业化进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胚肺成纤维二倍体细胞株的应用。

本发明提供了一种利用SLF-1细胞制备病毒液的方法，包括如下步骤：

(1)SLF-1细胞扩增培养；

(2)在SLF-1细胞上接种病毒；

(3)培养和收获感染后的SLF-1细胞；

(4)从收获的细胞培养液中获得病毒悬液；

(5)纯化病毒悬液。

上述方法中，培养SLF-1细胞的培养基为含有5％～10％胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM。

其中，步骤(1)中SLF-1细胞培养条件为35～37℃，5％CO₂。

其中，步骤(1)中细胞培养至形成致密单层后，以1:2～4的比例传代扩增培养，得到细胞悬液。

其中，步骤(2)按照0.001-0.1MOI接种病毒至细胞悬液。

本发明提供的制备病毒液的方法所述的病毒为水痘带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病毒或轮状病毒。

本发明提供了人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1在病毒培养中的应用。

本发明提供的人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1在裸鼠动物试验中得以证明该细胞株不具有致肿瘤性。与其它人二倍体细胞株如MRC-5相比，其增殖更快并对多种病毒具有敏感性。

人二倍体细胞株SLF-1具有如下生物学特性：

(1)细胞培养简单

在含有5％-10％的胎牛血清的MEM培养基中，于37℃，5％CO₂环境下培养本发明提供的SLF-1细胞，待形成致密单层后，按照传代比例1：2-1：4范围内进行连续传代。

(2)对多种病毒具有较高敏感度

本发明的SLF-1细胞株进行了多种病毒的适应性研究，包括水痘带状疱疹病毒，肠道病毒如EV71病毒、脊髓灰质炎病毒和柯萨奇A16病毒，风疹病毒，甲肝病毒，狂犬病毒和轮状病毒等。SLF-1细胞株对水痘病毒的敏感性较MRC-5细胞高，如在不同病毒接种比率下(MOI0.001、0.01、0.05)，其它培养规格条件相同下，水痘带状疱疹病毒在SLF-1细胞株的病毒滴度较MRC-5细胞高0.75-1.0lgCCID₅₀，SLF-1细胞平均产毒率为MRC-5细胞的4.6倍。SLF-1细胞株对狂犬病毒的敏感性高，病毒传代过程中滴度均高于5.0lgLD₅₀/ml，病毒滴度最高可达6.5lgLD₅₀/ml，并逐代稳定。SLF-1细胞株对风疹病毒的敏感性也高于MRC-5，和MRC-5细胞株培养风疹病毒相比，在相同的时间收获病毒时，SLF-1细胞株培养风疹病毒的滴度比MRC-5细胞高0.5-1.0lgCCID₅₀。SLF-1细胞株对甲肝病毒的敏感性良好，甲肝病毒抗原含量与同类人胚肺二倍体2BS细胞上抗原含量持平或者略高，见图16。SLF-1细胞株对EV71和CA16病毒均具有良好的敏感性。SLF-1细胞也对轮状病毒具有良好的敏感性。本发明提供的SLF-1细胞株有较广泛的病毒敏感性，病毒滴度(或抗原含量)不低于甚至高于同类二倍体细胞，如MRC-5细胞，可用于规模化生产这些病毒。因此，在本发明的实施方案中涉及了多种病毒的适应性研究，其中所述病毒包括水痘带状疱疹病毒、EV71病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病毒和轮状病毒等。

附图说明

图1为接种MOI为0.001时，水痘带状疱疹病毒在SLF-1和MRC-5的滴度比较。

图2为接种MOI为0.01时，水痘带状疱疹病毒在SLF-1和MRC-5的滴度比较。

图3为SLF-1株细胞培养狂犬病毒连续传代病毒滴度结果。

图4为EV71病毒在SLF-1细胞上的增殖曲线。

图5为SLF-1细胞培养EV71病毒连续传代病毒滴度结果。

图6为CA16病毒在SLF-1细胞上的增殖曲线。

图7为SLF-1细胞培养CA16病毒连续传代病毒滴度结果。

图8为在SLF-1和MRC-5细胞上培养的风疹病毒的滴度结果。

图9为G1血清型轮状病毒在SLF-1细胞上连续传代的增殖曲线。

图10为SLF-1细胞培养G1血清型轮状病毒连续传代病毒滴度结果。

图11为接种MOI为0.01-0.1时，甲肝病毒在SLF-1和2BS细胞的滴度比较。

图12为接种MOI为0.01-0.1时，脊髓灰质炎病毒在SLF-1株细胞上的生长曲线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

通过染色体核型检查试验证明本发明的SLF-1细胞株是正常的人二倍体细胞株，命名为SLF-1，并于2011年5月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为人胚肺成纤维细胞，保藏编号CGMCCNo.4875。

实施例1水痘带状疱疹病毒在SLF-1细胞株和其它二倍体细胞株的适应性

将Oka株水痘带状疱疹病毒(来自ATCC，编号为VR-795)工作种子按照MOI为0.001和0.01分别接种至SLF-1和MRC-5细胞，将接种病毒的细胞瓶置35.0±1.0℃吸附1小时，每20分钟摇匀一次；吸附结束后补加病毒维持液，置35.0±1.0℃培养箱中继续培养。为保证细胞及病毒生长，病毒培养过程中每48±4小时更换一次病毒培养液，分别于接毒后的第12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、168、192和216小时显微镜下观察并记录病变状态，弃掉培养液用PBS溶液洗细胞表面，再加入PBS溶液，冻融细胞，采用微量细胞病变法进行病毒滴定。结果见图1、图2。

本实施例结果说明，SLF-1细胞株对水痘带状疱疹病毒的敏感性较MRC-5细胞高，在不同病毒接种比率下(MOI0.001、0.01)，其它培养规格条件相同下，水痘带状疱疹病毒在SLF-1细胞株的病毒滴度较MRC-5细胞高0.75-1.0lgCCID₅₀，SLF-1细胞平均产毒率为MRC-5细胞的4.6倍。

实施例2狂犬病毒在SLF-1细胞的适应性

(1)培养实施例1获得的人二倍体细胞SLF-1株长成致密单层，0.25％胰蛋白酶消化，并用含有10％牛血清的MEM、EMEM、199及L60等培养基收集并制备成3×10⁵个/ml细胞悬液，将狂犬病病毒CTN-1V株按照MOI为0.01-0.1接种至细胞，添加病毒维持液，置33℃培养13天，观察细胞病变，每2天更换病毒维持液，收获的细胞上清液检测病毒滴度。见表3。

表3不同时间收获SLF-1细胞培养的狂犬病毒的滴度结果

(2)病毒传代稳定性：病毒培养9天后，收获病毒液，作为传代用狂犬病病毒种子。将狂犬病病毒种子在新建人二倍体细胞SLF-1株上连续传6代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在新建人二倍体细胞SLF-1株上的传代稳定性。本实施例说明SLF-1细胞株对狂犬病毒的敏感性高，病毒传代过程中滴度均高于5.0lgLD₅₀/ml，病毒滴度最高可达6.5lgLD₅₀/ml,并逐代稳定，见图3。

实施例3EV71病毒在SLF-1细胞株的适应性

(1)培养实施例1获得的人二倍体细胞SLF-1株并传代并培养至2×10⁷个/175cm²，将EV71病毒(北京科兴中维有限公司)工作种子按照MOI为0.01-0.1接种至SLF-1细胞，添加2％牛血清病毒维持液，置36±1℃培养7天，观察细胞病变，同时每天取样检测病毒滴度。结果见图4。结果说明EV71病毒培养1天后病毒滴度逐渐升高，培养至4天时达到峰值7.05lgCCID₅₀/ml，4天后随着细胞病变程度达到++++，细胞完全病变脱落，病毒滴度出现降低，可见SLF-1株对EV71病毒有良好的敏感性。

(2)病毒传代稳定性：当细胞病变程度至+++～++++时，冻融细胞收获病毒液，作为传代用EV71病毒种子。将EV71病毒种子在SLF-1细胞上连续传18代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在新建人二倍体细胞上的传代稳定性。结果见图5。滴度结果显示EV71病毒在新建人二倍体细胞SLF-1上传代稳定，且产毒量相对较高。

实施例4CA16病毒在SLF-1细胞株的适应性

(1)培养实施例1获得的人二倍体细胞SLF-1株并传代至2×10⁷个/175cm²适宜数量，将CA16病毒(CGMCCNo.5371)工作种子按照MOI为0.001-0.01接种至细胞，添加2％牛血清病毒维持液，置36±1℃培养3-5天，观察细胞病变，同时每天取样检测病毒滴度。结果见图6。CA16病毒培养1天后病毒滴度逐渐升高，培养至4天时达到峰值5.63lgCCID₅₀/ml，4天后随着细胞病变程度达到++++，细胞完全病变脱落，病毒滴度出现降低。

(2)病毒传代稳定性：当细胞病变程度至+++～++++时，冻融细胞收获病毒液，作为传代用CA16病毒种子。将CA16病毒种子在SLF-1细胞上连续传10代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在人二倍体细胞SLF-1株上的传代稳定性。结果见图7，结果说明CA16病毒种子在SLF-1细胞上连续传10代病毒滴度维持在5.63～6.0lgCCID₅₀/ml，具有良好的传代稳定性。

实施例5风疹病毒在SLF-1和MRC-5细胞上的适应性比较

培养MRC-5细胞和SLF-1细胞至2×10⁷个/175cm²，将风疹病毒工作种子RA27/3株(ATCC编号为VR-135q^Tm)按照MOI为0.01～0.1接种细胞，添加2％牛血清的细胞维持液，置32.0±1℃培养，每隔一天取样并检测病毒滴度，在第6、12天收获全部病毒液，更换细胞维持液，共培养18天。结果见图8。结果说明SLF-1细胞株对风疹病毒的敏感性高于MRC-5，和MRC-5细胞株培养风疹病毒相比，在相同的时间收获病毒时，SLF-1细胞株培养风疹病毒的滴度比MRC-5细胞高0.5-1.0lgCCID₅₀。

实施例6轮状病毒在SLF-1细胞株的适应性

(1)培养实施例1获得的人；胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1株并传代至2×10⁷个/175cm²，将G1、G2、G3、G4、G9、P1A[8]、G5和G8血清型的人牛(UK)重配轮状病毒(来自美国国立卫生院NIH)工作种子按照MOI为0.01-0.1分别接种至SLF-1细胞，添加病毒维持液，置36±1℃培养3-5天，观察细胞病变，同时每天取样检测病毒滴度。结果见图9。轮状病毒培养1天后病毒滴度逐渐升高，培养至3天时达到峰值7.2lgCCID₅₀/ml，3天后随着细胞病变程度达到++++，细胞完全病变脱落，病毒滴度出现降低。

(2)病毒传代稳定性：当细胞病变程度至++～+++时，冻融细胞收获病毒液，作为传代用轮状病毒种子。将轮状病毒种子在SLF-1细胞上连续传10代，观察细胞病变并检测病毒滴度，以检测病毒在新建人二倍体细胞上的传代稳定性。结果见图10，说明轮状病毒在SLF-细胞上的连续10代病毒滴度维持在6.8～7.8lgCCID₅₀/ml，产毒量较高且较稳定。

实施例7甲肝病毒在SLF-1细胞株的适应性

新建人二倍体细胞SLF-1株并传代至2×10⁷个/175cm²时，将甲肝病毒工作种子TZ84株按照MOI为0.01-0.1接种至SLF-1细胞，添加病毒维持液，置33℃培养28天，观察细胞病变，培养14天后每天取样检测甲肝病毒抗原含量，病毒培养至28天。

甲肝病毒在人二倍体细胞SLF-1株和2BS株上均不产生细胞病变。其在人二倍体细胞SLF-1株和2BS株上抗原含量及其抗原含量的变化趋势基本一致，随着培养时间的延长，抗原含量增加，甲肝抗原含量的变化范围为1100～2800U/ml。结果如图11。

实施例8脊髓灰质炎病毒在SLF-1细胞株的适应性

将长成致密单层的SLF-1株细胞器培养液，消化后，用含有10％牛血清的MEM培养基将细胞收集，制成3.0～5.0×10⁵个/ml的悬液，按照MOI为0.01-0.1，分别加入SabinⅠ、Ⅱ、Ⅲ型病毒(来自ATCC，编号VR-302、301、300)，至33℃摇床悬浮吸附25min。将悬浮吸附好的病毒接种于培养瓶中，与33℃静置培养，结果如图12。脊灰病毒培养12小时后病毒滴度逐渐升高，培养至60小时后可达到8.5lgCCID₅₀/ml。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种利用保藏编号为CGMCCNo.4875的SLF-1细胞制备病毒液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)SLF-1细胞扩增培养；

(2)在SLF-1细胞上接种病毒；

(3)培养和收获感染后的SLF-1细胞；

(4)从收获的细胞培养液中获得病毒悬液；

(5)纯化病毒悬液；

培养SLF-1细胞的培养基为含有5％～10％胎牛或小牛血清的MEM、M199或DMEM；

步骤(1)中SLF-1细胞培养条件为35～37℃，5％CO2；

步骤(1)中细胞培养至形成致密单层后，以1:2～1:4的比例传代扩增培养，得到细胞悬液；

步骤(2)按照0.001-0.1MOI接种病毒至细胞悬液；

所述的病毒为水痘带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A16病毒、风疹病毒、甲肝病毒、狂犬病毒或轮状病毒。

2.保藏编号为CGMCCNo.4875的人胚肺成纤维二倍体细胞SLF-1在病毒培养中的应用。