CN108220172B - 高产虫草素的蛹虫草突变株及应用 - Google Patents

高产虫草素的蛹虫草突变株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高产虫草素的蛹虫草(Cordyceps militaris)突变株及应用。利用重碳离子束注入诱变技术选育获得的一株高产虫草素及子实体的蛹虫草突变株CGMCC No.14800，以其作为发酵菌种，进行液体发酵制备虫草素，所得发酵液中虫草素产量最高可达929.390μg/mL，是出发菌株所得发酵液中虫草素产量的8.15倍；对菌株CGMCC No.14800进行固体培养，子实体产量最高可达22.376g/瓶，是出发菌株子实体产量的1.72倍；子实体虫草素产量最高可达11777.094μg/g，是出发菌株子实体虫草素产量的1.75倍。本发明为高产虫草素的蛹虫草菌株的开发提供了新渠道。

Description

高产虫草素的蛹虫草突变株及应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体地说，涉及高产虫草素的蛹虫草突变株及应用。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北虫草，是虫草属的模式种，是获得批准的新食品原料，目前已实现大规模人工培养，经济和药用价值很高，是食药用菌的研究热点。
虫草素是蛹虫草生物活性成分中最重要的一种，具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒、抗炎等作用。目前市场上虫草素价格昂贵，主要是由于条件限制只能在实验室中实现化学合成，无法实现大规模生产，市场上现有的虫草素主要是从蛹虫草培养物中提取分离。因此选育高产虫草素的蛹虫草菌株对降低虫草素的价格有重要作用，对其实验或临床应用具有重要意义。
近年来蛹虫草的人工栽培规模不断扩大，但是菌株退化一直是制约产业发展的难题，主要表现为不长或只长极少量子实体，且质量差，将造成极大的经济损失。因此提高子实体产量，改善蛹虫草子实体出草问题具有重要的经济意义。
发明内容
本发明的目的是提供利用重碳离子束注入诱变技术选育获得的一株高产虫草素及子实体的蛹虫草突变株CGMCC No.14800。
本发明的另一目的是提供蛹虫草突变株CGMCC No.14800在发酵生产虫草素中的应用。
为了实现本发明目的，本发明利用重碳离子束注入诱变技术选育获得的一株高产虫草素及子实体的蛹虫草(Cordyceps militaris)突变株。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.14800，保藏日期2017年11月24日。
本发明还提供蛹虫草突变株CGMCC No.14800在发酵生产虫草素中的应用。
所述应用包括：将蛹虫草突变株CGMCC No.14800接种于PDA培养基内，于20～28℃(优选25℃)避光培养至菌丝长满培养基表面，将PDA培养基上的蛹虫草菌种用无菌接种刀切成大小为0.5cm×0.5cm的接种块，取2～8块(优选5块)接入到装有250mL液体培养基的500mL三角瓶中，于20～28℃(优选25℃)，转速150r/min条件下培养5～7d(优选7d)，得到含有虫草素的发酵液；继续于20～28℃静置培养20～60d，得到含有虫草素的培养液。
本发明中，所述液体发酵培养基配方为：蔗糖30g/L，蛋白胨30g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
所述PDA培养基配方为：PDA粉末(购自BD公司)39g/L，pH自然。
本发明还提供蛹虫草突变株CGMCC No.14800的固体培养方法，包括以下步骤：
(1)将蛹虫草突变株CGMCC No.14800接种于PDA培养基内，于20～28℃(优选25℃)避光培养至菌丝长满培养基表面，将PDA培养基上的蛹虫草菌种用无菌接种刀切成大小为0.3cm×0.3cm的接种块，取2～8块(优选5块)接入到装有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于20～28℃(优选25℃)，转速150r/min条件下培养5～7d(优选7d)，得到种子液；
(2)取步骤(1)得到的种子液5mL均匀洒在固体培养基表面，于20～28℃(优选25℃)避光培养至菌丝长满培养基表面，将菌丝打散成小颗粒，在培养瓶中铺平，然后移入人工气候培养箱中培养20～60d。
相应优选后，步骤(2)人工气候培养箱的条件设定为：光照8h，湿度80％，温度为23℃，光照强度为1200lux，黑暗16h，湿度75％，温度为22℃。
所述固体培养基配方为：大米60g，营养液60mL。其中，所述营养液为：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.0g/L，pH自然。
本发明还提供所述固体培养方法在生产蛹虫草子实体中的应用。
本发明利用重碳离子束注入诱变技术选育获得的一株高产虫草素及子实体的蛹虫草突变株CGMCC No.14800，以其作为发酵菌种，进行液体发酵制备虫草素，所得发酵液中虫草素产量最高可达929.390μg/mL，是出发菌株CM-2液体发酵液中虫草素产量113.990μg/mL的8.15倍；静置发酵液中虫草素产量最高可达2291.490μg/mL，是出发菌株CM-2静置发酵液中虫草素产量419.140μg/mL的5.47倍。对菌株CGMCC No.14800进行固体培养，子实体产量最高可达22.376g/瓶，是出发菌株CM-2子实体产量13.014g/瓶的1.72倍；子实体中尿苷含量最高可达4996.422μg/g，是出发菌株CM-2子实体中尿苷含量3444.745μg/g的1.45倍；子实体中鸟苷含量最高可达3104.604μg/g，是出发菌株CM-2子实体中鸟苷含量2229.779μg/g的1.39倍；子实体中腺苷含量最高可达2283.195μg/g，是出发菌株CM-2子实体中腺苷含量1750.829μg/g的1.30倍；子实体中虫草素含量最高可达11777.094μg/g，是出发菌株CM-2子实体中虫草素含量6719.618μg/g的1.75倍。本发明为生产虫草素以及其他核苷类物质的蛹虫草菌株的开发提供了新渠道。
附图说明
图1为本发明实施例1中12C6+离子注入蛹虫草的存活率曲线。
图2为本发明实施例1中12C6+离子注入的突变率曲线。
图3为本发明实施例1中蛹虫草液体发酵液色谱图。其中：A为出发菌株CM-2，B为突变菌株CGMCC No.14800。
图4为本发明实施例1中蛹虫草液体静置培养色谱图。其中：C为出发菌株CM-2，D为突变菌株CGMCC No.14800。
图5为本发明实施例2中蛹虫草子实体出草情况。其中：A和C为出发菌株CM-2；B和D为突变菌株CGMCC No.14800。
图6为本发明实施例2中蛹虫草固体培养提取物色谱图。其中：E为出发菌株CM-2，F为突变菌株CGMCC No.14800。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1重碳离子束注入诱变选育高产虫草素的蛹虫草突变株
1、菌种
出发菌种：蛹虫草(Cordyceps militaris)编号CM-2，由北京市辐射中心微生物实验室保存。
2、培养基及试剂
(1)培养基
PDA培养基：PDA粉末(购自BD公司)39g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
液体培养基、种子液培养基：蔗糖30g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌30min。
蛹虫草固体培养基：大米60g，加入60mL营养液，115℃灭菌30min。
营养液：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.0g/L，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL。
试剂：蔗糖、葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁均为分析纯试剂，购自国药集团北京化学试剂公司；虫草素为高效液相色谱纯级别，购自Sigma公司；蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉为生物培养基级别，购自国药集团北京化学试剂公司；PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)为分子生物学培养基级别，购自美国BD公司(货号：213400)。
3、蛹虫草离子束注入样品制备方法
(1)液体培养最佳时间的确定
将PDA培养基上的蛹虫草菌种用无菌接种刀切成大小相同的接种块(0.5cm×0.5cm)，取5块接入到装有250mL液体培养基的500mL三角瓶中，放置于恒温摇床中，25℃，转速为150r/min培养，培养时间为5～7d。根据观察其菌丝体形态与数量，发现培养7d效果最佳。
(2)孢子悬液的制备
将培养好的蛹虫草菌悬液以5000r/min室温离心3min，此条件下的菌丝体和少部分孢子刚好沉淀，上清液中含有较多孢子悬浮，但也有少量菌丝体，取上清液以灭菌200目细胞筛过滤，该方法孢子和菌丝体分离的效果好，所得滤液中不含菌丝体，且孢子浓度较大，适合稀释后涂布到35mm无菌塑料培养皿中。
(3)孢子悬液稀释浓度的选择
将细胞筛过滤得到的浓度为3.0×109个/mL的孢子悬液，分别用液体培养基稀释至10倍、100倍、1000倍、10000倍，依次均匀涂布于35mm无菌塑料培养皿中，超净台中无菌风吹干，用倒置显微镜观察菌膜是否为单层，并洗下，计算存活率。综合以上指标，最终选择稀释100倍的孢子液最适合涂布35mm无菌塑料培养皿。
离子束注入诱变前样品的制备方法：蛹虫草菌种液体培养基于25℃摇床转速150r/min培养7d，菌悬液5000r/min室温离心3min，用200目灭菌细胞筛过滤后的孢子悬液，计数孢子数，最终选取孢子浓度为3.0×107个/mL(稀释液为液体培养基)，涂布到35mm无菌塑料培养皿上，于超净台无菌风吹干后进行重离子束注入。
4、离子束注入诱变与诱变菌株的获得
离子束注入设备为中国科学院兰州近代物理研究所的重离子注加速器(HIRFL)。处理好的样品放入离子注入机自动旋转30孔轮盘中，进行重离子束注入。注入离子种类为12C6+离子，束流能量为80MeV/u，LET值为：40keV/μm，剂量率为20Gy/min，注入剂量为0～100Gy，通过建立不同注入剂量与菌体存活率的关系，分析找到蛹虫草离子束注入诱变最佳条件。
(1)离子束注入剂量对存活率的影响
在0～100Gy/min注入剂量范围内选取0Gy/min、20Gy/min、40Gy/min、60Gy/min、80Gy/min、100Gy/min总计6个注入剂量诱变蛹虫草菌株。用1mL无菌水将离子束注入后培养皿上的菌膜洗下，吸取至无菌EP管中，记为诱变后原液，并依次以无菌水稀释至10倍、100倍及1000倍。将每个浓度梯度的菌液吸取0.1mL均匀涂布到90mm PDA平板上，每个样品各做3个平行实验。将涂布好的平板置于25℃恒温培养箱中培养4d并计数。以未经离子束注入样品的菌落数作为空白对照，计算平均存活率，已注入菌株的存活率计算公式如下：
Figure BDA0001571717030000061
式中：rS(Survival rate)为辐照存活率；Ni(Number of regenerated strainsfrom irradiation group)为辐照处理组再生菌株个数；Nc(Number of regeneratedstrains from control group)为空白对照组再生菌株个数。
按照存活率计算方法得到离子注入剂量与菌株存活率之间的关系如图1所示，未进行离子束注入的空白对照存活率作为100％。根据图1数据可以得出，在剂量从0～20Gy/min时存活率由100％下降，然后随着剂量的增加存活率逐渐上升后缓慢下降，逐渐趋近于零，这是离子束注入诱变存活率“马鞍形”曲线，也是选择最佳注入剂量的参考依据。
(2)蛹虫草菌株平板初筛方法
将离子束注入诱变后分离得到的蛹虫草单菌落用无菌牙签挑取放入新的PDA平板上，放入25℃恒温培养箱培养7d。根据平板中单菌落生长的速度、菌落颜色、菌落形态，对诱变后蛹虫草菌株进行固体平板初筛。根据蛹虫草菌株的特点，筛选标准为：菌落直径较大且菌丝茂密；菌落为较规则的圆形；菌落为多个同心圆成放射状；菌落有褶皱且菌落表面颜色为橘黄色；菌落背面颜色为深橘红色或深橘黄色。
(3)高效液相色谱法(HPLC)测定虫草素含量复筛
蛹虫草突变株发酵液获得：将初筛得到的平板菌种，用无菌接种刀切出大小相同的接种块(每块0.5cm×0.5cm)，取5块接入到装有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，放入恒温摇床25℃，转速为150r/min培养7d。将液体培养的蛹虫草培养物混匀，用5mL无菌注射器吸取发酵液到无菌EP管中，8000r/min，离心3min，吸取上清液0.22μm无菌滤膜过滤，直接放入2mL的液相样品瓶中，采用高效液相色谱法测定发酵液中虫草素含量。
(4)不同注入剂量下蛹虫草菌株突变率
按照方法(3)中处理蛹虫草诱变后菌株，获得液体发酵液，采用HPLC方法测定虫草素峰面积响应值，根据虫草素标准曲线方程计算虫草素含量，与出发菌株相比，变化幅度大于10％者为突变菌株，产量提高的为正突变菌株，产量降低的为负突变菌株，变化幅度小于10％者视为未产生突变。每个注入剂量最少检测50个菌株，菌株存活总数不足50的突变率不统计，以零计。根据以上标准统计每个离子束注入剂量下的突变率，计算公式如下：
Figure BDA0001571717030000081
式中：rM(Mutation rate)为辐照存活率；Ni(Number of mutational strainsfrom irradiation group)为处理组突变菌株个数；Nc(Number of mutational strainsfrom control group)为对照组突变菌株个数。
按照上述公式计算突变率，其中20Gy/min的注入剂量由于菌株存活率低，存活总菌株数小于50个，因此该剂量下突变率不计算，图中显示为0；未进行离子束注入的空白对照突变率为0，具体突变率结果如图2所示。由图2数据可得出离子束注入剂量在80～100Gy/min剂量范围内突变率最高可以达到20.37％，且根据筛选结果测定数据可知正突变菌株较多，因此选择这个剂量范围对蛹虫草菌株进行诱变，筛选突变菌株。
5、液体发酵培养
将突变菌株与出发菌株在完全相同的条件下进行液体发酵培养，培养基配方及培养条件为：蔗糖30g/L，蛋白胨30g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然，加热溶解，115℃，灭菌30min，250mL三角瓶装液体培养基100mL，摇床25℃恒温培养，转速为150r/min，培养时间为7d。将蛹虫草培养液混合后转入1.5mL无菌EP管中，8000r/min，离心3min，无菌注射器吸取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液直接放入高效液相色谱仪(HPLC)的样品瓶中后待测。
6、液体静置培养
将上述提到的液体发酵培养的蛹虫草继续放入25℃光照培养箱中，静置培养36d。同实施例5中高效液相色谱处理，滤液直接放入高效液相色谱仪(HPLC)的样品瓶中后待测。
7、虫草素含量的测定
(1)HPLC测定虫草素方法
采用HPLC法测定，具体参数：DAD检测器，检测波长为260nm，色谱柱：XDB-C18，4.6×250mm，5μm，流动相，甲醇：纯水＝15:85(v:v)，流速1.0mL/min，进样量10μL，柱温箱温度为25℃。
(2)虫草素标准曲线的制作
虫草素标样配制浓度为500、250、125、62.5、31.25、0μg/mL，根据虫草素浓度(x)与峰面积响应值(y)之间的线性关系，制作标准曲线，得到方程为：y＝35.551x-17.153，R2＝0.9999，表明0～500μg/mL浓度的虫草素线性关系良好，适合测定本发明中样品虫草素含量。
(3)虫草素含量
液体发酵培养阶段：通过(1)中的HPLC方法测定液体发酵培养物中虫草素含量。图3所示为液体发酵培养阶段的色谱图，其中图A为出发菌株CM-2，图B为正突变菌株CGMCCNo.14800。虫草素保留时间为11.112min。图中的结果显示正突变菌株CGMCC No.14800的虫草素含量远高于出发菌株CM-2。将测定的样品峰面积值代入标准曲线方程，计算得到样品浓度，结果如表1所示。
表1蛹虫草出发菌株与突变菌株液体发酵虫草素含量
Figure BDA0001571717030000091
液体静置培养阶段：按照(1)中虫草素测定方法进行测定，得到出发菌株与突变菌株液体静置培养虫草素色谱图如图4所示，C为出发菌株CM-2，D为突变菌株CGMCCNo.14800，由图可以直观得出突变菌株虫草素含量远高于出发菌株。将峰面积代入标准曲线方程计算得到虫草素含量结果见表2。
表2蛹虫草出发菌株与突变菌株静置液体培养虫草素含量
Figure BDA0001571717030000092
8、突变菌株的稳定性
对筛选得到的上述正突变菌株CGMCC No.14800进行传代稳定性实验，转接1次代表传代1次，总计传代8次，每次均采用相同的液体发酵和液体静置培养条件，采用相同的样品处理方法和虫草素含量测定方法，各代之间虫草素产量无显著性差异(P>0.05)。突变菌株CGMCC No.14800虫草素产量比出发菌株CM-2在液体发酵培养阶段提高8.15倍，在液体静置培养阶段提高5.47倍，该蛹虫草菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.14800。
实施例2蛹虫草突变株CGMCC No.14800的固体培养
1、突变菌株的固体培养
蛹虫草菌株固体培养采用液体种子，种子液的制备方法如实施例1液体培养中描述。取培养好的5mL种子液，均匀的洒在灭菌放凉后的固体培养基表面。25℃恒温避光培养，7d菌丝长满培养基表面，在超净台内用无菌镊子将培养基上层的菌丝及米粒打散成小颗粒，平铺在培养瓶中。然后移入20～23℃人工气候培养箱中，设定白天8h，湿度80％、温度为23℃，光照强度为1200lux，黑夜为16h，湿度75％，温度为22℃，2d后菌丝逐渐转黄变为橘色，黄色逐步加深，最后菌丝全部长满，8h/16h光照/黑暗进行培养30d，获得子实体(图5)。
种子液培养基：蔗糖30g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌30min。
蛹虫草固体培养基：大米60g，加入60mL营养液，115℃灭菌30min。
营养液：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.0g/L，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1000mL。
2、子实体样品处理方法
将组培瓶中的子实体取出，称量鲜重，并测量子实体高度然后60℃烘干到恒重(表3)，取出后研磨粉碎，过40目筛子。分别准确称量蛹虫草固体培养子实体粉末0.10g，加入10mL超纯水于50mL离心管中，温度60℃，频率40kHz避光超声波提取30min，冷却至室温，将提取液8000r/min离心5min，吸取上清液1.5mL，经0.22μm无菌水相微孔滤膜过滤后待测。
表3蛹虫草子实体情况
Figure BDA0001571717030000111
正突变菌株CGMCC No.14800子实体产量(鲜重)比出发菌株CM-2提高1.72倍。正突变菌株CGMCC No.14800子实体产量(干重)比出发菌株CM-2提高1.98倍。
3、虫草素含量的测定与子实体产量
采用HPLC法测定子实体中核苷类物质含量。其中，尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷标样配制浓度分别为100、80、40、20、10、5、0μg/mL，根据尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷标样浓度(x)与峰面积响应值(y)之间的线性关系，制作标准曲线，得到标准曲线方程分别为：y＝30.941x-16.477，R2＝0.9999；y＝28.704x+2.5897，R2＝0.9999；y＝31.122x–24.159，R2＝0.9997；y＝43.035x-42.977，R2＝0.9997。这4种核苷类物质在测定的浓度范围内峰面积响应值与浓度线性关系良好，说明该方法适合测定本实验样品。虫草素标准曲线使用实施例1中所述方法。
通过上述HPLC法测定的固体培养物中核苷类物质含量的色谱图如图6所示，其中E为出发菌株CM-2，F为正突变菌株CGMCC No.14800。其中尿苷保留时间为3.315min，鸟苷保留时间为4.402min，胸苷保留时间为6.799min，腺苷保留时间为8.622min，虫草素保留时间为11.112min，图6中的结果显示正突变菌株CGMCC No.14800核苷类物质的含量远远高于出发菌株CM-2。将测定的样品峰面积值代入标准曲线方程，计算得到样品浓度，折算后得到蛹虫草固体培养物中核苷类物质含量，结果如表4所示。可以看出正突变菌株CGMCC No.14800的尿苷含量比出发菌株CM-2提高45.04％，鸟苷含量提高39.23％，腺苷含量提高30.41％，虫草素含量提高75.26％，但胸苷含量降低21.06％。
表4蛹虫草出发菌株与突变菌株子实体中核苷类物质含量
Figure BDA0001571717030000121
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.高产虫草素的蛹虫草(Cordyceps militaris)突变株，保藏编号为CGMCC No.14800。
2.权利要求1所述蛹虫草突变株在发酵生产虫草素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将蛹虫草突变株CGMCC No.14800接种于PDA培养基内，于20～28℃避光培养至菌丝长满培养基表面，将PDA培养基上的蛹虫草菌种用无菌接种刀切成大小为0.5 cm×0.5 cm的接种块，取2~8块接入到装有250 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，于20～28℃，转速150 r/min条件下培养5~7 d，得到含有虫草素的发酵液；继续于20～28℃静置培养20～60 d，得到含有虫草素的培养液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述液体培养基配方为：蔗糖30 g/L，蛋白胨30 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，pH自然。
5.权利要求1所述蛹虫草突变株的固体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 将蛹虫草突变株CGMCC No.14800接种于PDA培养基内，于20～28℃避光培养至菌丝长满培养基表面，将PDA培养基上的蛹虫草菌种用无菌接种刀切成大小为0.3 cm×0.3cm的接种块，取2~8块接入到装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，于20～28℃，转速150 r/min条件下培养5~7 d，得到种子液；
(2) 取步骤(1)得到的种子液5mL均匀洒在固体培养基表面，于20～28℃避光培养至菌丝长满培养基表面，将菌丝打散成小颗粒，在培养瓶中铺平，然后移入人工气候培养箱中培养20～60 d。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固体培养基配方为：大米60 g，营养液60 mL；
其中，所述营养液为：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨15 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.0 g/L，pH自然。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)人工气候培养箱的条件设定为：光照8 h，湿度80%，温度为23℃，光照强度为1200 lux，黑暗16 h，湿度75%，温度为22℃。
8.权利要求5-7任一项所述方法在生产蛹虫草子实体中的应用。
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