CN109294922B - 一种蛹虫草菌种的制备方法及其制备的蛹虫草菌种 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛹虫草菌种的制备方法及其制备的蛹虫草菌种。该制备方法中所用的蛹虫草培养基含有金银花粉末，该蛹虫草培养基不易感染杂菌，出菌率高，菌丝生长速度快。该蛹虫草培养基成分简单，容易配制。同时制备的蛹虫草菌种中虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)含量高，可作为优质的菌种使用。

Description

一种蛹虫草菌种的制备方法及其制备的蛹虫草菌种

技术领域

本发明属于食用菌制种领域，特别是涉及一种蛹虫草菌种的制备方法、及制备的蛹虫草菌种。

背景技术

蛹虫草又称北虫草，与冬虫夏草同科同属，化学成分基本一致，其抗肿瘤成分虫草素含量高于冬虫夏草，且是卫生部批准的新资源食品，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎症、延缓衰老、提高免疫力等多种功效，适用人群广泛。因此蛹虫草被作为冬虫夏草的最佳替代品而渐渐走入人们视野并受到极大关注，蛹虫草产业目前已进入工厂化大面积栽培的充分发展时期。然而人工培养蛹虫草会由于培养基营养配比不合理，菌种退化、杂菌污染严重等多种原因，导致产量下降。

因而使用特定培养基制备蛹虫草菌种、以及制备优良的蛹虫草菌种对于后续生产优质的蛹虫草非常重要。而现有技术中缺少一种能保证蛹虫草菌种具有优良质量的制备方法，以及优良的蛹虫草菌种。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种蛹虫草菌种的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)制备蛹虫草培养基，所述蛹虫草培养基中含有金银花粉末，所述金银花粉末为干燥粉碎的金银花茎、叶、和/或花；步骤(2)在所述步骤(1)制备的蛹虫草培养基中接种蛹虫草母种，培养得到蛹虫草菌种。

本发明蛹虫草菌种的制备方法，通过将蛹虫草菌母种接种在以金银花粉末、葡萄糖、蛋白胨等制作的人工培养基里培养，不仅在培养中不易感染杂菌，还具有出菌率高、菌丝生长速度快的优点；得到抗杂菌能力强，营养成分高于野生的冬虫夏草的蛹虫草菌种。本发明的制备方法培殖蛹虫草菌种生长速度快，菌丝粗壮，利于后续的优质蛹虫草产品的扩增培养。

本发明通过在菌种的培养基内添加了金银花作为蛹虫草的营养来源；金银花，是许多中药配方中被广泛使用的草药之一。它有清热，解热，解毒，消炎、抗氧化等多种作用。经试验证明使用此培养基培育的蛹虫草菌种扩培不易感染杂菌，出菌率高，菌丝生长速度快。

所述蛹虫草母种可以用采集的野生菌种，也从商业上购买。

作为本发明的一种实施方式，本发明蛹虫草菌种制备方法中，所述步骤(1)中所述蛹虫草培养基含有碳源、氮源、矿质元素，以及 2％～8％W/V的所述金银花粉末；所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、马铃薯和/或果胶，所述氮源包括氨基酸、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉、蛹虫粉、氯化铵、硝酸钠、和/或磷酸氢二铵，所述矿质元素包括磷、钾、钙、镁；所述培养基pH为5.2～6.8。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明蛹虫草菌种制备方法中，所述蛹虫草培养基由20％W/V的去皮马铃薯、1％W/V的葡萄糖、1％W/V 的蛋白胨、0.05％W/V的蛹虫粉、0.05％W/V的磷酸二氢钾、0.03％W/V 的硫酸镁、0.001％W/V的维生素B₁、2％W/V的琼脂以及2％～8％W/V 的所述金银花粉末和余量的水组成，所述金银花粉末过60目筛，所述培养基pH为5.8。

作为本发明的一种更优选实施方式，本发明蛹虫草菌种制备方法中，所述蛹虫草培养基中金银花粉末含量为2～5％W/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明蛹虫草菌种制备方法中，所述步骤(2)中接种蛹虫草母种量为5％W/V，避光培养7d。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明蛹虫草菌种制备方法中，所述步骤(2)中培养温度为6℃～30℃，空气相对湿度保持在60％～70％。作为本发明的一种优选实施方式，本发明蛹虫草菌种制备方法中，所述步骤(2)中培养温度为20-22℃恒温。

本发明还涉及所述制备方法制备的蛹虫草菌种。

本发明制备的蛹虫草菌种，其中含有的多种活性成分较常规方法制备的菌种中活性成分高，且超过了野生冬虫夏草中各活性成分的含量；其菌丝体粗而强健，为后续蛹虫草的制备提供了优良的菌种。

作为本发明的一种实施方式，所述蛹虫草菌种为金银花蛹虫草菌晶懋1号，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15364，分类命名为蛹虫草(Cordyceps militaris),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日为2018年2月12日。

本发明所述蛹虫草菌种扩培不易感染杂菌，出菌率高，菌丝生长速度快，活性成分高于常规培养基培养的蛹虫草菌种，远高于野生的冬虫夏草。

附图说明

图1中1A为使用含2％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种出草培育的菌丝体照片；1B为使用含5％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种出草培育的菌丝体照片；1C为使用含 8％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种出草培育的菌丝体照片；1D为使用不含金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种出草培育的菌丝体照片。

具体实施方式

在本发明中“蛹虫草”，又叫北冬虫夏草，北虫草，为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属的模式种；子座单生或数个一起从寄生蛹体的头部或节部长出，颜色为橘黄或橘红色，一般为全长2～8厘米。蛹虫草已实现人工培育，将虫草菌接种至不同的培养基上，进行生长繁殖。人工使用虫蛹等为培养基培育的蛹虫草药用功效与野生虫草的功效相差无几，某些方面的医用表现甚至优于野生虫草。药化、药理和临床实验证明蛹虫草完全可以作为冬虫夏草的代用品，其中含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷等多种活性成分。

“蛹虫草菌种”是指蛹虫草的子实体，用于蛹虫草的扩增培养。

“金银花粉末”是指干燥粉碎的金银花茎、叶、和/或花，具有清热，解热，解毒，消炎、抗氧化等多种作用；干燥粉碎后，可以作为蛹虫草菌种培养基或蛹虫草培养基的添加成分。

“蛹虫粉”是蛹虫草菌种培养基或蛹虫草培养基的成分之一，为虫蛹的干燥粉末，为优质氮源。

“碳源”是微生物生长的一类营养物，为含碳化合物，碳源对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳骨架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳骨架，为微生物或细胞的正常生长，分裂提供物质基础。

“氮源”是作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料，用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成，培养基中使用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等。常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、麸皮、废菌丝体等。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

制备实施例1

按配方配制金银花蛹虫草培养基，金银花蛹虫草培养基配方为：去皮马铃薯200g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、琼脂20g、蛹虫粉5g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁3g、维生素B₁10mg、金银花混合粉末20g、纯净水定容到1L、PH5.8，其中金银花粉末为：金银花的茎、叶、或/和花烘干，粉碎，过60目筛。

将配制好的金银花蛹虫草培养基分装在玻璃试管中塞好棉塞，置高压锅中，在121℃下保持30min进行灭菌；冷却后接入5％蛹虫草母种，培养7天(培养条件：20-22℃恒温避光培养7d)，即为金银花蛹虫草一级菌种。

将所培养的金银花蛹虫草一级菌种提交保藏。

制备实施例2

按配方配制金银花蛹虫草培养基，金银花蛹虫草培养基配方为：去皮马铃薯200g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、琼脂20g、蛹虫粉5g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁3g、维生素B₁10mg、金银花混合粉末50g、纯净水定容到1L、PH5.8，其中金银花粉末为：金银花的茎、叶、或/和花烘干，粉碎，过60目筛。

将配制好的金银花蛹虫草培养基分装在玻璃试管中塞好棉塞，置高压锅中，在121℃下保持30min进行灭菌；冷却后接入5％蛹虫草母种，培养7天(培养条件：20-22℃恒温避光培养7d)，即为金银花蛹虫草一级菌种。

制备实施例3

按配方配制蛹虫草培养基，蛹虫草培养基配方为：去皮马铃薯200g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、琼脂20g、蛹虫粉5g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁3g、维生素B₁10mg、金银花混合粉末80g、纯净水定容到1L、PH5.8，金银花混合粉末为：其中金银花粉末为：金银花的茎、叶、或/和花烘干，粉碎，过60目筛。

将配制好的蛹虫草培养基分装在玻璃试管中塞好棉塞，置高压锅中，在121℃下保持30min进行灭菌；冷却后接入5％蛹虫草母种，培养7天(培养条件：20-22℃恒温避光培养7d)，即为蛹虫草一级菌种。

比较例4

按照制备实施例1的配方配制蛹虫草培养基，区别仅在于其中不含有金银花混合粉末，配方为：去皮马铃薯200g、葡萄糖10g、蛋白胨 10g、琼脂20g、蛹虫粉5g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁3g、维生素B₁10mg、纯净水定容到1L、PH5.8。

按实施例1的培养条件进行比较例4蛹虫草一级菌种的制备。

实施例5制备实施例1～3和比较例4的一级菌种的出草培育

使用制备实施例1～3和比较例4的一级菌种分别制作液体菌种，注射到蚕蛹体内，接种量为每个蚕蛹注射0.01-0.05ml所述蛹虫草菌种，做出草培育，培育条件为16℃-18℃下避光培养13天左右，蚕蛹气门有白色菌丝时转到20-22℃光照，湿度控制在65％以上，进行培养40天左右。

测定菌丝的生长状况和生长速度，测定的结果如表1，不同制备例蛹虫草菌种的外观图片见图1：

表1制备实施例1～3和比较例4制备的一级菌种的菌丝生长状况和生长速度

由图1可以看出，图1A中使用含2％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种菌丝体粗壮且浓密，色泽金黄；图1B中使用含 5％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种菌丝体较细，较浓密，色泽金黄；图1C中使用含8％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种菌丝体较细，较稀疏，且多矮小，色泽金黄；图1D 中使用不含金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种菌丝体多矮小，稀疏、气生丝多，色泽金黄。当使用适当含量(2～5％W/V)的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种，其菌丝体外观也更好、更强壮。

由上述结果可见，本发明通过在蛹虫草培养基中添加了金银花粉末，不仅不易感染杂菌，出菌率高，而且菌丝生长速度快；有利于培养优质的蛹虫草菌种。同时当培养基中的金银花混合粉末选择2％W/V时，菌丝体相对最粗壮，生长速度更快。

菌丝健壮程度和生长趋势的差异显示了菌种的形态状况，反映了菌种之间的种性差异，菌株气生菌丝增多、生长速度显著减慢及菌丝瘦弱、长势差等，说明菌株性能差，而菌种形态及生长特征体现了该菌种性能。因此本发明添加了2％-5％W/V的金银花混合粉末的培养基制备的蛹虫草菌种具有优良的性能，可以为大规模培养蛹虫草提供良好的菌种条件。

实施例5制备实施例1～3和比较例4制备的蛹虫草一级菌种各活性成分检测

本实施例使用常规测量方法检测制备实施例1～3制备的蛹虫草一级菌种和野生冬虫夏草中各活性成分含量，检测出的各成分和含量见表 2：

表2本发明制备的蛹虫草和比较例4一级菌种和野生冬虫夏草中各活性成分及含量

本发明制备的蛹虫草菌种由于在培养基中添加了金银花粉末，在培养的蛹虫草一级菌种中产生了虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化酶 (SOD)、腺苷等活性成分，虫草素、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷其含量水平不仅超过了比较例4中使用常规培养基培养的蛹虫草菌种中的含量，还远远超过了野生冬虫夏草中各活性成分的含量，而制备例 3的菌种虫草多糖含量远远高于比较例4的蛹虫草菌种含量，也远远高于野生冬虫夏草中的含量，因此本发明制备的优质的蛹虫草菌种能为后续大规模培养蛹虫草提供良好的条件。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种蛹虫草菌种的制备方法，其中，所述制备方法包括：

步骤(1)制备蛹虫草培养基，所述蛹虫草培养基中含有金银花粉末，所述金银花粉末为干燥粉碎的金银花茎、叶、和/或花，所述蛹虫草培养基由20％W/V的去皮马铃薯、1％W/V的葡萄糖、1％W/V的蛋白胨、0.05％W/V的蛹虫粉、0.05％W/V的磷酸二氢钾、0.03％W/V的硫酸镁、0.001％W/V的维生素B₁、2％W/V的琼脂以及2％～8％W/V的所述金银花粉末和余量的水组成，所述金银花粉末过60目筛，所述培养基pH为5.8；

步骤(2)在所述步骤(1)制备的蛹虫草培养基中接种蛹虫草母种，培养得到蛹虫草菌种。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述蛹虫草培养基中金银花粉末含量为2～5％W/V。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中接种蛹虫草母种量为5％W/V，避光培养7天。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中培养温度为6℃～30℃，空气相对湿度保持在60％～70％。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中培养温度为20-22℃。

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