CN108260476B - 一种羊肚菌菌种分离的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于菌种分离技术领域，公开了一种羊肚菌菌种分离的方法，营养袋的一面扎孔，放置于羊肚菌生长附近，扎孔向地面放置；2‑3天后，待羊肚菌菌丝穿过营养袋扎孔，长入营养袋培养基中后，将营养袋取走；营养袋表面消毒，从扎孔处取麦粒，接种到平板培养基；培养皿置于培养箱中避光培养，培养温度为23℃；3‑4天后，待长出羊肚菌丝后，挑取绿豆粒大小的无污染菌种块，转接到新的平板培养基上，待菌种纯化后，再转接入斜面培养基上培养，得羊肚菌菌种。本发明分离羊肚菌菌种，成功率高达82.69％，污染率仅为17.31％，仅通过1‑2次转接即可，15天即可获得羊肚菌菌种，平均可减少2‑3次的转接次数，可缩短近10天的时间。

Description

一种羊肚菌菌种分离的方法
技术领域
本发明属于菌种分离技术领域，尤其涉及一种羊肚菌菌种分离的方法。
背景技术
羊肚菌(Morchella esculenta)，隶属子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Pezizomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)，俗称羊肚蘑、网兜蘑。它已被公认为是一种珍贵的食药用大型真菌。目前，羊肚菌菌种分离的方法主要有子实体组织分离法、孢子分离法和羊肚菌基脚土分离法。组织分离法是指采用羊肚菌菌柄或菌盖组织进行分离菌种，但是，由于羊肚菌的子实体中空、组织结构较薄、凹凸不平，杂菌较多，分离过程要求极其精细，分离的结果往往污染率较高，必须进行反复、繁锁的分离提纯工作，才能获得纯菌丝体；孢子分离法是通过采集羊肚菌孢子，制备无菌孢子液，并将其稀释成一定浓度。然后在平板或试管斜面培养基上培养单孢子菌落，由于在孢子形成阶段经过减数分裂过程，发生基因的分离和重组，获得的单孢子菌种不能保证能否结实。还必须将不同单孢子菌落的菌丝进行融合获得双核菌丝菌种，再进行双核菌丝的分离提纯、鉴定等，操作十分复杂；基脚土分离法是指取羊肚菌生长周围5cm范围内的土壤，接种到培养基上分离菌种，由于土壤中杂菌较多，分离结果往往污染率较高，必须经过多次反复分离提纯，操作难度大。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有分离方法往往污染率较高，需要反复分离提纯多次，分离，获得的菌种还需进行复杂的菌丝融合，提纯、栽培鉴定等，程序多、操作复杂、耗时较长等。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种羊肚菌菌种分离的方法。
本发明是这样实现的，一种羊肚菌菌种分离的方法，所述羊肚菌菌种分离的方法包括：
步骤一，营养袋的一面扎孔，放置于羊肚菌生长附近，扎孔向地面放置；
步骤二，2-3天后，待羊肚菌菌丝穿过营养袋扎孔，长入营养袋培养基中后，将营养袋取走；
步骤三，营养袋表面消毒，从扎孔处取麦粒，接种到平板培养基；
步骤四，培养皿置于培养箱中避光培养，培养温度为23℃；
步骤五，3-4天后，待长出羊肚菌丝后，挑取绿豆粒大小的无污染菌种块，转接到新的平板培养基上，待菌种纯化后，再转接入斜面培养基上培养，得羊肚菌菌种。
进一步，所述步骤一中孔与孔间隔1cm，每排扎7-8个孔，每排间间隔1cm。
本发明的另一目的在于提供一种所述羊肚菌菌种分离的方法使用的羊肚菌母种培养基，所述羊肚菌母种培养基由A：马铃薯200g去皮、煮汁，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，水1000mL组成；
羊肚菌母种培养基或为B：蛋白胨20g、琼脂20g、葡萄糖20g、小麦粉5.0g、维生素E2粒、维生素B15粒及水1000mL组成，A、B两种配方，任选一种即可。
进一步，所述羊肚菌母种培养基的制备方法包括：
培养基121℃下高压灭菌30min，将灭菌后的培养基倒入直径75mm的培养皿中，制成平板培养基，备用。
本发明的另一目的在于提供一种所述羊肚菌菌种分离的方法使用的羊肚菌营养袋，羊肚菌营养袋由小麦70％，谷壳19％和糖1％(重量比)组成。
进一步，所述羊肚菌营养袋的制备方法包括：小麦、谷壳预湿后，拌入糖，混匀，水分控制在65％，采用12*24cm，厚4丝的聚丙烯袋装袋，装袋后121℃下灭菌3h。
本发明的优点及积极效果为：通过从羊肚菌营养袋中分离羊肚菌菌种的方法，是利用羊肚菌生长季节温度相对较低，杂菌生长慢、数量少，而羊肚菌菌丝在此温度下可正常生长，其生长蔓延速度较快的特点。羊肚菌菌丝一般在2天左右即可生长蔓延到营养袋内，此时采集营养袋分离羊肚菌菌种。可有效降低污染，提高分离效率。本发明分离羊肚菌菌种，成功率高达82.69％，污染率仅为17.31％，仅通过1-2次转接即可，15天即可获得羊肚菌菌种，平均可减少2-3次的转接次数，可缩短近10天的时间；可节省近三分之一的劳务和材料。操作简单，仪器设备、技术条件等要求不高，便于运用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的羊肚菌菌种分离的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明利用羊肚菌生长季节温度相对较低，杂菌生长慢、数量少，而羊肚菌菌丝在此温度下可正常生长，其生长蔓延速度较快的特点。具有操作简单、技术要求不高、分离成功率高、污染率低等优点。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的羊肚菌菌种分离的方法包括以下步骤：
S101：羊肚菌母种培养基制作：A：马铃薯200g(去皮、煮汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，水1000mL；B：蛋白胨20g，琼脂20g，葡萄糖20g，小麦粉5.0g，维生素E 2粒，维生素B15粒，水1000mL。上述两种配方培养基121℃下高压灭菌30min，在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入直径75mm的培养皿中，制成平板培养基，备用；
S102：羊肚菌营养袋制作：配方：小麦70％，谷壳19％，糖1％；小麦、谷壳预湿后，拌入糖，混匀，水分控制在65％左右，采用12*24cm，厚4丝的聚丙烯袋装袋，装袋后121℃下灭菌3h；
S103：放置营养袋：将营养袋的一面用消过毒的铁钉扎三排孔，孔与孔间隔1cm，每排扎7-8个孔，每排间间隔1cm；将扎好孔的营养袋放置于羊肚菌生长的附近，扎孔迎向地面放置；
S104：取样：2-3天后，待羊肚菌菌丝穿过营养袋扎孔，长入营养袋培养基中后，将整个营养袋取走，带回实验室；
S105：接种：将取样回来的营养袋表面消毒后，在超净工作台上从扎孔处取麦粒，接种到平板培养基中间，整个接种过程中要做到无菌操作；
S106：培养：接种后，将培养皿置于培养箱中避光培养，培养温度为23℃；
S107：转接：3-4天后，羊肚菌菌丝开始大量生长，选取长势好、无污染或污染小的平板，从中挑去绿豆粒大小的菌种块，转接到新的平板培养基上，待菌种纯化后，再转接入斜面培养基上(培养基同上述母种培养基)培养，培养条件同上，得羊肚菌菌种。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1：
第一步：羊肚菌母种培养基制作
A马铃薯综合培养基：马铃薯200g(去皮、煮汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，水1000mL。马铃薯去皮、切块，加入一定量水，文火煮汁30min，过滤、取汁液，再汁液中加入琼脂，文火煮融后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁，溶解后，加水补足1000mL，趁热分装，121℃下高压灭菌30min后，在超净工作台上将灭菌后的培养基趁热倒入直径75mm的培养皿中，制成平板培养基，备用。
B蛋白胨培养基：蛋白胨20g，琼脂20g，葡萄糖20g，小麦粉5.0g，维生素E 2粒，维生素B15粒，水1000mL。再锅中倒入适量水，加入琼脂煮融后，再加入蛋白胨煮融，之后加入葡萄糖、小麦粉、维生素等，溶解后，不足水分后。趁热分装，121℃下高压灭菌30min，在超净工作台上将灭菌后的培养基趁热倒入直径75mm的培养皿中，制成平板培养基，备用。
上述两种培养基，任选一种即可。
第二步：羊肚菌营养袋制作
配方：小麦70％，谷壳19％，糖1％。
小麦、谷壳预湿后，拌入糖，混匀，水分控制在65％左右，采用12*24cm，厚4丝的聚丙烯袋装袋，装袋后121℃下灭菌3h，冷却，得羊肚菌营养袋。
第三步：放置营养袋
将营养袋的一面用消过毒的铁钉(2寸铁钉，即长50mm，直径3.4mm的铁钉)扎三排孔，孔与孔间隔1cm，每排扎7-8个孔，每排间间隔1cm；将扎好孔的营养袋放置于羊肚菌生长的附近，扎孔迎向地面放置。
第四步：取样
营养袋放置2-3天后，待羊肚菌菌丝穿过营养袋扎孔，长入营养袋培养基中后，将整个营养袋取走，带回实验室。
第五步：接种
将取样回来的营养袋表面消毒后，在超净工作台上从扎孔处取麦粒，接种到平板培养基中间，每个平板培养基接种一颗麦粒，整个接种过程中要严格按照无菌操作要求进行。
第六步：培养
接种后，将培养皿置于培养箱中避光培养，培养温度为：23℃，空气相对湿度60-70％。
第七步：转接
培养3-4天后，羊肚菌菌丝开始大量生长，选取长势好、无污染或污染小的平板，从中挑去绿豆粒大小的菌种块，转接到新的平板培养基上，同第六步培养方法培养，待菌种纯化后，再转接入斜面培养基上(培养基同上述母种培养基)培养，培养条件同上，得羊肚菌母种。
第八步：结果鉴定
严格按照上述不走分离羊肚菌菌种，一般通过1-2次转接即可得到无污染、纯化的羊肚菌菌种，整个过程仅需要15天左右即可完成，获得羊肚菌菌种。实施实例统计表明：通过本方法分离羊肚菌菌种，成功率达82.69％，污染率仅为17.31％，缩短近10天的时间；可节省近三分之一的劳务和材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种羊肚菌菌种分离的方法，其特征在于，所述羊肚菌菌种分离的方法包括：
步骤一，营养袋的一面扎孔，放置于羊肚菌生长附近，扎孔向地面放置；
步骤二，2-3天后，待羊肚菌菌丝穿过营养袋扎孔，长入营养袋培养基中后，将营养袋取走；
步骤三，营养袋表面消毒，从扎孔处取麦粒，接种到平板培养基；
步骤四，培养皿置于培养箱中避光培养，培养温度为23℃；
步骤五，3-4天后，待长出羊肚菌菌丝后，挑取绿豆粒大小的无污染菌种块，转接到新的平板培养基上，待菌种纯化后，再转接入斜面培养基上培养，得羊肚菌菌种；
所述羊肚菌营养袋的制备方法包括：小麦、谷壳预湿后，拌入糖，混匀，水分控制在65％，采用12*24cm，厚4丝的聚丙烯袋装袋，装袋后121℃下灭菌3h；所述羊肚菌的母种培养基按质量计为A；由马铃薯200g去皮、煮汁、葡萄糖20g、琼脂20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g及水1 000mL组成；
所述羊肚菌的母种培养基按质量计或为B；由蛋白胨20g、琼脂20g、葡萄糖20g、小麦粉5.0g、维生素E 2粒、维生素B1 5粒及水1 000mL组成。
2.如权利要求1所述的羊肚菌菌种分离的方法，其特征在于，所述步骤一中孔与孔间隔1cm，每排扎7-8个孔，每排孔间隔1cm。
3.一种如权利要求1所述的羊肚菌菌种分离的方法，其特征在于，所述羊肚菌的母种培养基的制备方法包括：
母种培养基在121℃下高压灭菌30min，将灭菌后的培养基倒入直径75mm的培养皿中，制成平板培养基，备用。
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