CN100374541C - 通过降低培养基的水活度生产杀虫真菌液体种子和分生孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过降低培养基的水活度生产杀虫真菌液体种子和分生孢子的方法，通过在液体发酵的稳定生长期前调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到包含杀虫真菌芽生孢子的发酵液作为液体种子，并可进一步进行固体发酵制备得到杀虫真菌分生孢子。本发明方法制备的优质液体种子最大生物量显著增加，产生的芽生孢子耐热、耐紫外辐射能力、毒力均明显提高。制备的分生孢子产孢量显著增加，耐热能力、耐紫外辐射能力和对目标害虫的毒力均明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及杀虫真菌液体种子和分生孢子的制备方法。
背景技术
杀虫真菌是一类重要的害虫生防微生物，菌种涉及接合菌亚门、半知菌亚门、子囊菌亚门和担子菌亚门。其中半知菌亚门的丝孢类真菌如白僵菌、绿僵菌、拟青霉、轮枝菌等是目前国内外用于害虫防治的重要杀虫真菌，已有多种商品制剂注册，用于防治同翅目、鳞翅目、鞘翅目、直翅目等许多重要的农林害虫，市场规模日益扩大，形成了良好的社会效益和经济效益。
真菌杀虫剂的有效成分主要是真菌的繁殖体孢子，制备优良的孢子粉是形成制剂的前提。真菌孢子粉的制备主要经历了液体深层发酵、固体发酵和液固两相发酵。液体深层发酵主要产生的是芽生孢子，优点是制备便利、产量大，缺点是芽生孢子细胞壁薄，抗逆性能低，贮存性能差；固体发酵产生分生孢子，但存在制备周期长，条件难以控制，产生成本高；液固两相制备工艺主要是利用液体发酵制备芽生孢子和菌丝体，然后转接固体发酵制备分生孢子，从而大大缩短了制备周期，提高了产量，目前被很多国家(尤其是发展中国家)采用。如我国利用液固两相法制备球孢白僵菌分生孢子的工艺已较为成熟。
然而，目前杀虫真菌发酵工艺的目标主要集中在提高孢子粉的产量上，而忽视了发酵条件对孢子生理状态的影响，结果制备的孢子粉“高产不高质”，存在抗逆性能差、不耐贮存，制剂加工性能和商品化性能低等不足。可见，在提高发酵产量的基础上，改良孢子的抗逆、耐热、贮存和毒力等质量性能，对促进真菌杀虫剂的产业具有重要价值。
已有研究表明，适当降低培养基的水活度，可促进真菌胞内小分子量的多元醇如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、海藻糖等的积累，提高真菌的抗逆性能(耐干旱、耐贮藏、耐高温)和毒力。但由于降低培养基的水活度，在液体培养条件下可明显延迟生长速率，延长发酵周期；在固体条件下不仅延迟了菌体生长，而且产量降低明显(甚至比正常水活度条件下的产量降低1000倍以上)。
目前，利用该方法制备杀虫真菌孢子仅有一例报道，即美国农业部利用KCl调整培养基的水活度进行液体发酵制备玫烟色拟青霉芽生孢子(专利号：US5968808)。而利用水活度调节进行固体发酵和液固两相法发酵制备提高孢子质量和产量的方法，尚无实际应用的报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的一个目的在于提供一种杀虫真菌液体种子的制备方法，其通过适时调节液体培养基水活度而发酵制备优质液体种子。
本发明的再一目的在于提供一种杀虫真菌分生孢子的制备方法，其通过液固两相发酵，在液体培养期间降低培养基的水活度制备液体种子，再进行固体发酵，制备分生孢子。
本发明的另一个目的在于提供一种高产、高质(抗逆、耐贮藏、高毒力)的杀虫真菌分生孢子。
本发明的还一个目的在于提供一种高产、高质(抗逆、耐贮藏、高毒力)的杀虫真菌液体种子。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种杀虫真菌液体种子的制备方法，其包括下述步骤：
将杀虫真菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长初始期、生长延滞期和/或对数生长期，调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到含杀虫真菌芽生孢子的液体种子。
根据本发明的另一方面，提供了一种杀虫真菌分生孢子的制备方法其包括下述步骤：
1)杀虫真菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长初始期、生长延滞期和/或对数生长期，调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到含杀虫真菌芽生孢子的液体种子；
2)将上述步骤中制备的液体种子接种至固体培养基，通过固体发酵培养制备得到杀虫真菌分生孢子。
以上所述芽生孢子(芽孢子)是从一个细胞以出芽方式形成的无性孢子，芽生孢子在一定条件下又能萌发成单核菌丝或双核菌丝。
以上所述分生孢子是由菌丝的一部分转变成分生孢子梗，由分生孢子梗生出的孢子，分生孢子在适宜条件下又能萌发成单核菌丝或双核菌丝。
本发明方法中，降低液体培养基水活度的方法为向培养基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl、KCl或葡萄糖等物质，优选向培养基中加入甘油或PEG200，最优选为甘油。
本发明所述的方法适用于现有技术中所有的杀虫真菌，其中优选为丝孢类真菌，例如白僵菌、绿僵菌、拟青霉、轮枝菌等。
在本发明的一个较佳实施例中，本发明制备液体种子和分生孢子的方法依次通过以下步骤实现：1、菌株活化与培养；2、杀虫真菌液体种子的制备；3、固体发酵及分生孢子收集。
在步骤1中，首先将杀虫真菌的保存菌株于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7，pH7.0左右。
在步骤2中，将由步骤1得到的活化菌株定量接种到装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量转接到发酵罐发酵培养。在液体发酵的不同阶段，通过流加方式加入一定量的灭菌甘油、PEG200、NaCl或葡萄糖等物质，调节培养基水活度至Aw 0.98～0.96，继续培养至稳定生长期。步骤2也可以直接以摇瓶培养的液体种子进行固体发酵，在摇瓶培养的稳定生长期前通过添加灭菌甘油、PEG200、NaCl或葡萄糖等物质降低培养基水活度至0.98～0.96，继续培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为：米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。培养基的水活度利用水活度测定仪(AquLab LITE)检测。
在步骤3中，将生长稳定期的液体种子接种固体发酵培养基，接种比例为1∶1.5。然后进行固体反应器培养或浅盘发酵。发酵温度(品温)控制在25±1℃，72小时之内相对湿度在95％以上，并通气培养，避免搅动。72-120小时降低相对湿度至75％左右，并进行光照培养，待大量产孢后，于30℃进行干燥处理。定量取样检测含水量和产孢量。含水量测定利用水分快速测定仪(SH10A)，产孢量测定如下：定量称取培养基质于一定体积的0.05％Tween-80溶液中，充分分散后，用血球计数板测定孢悬液的浓度，重复3次。然后根据发酵基物培养基含水量，计算5％含水量条件下的产孢量(个/g)。干燥后的基物利用孢子分离设备(MycoHarvester)收集孢子，收集的孢子纯度达1.0×1011孢子/克(含水量5％左右)。固体发酵培养基配方：米粉50％，麦麸20％，谷壳30％。
步骤3中的产孢量测定结果表明，低水活度来源的液体种子接种固体发酵后，分生孢子产量比正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵后分生孢子(对照)产量明显提高；抗逆性和生物测定表明，步骤3中制备的分生孢子耐紫外辐射能力和耐热能力显著增强，毒力明显高于对照。
本发明的优点在于：
1、本发明提供的杀虫真菌孢子制备方法，可通过在液体种子发酵过程中适时降低培养基的水活度，不仅使得杀虫真菌在液体培养条件下的生长速率提高，发酵周期缩短；而且与正常水活度下培养的液体种子相比，本发明的液体种子在固体培养条件下产孢量和活孢率均有所提高。
2、本发明提供的液体种子显著提高了菌株生物量的积累，耐紫外辐射能力、耐热能力和毒力均显著高于正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子。
3、该液体种子接种固体发酵培养基发酵制备的分生孢子，与对照相比，分生孢子产量、耐紫外辐射能力、耐热能力和毒力均明显提高。
为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
附图说明
图1为本发明一个实施例中不同初始水活度培养条件下的菌体生长规律；
图2为本发明另一实施例中不同初始水活度培养条件下的菌体生长规律；
图3为本发明又一实施例中不同生长阶段降低水活度对菌体生长的影响，其中，1为初始水活度为0.96，2为延滞期降低培养基水活度至0.96，3为对照(正常水活度培养，水活度大于0.99)；
图4为本发明又一实施例中在对数生长期降低水活度对菌体生长的影响，其中，1为对照(正常水活度培养，水活度大于0.99)，2为培养初始水活度为0.96；3为在对数生长期降低水活度至0.96。
图5为本发明又一实施例中在稳定生长期降低水活度对菌体生长的影响，其中，1为对照(正常水活度培养，水活度大于0.99)，2为培养初始水活度为0.96；3为在生长稳定期降低水活度至0.96。
发明的具体实施方式：
本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。
菌体生物学特性的测定方法
1、萌发率测定
将待测孢子用0.05％Tween-80配成107个/mL孢悬液，吸取100μL加入到1/4SDAY平板上，涂布接种，置于26℃恒温培养箱培养，24小时后取样显微镜镜检萌发率，当芽管长度达孢子直径时视为孢子萌发。每个重复检测100个孢子以上，重复3次。相对萌发率的计算方法如下：
2、耐紫外辐射能力测定
将收集的芽生孢子或分生孢子用0.05％Tween-80配成107个/mL孢悬液，吸取50μL置于灭菌盖玻片上，在超净工作台上用8W紫外灯(灯管与盖玻片间距为20cm)照射40min后，转入装有定量灭菌0.05％Tween-80的小三角瓶中，暗处理30min后，恒温摇床培养(26℃，180rpm)24小时，测定其萌发率，重复3次。
3、耐热力检测
将收集的芽生孢子或分生孢子用0.05％Tween-80配成107个/mL孢悬液，吸取1mL置于1.5mL灭菌离心管中离心，去掉上清液，置于50℃恒温水浴锅中热激1hr后，测定其萌发率，重复3次。
4、生物学活性测定
选择桃蚜进行生物测定。方法如下：120mm玻璃培养皿中垫上灭菌滤纸，放上擦干净的甘蓝叶片，用毛笔挑取30头生殖盛期的桃蚜无翅成虫，在26℃下繁殖48小时后取出，每片甘蓝叶上可产有大小一致的若蚜30～50头，待其再生长3天后，采用带虫浸虫法，将孢悬液浓度为107个/mL接种，然后转接到保鲜的新鲜甘蓝叶片，在25±1℃，12L/12N光照条件下培养，以0.05％Tween-80为对照。48小时后开始统计死亡率，统计结果用SPSS软件计算致死中时(LT50)。
液体种子的制备及液体种子的生物学特性
【实施例1】
一、菌株活化及培养
将保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb0062，分离自感染的菜青虫(Pieris rape)，保存于西南农业大学生物技术中心，也可以从公知途径获得，例如CCTCC AF 93297)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7％，pH7.0左右。
二、液体发酵
将活化菌种定量接种到装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量(1∶10)转接到发酵罐发酵培养。接种后发酵培养液用一定量的灭菌甘油，调节培养基水活度至Aw 0.96(利用水活度测定仪AquLab LITE检测)。继续发酵培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为：米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液体种子生物量测定
在液体发酵过程中定时取样，分离并用清水洗涤菌体，80℃烘干至恒重，分析天平称量，每次取样重复三次。换算成每毫升含有的菌体干重。
不同初始水活度培养条件下菌体生长规律的结果见图1。结果表明，降低培养基初始水活度至Aw 0.96(Aw＝0.96调节水活度所使用的物质为甘油)，生长至稳定期积累的最大生物量0.0324g/mL显著高于对照(Aw大于0.99，0.0259g/mL)，比对照提高25％，但达到最高生物量的时间分别比对照延长了60小时。
四、液体种子的抗逆能力测定
在稳定生长期取样分离芽生孢子进行抗逆性检测，包括耐热性和耐紫外辐射。
结果见表1。结果表明，用甘油调节初始水活度为Aw 0.96培养的芽生孢子，耐热能力和对紫外辐射的耐受能力均显著提高，处理后的孢子相对萌发率分别比对照(初始水活度Aw大于0.99)高出29.33％和48.67％。
表1不同初始水活度下培养的芽生孢子的抗逆性比较
| 处理 | 热激后相对萌发率(％) | 紫外照射后相对萌发率(％) |
| 1 | 36.00±4.58 | 39.33±0.58 |
| 2 | 65.33±3.51 | 88.00±1.00 |
| Ftest | F＝77.44，P＜0.01 | F＝5329，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度(水活度大于0.99)下培养的芽生孢子；处理2为用甘油调节初始水活度为Aw 0.96培养的芽生孢子；每一数值代表3个重复的平均数±标准差。
五、液体种子的毒力测定
生物测定结果见表2。结果表明，初始水活度为Aw 0.96培养的芽生孢子，对桃蚜的毒力显著提高。在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99)缩短了16.18hr。
表2不同初始水活度下培养的芽生孢子对蚜虫的毒力比较
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误差(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 7.2189 | 0.8878 | 11.9449 | 83.76±2.03 | 79.41-88.11 |
| 2 | 0.5248 | 0.9876 | 15.8488 | 67.58±1.82 | 63.92-71.24 |
注：处理1为正常水活度(水活度大于0.99)下培养的孢子；处理2为用甘油调节初始水活度为Aw 0.96培养的孢子。
【实施例2】
一、菌株活化及培养
将保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)来源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7％，pH7.0左右。
二、液体发酵
将活化菌种定量接种到装有100mL液体种子培养基的500ml三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量(1∶10)转接到发酵罐发酵培养。接种后发酵培养液用一定量的灭菌PEG200，调节培养基水活度至Aw 0.96(利用水活度测定仪AquLab LITE检测)。继续发酵培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为：米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液体种子生物量测定
在液体发酵过程中定时取样，分离并用清水洗涤菌体，80℃烘干至恒重，分析天平称量，每次取样重复三次。换算成每毫升含有的菌体干重。
不同初始水活度培养条件下菌体生长规律的结果见表2。结果表明，用PEG200降低培养基初始水活度至Aw 0.96(Aw＝0.96调节水活度所使用的物质为PEG200)，培养240小时所积累的最大生物量(0.0151g/mL)明显低于对照(Aw大于0.99，0.0259g/mL)，比对照降低约42％，所用时间也比对照延长了72小时。
四、液体种子的抗逆能力测定
在稳定生长期取样分离芽生孢子进行抗逆性检测，包括耐热性和耐紫外辐射。
结果见表3。结果表明，用PEG200调节初始水活度为Aw 0.96培养的芽生孢子，耐热能力和对紫外辐射的耐受能力均显著提高，处理后的孢子相对萌发率分别比对照(初始水活度Aw大于0.99)高出27.33％和55.67％。
表3不同初始水活度下培养的芽生孢子的抗逆性比较
| 处理 | 热激后相对萌发率(％) | 紫外照射后相对萌发率(％) |
| 1 | 36.00±4.58 | 39.33±0.58 |
| 2 | 63.33±3.21 | 95.00±2.00 |
| Ftest | F＝71.53，P＜0.01 | F＝4335，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度(水活度大于0.99)下培养的孢子；处理2为用PEG200调节初始水活度为Aw 0.96培养的孢子；每一数值代表3个重复的平均数±标准差。
五、液体种子的毒力测定
生物测定结果见表4。结果表明，用PEG200调节初始水活度为Aw 0.96培养的孢子，对桃蚜的毒力有所提高。在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99)缩短了6.1hr。
表4不同初始水活度下培养的芽生孢子对蚜虫的毒力比较
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误差(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 7.2189 | 0.8878 | 11.9449 | 83.76±2.03 | 79.41-88.11 |
| 2 | 2.5996 | 0.9699 | 8.6020 | 89.86±3.59 | 82.18-97.54 |
注：处理1为正常水活度(水活度大于0.99)下培养的孢子；处理2为用PEG200调节初始水活度为0.96培养的孢子。
【实施例3】
一、菌株活化及培养
将保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)来源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7％，pH7.0左右。
二、液体发酵
将活化菌种定量接种到装有100mL液体种子培养基的500ml三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量(1∶10)转接到发酵罐发酵培养。在液体发酵的延滞生长期(31小时)，通过流加方式加入一定量的灭菌甘油，调节培养基水活度至Aw 0.96(利用水活度测定仪AquLab LITE)，继续培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为：米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液体种子生物量测定
生物量测定结果见图3。结果表明，在液体发酵的生长延滞期降低培养基水活度到Aw＝0.96与正常水活度培养条件(Aw大于0.99)相比，发酵的生物量积累提高了47.1％，达到最大生物量所用时间比初始水活度为0.96处理提前了12小时。
四、液体种子的抗逆能力测定
在稳定生长期取样分离芽生孢子进抗逆性检测，包括耐热性和耐紫外辐射。
结果见表5。结果表明，在发酵生长延滞期降低培养基的水活度为Aw 0.96培养的孢子，耐热能力和对紫外辐射的耐受能力均显著提高，处理后的孢子萌发率分别比对照(初始水活度Aw大于0.99)高出46.67％和4.00％。
表5不同水活度下培养的芽生孢子的抗逆性比较
| 处理 | 热激后的相对萌发率(％) | 紫外照射后的萌发率(％) |
| 1 | 36.00±4.58 | 39.33±0.58 |
| 2 | 82.67±5.69 | 43.33±1.53 |
| Ftest | F＝122.5，P＜0.01 | F＝21.13，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度(水活度大于0.99)下培养的孢子；处理2为用甘油在发酵生长的延滞期(31小时)降低水活度至0.96所培养的孢子；每一数值代表3个重复的平均数±标准差。
五、液体种子的毒力测定
生物测定结果见表6。结果表明，在Bb0062正常水活度培养的生长延滞期降低培养基水活度至AW＝0.96液体培养的孢子，对桃蚜的毒力显著提高。在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时分别比对照(初始水活度Aw大于0.99)缩短了11.06hr。
表6不同水活度下培养的芽生孢子对蚜虫的毒力比较
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误差(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 7.2189 | 0.8878 | 11.9449 | 83.76±2.03 | 79.41-88.11 |
| 2 | 8.7327 | 0.9474 | 9.5276 | 72.70±1.83 | 68.79-76.61 |
注：处理1为正常水活度(水活度大于0.99)下培养的芽生孢子；处理2为用甘油在发酵生长的延滞期(31小时)降低水活度至0.96所培养的芽生孢子。
【实施例4】
一、菌株活化及培养
将保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)来源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7％，pH7.0左右。
二、液体发酵
将活化菌种定量接种到装有100mL液体种子培养基的500ml三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量(1∶10)转接到发酵罐发酵培养。在液体发酵的对数生长期(70小时)，通过流加方式加入一定量的灭菌甘油，调节培养基水活度至Aw 0.96(利用水活度测定仪AquLab LITE)，继续培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为：米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液体种子生物量测定
生物量测定结果见图4。结果表明，在液体发酵的生长对数期降低培养基水活度到Aw＝0.96，发酵的生物量积累分别比正常水活度(Aw大于0.99)和初始水活度为0.96培养条件下积累的生物量提高47.49％和17.9％；达到最大生物量所用时间比初始水活度为0.96处理提前了12小时。
四、液体种子的抗逆能力测定
在稳定生长期取样分离芽生孢子进行抗逆性检测，包括耐热性和耐紫外辐射。
结果见表7。结果表明，在发酵生长对数期降低培养基的水活度为Aw 0.96培养的芽生孢子，耐热能力和对紫外辐射的耐受能力均显著提高，处理后的孢子相对萌发率分别比对照(初始水活度Aw大于0.99)高出14.33％和15.00％(结果见下表)。
表7不同水活度下培养的芽生孢子的抗逆性比较
| 处理 | 热激后的相对萌发率(％) | 紫外照射后的相对萌发率(％) |
| 1 | 36.00±4.58 | 39.33±0.58 |
| 2 | 50.33±2.08 | 54.33±2.08 |
| Ftest | F＝24.3，P＜0.01 | F＝144.6，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的芽生孢子；处理2为在生长对数期降低培养基水活度至0.96培养的芽生孢子；每一数值代表3个重复的平均数±标准差。
五、液体种子的毒力测定
生物测定结果见表8。结果表明，在Bb0062正常水活度培养的芽生孢子比对数生长期降低培养基水活度至AW＝0.96液体培养的芽生孢子，对桃蚜的毒力显著提高。在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99)缩短了18.73小时(结果见下表)。
表8不同水活度下培养的芽生孢子毒力比较
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 7.2189 | 0.8878 | 11.9449 | 83.76±2.03 | 79.41-88.11 |
| 2 | 4.4841 | 0.9471 | 7.0073 | 65.03±2.44 | 59.80-70.26 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的芽生孢子；处理2为在对数生长期降低培养基水活度至0.96培养的芽生孢子。
【实施例5】
一、菌株活化及培养
将保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)来源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7％，pH7.0左右。
二、液体发酵
将活化菌种定量接种到装有100mL液体种子培养基的500ml三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量(1∶10)转接到发酵罐发酵培养。在液体发酵的稳定生长期(144小时)，通过流加方式加入一定量的灭菌甘油，调节培养基水活度至Aw 0.96(利用水活度测定仪AquLab LITE)，继续培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为：米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液体种子生物量测定
生物量测定结果见图5。结果表明，在液体发酵的生长稳定期降低培养基水活度到Aw＝0.96，发酵的生物量积累分别比正常水活度(Aw大于0.99)和初始水活度为0.96培养条件下积累的生物量提高47.87％和18.2％；而且，达到最大生物量所用时间比初始水活度为0.96处理提前了24小时。
四、液体种子的抗逆能力测定
在稳定生长期取样分离芽生孢子进行抗逆性检测，包括耐热性和耐紫外辐射。
结果见表9。结果表明，在发酵生长稳定期降低培养基的水活度为Aw 0.96培养的芽生孢子，耐热能力比对照(初始水活度Aw大于0.99)高出2.33％，对紫外辐射的耐受能力下降了11％。
表9不同水活度下培养的孢子的抗逆性比较
| 处理 | 热激后的相对萌发率(％) | 紫外照射后的相对萌发率(％) |
| 1 | 36.00±4.58 | 39.33±0.58 |
| 2 | 38.33±2.08 | 28.33±0.58 |
| Ftest | F＝0.645，P＞0.05 | F＝544.5，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的芽生孢子；处理2为在生长稳定期降低培养基水活度至0.96培养的芽生孢子；每一数值代表3个重复的平均数±标准差。
五、液体种子的毒力测定
生物测定结果见表10。结果表明，在Bb0062正常水活度培养的生长稳定期降低培养基水活度至AW＝0.96液体培养的孢子，对桃蚜的毒力有一定的提高。在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99)缩短了2.92小时。
表10不同水活度下培养的芽生孢子毒力比较
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 7.2189 | 0.8878 | 11.9449 | 83.76±2.03 | 79.41～88.11 |
| 2 | 6.1779 | 0.9715 | 13.0587 | 80.84±1.88 | 76.81～84.87 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的芽生孢子；处理2为在生长稳定期降低培养基水活度至0.96培养的芽生孢子。
固体发酵及分生孢子的生物学特性
【实施例6】
一、接种
将初始水活度为0.96培养的液体种子(按实施例1制备得到)按1∶2的比例接种固体发酵培养基。固体发酵培养基配方：米粉50％，麦麸20％，谷壳30％。
二、固体发酵
将接种后的固体基质置于双相脉动式固体发酵反应器中发酵，48小时内保持相对湿度在95％以上，品温控制在26±2℃；48～120hr缓慢降低相对湿度至75％，品温控制在26±2℃。发酵结束后，将发酵基物置于27±1℃，相对湿度在75％左右，日光灯光照培养产孢3天。然后置于30℃干燥至含水量8％左右，收集分生孢子。
三、产孢量测定
产孢并干燥后，随机取样，定量称取培养基质于一定体积的0.05％Tween-80溶液中，充分分散，然后用血球计数板测定孢悬液的浓度，3次重复，计算平均产孢量(个孢子/克)。
结果见表11。结果表明，与正常水活度(Aw大于0.99)培养的液体种子相比，将初始水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵，产孢量没有明显差别。
表11低水活度液体种子和正常液体种子对发酵产孢量的影响
| 处理 | 产孢量(10<sup>10</sup>个/g) |
| 1 | 1.20±0.16 |
| 2 | 1.08±0.06 |
| Ftest | F＝1.495，P＞0.05 |
注：处理1为正常水活度下(Aw大于0.99)培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为初始水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后制备的分生孢子。
四、分生孢子活力和抗逆性研究
用孢子收集器(Mycoharvester)从发酵并干燥基物中分离分生孢子，检测孢子纯度为1200×108孢子/克，然后进行活孢率和抗逆性检测。
结果见表12。结果表明，与正常水活度(Aw大于0.99)培养的液体种子(对照)相比，将初始水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵，分生孢子活力得到一定程度的提高，但差异不显著；分生孢子的耐热能力和耐紫外辐射能力则显著高于对照，热激处理和紫外照射处理后的活孢率分别比对照提高了8％和38％。
表12不同水活度液体种子对固体发酵孢子的质量的影响
| 处理 | 活孢率(％) | 热激后的相对萌发率(％) | 紫外照射后的相对萌发率(％) |
| 1 | 90.25±6.53 | 13.33±2.52 | 31.67±2.08 |
| 2 | 95.17±4.49 | 21.33±3.51 | 69.67±2.08 |
| Ftest | F＝1.15，P＞0.05 | F＝10.29，P＜0.05 | F＝499.8，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度下(Aw大于0.98)培养的液体种子接种固体发酵后产生的孢子；处理2为初始水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后制备的孢子；每一数值为3个重复的平均数±标准差。
五、分生孢子毒力测定
生物测定结果见表13。结果表明，初始水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子，对蚜虫的毒力显著提高，在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子)缩短了28.13小时。
表13不同水活度液体种子对固体发酵孢子毒力的影响
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误差(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 2.0992 | 0.9892 | 3.8821 | 111.11±5.19 | 99.98-122.24 |
| 2 | 9.4784 | 0.9699 | 3.4479 | 82.98±3.17 | 76.18-89.78 |
注：处理1为正常水活度下(Aw大于0.99)培养的液体种子接种固体发酵后产生的孢子；处理2为初始水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后制备的孢子。
【实施例7】
一、接种
将在生长延滞期(31小时)降低水活度至0.96后培养的液体种子(按实施例3制备得到)按1∶2的比例接种固体发酵培养基。固体发酵培养基配方：米粉50％，麦麸20％，谷壳30％。
二、固体发酵
将接种后的固体基质置于双相脉动式固体发酵反应器中发酵，48小时内保持相对湿度在95％以上，品温控制在26±2℃；48～120hr缓慢降低相对湿度至75％，品温控制在26±2℃。发酵结束后，将发酵基物置于27±1℃，相对湿度在75％左右，日光灯光照培养产孢3天。然后置于30℃干燥至含水量8％左右，收集分生孢子。
三、产孢量测定
产孢并干燥后，随机取样，定量称取培养基质于一定体积的0.05％Tween-80溶液中，充分分散，然后用血球计数板测定孢悬液的浓度，3次重复，计算平均产孢量(孢子/克)。
结果见表14。结果表明，与正常水活度(Aw大于0.99)培养的液体种子相比，将在液体发酵的延滞生长期降低培养基水活度至0.96培养的液体种子接种固体发酵，产孢量比对照(正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵)相比，没有显著差异。
表14不同水活度液体种子对固体发酵产孢量的影响
| 处理 | 产孢量±标准差(10<sup>10</sup>个/克) |
| 1 | 1.20±0.16 |
| 2 | 1.14±0.05 |
| Ftest | F＝0.33，P＞0.05 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为在生长延滞期(31小时)降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子。
四、分生孢子活力和抗逆性研究
用孢子收集器(Mycoharvester)从发酵并干燥基物中分离分生孢子，检测孢子纯度为1200×108孢子/克，然后进行活孢率和抗逆性检测。
结果见表15。结果表明，与正常水活度(Aw大于0.99)培养的液体种子(对照)相比，在发酵的生长延滞期降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵，分生孢子活力略有提高，但差异不明显；分生孢子的耐热能力和耐紫外辐射能力也明显提高，与对照差异显著，热激处理和紫外照射处理后的活孢率分别比对照提高了21％和26％。
表15不同水活度液体种子对固体发酵孢子质量的影响
| 处理 | 萌发率(％) | 热激后的相对萌发率(％) | 紫外照射后的相对萌发率(％) |
| 1 | 90.25±6.53 | 13.33±2.52 | 31.67±2.08 |
| 2 | 96.36±4.92 | 34.33±2.08 | 57.67±2.52 |
| Ftest | F＝1.09，P＞0.05 | F＝124.0，P＜0.01 | F＝190.1，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度下(Aw大于0.99)培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为在生长延滞期(31小时)降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子。
五、分生孢子毒力测定
生物测定结果见表16。结果表明，在液体发酵生长延滞期降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子，对蚜虫的毒力显著提高，在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子)缩短了36.25hr。
表16不同水活度液体种子对固体发酵孢子毒力的影响
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误差(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 2.0992 | 0.9892 | 3.8821 | 111.11±5.19 | 99.98-122.24 |
| 2 | 1.1667 | 0.9863 | 1.8816 | 74.86±5.82 | 62.38-87.33 |
注：处理1为正常水活度下(Aw大于0.99)培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为在生长延滞期(31小时)降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子。
【实施例8】
一、接种
将在生长对数期(70小时)降低水活度至0.96后培养的液体种子(按实施例4制备得到)按1∶2的比例接种固体发酵培养基。固体发酵培养基配方：米粉50％，麦麸20％，谷壳30％。
二、固体发酵
将接种后的固体基质置于双相脉动式固体发酵反应器中发酵，48小时内保持相对湿度在95％以上，品温控制在26±2℃；48～120h缓慢降低相对湿度至75％，品温控制在26±2℃。发酵结束后，将发酵基物置于27±1℃，相对湿度在75％左右，日光灯光照培养产孢3天。然后置于30℃干燥至含水量8％左右，收集分生孢子。
三、产孢量测定
产孢并干燥后，随机取样，定量称取培养基质于一定体积的0.05％Tween-80溶液中，充分分散，然后用血球计数板测定孢悬液的浓度，3次重复，计算平均产孢量(孢子/克)。
结果见表17。结果表明，与正常水活度(Aw大于0.99)培养的液体种子相比，将在液体发酵对数生长期降低培养基水活度至0.96培养的液体种子接种固体发酵，产孢量比对照(正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵)提高了38％以上。
表17不同水活度液体种子对固体发酵产孢量的影响
| 处理 | 产孢量(10<sup>9</sup>个/g) |
| 1 | 1.20±0.16 |
| 2 | 1.66±0.17 |
| Ftest | F＝11.09，P＜0.05 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为在生长对数期(70小时)降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子。
四、分生孢子活力和抗逆性研究
用孢子收集器(Mycoharvester)从发酵并干燥基物中分离分生孢子，检测孢子纯度为1200×108个孢子/克，然后进行活孢率和抗逆性检测。
结果见图18。结果表明，与正常水活度(Aw大于0.99)培养的液体种子(对照)相比，在发酵的生长对数期降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵，分生孢子活力略有提高；分生孢子的耐热能力和耐紫外辐射能力明显提高，与对照差异显著，热激处理和紫外照射处理后的活孢率分别比对照提高了12.67％和26.33％。
表18不同水活度液体种子对固体发酵孢子质量的影响
| 处理 | 萌发率(％) | 热激后的相对萌发率(％) | 紫外照射后的相对萌发率(％) |
| 1 | 90.25±3.77 | 13.33±2.52 | 31.67±2.08 |
| 2 | 98.33±1.99 | 26.00±2.00 | 58.00±3.61 |
| Ftest | F＝4.20，P＞0.05 | F＝46.58，P＜0.01 | F＝120.0，P＜0.01 |
注：处理1为正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为在生长对数期(70小时)降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子。
五、分生孢子毒力测定
生物测定结果见表19。结果表明，在液体发酵对数生长期降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子，对蚜虫的毒力显著提高，在浓度为1×107孢子/mL下，致死中时比对照(初始水活度Aw大于0.99培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子)缩短了10.27小时。
表19不同水活度液体种子对固体发酵孢子毒力的影响
| 处理 | 卡方 | 相关系数 | 斜率 | 致死中时±标准误差(小时) | 95％置信限(小时) |
| 1 | 2.0992 | 0.9892 | 3.8821 | 111.11±5.19 | 99.98-122.24 |
| 2 | 2.9921 | 0.9658 | 5.0103 | 100.84±6.45 | 87.22-114.45 |
注：处理1为正常水活度下(Aw大于0.99)培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子；处理2为在对数生长期(70小时)降低培养基水活度为0.96培养的液体种子接种固体发酵后产生的分生孢子。
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (8)
1.制备杀虫真菌液体种子的方法，包括下述步骤：
将球孢白僵菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长延滞期和/或对数生长期，调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到含球孢白僵菌芽生孢子的液体种子。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节液体培养基的水活度的方法为向液体培养基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl或葡萄糖。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述调节液体培养基的水活度的方法为向液体培养基中加入甘油或聚乙二醇200。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述调节液体培养基的水活度的方法为向液体培养基中加入甘油。
5.制备杀虫真菌分生孢子的方法，包括下述步骤：
1)将球孢白僵菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长延滞期和/或对数生长期，调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到含球孢白僵菌芽生孢子的液体种子；
2)将上述步骤中制备的液体种子接种至固体培养基，通过固体发酵培养制备得到杀虫真菌分生孢子。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述调节液体培养基的水活度的方法为向液体培养基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl或葡萄糖。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于所述调节液体培养基的水活度的方法为向液体培养基中加入甘油或聚乙二醇200。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述调节液体培养基的水活度的方法为向液体培养基中加入甘油。
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| 害虫防治用玫烟色拟青霉分生孢子粉的干燥工艺优化. 陈宜涛等.菌物系统，第21卷第4期. 2002 * |
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