CN109136139A - 一种马铃薯内生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种马铃薯内生菌及其应用。所述马铃薯内生菌为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，已于2018年4月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC NO.15554。本发明通过将马铃薯块茎浸蘸该菌株的发酵液，达到降低马铃薯中龙葵碱含量的效果。本发明所提供的马铃薯内生菌能显著抑制贮藏过程中马铃薯块茎中的龙葵碱含量的增加，通过将菌种接种于马铃薯块茎，可抑制α‑茄碱和α‑卡茄碱，提高马铃薯的食用安全性。本发明进一步明确了制备所述马铃薯内生菌发酵培养液的最适培养配方和发酵条件，为进一步开发和研制马铃薯生防菌剂提供了可用菌株及理论基础。

Description

一种马铃薯内生菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种马铃薯内生菌及其应用。
背景技术
马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻、玉米之后的第四大粮食作物，是一种世界性经济作物，分布广泛，容易栽培，宜粮宜饲，宜做多种原料，而且营养丰富，粮菜兼用。
受耕地面积、水资源、气候变化等因素变化影响，小麦、水稻、玉米等传统粮食作物继续增产的难度较大。而马铃薯具有适应性广、耐寒、耐旱、耐贫瘠等优势，种植面积扩增潜力大，中国大部分地区的生态条件都可满足马铃薯的栽培生产要求，马铃薯增产潜力远优于小麦、水稻和玉米等传统作物。在不与三大主粮争水抢地的前提下，因地制宜的扩大马铃薯的种植面积，能有效缓解粮食作物生产导致的资源环境生态压力。
马铃薯还是全球公认的全营养食物，具有独特的营养价值：1、脂肪含量低，有利于抑制体重增长、预防肥胖；2、富含膳食纤维，有助于清理肠道、预防消化系统疾病。
然而，马铃薯在采后贮藏过程中，由于贮藏方式不当或受到外界损伤，常伴随着发芽毒变、龙葵碱含量升高等影响人体健康的情况发生，对粮食安全、资源环境压力、居民消费百害而无一利。因此，急需提供一种能够抑制贮藏过程中马铃薯龙葵碱含量升高的方法。
内生菌作为植物组织中巨大的微生物潜在资源，凭借其与宿主复杂密切的代谢关系，越来越受到研究人员的重视，关于内生菌对植物体产生的多种生理影响及作用机制的相关研究已有很多报道。近年来，已经从黄瓜、甜菜根、甘蓝、花生果仁百慕大草的茎、马铃薯的块茎、种子和胚珠、棉花的胚根、棉铃和水稻的叶子及其他植物储藏器官内分离到大量内生菌。目前从植物中分离的内生菌有其独特的生物学作用：固氮、促进植物生长、防治病虫害等。对马铃薯内生菌的研究则主要集中在抗病促生方面，尚未见到关于马铃薯内生菌对龙葵碱生物防治方面的研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于筛选出一株能够高效抑制马铃薯龙葵碱含量升高的微生物菌株，并通过生物防治的方式降低龙葵碱含量升高所带来的危害和损失，从而提高马铃薯的食用安全性和贮藏品质。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明首先提供一种马铃薯内生菌，经鉴定为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，已于2018年4月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC NO.15554。
本发明通过将马铃薯块茎浸蘸该菌株的发酵液，达到降低马铃薯中龙葵碱含量的效果。本发明所提供的马铃薯内生菌能显著抑制贮藏过程中马铃薯块茎中的龙葵碱含量的增加，通过将菌种接种于马铃薯块茎，可抑制α-茄碱和α-卡茄碱，提高马铃薯的食用安全性。
进一步地，经过扩增和测序，本发明所述的马铃薯内生菌的16S rDNA的序列如SEQID NO.1所示。
第二方面，本发明优化了所述马铃薯内生菌的培养条件，提供了一种培养方法，所述方法操作简单，将所述马铃薯内生菌菌株接入液体培养基，摇床振荡培养即可。
作为优选，所述液体培养基以LB培养基为基础培养基，另添加葡萄糖作为碳源，另添加牛肉膏作为氮源。
作为优选，所述液体培养基的初始pH为8。
作为优选，培养温度为28～32℃，和/或，培养时间为38-42h；更优选培养温度为30℃，和/或，培养时间为40h。
更为具体地，所述液体培养基的配方为：LB培养基+1％v/v马铃薯浸汁+葡萄糖10g/L+牛肉膏10g/L。
所述马铃薯浸汁的制备方法为：称取25g马铃薯，研磨，加入到250mL蒸馏水中，28℃，200r/min，震荡1h后，四层纱布过滤得到10％(w/v)的马铃薯浸汁。加入到培养基之后，其含量为1％(v/v)。
第三方面，本发明提供了所述马铃薯内生菌在抑制马铃薯龙葵碱含量升高方面的应用。
进一步地，含有本发明所述马铃薯内生菌，或由其制备而成的产品也属于本发明的保护范围。例如可以是一种生物防治制剂，但并不局限于此。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供的马铃薯内生菌能显著抑制贮藏过程中马铃薯块茎中的龙葵碱含量的增加，通过将菌种接种于马铃薯块茎，可抑制α-茄碱和α-卡茄碱，提高马铃薯的食用安全性。本发明进一步明确了制备所述马铃薯内生菌发酵培养液的最适培养配方和发酵条件，为进一步开发和研制马铃薯生防菌剂提供了可用菌株及理论基础。
附图说明
图1为本发明所述马铃薯内生菌的扫描电镜观察图。
图2为本发明所述马铃薯内生菌的16S rDNA的PCR扩增产物电泳图。
图3为本发明所述马铃薯内生菌基于16S rDNA基因序列构建的系统进化图。
图4为本发明所述马铃薯内生菌在不同碳源下，对龙葵碱的抑制率。
图5为本发明所述马铃薯内生菌在不同氮源下，对龙葵碱的抑制率。
图6为本发明所述马铃薯内生菌在不同培养时间下，对龙葵碱的抑制率。
图7为本发明所述马铃薯内生菌在不同培养温度下，对龙葵碱的抑制率。
图8为本发明所述马铃薯内生菌在不同初始培养pH下，对龙葵碱的抑制率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中，对龙葵碱抑制率的检测方法具体如下：
A、将马铃薯块茎接种所述的内生菌，接种后将马铃薯置于25℃下光照培养，具体为：
挑选外形均匀一致且状态良好的完整马铃薯样品，在清洗晾干后，将样品组在菌液中浸泡10分钟，并设置空白培养基同样进行浸泡。作为阳性对照组，使用常用的马铃薯抑芽剂氯苯胺灵(chloropropham，1-methylethyl-3-chlorophenylcarbamate，CIPC)，按照生产使用剂量(0.01mg CIPC/g Potatoes.)对马铃薯块茎进行施用。待全部样品处理完毕后，将样品置于25℃，100％光照条件下贮藏12天，诱导龙葵碱产生。
B、从马铃薯接种后的第2天开始，每2天测定其龙葵碱含量，得到菌株对龙葵碱的抑制情况。
测定其龙葵碱含量(液相色谱-质谱方法)的方法具体：将马铃薯打碎，用1％甲酸-甲醇(1：1，V:V)超声提取50min，采用C18色谱柱分离，流动相为乙腈-0.1％甲酸(V:V)，等度洗脱，柱温20℃，流速0.3mL/min，以三重四级杆质谱仪在电喷雾正离子化(ESI+AJS)及MRM模式下进行定量。
实施例1
本实施例用于说明可抑制马铃薯总龙葵碱含量增长的马铃薯内生菌的分离纯化与鉴定。
一、马铃薯内生菌的分离、纯化
A、材料：马铃薯品种为荷兰15；
B、消毒：马铃薯块茎消毒采用超纯水超声处理15min，0.01％Tween-20浸泡1min，3％氯酸钠浸泡7min，2.5％硫代硫酸钠浸泡9min，75％酒精浸泡3min，蒸馏水洗涤5次，其中第三次洗涤水取200μL涂布ISP2平板，再用10％碳酸氢钠浸泡10min；
C、分离：将经表面消毒的马铃薯块茎，切好后各取25g样品，用消过毒的研钵进行研磨，后将其转移到锥形瓶中，加入225mL生理盐水，得10-1，进行充分震荡。取1mL转移到15mL离心管中，加入9mL生理盐水，得10-2，进行充分震荡依次进行梯度稀释，分别移取10-1、10-2、10-3、10-4四个浓度梯度的溶液200μL涂布到(1)至(11)号培养基上，于28℃下培养3-5天；
(1)至(11)号培养基分别为：(1)腐殖酸培养基；(2)10％浓度YIM 38培养基；(3)自来水酵母培养基；(4)葡萄糖淀粉培养基；(5)丙酸钠培养基；(6)海藻糖-脯氨酸培养基；(7)纤维素培养基；(8)M-WA培养基；(9)10％浓度营养琼脂；(10)棉籽糖组氨酸培养基；(11)R2A合成培养基；
D、涂布方法：无菌吸管吸取200μL不同浓度梯度稀释液接种在琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将稀释液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上20-30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，于28℃下培养3-5天；
E、观察并挑取外观形态特征不同的单菌落在LB号培养基上平板上划线纯化，经过2-3次点接纯化、转接后，从中选择得到单一菌种；然后将纯化好的菌株转接至LB培养基上，4℃编号保存备用。将以上所得的纯培养物于30％甘油中-80℃冻存。并对分离的单菌落进行菌体形态观察、生理生化分析，并对菌落、菌体或生理生化特征有明显差异的菌株进行16S rDNA序列分析。
二、马铃薯内生菌的鉴定
1、形态鉴定
从马铃薯中分离筛选的内生菌株，命名为NA2-14，在LB培养基中，菌株的平板菌落形态为圆形，扁平，表面光滑、湿润，浅黄色，革兰氏染色阳性。在扫描电镜观察如图1，菌体有内生孢子，呈杆状1.1-1.5μm×2.5-3.5μm(宽×长)。
2、生理生化鉴定
测定生理生化指标的具体实验方法参照R.E.布坎南等《伯杰细菌鉴定手册》和东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》。
初步鉴定为芽胞杆菌(Bacillus)。其生理生化特性见表1。
表1马铃薯内生菌菌株的生理生化特性
注：“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应。
3、分子生物学鉴定：16S rDNA鉴定
采用Chelex-100法(周双清等，2010)提取基因组DNA。用无菌接种环从固体培养基上挑取适量菌体于1.5mL无菌的Eppendorf管中，加入50μL 5％(w/v)的Chelex-100，沸水浴15min，冷却至室温后，12000r/min离心5min，上清转移至另一无菌的1.5mL Eppendorf管中备用，作为PCR模板。细菌16S rDNA基因扩增通用引物27f和1492r，PCR反应体系共25μL，包括2μL DNA模板，12.5μL PrimerSTAR Max高保真酶，27f和1492r引物各1μL，8.5μL灭菌水。反应程序见表2。随后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果(图2)，确认条带是否达到测序要求。16S rDNA的PCR扩增产物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序，序列具体如SEQ ID NO.1所示。根据菌株的16S rDNA序列结果，选择测序良好的一端(约750bp，27f端)，登陆EzTaxon数据库(http://http://www.ezbiocloud.net/)，对测得的序列进行比对。
表2PCR反应程序
注：变性、退火和延伸程序重复27个循环。
引物的碱基序列为：
27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492r:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
根据16S rDNA基因序列在EzTaxon数据库中已注册的16S rDNA序列进行同源相似性比较，从中选择相似性较高且是有效描述的典型菌株的16S rDNA基因序列作为参比对象，用BioEdit进行多序列比对，采用MEGA7软件以临近法进行聚类分析和构建发育树(图3)。结果表明，马铃薯内生菌菌株与Bacillus megaterium这个芽孢杆菌处于同一个分支上，同源性高达93％以上。综合菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌。并将该菌株送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.15554，保藏日期为2018年4月3日。
实施例2
本实施例用于说明对本发明所述马铃薯内生菌最适宜发酵条件的优化。具体为：对实施例1分离出的菌株在发酵过程中的碳源、氮源、培养温度、培养时间、初始pH值等进行了单因素优化试验，实验设计如下：
一、所用材料为荷兰15号马铃薯，随机选择外形均匀一致且状态良好的完整马铃薯块茎，进行发酵条件的优化，单因素设计如下：
碳源：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘露醇。
氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硝酸钾和硫酸铵。
培养时间：20h、40h、60h、80h和100h。
培养温度：15℃、20℃、25℃、28℃和30℃。
初始pH值：5、6、7、8和9。
在LB培养基+1％马铃薯浸汁的基础上，添加不同的碳源、氮源，改变培养时间、培养温度和初始pH，测量其龙葵碱含量，得到不同发酵条件下对龙葵碱抑制率的影响。
所述马铃薯浸汁的制备方法为：称取25g马铃薯，研磨，加入到250mL蒸馏水中，28℃，200r/min，震荡1h后，四层纱布过滤得到10％(w/v)的马铃薯浸汁。加入到培养基之后，其含量为1％(v/v)。
(1)不同碳源对抑制率的影响
以葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘露醇为额外碳源在基础培养基中添加，添加量为10g/L，其它培养条件不变，分别测定菌液抑制率。
(2)不同氮源对抑制率的影响
以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硝酸钾、硫酸铵作为额外氮源在基础培养基中添加，添加量为10g/L，其它培养条件不变，分别测定菌液对龙葵素的抑制率。
(3)不同温度对抑制作用的影响
分别于15℃、20℃、25℃、28℃、35℃条件下对菌株进行发酵培养，其它培养条件不变，分别测定菌液对龙葵素的抑制率。
(4)不同初始pH值对抑制率的影响
分别调节初始pH为5、6、7、8、9，对菌株进行发酵培养，其它培养条件不变，分别测定菌液对龙葵素的抑制率。
(5)不同时间对抑制率的影响
分别对菌株发酵培养20h、40h、60h、80h、100h，它培养条件不变，分别测定菌液对龙葵素的抑制率。
二、结果分析：
(1)不同碳源的优化结果：
碳源是微生物的结构组成物质及生命活动能源，也直接影响着其代谢产物的种类和数量。添加不同额外碳源进行培养，菌液抑制作用结果如图4。可见不同碳源的添加都在一定程度上改变了菌株的抑制率，不添加额外碳源地抑制率在15％左右，葡萄糖对抑制率的提升效果较明显，抑制率接近25％。因此将葡萄糖作为最适添加碳源。
(2)不同氮源的优化结果：
氮源是合成蛋白质、核酸等物质基本元素，微生物的繁殖和代谢都需要氮源。微生物产生各种代谢产物，如酶类中的氨基酸等的构成同样需要培养基成分中的氮源。添加不同氮源对抑制率的影响见图5。可见牛肉膏对抑制率的提升效果最明显，在基础培养基的基础上使抑制率又提高了约32％。因此将其作为添加氮源。
(3)不同培养时间的优化结果：
不同马铃薯块茎诱导时间下的菌株抑制率如图6所示。在本试验诱导条件下，菌株对α-茄碱和α-卡茄碱的总抑制率平均达到25％以上。其中，最高抑制率可达到34.6％。随着块茎培养时间的延长，即龙葵碱诱导时间的延长，菌株的抑制作用逐渐下降。可能是由于随着诱导时间越来越长，块茎产生α-茄碱和α-卡茄碱的速度加快，龙葵碱积累量增多，而抑制龙葵碱产生的菌株代谢产物有限，造成了抑制效果减弱。
(4)不同培养温度的优化结果：
培养温度是影响微生物生长和代谢产物积累的重要因素之一。温度过低，微生物生长缓慢，代谢产物积累较少，影响菌株活性。温度过高会抑制甚至杀灭微生物，同样使代谢产物无法产生。不同培养温度下的抑制率见图7。随着温度的升高，代谢产物积累增加，抑制率随之升高。在30℃左右时抑制率达到最高。温度继续升高，代谢产物积累反而降低，对龙葵碱的抑制效果下降。因此将30℃作为最适培养温度。
(5)不同初始pH的优化结果：
初始pH值会通过培养环境间接影响菌体状态和生物合成途径，影响菌株作用效果。不同初始pH值条件下的菌株抑制率如图8。结果表明初始pH对抑制率的影响作用较小，各组处理抑制率相近。这可能是由于菌株通过自身代谢，对培养基的pH改变作用较大，使各组pH值保持相近。对培养后的菌液进行测定，pH值均在8左右，符合菌株的最适生长pH范围。因此将要8作为初始pH值。
结果表明：(1)对本发明分离的马铃薯内生菌菌株在发酵过程中的碳源、氮源、培养温度、培养时间、初始pH值等进行了单因素优化试验。结果表明各因素最适水平为添加碳源、氮源分别是葡萄糖10g/L和牛肉膏10g/L，温度30℃，初始pH8，培养时间40h。
(2)在本试验龙葵碱诱导条件下，该马铃薯内生菌菌株对30天内马铃薯块茎各阶段的平均抑制率达到25％以上，抑制率随诱导时间的正常逐渐下降。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 一种马铃薯内生菌及其应用
<141> 2018-09-04
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 1
cactctgtca ccttaggcgg ctagctcctt acggttactc caccgacttc gggtgttaca 60
aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 120
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gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt 1140
aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctatgc 1200
atcgttgcct tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa tgcaccgcgg gcccatctgt 1260
aagtgatagc cgaaaccatc tttcaatcat ctcccatgaa ggagaagatc ctatccggta 1320
ttagcttcgg tttcccgaag ttatcccagt cttacaggca ggttgcccac gtgttactca 1380
cccgtccgcc gctaacgtca tagaagcaag cttctaatca gttcgctcga ctgcatgtat 1440
agcagcgccc cgcc 1454
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一种马铃薯内生菌，其特征在于，所述马铃薯内生菌为巨大芽孢杆菌，可抑制马铃薯龙葵碱含量的升高。
2.根据权利要求1所述的马铃薯内生菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.15554。
3.根据权利要求1或2所述的马铃薯内生菌，其特征在于，其16S rDNA的序列如SEQ IDNO.1所示。
4.权利要求1～3任一项所述的马铃薯内生菌的培养方法，其特征在于，将所述马铃薯内生菌菌株接入液体培养基，摇床振荡培养。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基以LB培养基为基础培养基，另添加葡萄糖作为碳源，另添加牛肉膏作为氮源。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基的初始pH为8。
7.根据权利要求4～6任意一项所述的培养方法，其特征在于，培养温度为28～32℃，和/或，培养时间为38-42h；优选培养温度为30℃，和/或，培养时间为40h。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基的配方为：LB培养基+1％v/v马铃薯浸汁+葡萄糖10g/L+牛肉膏10g/L。
9.权利要求1～3任一项所述的马铃薯内生菌在抑制马铃薯龙葵碱含量升高方面的应用。
10.一种生物防治制剂，其特征在于，含有权利要求1～3任一项所述的马铃薯内生菌，或由权利要求1～3任一项所述的马铃薯内生菌制备而成。
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