CN110093283B - 球孢白僵菌菌株及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供球孢白僵菌菌株及其培养方法，涉及微生物领域。该球孢白僵菌，分类命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD‑1株，保藏号为CGMCC NO：16500。球孢白僵菌的培养方法，包括如下步骤：将所述球孢白僵菌通过一级种子培养、二级种子培养和三级种子培养得到三级种子液，将所述三级种子液接种至固态培养基，进行固态发酵，得到球孢白僵菌孢子粉。本发明球孢白僵菌菌株，对小绿叶蝉有显著的致死作用，采用本发明培养方法，在较短的发酵时间内可以获得高产量的球孢白僵菌分生孢子。

Description

球孢白僵菌菌株及其培养方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体地说是涉及到球孢白僵菌菌株及其培养方法。
技术背景
近年来，随着害虫抗药性的增加，生物防治逐渐成为人们的研究热点。球孢白僵菌作为一种广谱性的昆虫病原真菌，可以用于防治多种有害生物。
球孢白僵菌，属于子囊菌门、肉座菌目、虫草科、白僵菌属。球孢白僵菌是国内外广泛用于害虫生物防治的杀虫真菌之一，被认为是最具开发潜力的一种昆虫病原真菌。
球孢白僵菌是广谱性杀虫真菌，国内外研究人员利用球孢白僵菌防治茶叶小绿叶蝉、玉米螟、松毛虫、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔红蜘蛛和蚜虫等农林害虫。特别是对茶叶小绿叶蝉、玉米螟、松毛虫的生物防治，在国内已作为常规手段连年使用。由于球孢白僵菌能有效地控制虫口数量，同时不伤害其他天敌昆虫和有益生物，完全符合有害生物综合治理的宗旨，同时由于其容易大量生产，防治成本较有竞争力，因而其具有广泛的应用前景。
分生孢子(conidiospore)是真菌中常见的一类无性孢子，是生于细胞外的孢子，所以称为外生孢子。分生孢子着生于已分化的分生孢子梗(conidiophore)或具有一定形状的小梗上，也有些真菌的分生孢子就着生在菌丝的顶端。
现有技术中，培养球孢白僵菌的发酵周期长，孢子含量不够高。
发明内容
本发明的目的是提供球孢白僵菌菌株，对小绿叶蝉有显著的致死作用。
本发明的另一目的是提供球孢白僵菌菌株的培养方法，在较短的发酵时间内可以获得高产量的球孢白僵菌分生孢子。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一株球孢白僵菌，分类命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，保藏号为 CGMCC NO：16500。
所述球孢白僵菌的培养方法，包括如下步骤：将所述球孢白僵菌通过一级种子培养、二级种子培养和三级种子培养得到三级种子液，将所述三级种子液接种至固态培养基，进行固态发酵，得到球孢白僵菌孢子粉。
在本发明中，三级种子培养中，发酵培养基含有大米粉10～30g/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖5～20g/L、黄豆饼粉5～20g/L、蚕蛹粉5～10g/L、酵母粉5～10g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、氯化钙0.1～0.5g/L、pH7.0；三级种子培养中，搅拌转速为120～200rpm，通气量和温度控制如下：0h～8h：气液比为0.4～0.6:1、温度为26℃～28℃；8h～24h：气液比为0.8～1.0:1、温度为24℃～26℃；24h～48h：气液比为0.8～1.2:1、温度为24℃～ 26℃。
在本发明中，固态发酵中的固体培养基采用如下方法制备：将大米30～50质量份、玉米粉10～20质量份、葡萄糖1～3质量份、谷壳10～30质量份、麦麸5～20质量份、蚕蛹粉 5～10质量份、豆饼粉2～10质量份和水100～200质量份混合均匀。
在本发明的固态发酵中，三级种子液的接种量为10～15％，固态发酵中换气量、温度和湿度控制如下：0～48h：换气量为0.2～0.4:1、温度为27℃～29℃、湿度为60～70％；48～168h天：换气量为0.4～0.6:1、温度为24℃～26℃、湿度为50～65％；168～216h：换气量为0.4～0.6:1、温度为27℃～29℃、湿度为40～50％。
优选的技术方案中，固态发酵中固体培养基的厚度为5-8厘米。
有益效果：
本发明提供的球孢白僵菌菌株，对小绿叶蝉有显著的致死作用。采用本发明培养方法，在较短的发酵时间内可以获得高产量的球孢白僵菌分生孢子，提高了生产效率，节约了生产成本，为球孢白僵菌的产业化奠定了坚实的基础。由于分生孢子对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有抗性，因此分生孢子含量高，在加工过程中菌体存活率高，获得的制剂有效成分含量高、货架期长、产品质量稳定。
附图说明
图1球孢白僵菌ZD-1株菌落及显微照片。
具体实施方式
本发明中培养基使用的溶剂为水。气液比是指每分钟通气量(m3)与发酵液体积(m3) 之比。换气量是指每分钟通气量(m3)与固体发酵培养基体积(m3)之比。
实施例1球孢白僵菌菌株的筛选及鉴定
(1)球孢白僵菌菌株的筛选
以茶叶小绿叶蝉为试验对象，本实施例介绍了球孢白僵菌ZD-1株的筛选。
供试菌株：XY-201805株、YN-201803株、ZD-1株、KM-4株、ZA-7-3株、B3株、 B822株、PE-55株、PE-23株。
供试虫源：2018年4月上旬至4月下旬，于云南省农业科学研究院茶叶基地采集小绿叶蝉。将采回的小绿叶蝉置于广口瓶内，以带嫩叶和幼芽的新鲜茶树枝条室内饲养。
将各供试菌株分别接种于萨氏培养基SDAY上(萨氏培养基SDAY配方：4％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母粉、2％琼脂)，在25±1℃条件下，培养8天，得到各菌株的孢子。用含有0.05％Tween 80的无菌水洗下孢子，配制成1.0×107个/mL的孢子悬浮液，备用。
选取个体大小一致的小绿叶蝉，考察上述各菌株的孢子悬浮液对小绿叶蝉的致病力。具体方法如下：将小绿叶蝉在孢子悬浮液中浸10s后取出，置于滤纸上吸去多余水分，转入人工饲养盒中。每种孢子悬浮液处理50头试虫，重复3次。以浸含有0.05％Tween 80 的无菌水作为对照，同样条件下正常饲养。饲养过程中，及时将死虫转入无菌培养皿内培养。分别在小绿叶蝉处理后第6天、第9天、第12天统计死亡数，以虫尸上长出可见的菌丝或孢子粉为有效致死。具体结果见表1。
表1不同球孢白僵菌菌株处理后小绿叶蝉的累计死亡率
Figure RE-GDA0002083377790000031
由表1数据可知，各球孢白僵菌孢子对小绿叶蝉均有不同程度的致病力。但ZD-1株的杀虫效果最好，在第12天，其累计死亡率可达95.33％。
(2)鉴定
ZD-1株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长较慢，28℃黑暗条件下培养14天，菌落直径为58～61mm，初期为白色，后逐渐变为浅黄色，绒状到絮状，具同心环纹及放射状纹路；菌落背面米色到浅黄褐色，无水溶性色素。
ZD-1株营养菌丝薄壁，透明、光滑，常见分枝，宽0.7～2.0μm，分生孢子梗直接着生在营养菌丝上，分生孢子簇生于分生孢子梗上，近球形到椭圆形，单孢、薄壁、透明、光滑，23.5～43.2×2.2～4.3μm(见附图1)。
ZD-1株rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，通过序列比对，发现ZD-1株为球孢白僵菌，命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，缩写为球孢白僵菌ZD-1株。
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，已经保藏。
分类命名为：球孢白僵菌
Beauveria bassiana。
参椐的生物材料(株)：ZD-1。
保藏日期为2018年11月19日。
保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC。
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
保藏编号为：CGMCC NO.16500。
实施例2球孢白僵菌ZD-1株的液体发酵培养
本实施例介绍了球孢白僵菌ZD-1株的液体发酵培养。
1、球孢白僵菌ZD-1株孢子活化
将球孢白僵菌ZD-1株斜面种子接种于萨氏培养基SDAY(4％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母粉、2％琼脂)上，在25±1℃培养8天，得到活化后的球孢白僵菌ZD-1株孢子。
2、制备球孢白僵菌ZD-1株一级种子液
在250mL三角烧瓶中，液体萨氏培养基SDAY的装液量50mL，接入上述活化后的球孢白僵菌ZD-1株孢子，使孢子浓度为3×106个/mL。在25±1℃、150rpm条件下，振荡培养36h后，得到孢子含量为30×108个/mL的一级种子液。
其中液体萨氏培养基SDAY含有40g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨和10g/L酵母粉。
3、制备球孢白僵菌ZD-1株二级种子液
在100L发酵罐中，配制含有如下成分的培养基：淀粉10g/L、葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、硫酸镁0.25g/L。溶剂为水。在121℃下灭菌30min，冷却至室温后，按照2.5％的接种量接种本实施例标题2中所得一级种子液，在25±1℃、200rpm、气液比1:1的条件下培养36h，得到二级种子液，孢子含量为1.3×109个/mL。
4、球孢白僵菌ZD-1株三级液体发酵培养
将球孢白僵菌ZD-1株的二级种子液，按照接种量为1％(V/V)分别接入4个3000L发酵罐中进行培养。各发酵罐使用的培养基及培养条件分别如下。
(1)发酵罐1
培养基含有如下成分：大米粉20g/L、葡萄糖10g/L、蔗糖5g/L，黄豆饼粉5g/L、蚕蛹粉5g/L、酵母粉7.5g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.3g/L、pH7.0。溶剂为水。
培养条件：发酵罐搅拌转速120rpm，培养过程中通气量和温度控制如下：0h～8h：气液比为0.4:1、温度26℃；8h～24h：气液比为0.8:1、温度25℃；24h～48h：气液比为0.8:1、温度25℃。
(2)发酵罐2
培养基含有如下成分：大米粉20g/L、葡萄糖10g/L、蔗糖5g/L，黄豆饼粉5g/L、蚕蛹粉5g/L、酵母粉7.5g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.3g/L、pH7.0。溶剂为水。
培养条件：发酵罐搅拌转速150rpm，培养过程中通气量和温度控制如下：0h～8h：气液比为0.5:1、温度28℃；8h～24h：气液比为0.8:1、温度25℃；24h～48h：气液比为1:1、温度25℃。
(3)发酵罐3
培养基含有如下成分：大米粉30g/L、葡萄糖20g/L、蔗糖10g/L、黄豆饼粉10g/L、蚕蛹粉5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.3g/L、pH7.0。溶剂为水。
培养条件：发酵罐搅拌转速150rpm，培养过程中通气量和温度控制如下：0h～8h：气液比为0.5:1、温度28℃；8h～24h：气液比为0.8:1、温度25℃；24h～48h：气液比为1:1、温度25℃。
(4)发酵罐4
培养基含有如下成分：大米粉30g/L、葡萄糖30g/L、蔗糖20g/L、黄豆饼粉20g/L、蚕蛹粉10g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.5g/L、pH7.0。溶剂为水。
培养条件：发酵罐搅拌转速200rpm，培养过程中通气量和温度控制如下：0h～8h：气液比为0.6:1、温度28℃；8h～24h：气液比为1.0:1、温度25℃；24h～48h：气液比为1.2:1、温度25℃。
培养结束后，检测各发酵罐所得孢子含量，结果如表2所示。
表2不同培养基及培养条件对孢子含量的影响
Figure RE-GDA0002083377790000051
Figure RE-GDA0002083377790000061
表2结果表明：
发酵罐1跟发酵罐2比，培养基一样，培养条件不一样。发酵罐2的球孢白僵菌孢子含量一直稳步上升，到44h时达到最高(885×108个/mL)，而发酵罐1在40h达到最高 (332×108个/mL)，发酵罐2的最高孢子含量为发酵罐1的2.67倍。即发酵罐2的结果要优于发酵罐1。
发酵罐2跟发酵罐3比，培养条件一样，培养基不一样。发酵罐3在36h达到最高(503×108个/mL)。发酵罐2的最高孢子含量为发酵罐3的1.76倍，即发酵罐2的结果要优于发酵罐3。
发酵罐2跟发酵罐4比，培养基和培养条件都不一样。发酵罐4在40h达到最高(515×108个/mL)。发酵罐2的最高孢子含量为发酵罐4的1.72倍，即发酵罐2的结果要优于发酵罐4。
综合考虑发酵时间、发酵液中的孢子含量这二个因素，采用发酵罐2的培养基和培养条件，发酵培养44h，得到三级种子液。
实施例3球孢白僵菌ZD-1株的固体发酵培养
本实施例介绍了球孢白僵菌ZD-1株的固体发酵培养。
将固体培养基高温高压灭菌，洁净室浅盘平铺，固体培养基厚7cm，冷却至室温。将球孢白僵菌ZD-1株的三级种子液，均匀接种到各浅盘中进行进一步的发酵培养，各浅盘中的培养基及培养条件分别如下。
浅盘1：
培养基：按照质量份称取大米30份、玉米粉10份、葡萄糖1份、谷壳27份、麦麸 18份、蚕蛹粉8.5份、豆饼粉5.5份，水150份，混合均匀。
培养条件：接种量10％，接种后培养条件控制如下：0～48h：换气量为0.2:1、温度27℃～28℃、湿度为65％；48～168h：换气量为0.4:1、温度24℃～25℃、湿度为55％； 168～216h：换气量为0.4:1、温度27℃～28℃、湿度为45％。
浅盘2：
培养基：按照质量份称取大米30份、玉米粉10份、葡萄糖1份、谷壳27份、麦麸 18份、蚕蛹粉8.5份、豆饼粉5.5份、水150份，混合均匀。
培养条件：接种量为15％，接种后培养条件控制如下：0～48h：换气量为0.3:1、温度 27.5℃～28.5℃、湿度为65％；48～168h：换气量为0.5:1、温度24.5℃～25.5℃、湿度为60％；168～216h：换气量为0.5:1、温度28℃～29℃、湿度为45％。
浅盘3：
培养基：按照质量份称取大米30份、玉米粉11份、葡萄糖2份、谷壳30份、麦麸 20份、蚕蛹粉5份、豆饼粉2份、水150份，混合均匀。
培养条件：接种量为15％，接种后培养条件控制如下：0～48h：换气量为0.3:1、温度 27.5℃～28.5℃、湿度为65％；48～168h：换气量为0.5:1、温度24.5℃～25.5℃、湿度为60％；168～216h：换气量为0.5:1、温度28℃～29℃、湿度为45％。
浅盘4：
培养基：按照质量份称取大米50份、玉米粉10份、葡萄糖3份、谷壳10份、麦麸10份、蚕蛹粉10份、豆饼粉7份、水150份，混合均匀。
培养条件：接种量为15％，接种后培养条件控制如下：0～48h：换气量为0.4:1、温度 28℃～29℃、湿度为70％；48～168h：换气量为0.6:1、温度25℃～26℃、湿度为60％；168～216h：换气量为0.6:1、温度28℃～29℃、湿度为50％。
将各浅盘培养物，在相同工艺条件干燥处理后，采用旋风分离集孢器进行孢子抽提，得到球孢白僵菌孢子粉，取样测定其孢子萌发率(萨氏培养基SDAY，在25±1℃培养24h后测定萌发率，当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。
各浅盘中球孢白僵菌ZD-1株在发酵145h、169h、193h的孢子含量、萌发率结果如下表3所示。
表3固体发酵培养基及培养条件对发酵结果的影响
Figure RE-GDA0002083377790000071
浅盘1跟浅盘2比，培养基一样，培养条件不一样。浅盘2孢子含量最高能达到1150×108个/g，是浅盘1孢子最高含量884×108个/g的1.3倍。即浅盘2的结果要优于浅盘1。
浅盘2跟浅盘3比，培养条件一样，培养基不一样。浅盘3的孢子含量在第8天达到最高为961×108个/g。浅盘2的最高孢子含量为浅盘3的1.2倍，即浅盘2的结果要优于浅盘3。
浅盘2跟浅盘4比，培养基和培养条件都不一样。浅盘4的孢子含量在第8天达到最高为818×108个/g。浅盘2的最高孢子含量为浅盘4的1.41倍，即浅盘2的结果要优于浅盘4。
孢子萌发率，上述4个浅盘的结果都高于90％。最高的萌发率为浅盘2第7天的样品，为98.8％。
综合考虑孢子含量、孢子萌发率这二个因素，浅盘2的培养基和培养条件是最佳的组合。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南星耀生物制品有限公司
<120> 球孢白僵菌菌株及其培养方法
<130> 20190507
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 457
<212> DNA
<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株
<400> 1
gaggtcaacg ttcagaagtt gggtgtttta cggcgtggcc gcgtcggggt tccggtgcga 60
gctgtattac tgcgcagagg tcgccgcgga cgggccgcca ctccatttca gggccggcgg 120
tgtgctgccg gtccccaacg ccgacctccc caaggggagg tcgagggttg aaatgacgct 180
cgaacaggca tgcccgccag aatgctggcg ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat 240
tcactggatt ctgcaattca cattacttat cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatgcca 300
gagccaagag atccgttgtt gaaagttttg attcatttgt tttgccttgc ggcgtattca 360
gaagatgctg gaatacaaga gtttgaggtc cccggcgggc cgctggtcca gtccgcgtcc 420
gggatccctc cgctggttca ccaacggaga ccttgtt 457

Claims (5)

1.一株球孢白僵菌，分类命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，保藏号为CGMCC NO：16500。
2.权利要求1所述球孢白僵菌的培养方法，特征在于包括如下步骤：将权利要求1所述球孢白僵菌通过一级种子培养、二级种子培养和三级种子培养得到三级种子液，将所述三级种子液接种至固体培养基，进行固体发酵，得到球孢白僵菌孢子粉；三级种子培养中，发酵培养基含有大米粉10~30g/L、葡萄糖10~30g/L、蔗糖5~20g/L、黄豆饼粉5~20g/L、蚕蛹粉5~10g/L、酵母粉5~10g/L、磷酸二氢钾0.1~0.5g/L、硫酸镁0.1~0.5g/L、氯化钙0.1~0.5g/L、pH7.0；三级种子培养中，搅拌转速为120~200rpm，通气量和温度控制如下：0h～8h：气液比为0.4～0.6:1、温度为26℃～28℃；8h～24h：气液比为0.8～1.0:1、温度为24℃～26℃；24h～48h：气液比为0.8～1.2:1、温度为24℃～26℃。
3.根据权利要求2所述球孢白僵菌的培养方法，其特征在于：固体发酵中的固体培养基采用如下方法制备：将大米30~50质量份、玉米粉10~20质量份、葡萄糖1~3质量份、谷壳10~30质量份、麦麸5~20质量份、蚕蛹粉5~10质量份、豆饼粉2~10质量份和水100~200质量份混合均匀。
4.根据权利要求3所述球孢白僵菌的培养方法，其特征在于：固体发酵中，三级种子液的接种量为10~15%，固态发酵中换气量、温度和湿度控制如下：0～48h：换气量为0.2～0.4:1、温度为27℃～29℃、湿度为60～70%；48～168h：换气量为0.4～0.6:1、温度为24℃～26℃、湿度为50～65%；168～216h：换气量为0.4～0.6:1、温度为27℃～29℃、湿度为40～50%。
5.根据权利要求4所述球孢白僵菌的培养方法，其特征在于固体发酵中固体培养基的厚度为5-8厘米。
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