CN109628320B - 球孢白僵菌三级培养基及其制备方法 - Google Patents

球孢白僵菌三级培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种球孢白僵菌三级培养基及其制备方法，该球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳20‑30份、麦麸20‑30份、土霉素0.001‑0.01份和水30‑50份。还可以包括KH2PO4。通过在培养基配方及所用水中增加土霉素，杀灭自来水中的大部分微生物，进一步保证白僵菌5‑7天生长期培养基低微生物环境状态，让白僵菌在开放式环境中成优势菌种生长。采用本发明提供的培养基进行三级培养，生产的球孢白僵菌高孢粉最高达2300亿/克。

Description

球孢白僵菌三级培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及白僵菌制备领域，具体为一种球孢白僵菌三级培养基及其制备方法。
背景技术
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为子囊菌类的真菌，可工业化培养生产，利用其产生的分生孢子加工成微生物杀虫剂。白僵菌高孢粉无毒无味，无环境污染，对害虫具有持续感染力，害虫一经感染可连续浸染传播；可寄生15个目149个科的700余种昆虫，对人畜和环境比较安全、害虫一般不易产生抗药性、可与某些化学农药(杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂)同时使用。在中国白僵菌防治最成功的是森林、苗圃、草坪、农田等的蛴螬、玉米螟、松毛虫、茶小绿叶蝉等农林害虫，是二十一世纪首选的绿色环保高效生物杀虫药剂之一。目前市场上生产的白僵菌孢子粉含孢率1000亿/克左右，且产量低，杂菌多，培养基的选择对其有很多的影响。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种球孢白僵菌三级培养基及其制备方法，能够减少杂菌的产生，提高白僵菌产量和质量。
本发明采取的技术方案是，一种球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳20-30份、麦麸20-30份、土霉素0.001-0.01份和水30-50份。
优选地方案中，谷壳25份、麦麸25份、土霉素0.006份、水40份。
进一步地，所述原料还包括KH2PO4。
进一步地，所述KH2PO4加入量为1×10-5～5×10-5份。
进一步地，所述水采用自来水加入土霉素混合而成，加入比例为1kg水中加入0.1-0.2g土霉素。自来水与土霉素混合后放置10-20min后使用。
本发明还涉及制备所述培养基的方法，包括以下步骤：
将谷壳和麦麸进行高温灭菌，然后在无菌环境中混合均匀，混合物料在60℃以下时加部分水混合，混合物料在30℃以下时加入其它原料及白僵菌三级菌种菌液，混合均匀后得到球孢白僵菌接种后的三级培养，即白僵菌固体浅盘扩大培养。谷壳和麦麸分别用编织袋装袋进行常压高温灭菌。
进一步地，第一次加水时，用量为总用水量的2/3，后一次加水时为总用水量的1/3。分量分次加水的目的在于，第一次加水有效降低三级料温，第二次降料温及均匀混合菌液及其它原料。
进一步地，所述三级菌种菌液的加入比例是菌液质量与谷壳麦麸质量比为1：4-6。
本发明还涉及所述的培养基进行三级培养的方法，接种后的三级培养基在培养盘中进行铺料，先在室内培养，温度为26-30℃，湿度90-98％，培养时间为5-7天，待白僵菌长满后，移至开放式环境进行自然干燥，得到含白僵菌的物料。
进一步地，整个培养过程中，温度控制在30℃以下，干燥过程中，增加散照光。
本发明具有以下有益效果：
1.通过在培养基配方及所用水中增加土霉素，杀灭自来水中的大部分微生物，进一步保证白僵菌5-7天生长期培养基低微生物环境状态，让白僵菌在开放式环境中成优势菌种生长。此处无需采取高温高压灭菌，在工厂大批量生产的条件下，进行少量土霉素简单杀灭大部分微生物，低成本消耗。
2.通过培养基配方中增加磷酸二氢钾，在使用最低有效成本情况下，提供白僵菌生长所需的K、P元素。
3.白僵菌最适生长温度是25-28℃，pH6.0-7.0均可，工业化生产具有较强的季节性，在(湖北省)中原地带，常是每年的10月至次年5月生产，为延长生产期尽可能节约成本、高效生产，经过长期试验：每年10月中旬为最早的生产开始阶段，随着全球不断升温，10月中旬温度可高达25℃左右，其它细菌、霉菌同样适宜生长繁殖，为使白僵菌成为优势生长菌种，一方面研发人员不断寻求筛选活性强、抗杂菌能力强的纯野生菌种；另外一方面则需人为为白僵菌生产提供有利环境。本发明通过加入土霉素，杀灭三级扩大培养中的其他竞争微生物，土霉素加入比例也是经过多次试验生产比较，从成本、效益综合因素考虑，最终确定的。
4.对于本配方中的用水量，在中原地带，因地制宜，较适合白僵菌生长的室内湿度是90-98％，在反复试验，经验积累，成功之后得出30-50份水的比例配以25份的谷壳和25份麦麸为最佳比例范围。水用量多了，湿度大，随着生长产热，温度提高，潮湿高温不透气，十分容易烧盘(菌体全部被烧死，生产失败)，水用量少了，谷壳多了，麦麸少了，培养基保水性差，容易生长期缺水，生长停滞，造成低产甚至无产现象。
5.在制备培养基的过程中，水分两次加入，第一次主要是起到冷却和加湿的作用，后一次加入水是为了提高培养基的湿度，并且冲散加入的菌液和其他成分，以达到原料均匀混合的效果。
6.在三级培养的过程中，注意控制料温，不能超过30℃，否则容易引起烧盘；在培养过程中，孢子繁殖在有光照的条件下为多，但如果直射，对白僵菌有一定的杀伤作用，选择散射光，对白僵菌孢子的萌发有促进作用，可以提高萌发率4-5倍或者更多。
7、采用本发明提供的培养基进行三级培养，生产的球孢白僵菌高孢粉平均达1600亿/克，最高达2300亿/克(国家标准为1000亿/克)。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐明本发明。
实施例1：
一种球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳25份、麦麸25份、土霉素0.006份、水40份。
实施例2：
一种球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳20份、麦麸30份、土霉素0.007份、水50份。
实施例3：一种球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳30份、麦麸20份、土霉素0.005份、水30份。
实施例4：一种球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳24份、麦麸26份、土霉素0.0065份、水45份。
实施例5：
一种球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳25份、麦麸25份、土霉素0.006份、水40份和KH2PO42.5×10-5份。
上述实施例中，所述水采用自来水加入土霉素混合而成，加入比例为1kg水中加入0.1-0.2g土霉素。自来水与土霉素混合后放置10-20min后使用。
本发明还涉及制备所述培养基的方法，包括以下步骤：
将谷壳和麦麸进行高温灭菌，然后在无菌环境中混合均匀，混合物料在60℃以下时加部分水混合，混合物料在30℃以下时加入其它原料及白僵菌三级菌种菌液，混合均匀后得到三级培养基。
进一步地，第一次加水时，用量为总用水量的2/3，后一次加水时为总用水量的1/3。进一步地，所述三级菌种菌液的加入比例是1：5。
所述的培养基进行三级培养时，接种后的三级培养基在培养盘中进行铺料，先在室内培养，温度为26-30℃，培养时间为5-7天，待白僵菌长满后，移至开放式环境进行自然干燥，得到含白僵菌的物料。
进一步地，整个培养过程中，温度控制在30℃以下，干燥过程中，增加散照光。
另外，还可以加入0.008-0.012份的蛋白胨，补充氮源，可以确保含孢量的稳定。
对比例：该球孢白僵菌三级培养基，包括按重量份计的以下原料：谷壳25份、麦麸25份、水40份，其中的水为自来水。
实施例及对比例的效果见下表1。
表1
含孢量(亿/克) 活孢率(％) 含水率(％)
实施例1 2236 90 8
实施例2 2114 88 9
实施例3 2098 85 8
实施例4 2187 87 9
实施例5 2305 92 8
对比例 1329 80 10
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种工业化生产球孢白僵菌三级培养基，其特征在于，包括按重量份计的以下原料：谷壳20-30份、麦麸20-30份、土霉素0.001-0.01份和水30-50份； 其中水采用自来水加入土霉素混合而成，加入比例为1kg水中加入0.1-0.2g土霉素；
培养基制备时，具体方法为：
将谷壳和麦麸分别用编织袋装袋进行常压高温灭菌，然后在无菌环境中混合均匀，混合物料在60℃以下时加总用水量的2/3的水混合，混合物料在30℃以下时加入其它原料及白僵菌三级菌种菌液，混合均匀后得到球孢白僵菌接种后的三级培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：谷壳25份、麦麸25份、土霉素0.006份、水40份。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述原料还包括KH2PO4。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述KH2PO4加入量为1×10-5~5×10-5份。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述三级菌种菌液的加入比例是菌液质量与谷壳麦麸总质量比为1：4-6。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：接种后的三级培养基在培养盘中进行铺料，先在室内培养，温度为26-30℃，湿度90-98%，培养时间为5-7天，待白僵菌长满后，移至开放式环境进行自然干燥，得到含白僵菌的物料。
7.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：整个培养过程中，温度控制在30℃以下，干燥过程中，增加散照光。
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