CN110819544A - 一种绿僵菌高孢粉的制备方法 - Google Patents

一种绿僵菌高孢粉的制备方法 Download PDF

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许天委
李国寅
丁兆建
郝慧华
吴小霞
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

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Abstract

本发明公开了一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括以下步骤：在试管中进行绿僵菌菌种斜面培养基的制作，并利用斜面培养基对绿僵菌菌种进行传代培养、活化；在试管中斜面培养基表面长满孢子时，从斜面培养基中取部分孢子及菌苔，将孢子及菌苔接入液体培养基中；将载有孢子及菌苔的液体培养基在恒温振荡箱中恒温培养，至液体培养液中出现粘稠菌丝体；将出现粘稠菌丝体的液体培养液与营养液混合，得混合的绿僵菌培养液，将培养液均匀喷洒在平铺的布块上，布块经蒸汽高温灭菌，且置于发酵容器进行发酵。该绿僵菌高孢粉的制备方法，利用布块作为培养载体能够降低培养成本，同时便于后期孢子的收集，土霉素的加入能够保证绿僵菌的生长环境。

Description

一种绿僵菌高孢粉的制备方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种绿僵菌高孢粉的制备方法。
背景技术
20世纪中期以来，由于化学杀虫剂无限制地使用，严重污染了环境和农林牧产品，危害了人畜健康，同时使自然生态系统遭到破坏。生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是生物防治的重要手段之一。真菌杀虫剂由于具有良好的扩散效果、较长的宿存能力、独特的体壁入侵方式，以及对害虫不产生抗药性和易大量生产等特点，使得真菌杀虫剂在森林害虫、土壤害虫和刺吸式口器害虫的生物防治中具有明显的优势。绿僵菌是最早应用于害虫生物防治的一种虫生真菌，能寄生8个目30个科昆虫超过200余种昆虫，利用绿僵菌防治害虫的研究与实践已逾百年，其具有致病力强、不污染环境、持效期长等特点，是一种可持续防治害虫的优良生物制剂。
目前，国内外绿僵菌分生孢子的获得主要是采用液固双相发酵的方式，即将液体种子接种于常规的大米等营养基质固体剂型固体发酵，但大米等基质的使用成本较高，同时后期不易分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿僵菌高孢粉的制备方法，以弥补现有技术的不足。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、在试管中进行绿僵菌菌种斜面培养基的制作，并利用斜面培养基对绿僵菌菌种进行传代培养、活化；
S2、在试管中斜面培养基表面长满孢子时，从斜面培养基中取部分孢子及菌苔，将孢子及菌苔接入液体培养基中，液体培养基经蒸汽高温灭菌且保持室温；
S3、将载有孢子及菌苔的液体培养基在恒温振荡箱中恒温培养，至液体培养液中出现粘稠菌丝体；
S4、将出现粘稠菌丝体的液体培养液与营养液混合，得混合的绿僵菌培养液，营养液经蒸汽高温灭菌并冷却至室温，将培养液均匀喷洒在平铺的布块上，布块经蒸汽高温灭菌，且置于发酵容器进行发酵。
优选的，步骤S1中绿僵菌菌种培养温度保持为23-28℃。
优选的，步骤S3中保持恒温26℃，且恒温培养时间为2-3天。
优选的，步骤S4中保持发酵温度为25-28℃，发酵时间为4-6天。
优选的，斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉100-200份，麸皮120-160份，土霉素0.1-1份，琼脂10-20份，水400-460份。
优选的，斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉150份，麸皮140份，土霉素0.6份，琼脂15份，水430份。
优选的，斜面培养基的制备包括以下步骤：
稻壳粉与麸皮粉碎至200目，后进行高温灭菌混合，降温后加水混合，并混入琼脂及土霉素，混合均匀后得到斜面培养基。
优选的，营养液按重量份计包括以下原料：水1000份，蛋白粉20份，米粉20份，蔗糖40份，KH2PO44×10-5份。
优选的，营养液按重量份计包括以下原料：水800份，蛋白粉18份，米粉16份，蔗糖40份，KH2PO43×10-5份。
优选的，营养液按重量份计包括以下原料：水1000份，蛋白粉20份，米粉18份，蔗糖36份，KH2PO45×10-5份。
本发明的技术效果和优点：该绿僵菌高孢粉的制备方法，载有绿僵菌菌种的培养液喷洒在平铺布块上，利用布块作为培养载体，与传统的利用大米等作为培养载体相比，能够降低培养成本，同时便于后期孢子的收集，营养液可提供供绿僵菌生长所需的K、P元素，同时斜面培养基中的土霉素能够简单对斜面培养基进行微生物杀灭，保证绿僵菌的生长环境。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述：
实施例1
一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、在试管中进行绿僵菌菌种斜面培养基的制作，并利用斜面培养基对绿僵菌菌种进行传代培养、活化，绿僵菌菌种培养温度保持为23-28℃；
S2、在试管中斜面培养基表面长满孢子时，从斜面培养基中取部分孢子及菌苔，将孢子及菌苔接入液体培养基中，液体培养基经蒸汽高温灭菌且保持室温；
S3、将载有孢子及菌苔的液体培养基在恒温振荡箱中恒温培养，保持恒温26℃，恒温培养时间为2-3天，至液体培养液中出现粘稠菌丝体；
S4、将出现粘稠菌丝体的液体培养液与营养液混合，得混合的绿僵菌培养液，营养液经蒸汽高温灭菌并冷却至室温，将培养液均匀喷洒在平铺的布块上，布块经蒸汽高温灭菌，且置于发酵容器进行发酵，保持发酵温度为25-28℃，发酵时间为4-6天。
具体的，斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉100份，麸皮120份，土霉素0.1份，琼脂10份，水400份。
具体的，斜面培养基的制备包括以下步骤：
稻壳粉与麸皮粉碎至200目，后进行高温灭菌混合，降温后加水混合，并混入琼脂及土霉素，混合均匀后得到斜面培养基。
具体的，营养液按重量份计包括以下原料：水1000份，蛋白粉20份，米粉20份，蔗糖40份，KH2PO44×10-5份。
实施例2
一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、在试管中进行绿僵菌菌种斜面培养基的制作，并利用斜面培养基对绿僵菌菌种进行传代培养、活化，绿僵菌菌种培养温度保持为23-28℃；
S2、在试管中斜面培养基表面长满孢子时，从斜面培养基中取部分孢子及菌苔，将孢子及菌苔接入液体培养基中，液体培养基经蒸汽高温灭菌且保持室温；
S3、将载有孢子及菌苔的液体培养基在恒温振荡箱中恒温培养，保持恒温26℃，恒温培养时间为2-3天，至液体培养液中出现粘稠菌丝体；
S4、将出现粘稠菌丝体的液体培养液与营养液混合，得混合的绿僵菌培养液，营养液经蒸汽高温灭菌并冷却至室温，将培养液均匀喷洒在平铺的布块上，布块经蒸汽高温灭菌，且置于发酵容器进行发酵，保持发酵温度为25-28℃，发酵时间为4-6天。
具体的，斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉150份，麸皮140份，土霉素0.6份，琼脂15份，水430份。
具体的，斜面培养基的制备包括以下步骤：
稻壳粉与麸皮粉碎至200目，后进行高温灭菌混合，降温后加水混合，并混入琼脂及土霉素，混合均匀后得到斜面培养基。
具体的，营养液按重量份计包括以下原料：水800份，蛋白粉18份，米粉16份，蔗糖40份，KH2PO43×10-5份。
实施例3
一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、在试管中进行绿僵菌菌种斜面培养基的制作，并利用斜面培养基对绿僵菌菌种进行传代培养、活化，绿僵菌菌种培养温度保持为23-28℃；
S2、在试管中斜面培养基表面长满孢子时，从斜面培养基中取部分孢子及菌苔，将孢子及菌苔接入液体培养基中，液体培养基经蒸汽高温灭菌且保持室温；
S3、将载有孢子及菌苔的液体培养基在恒温振荡箱中恒温培养，保持恒温26℃，恒温培养时间为2-3天，至液体培养液中出现粘稠菌丝体；
S4、将出现粘稠菌丝体的液体培养液与营养液混合，得混合的绿僵菌培养液，营养液经蒸汽高温灭菌并冷却至室温，将培养液均匀喷洒在平铺的布块上，布块经蒸汽高温灭菌，且置于发酵容器进行发酵，保持发酵温度为25-28℃，发酵时间为4-6天。
具体的，斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉200份，麸皮160份，土霉素1份，琼脂20份，水460份。
具体的，斜面培养基的制备包括以下步骤：
稻壳粉与麸皮粉碎至200目，后进行高温灭菌混合，降温后加水混合，并混入琼脂及土霉素，混合均匀后得到斜面培养基。
具体的，营养液按重量份计包括以下原料：水1000份，蛋白粉20份，米粉18份，蔗糖36份，KH2PO45×10-5份。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、在试管中进行绿僵菌菌种斜面培养基的制作，并利用斜面培养基对绿僵菌菌种进行传代培养、活化；
S2、在试管中斜面培养基表面长满孢子时，从斜面培养基中取部分孢子及菌苔，将孢子及菌苔接入液体培养基中，液体培养基经蒸汽高温灭菌且保持室温；
S3、将载有孢子及菌苔的液体培养基在恒温振荡箱中恒温培养，至液体培养液中出现粘稠菌丝体；
S4、将出现粘稠菌丝体的液体培养液与营养液混合，得混合的绿僵菌培养液，营养液经蒸汽高温灭菌并冷却至室温，将培养液均匀喷洒在平铺的布块上，布块经蒸汽高温灭菌，且置于发酵容器进行发酵。
2.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：步骤S1中绿僵菌菌种培养温度保持为23-28℃。
3.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：步骤S3中保持恒温26℃，且恒温培养时间为2-3天。
4.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：步骤S4中保持发酵温度为25-28℃，发酵时间为4-6天。
5.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉100-200份，麸皮120-160份，土霉素0.1-1份，琼脂10-20份，水400-460份。
6.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：斜面培养基按重量份计包括以下原料：稻壳粉150份，麸皮140份，土霉素0.6份，琼脂15份，水430份。
7.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：斜面培养基的制备包括以下步骤：
稻壳粉与麸皮粉碎至200目，后进行高温灭菌混合，降温后加水混合，并混入琼脂及土霉素，混合均匀后得到斜面培养基。
8.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：营养液按重量份计包括以下原料：水1000份，蛋白粉20份，米粉20份，蔗糖40份，KH2PO44×10-5份。
9.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：营养液按重量份计包括以下原料：水800份，蛋白粉18份，米粉16份，蔗糖40份，KH2PO43×10-5份。
10.根据权利要求1所述的绿僵菌高孢粉的制备方法，其特征在于：营养液按重量份计包括以下原料：水1000份，蛋白粉20份，米粉18份，蔗糖36份，KH2PO45×10-5份。
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