CN103992977A - 一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法 - Google Patents
一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法，属于微生物发酵工程领域。以提高枯草芽孢杆菌的菌体产量和芽孢率。该方法是经激活枯草芽孢杆菌、二步发酵培养生产目标产品。本发明方法的培养基成分易得且价格便宜、工艺参数简单、发酵周期短，所得枯草芽孢杆菌的细胞生物量可达到9×109cfu/ml以上，且芽孢率90%以上。显著提高产品的质量和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性需氧菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。其广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。能迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生有机酸，降低肠道PH，间接抑制其他致病菌生长；刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一。
在水产养殖领域，枯草芽孢杆菌能有效降解养殖水体中的有机质，改善水色，抑制有害藻类的过度繁殖，消除底部淤积，改良地质；有效降解高分子物质为低分子物质，促进营养成分的吸收，提高饲料的利用率，同时还能抑制病害微生物的生长，提高水产动物的免疫力，增强水产动物的抵抗力，减少疾病的发生，提高成活率。
目前枯草芽孢杆菌生产过程中普遍存在菌数和芽孢率偏低的问题，一般芽孢含量在5.0×109cfu/ml以下，没有芽孢的菌体会在短时间内死亡，大大降低菌剂的活性和质量稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法，能促进枯草芽孢杆菌的生长，提高枯草芽孢杆菌的菌体数量和芽孢产率。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
将-70℃保存的枯草芽孢杆菌无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，于35~38℃培养3~4天，得到激活的枯草芽孢杆菌；
所述固体培养基按质量百分比，由如下组分组成：牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、琼脂1.5~2.0%，余量为水，PH6.8~7.2；
将激活的枯草芽孢杆菌接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为200ml，摇床培养条件为：温度33~37℃、转数200~220rpm，培养16~20小时，得到一级发酵罐所用的种子液；
所述液体培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4~0.7%、牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、酵母膏0.4~0.6%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、硫酸铵0.2~0.5%、氯化钠0.3~0.6%，消泡剂0.15%~0.25%、余量为水，PH6.8~7.2；
将将步骤得到的种子液接种于100L种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量5~10%（v/v），发酵条件为：温度33~37℃、罐压0.03~0.05Mpa通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵6~10小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵6~10小时后搅拌转数调整为220 rpm，发酵培养10~14小时，得到二级罐所用种子菌液；
所述液体培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4~0.7%、牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、酵母膏0.4~0.6%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、硫酸铵0.2~0.5、硫酸镁0.02~0.04%、硫酸锰0.005~0.01%、氯化钠0.3~0.6%，消泡剂0.15%~0.25%、余量为水，PH7.0~7.2；
将将步骤得到的种子液接种于1000L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为700L，发酵条件与步骤相同，接种量5~10%（v/v），发酵培养36~40小时。收集发酵培养液得到枯草芽孢杆菌液体产品；
所述液体培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4~0.7%、玉米浆粉2~3%、玉米微粉0.1~0.2%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、硫酸铵0.2~0.5%、硫酸镁0.01~0.03%、氯化钠0.2~0.5%、消泡剂0.15%~0.25%、余量为水，PH7.0~7.2；
培养基的灭菌条件为：121℃、0.11Mpa灭菌20~30min.
平板计数得到枯草芽孢杆菌数在9×109cfu/ml以上，孔雀石绿染色后油镜观察，芽孢率90%以上。
本发明方法的优点在于：培养基成分易得且价格便宜、工艺参数简单、发酵周期短，所得的枯草芽孢杆菌不仅活菌数高，并且芽孢率高，可达到8×109cfu/ml以上，显著提高产品质量。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将-70℃保存的枯草芽孢杆菌无菌划线接种于灭菌的固体培养基上（固体培养基按质量百分比，由如下组分组成：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、琼脂1.5%，余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min.）37℃培养4天。
将固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后，接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、氯化钠0.5%，消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min），培养基装量为200ml，摇床培养条件为：温度37℃、转数220rpm，培养16小时。
将步骤得到的种子液接种于100L种子发酵罐的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、氯化钠0.5%，消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min），培养基装量为70L，接菌量5%（v/v），发酵条件为：温度37℃、罐压0.05Mpa，通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵6小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵6小时后搅拌转数调整为220 rpm，发酵培养10小时，得到二级罐所用种子菌液；
将步骤培养的种子液接种于1000L发酵罐的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、玉米浆粉2%、玉米微粉0.1%，磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、硫酸镁0.01%、氯化钠0.2%、消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20~30min），培养基装量为700L，发酵条件为：温度37℃、罐压0.05Mpa，通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵6小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵6小时后搅拌转数调整为220 rpm，接种量10%（v/v），发酵培养36小时。收集发酵培养液得到枯草芽孢杆菌液体产品。营养琼脂平板计数活菌数9.6×109cfu/ml，孔雀石绿芽孢染色油镜观察芽孢率92%。
实施例2
将-70℃保存的枯草芽孢杆菌无菌划线接种于灭菌的固体培养基上（固体培养基按质量百分比，由如下组分组成：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、琼脂1.5%，余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min.）37℃培养4天。
将固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后，接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、氯化钠0.5%，消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min），培养基装量为200ml，摇床培养条件为：温度37℃、转数220rpm，培养18小时。
将步骤得到的种子液接种于100L种子发酵罐的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、氯化钠0.5%，消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min），培养基装量为70L，接菌量10%（v/v），发酵条件为：温度37℃、罐压0.05Mpa，通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵8小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵8小时后搅拌转数调整为220 rpm，发酵培养12小时，得到二级罐所用种子菌液；
将步骤培养的种子液接种于1000L发酵罐的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.5%、玉米浆粉2.5%、玉米微粉0.15%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸铵0.24%、硫酸镁0.02%、氯化钠0.4%、消泡剂0.15%、余量为水，PH7.2， PH7.0，121℃、0.11Mpa，灭菌20~30min），培养基装量为700L，发酵条件为：温度37℃、罐压0.05Mpa，通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵8小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵8小时后搅拌转数调整为220 rpm，接种量10%（v/v），发酵培养40小时。收集发酵培养液得到枯草芽孢杆菌液体产品。营养琼脂平板计数活菌数1.3×1010cfu/ml，孔雀石绿芽孢染色油镜观察芽孢率95%。
实施例3
将-70℃保存的枯草芽孢杆菌无菌划线接种于灭菌的固体培养基上（固体培养基按质量百分比，由如下组分组成：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.6%、琼脂1.5%，余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min.）37℃培养4天。
将固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后，接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、氯化钠0.5%，消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min），培养基装量为200ml，摇床培养条件为：温度37℃、转数220rpm，培养18小时。
将步骤得到的种子液接种于100L种子发酵罐的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸铵0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、氯化钠0.5%，消泡剂0.15%、余量为水，PH7.0，121℃、0.11Mpa灭菌20min），培养基装量为70L，接菌量10%（v/v），发酵条件为：温度37℃、罐压0.05Mpa，通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵8小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵8小时后搅拌转数调整为220 rpm，发酵培养12小时，得到二级罐所用种子菌液；
将步骤培养的种子液接种于1000L发酵罐的灭菌培养基中（培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.7%、玉米浆粉3%、玉米微粉0.2%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.03%、氯化钠0.5%、消泡剂0.15%、余量为水， PH7.2，121℃、0.11Mpa，灭菌20~30min），培养基装量为700L，发酵条件为：温度37℃、罐压0.05Mpa，通气比列:起始通气比为1:0.6（v/v），发酵10小时后加大通气比为1:1（v/v） 、起始搅拌转数为180 rpm ，发酵10小时后搅拌转数调整为220 rpm，接种量10%（v/v），发酵培养40小时。收集发酵培养液得到枯草芽孢杆菌液体产品。营养琼脂平板计数活菌数1.5×1010cfu/ml，孔雀石绿芽孢染色油镜观察芽孢率97%。
Claims (2)
1.一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
将-70℃保存的枯草芽孢杆菌无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，于35~38℃培养3~4天，得到激活的枯草芽孢杆菌；
所述固体培养基按质量百分比，由如下组分组成：牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、琼脂1.5~2.0%，余量为水，PH6.8~7.2；
将激活的枯草芽孢杆菌接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为200ml，摇床培养条件为：温度33~37℃、转数200~220rpm，培养16~20小时，得到一级发酵罐所用的种子液；
所述液体培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4~0.7%、牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、酵母膏0.4~0.6%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、硫酸铵0.2~0.5%、氯化钠0.3~0.6%，消泡剂0.15%~0.25%、余量为水，PH6.8~7.2；
将步骤培养的种子液接种于100L种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量5~10%（v/v），发酵条件为：温度33~37℃、罐压0.03~0.05Mpa通气比列为1:0.6~1:1（v/v） 、搅拌转数为180~220 rpm，发酵培养10~14小时，得到二级罐所用种子菌液；
所述液体培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4~0.7%、牛肉膏0.3~0.4%、蛋白胨0.6~1.0%、酵母膏0.4~0.6%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、硫酸铵0.2~0.5、硫酸镁0.02~0.04%、硫酸锰0.005~0.01%、氯化钠0.3~0.6%，消泡剂0.15%~0.25%、余量为水，PH7.0~7.2；
将步骤培养的种子液接种于1000L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为700L，发酵条件与步骤3）相同，接种量5~10%（v/v），发酵培养36~40小时；
所述液体培养基按质量百分比：由如下组分组成：葡萄糖0.4~0.7%、玉米浆粉2~3%、玉米微粉0.1~0.2%、磷酸氢二钾0.1~0.3%、硫酸铵0.2~0.5%、硫酸镁0.01~0.03%、氯化钠0.2~0.5%、消泡剂0.15%~0.25%、余量为水，PH7.0~7.2。
2.根据权利要求1所述的一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于所述培养基使用前都需要灭菌处理，灭菌条件为：121℃、0.11Mpa灭菌20~30min。
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