CN106635890B - 一种连续培养枯草芽孢杆菌的方法及专用的发酵系统 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的连续培养方法和专用的发酵系统。本发明的方法包括下述步骤：(1)将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，进行菌种活化，然后依次转接到三角瓶和种子罐进行培养，制备枯草芽孢杆菌种子；(2)取培养料：淀粉、玉米粉、豆粕粉、蛋白胨、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、MnSO4、消泡剂、水；(3)将步骤(2)中的培养料经灭菌处理后，接种活化、培养好的枯草芽孢杆菌种子，再经过三级连续培养，得发酵液。本发明的方法所培养的枯草芽孢杆菌的质量和品质比较稳定均一，不易发生杂菌污染和菌种变异；延长各检测仪器的寿命；节省时间、提高了产量和生产效率；提高了枯草芽孢杆菌菌体浓度和芽孢率。

Description

一种连续培养枯草芽孢杆菌的方法及专用的发酵系统
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的培养方法，还涉及上述的枯草芽孢杆菌的培养过程中专用的设备。
背景技术
枯草芽孢杆菌是在自然界广泛存在的一种好氧的产芽抱杆菌，它具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等酶活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境。近几年，枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。
芽孢是细菌营养体在必需养料即将耗尽时，在细胞内形成的含水量极低、抗逆性极强的休眠体。很多研究表明，枯草芽抱杆菌所产生的芽孢具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等多种抗逆性，由于芽孢极强的抗逆性，在工业机械化生产及高温干燥的过程中，可以保证微生物菌剂的活性，提高其产品质量。目前，在工业生产过程中主要存在芽孢形成率不高、生产成本过高等问题。
因此，需要从培养工艺和培养设备上入手，发明一种高效培养枯草芽孢杆菌的方法，通过一种逐步改变培养条件的连续培养方式，提高枯草芽抱杆菌发酵过程中的芽孢数量，同时降低生产成本，实现枯草芽孢杆菌的高效生产。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种高效生产枯草芽孢杆菌的设备；
本发明还提供了高效的培养枯草芽孢杆菌的方法，采用本发明的三级连续培养方法生产得到的枯草芽孢杆菌，其活菌数可达到100-130亿/mL，其芽孢率高达93％以上；
本发明的枯草芽孢杆菌的连续培养方法具体步骤如下：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持32-35℃，培养24-36小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.5，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环菌种接种到三角瓶中，接种后保持32-35℃，100-150rpm，培养16-18小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.0-7.5，121℃灭菌30分钟；
c.种子罐菌种培养
将上述培养好的三角瓶菌种按0.5-1％接种量接种到种子罐中的培养料A中，培养温度30-32℃，通气量0.5-1(V/V·min)，转速100-150rpm，培养18-20小时；
种子罐培养料A配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5，该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中。
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，MnSO45mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料B经灭菌处理后输送至一级培养罐，然后将种子罐中培养好的菌种接种至一级培养罐发酵培养；将所得的一级发酵液送至二级培养罐中培养，得到的二级发酵液送至芽孢培养罐中培养,得到含有枯草芽孢杆菌的终产物发酵液。
上述的枯草芽孢杆菌的连续培养方法中，
一级培养罐培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V·min)；
二级培养罐培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8-1.1(V/V·min)；
芽孢培养罐培养条件为，温度38-40℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V·min)。
步骤(1)中培养料A的灭菌处理时，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至种子罐中；
步骤(3)中培养料B的灭菌处理步骤具体为，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至料液储罐，从料液储罐中将物料送至一级培养罐培养。
每次输送至发酵罐的培养料B的体积为一级发酵罐总容积的80％。
从种子罐接种0.5-1％的种子到一级培养罐，培养6-10小时，然后从料液储罐中以恒定速度输入培养料B至一级培养罐，得到一级发酵液，同时以相同的速度将一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将二级发酵液输入灭过菌的芽孢培养罐，待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出发酵液。
每个连续生产的周期控制在10-12天以内，在一个生产周期内每隔24小时，取样检测是否污染杂菌，一旦发现污染杂菌，立即停止，重新灭菌开始新一轮生产。
上述的一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐的体积比为2:2:1。
上述的发酵液控制其流经系统的速度，使一级培养罐和二级培养罐内发酵液的平均滞留培养时间均为6-10小时，芽孢培养罐内发酵液的平均滞留培养时间均为3-5小时，控制该连续系统内的平均总培养时间为15-25小时。
枯草芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持33℃，培养30小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环枯草芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后保持33℃，120rpm，培养17小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.1，121℃灭菌30分钟；
c.种子罐菌种培养
将上述培养好的三角瓶菌种按0.8％接种量接种到种子罐中的培养料A中，培养温度31℃，通气量0.8(V/V·min)，转速120rpm，培养19小时；
种子罐培养料A配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5，该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，MnSO45mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料B在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中，经过冷却装置冷却，将冷却后的培养料B输送至已灭菌处理的料液储罐中；
培养料B从料液储罐中输入一级培养罐，输入培养料的量为一级培养罐总体积的80％，
从种子罐接种0.5-1％的种子到一级培养罐的培养料A中，培养6-10小时后，再次连续开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料B；
一级培养罐发酵培养的条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V·min)；
同时以同样速度将经一级培养罐发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐；所述的二级培养罐发酵培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8-1.1(V/V·min)；
待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液，然后一直维持该系统的恒定连续发酵状态；
芽孢培养罐培养条件为，温度38-40℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V·min)。
本发明的枯草芽孢杆菌的连续培养方法专用的发酵系统，包括依次串联连接的配料罐、连消装置、维持罐、冷却装置、料液储罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐；
冷却装置与一级培养罐之间并联有种子罐；
芽孢培养罐连接有辅料罐；
配料罐与连消装置之间连接有输送泵Ⅰ；所述的维持罐与冷却装置之间有输送泵Ⅱ；
储料罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐之间均有恒流泵。
冷却装置产生的热水可用于连消装置预热，从而减少能耗，节约成本。
本发明的有益效果在于，可以高度机械化和自动化，枯草芽孢杆菌的质量和品质比较稳定均一；
本发明方法由于高度的自动化操作，减少了人为因素和与外界接触的机会，从而减少了操作带来的污染几率，不易发生杂菌污染和菌种变异；
本发明方法实施过程中，各个培养罐体内的温度探头等检测仪器无须经过多次高温灭菌，减少损伤，延长各检测仪器的寿命；
本发明方法耗费在非生产的准备时间比较少，提高了产量和生产效率；
本发明方法将菌种繁殖、菌体高速生长和芽孢产生的过程分别进行控制，使二级培养罐和芽孢培养罐的菌体一直处于一个比较高的浓度，有效提高了枯草芽孢杆菌菌体浓度和芽孢率。
附图说明
图1为本发明的枯草芽孢杆菌连续培养的流程图；
图中，1-配料罐，2-连消装置，3-维持罐，4-输送泵Ⅰ，5-料液储罐，6-一级培养罐，7-种子罐，8-二级培养罐，9-芽孢培养罐，10-辅料罐，11-冷却装置，12-输送泵Ⅱ。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
实施例1
枯草芽孢杆菌的连续培养方法专用的发酵系统，包括依次串联连接的配料罐1、连消装置2、维持罐3、冷却装置11、料液储罐5、一级培养罐6、二级培养罐8、芽孢培养罐9；
冷却装置11与一级培养罐6之间并联有种子罐7；
芽孢培养罐9连接有辅料罐10；
配料罐1与连消装置2之间连接有输送泵Ⅰ4；维持罐3与冷却装置11之间有输送泵输送泵Ⅱ12；
储料罐、一级培养罐6、二级培养罐8、芽孢培养罐9之间均有恒流泵。
具体的步骤是，从种子罐7接种0.5-1％的枯草芽孢杆菌菌种到一级培养罐6的培养料A中，培养8-12小时，然后从料液储罐5中以恒定速度输入培养料B至一级培养罐6，得到一级发酵液，再以相同的速度将发酵液输入灭过菌的二级培养罐8，待二级培养罐8内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将二级发酵液输入灭过菌的芽孢培养罐9，待芽孢培养罐9内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出终产物发酵液。
步骤(1)中培养料A的灭菌处理时，将配料罐1中的物料通过输送泵Ⅰ4输送至连消装置2灭菌，再输送至维持罐3中暂存，通过输送泵Ⅱ12将暂存的物料送至冷却装置11中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至种子罐中；
步骤(3)中培养料B的灭菌处理步骤具体为，将配料罐1中的物料通过输送泵Ⅰ4输送至连消装置2灭菌，再输送至维持罐3中暂存，通过输送泵Ⅱ12将暂存的物料送至冷却装置11中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至料液储罐5，从料液储罐5中将物料送至一级培养罐6培养。
实施例2
枯草芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持33℃，培养30小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环枯草芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后保持33℃，120rpm，培养17小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.1，121℃灭菌30分钟；
c.种子罐菌种培养
将上述配制好的三角瓶菌种按0.8％接种量接种到种子罐中的培养料A中，培养温度31℃，通气量0.8(V/V·min)，转速120rpm，培养19小时；
种子罐培养料A配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5。该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，MnSO45mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中，经过冷却装置冷却，将冷却后的培养料输送至已灭菌处理的料液储罐中；
培养料从料液储罐中输入一级培养罐，输入培养料的量为一级培养罐总体积的80％，从种子罐接种0.8％的种子到一级培养罐，培养8小时后，再次连续开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料；
一级培养罐发酵培养的条件为，温度34℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7V/V·min；
同时以同样速度将经一级培养罐6发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐8，待二级培养罐8内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐9；二级培养罐8发酵培养条件为，温度34℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.9V/V·min；
待芽孢培养罐9内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液，然后一直维持该系统的恒定连续发酵状态；
芽孢培养罐9培养条件为，温度39℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7V/V·min。
一级培养罐6、二级培养罐7、芽孢培养罐9的体积比为2:2:1。
每个连续生产的周期控制在10-12天以内，在一个生产周期内每隔24小时，取样检测是否污染杂菌，一旦发现污染杂菌，立即停止，重新灭菌开始新一轮生产。
发酵液控制其流经系统的速度，使一级培养罐6和二级培养罐8内发酵液的平均滞留培养时间均为8小时，芽孢培养罐9内发酵液的平均滞留培养时间均为4小时，控制该连续系统内的平均总培养时间为20小时。
该系统可实现高度机械化和自动化，减少了人为因素和与外界接触的机会，减少污染几率，能够连续获得高质量且稳定的发酵液，发酵液的枯草芽孢杆菌活菌数可达到约120亿/mL左右，其芽孢率高达95.0％；
与传统的分批生产相比较，本发明各个培养罐体内的温度探头等检测仪器无须经过多次高温灭菌，减少损伤，延长各检测仪器的寿命；
本发明方法在其生产周期内，备料、灭菌需要10小时左右，进入培养罐后到开始收获发酵液耗时15-25小时，然后一直有产品形成，一直是生产时间，即本发明的连续系统内每个周期的平均总培养时间为15-25小时；而传统的分批生产每批次都需要备料、灭菌耗费6小时，种子罐培养耗时20小时，培养罐耗时28小时，清洗罐体耗时4小时，即每个周期的耗时为58小时，由此可见本发明耗费在非生产的准备时间比较少，每个生产周期约生产效率提高了1倍左右。
若将上述的培养过程的培养基和培养料调整如下：
试管斜面菌种活化中，试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.5，121℃下灭菌20分钟；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.0-7.5，121℃灭菌20分钟：
种子罐中的培养料A的配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
取培养料B：培养料B配料为，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
培养的方法完全相同，仅仅是将培养基和培养料作调整，发酵液的枯草芽孢杆菌活菌数可达到约90亿/mL左右，其芽孢率为89.1％；本发明人在实验过程中，同时也研究了地衣芽孢杆菌的连续培养，发现上述的培养对于地衣芽孢杆菌，其培养效果较好，但是该培养基和培养料，用于枯草芽孢杆菌，其效果要差一些，以上的实验表明，本发明的培养方法中，培养基、培养料的选择，也会对芽孢率和活菌数产生影响。从培养料A送到种子罐中接种三角瓶中的菌种，然后将培养料B送至一级培养罐中，同时将经种子罐培养后中的菌种接种至一级培养罐中发酵，再经过二级培养罐中发酵，再转入芽孢培养罐中发酵，至最后得到含有枯草芽孢杆菌的终产物发酵液，此为一个生产周期。
实施例3
枯草芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持32℃，培养24小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环菌种接种到三角瓶中，接种后保持32℃，100rpm，培养16小时；
所述的三角瓶培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.0，121℃灭菌30分钟；
c.种子罐菌种培养
将上述配制好的三角瓶菌种按0.5-1％接种量接种到种子罐中的培养料A中，培养温度30℃，通气量0.5(V/V·min)，转速100rpm，培养18小时；
种子罐培养料A配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5。该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中。
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，MnSO45mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0；
(3)将步骤(2)中的培养料在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中，经过冷却装置冷却，将冷却后的培养料输送至已灭菌处理的料液储罐中；
培养料从料液储罐中输入一级培养罐，输入培养料的量为一级培养罐总体积的80％，从种子罐接种0.5％的种子到一级培养罐，培养6小时后，再次连续开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料；
一级培养罐发酵培养的条件为，温度33℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6(V/V·min)；
同时以同样速度将经一级培养罐发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐；所述的二级培养罐发酵培养条件为，温度33℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8(V/V·min)；
待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液，然后一直维持该系统的恒定连续发酵状态；
芽孢培养罐培养条件为，温度38℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6(V/V·min)。
发酵液的枯草芽孢杆菌活菌数可达到约116亿/mL，其芽孢率高达94.2％。
实施例4
枯草芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持35℃，培养36小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.5，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环菌种接种到三角瓶中，接种后保持35℃，150rpm，培养18小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.5，121℃灭菌30分钟；
c.种子罐菌种培养
将上述配制好的三角瓶菌种按1％接种量接种到种子罐中的培养料A中，培养温度32℃，通气量1(V/V·min)，转速150rpm，培养20小时；
种子罐培养料A配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.5；该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，MnSO45mg/L，消泡剂1g/L，pH7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中，经过冷却装置冷却，将冷却后的培养料输送至已灭菌处理的料液储罐中；
培养料从料液储罐中输入一级培养罐，输入培养料的量为一级培养罐总体积的80％，从种子罐接种1％的种子到一级培养罐，培养10小时后，再次连续开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料；
一级培养罐发酵培养的条件为，温度35℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.8(V/V·min)；
同时以同样速度将经一级培养罐发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐；所述的二级培养罐发酵培养条件为，温度35℃，搅拌桨转速200rpm，通风量1.1(V/V·min)；
待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液，然后一直维持该系统的恒定连续发酵状态；
芽孢培养罐培养条件为，温度40℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.8(V/V·min)。
发酵液的枯草芽孢杆菌活菌数可达到约118亿/mL，其芽孢率高达94.6％。

Claims (4)

1.枯草芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的枯草芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持33℃，培养30小时进行菌种活化；
所述的试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环枯草芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后保持33℃，120rpm，培养17小时；
所述的三角瓶培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.1，121℃灭菌30分钟；
c.种子罐菌种培养
将上述培养好的三角瓶菌种按0.8％接种量接种到种子罐中的培养料A中，培养温度31℃，通气量0.8(V/V•min)，转速120rpm，培养19小时；
所述的种子罐培养料A配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4•7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5，该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4•7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料B在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中，经过冷却装置冷却，将冷却后的培养料B输送至已灭菌处理的料液储罐中；
培养料B从料液储罐中输入一级培养罐，输入培养料的量为一级培养罐总体积的80％，
从种子罐接种0.5-1％的种子到一级培养罐中，培养6-10小时后，再次连续开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料B；
所述的一级培养罐发酵培养的条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V•min)；
同时以同样速度将经一级培养罐发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐；所述的二级培养罐发酵培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8-1.1(V/V•min)；
待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液，然后一直维持该系统的恒定连续发酵状态；
所述的芽孢培养罐培养条件为，温度38-40℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V•min)；
上述方法中所用系统：包括依次串联 连接的配料罐、连消装置、维持罐、冷却装置、料液储罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐；
所述的冷却装置与一级培养罐之间并联有种子罐；
所述的芽孢培养罐连接有辅料罐；
所述的配料罐与连消装置之间连接有输送泵Ⅰ；所述的维持罐与冷却装置之间有输送泵Ⅱ；
所述的储料罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐之间均有恒流泵。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于：
所述步骤(1)中培 养料A的灭菌处理时，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持 罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至种子罐中；
所述的步骤(1)中培养料B的灭菌处理步骤具体为，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至料液储罐，从料液储罐中将物料送至一级培养罐培养。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于，每个连续生产的周期控制在12天以内，在一个生产周期内每隔24小时，取样检测是否污染杂菌，一旦发现 污染杂菌，立即停止，重新灭菌开始新一轮生产。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于，所述的一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐的体积比为2:2:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055272A (zh) * 2018-09-07 2018-12-21 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168055A (zh) * 2011-03-03 2011-08-31 大连吉翔农业科技有限公司 一种高芽孢率的枯草芽孢杆菌发酵方法
CN103865827A (zh) * 2012-12-15 2014-06-18 重庆江合生物科技有限责任公司 一种高密度培养高活菌数枯草芽孢杆菌的方法
CN103881953A (zh) * 2014-04-18 2014-06-25 哈尔滨方依达肥业股份有限公司 一种枯草芽孢杆菌的连续发酵方法
CN103992977A (zh) * 2014-06-08 2014-08-20 威海金牌生物科技股份有限公司 一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法
CN104293721A (zh) * 2014-10-23 2015-01-21 中盐工程技术研究院有限公司 一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法
CN104894032A (zh) * 2015-06-19 2015-09-09 黑龙江省科学院微生物研究所 一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法
CN105255785A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 山东省农业科学院农业资源与环境研究所 一种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168055A (zh) * 2011-03-03 2011-08-31 大连吉翔农业科技有限公司 一种高芽孢率的枯草芽孢杆菌发酵方法
CN103865827A (zh) * 2012-12-15 2014-06-18 重庆江合生物科技有限责任公司 一种高密度培养高活菌数枯草芽孢杆菌的方法
CN103881953A (zh) * 2014-04-18 2014-06-25 哈尔滨方依达肥业股份有限公司 一种枯草芽孢杆菌的连续发酵方法
CN103992977A (zh) * 2014-06-08 2014-08-20 威海金牌生物科技股份有限公司 一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法
CN104293721A (zh) * 2014-10-23 2015-01-21 中盐工程技术研究院有限公司 一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法
CN104894032A (zh) * 2015-06-19 2015-09-09 黑龙江省科学院微生物研究所 一种促进枯草芽孢杆菌生长和产生芽孢的培养方法
CN105255785A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 山东省农业科学院农业资源与环境研究所 一种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
枯草芽孢杆菌 XF-1发酵培养基响应曲面法优化研究;李野等;《首届全国农业环境科学学术研讨会论文集》;20051130;第121-124页 *
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验;吴俊罡等;《国外畜牧学（猪与禽）》;20030531;第23卷(第3期);第31-33页 *

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