CN106754477B - 一种地衣芽孢杆菌的连续培养方法及专用的发酵系统 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及地衣芽孢杆菌的连续培养方法和专用发酵系统。本发明的方法，包括下述的步骤：(1)将地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，菌种活化，依次转接到三角瓶和种子罐培养，制备地衣芽孢杆菌种子；(2)取培养料：淀粉/葡萄糖、玉米粉、豆粕粉、(NH4)2HPO4、NaCl、CaCl2、MgSO4.7H2O、KH2PO4、K2HPO4、MnSO4、消泡剂、水；(3)将步骤(2)中的培养料经灭菌处理后，接种活化、培养好的地衣芽孢杆菌种子，再经过三级连续培养，得最终发酵液。本发明的方法实现了高度机械化和自动化，地衣芽孢杆菌的质量和品质比较稳定均一，也不易发生杂菌污染和菌种变异；延长了各检测仪器的寿命；节省时间、提高了产量和生产效率；提高了地衣芽孢杆菌菌体浓度和芽孢率。

Description

一种地衣芽孢杆菌的连续培养方法及专用的发酵系统
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌的连续培养方法，还涉及上述的地衣芽孢杆菌的培养过程中专用的设备。
背景技术
地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)是芽抱杆菌中较具应用潜力的菌种之一。属于革兰氏阳性杆状细菌，可产生内生芽抱，耐热抗逆性强，在土壤和植物表面普遍存在，是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害。
地衣芽孢杆菌能产生多种抗菌物质,地衣芽孢杆菌在一定条件下能产生脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类和氨基酸类等多种抗生素，对多种植物病原菌起到很好的抑制作用，地衣芽孢杆菌同时能产生多种营养物质，如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等，参与动物机体新陈代谢，为机体提供营养物质。地衣芽孢杆菌有很强的生命活力、具备产生各种酶的能力,具有调节动物微生态平衡、促进肠道有益菌生长、降低病原菌的数量、增加动物机体的抗病力、提高机体的免疫功能，进入21世纪以来,已经在饲料工业上开始大规模应用。地衣芽孢杆菌制剂还可以作为药物，口服以后以活菌形式进入肠道内,在生长代谢中能产生多种抗菌活性物质，如短杆菌肽、枯草杆菌素、制霉菌素和头孢菌素C等,可抑制肠道中的致病菌。因此,芽孢杆菌被广泛应用于种植业、医药、农药、饲料加工等各个行业。
但是由于地衣芽孢杆菌的营养体抗逆性比较差，很容易在制成产品的过程中大量死亡，而其生长后期形成的芽孢，由于在结构和化学成分上均有别于营养细胞，也就具有了许多不同于营养细胞的特性。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，能够在制成产品和储运的过程中保存大量的活体，这些芽孢能够在适宜的条件下重新萌发形成营养体，并进行大量繁殖，进而实现地衣芽孢杆菌的各种功效。因此在地衣芽孢杆菌的培养过程中，需要通过一定的培养条件和培养过程使大量的菌体生成芽孢，为地衣芽孢杆菌产品的制备和发挥最大功效奠定基础。
因此，需要从培养工艺或是培养设备上入手，发明一种高效培养地衣芽孢杆菌的方法，通过一种逐步改变培养条件的连续培养方式，实现地衣芽孢杆菌的高效生产。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种高效生产地衣芽孢杆菌的设备；
本发明还提供了高效的培养地衣芽孢杆菌的方法，采用本发明的三级连续培养方法生产得到的地衣芽孢杆菌，其活菌数可达到130-150亿/mL，其芽孢率高达90％以上。
本发明的地衣芽孢杆菌的连续培养方法具体步骤如下：
地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持32-35℃，培养24-36小时，进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.5，121℃下灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从试管中挑取1-2环活化好的地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后在32-35℃，100-150rpm的条件下，培养18-20小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.0-7.5，121℃灭菌20分钟：
c.种子罐菌种培养
向种子罐中输入经过灭菌的培养料A，然后将上述培养好的三角瓶中的菌种按0.5-1％的接种量接种到种子罐中，培养温度30-32℃，通气量0.5-1(V/V·min)，转速150-200rpm，培养18-22小时；
种子罐中的培养料A的配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料B经灭菌处理最后输送至一级培养罐，然后将经种子罐中培养好的菌种接种至一级培养罐中发酵培养；将所得的一级发酵液送至二级培养罐中培养，得到的二级发酵液送至芽孢培养罐中培养，得到含有地衣芽孢杆菌的终产物发酵液。
优选的，一级培养罐培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V·min)；
二级培养罐培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8-1.1(V/V·min)；
芽孢培养罐培养条件为，温度40-42℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8(V/V·min)。
上述步骤(1)中的培养料A灭菌处理的具体步骤是，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至种子罐中；
上述的步骤(3)中培养料B的灭菌处理步骤具体为，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至料液储罐，从料液储罐中将物料送至一级培养罐培养。
上述的每次输送至一级发酵罐的培养料B的体积为一级发酵罐总体积的80％。
从种子罐接种0.5-1％的种子到一级培养罐，培养8-12小时，然后从料液储罐中以恒定速度输入培养料B至一级培养罐，得到一级发酵液，再以相同的速度将一级发酵液从输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将二级发酵液输入灭过菌的芽孢培养罐，待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出终产物发酵液。
本发明的地衣芽孢杆菌的方法中，每个连续生产的周期控制在10-12天以内，在一个生产周期内每隔24小时，取样检测是否污染杂菌，如有污染杂菌，立即停止，重新灭菌开始新一轮生产。
上述的一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐的容积比为2:2:1。
上述的发酵液控制其流经系统的速度，使一级培养罐和二级培养罐内发酵液的平均滞留培养时间均为8-12小时，芽孢培养罐内发酵液的平均滞留培养时间均为4-6小时，控制该连续系统内的平均总培养时间为20-30小时。
地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持33℃，培养30小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后保持33℃，120rpm，培养19小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl 1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
c.种子罐菌种培养
向种子罐中输入经过灭菌的培养料A，然后将上述培养好的三角瓶菌种按0.8％的接种量接种到种子罐中，培养温度31℃，通气量0.8(V/V·min)，转速180rpm，培养20小时；
种子罐培养料A的配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO40.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉(葡萄糖)25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.1；
(3)将步骤(2)中的培养料B在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌后输送至维持罐中，再输送至冷却装置，经过冷却装置冷却后，将培养料B输送至已灭菌处理的料液储罐中；
从种子罐接种0.8％的种子到一级培养罐，培养10小时后，开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料B，培养料B的量为一级培养罐总体积的80％；
一级培养罐发酵培养的条件为，温度34℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7(V/V·min)；
以同样速度将经一级培养罐发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐；所述的二级培养罐发酵培养条件为，温度34℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.9(V/V·min)；
待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出终产物发酵液；
芽孢培养罐培养条件为，温度41℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7(V/V·min)。
本发明的地衣芽孢杆菌的连续培养方法专用的发酵系统，包括依次串联连接的配料罐、连消装置、维持罐、冷却装置、料液储罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐；
冷却装置与一级培养罐之间并联有种子罐；
芽孢培养罐连接有辅料罐；
配料罐与连消装置之间连接有输送泵Ⅰ；维持罐与冷却装置之间有输送泵Ⅱ；
储料罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐之间均有恒流泵。
本发明的有益效果在于，实现了高度机械化和自动化，地衣芽孢杆菌的质量和品质比较稳定均一；
本发明方法由于高度的自动化操作，减少了人为因素和与外界接触的机会，从而减少了操作带来的污染几率，不易发生杂菌污染和菌种变异；
本发明方法实施过程中，各个培养罐体内的温度探头等检测仪器无须经过多次高温灭菌，减少损伤，延长各检测仪器的寿命；
本发明方法耗费在非生产的准备时间比较少，提高了产量和生产效率；
本发明方法将菌种繁殖、菌体高速生长和芽孢产生的过程分别进行控制，使二级培养罐和芽孢培养罐的菌体一直处于一个比较高的浓度，有效提高了地衣芽孢杆菌菌体浓度和芽孢率。
附图说明
图1为本发明的地衣芽孢杆菌连续培养的流程图；
图中，1-配料罐，2-连消装置，3-维持罐，4-输送泵Ⅰ，5-料液储罐，6-一级培养罐，7-种子罐，8-二级培养罐，9-芽孢培养罐，10-辅料罐，11-冷却装置，12-输送泵Ⅱ。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
实施例1
地衣芽孢杆菌的连续培养方法专用的发酵系统，包括依次串联连接的配料罐1、连消装置2、维持罐3、冷却装置11、料液储罐5、一级培养罐6、二级培养罐8、芽孢培养罐9；
冷却装置11与一级培养罐6之间并联有种子罐7；
芽孢培养罐9连接有辅料罐10；
配料罐1与连消装置2之间连接有输送泵输送泵Ⅰ4；维持罐3与冷却装置11之间有输送泵输送泵Ⅱ12；
储料罐、一级培养罐6、二级培养罐8、芽孢培养罐9之间均有恒流泵。
具体的步骤是，从种子罐接种0.5-1％的菌种到一级培养罐，培养8-12小时，然后从料液储罐5中以恒定速度输入培养料B至一级培养罐6，得到一级发酵液，再以相同的速度将发酵液输入灭过菌的二级培养罐8，待二级培养罐8内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将二级发酵液输入灭过菌的芽孢培养罐9，待芽孢培养罐9内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出终产物发酵液。
实施例2
地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持33℃，培养30小时进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后保持33℃，120rpm，培养19小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
c.种子罐7菌种培养
将上述培养好的三角瓶菌种按0.8％接种量接种到种子罐7中，培养温度31℃，通气量0.8(V/V·min)，转速180rpm，培养20小时；
种子罐7培养料配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5。该培养料经连消装置2灭菌后，输送至种子罐7中。
(2)取培养料：培养料配料为，淀粉(葡萄糖)25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.1；
(3)将步骤(2)中的培养料B在配料罐1中混合均匀，送至连消装置2灭菌，再输送至维持罐3中，经过冷却装置11冷却，将冷却后的培养料输送至已灭菌处理的料液储罐5中；
从种子罐7接种0.8％的种子到一级培养罐6的培养料A中，培养10小时后，开始从料液储罐5以恒定速度向一级培养罐6中输入培养料，培养料B的量为一级培养罐6总体积的80％；
步骤(1)中的培养料A灭菌处理的具体为，将配料罐1中的物料通过输送泵Ⅰ4输送至连消装置2灭菌，再输送至维持罐3中暂存，通过输送泵Ⅱ12将暂存的物料送至冷却装置11中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至种子罐7中；
步骤(3)中培养料B的灭菌处理具体为，将配料罐1中的物料通过输送泵Ⅰ4输送至连消装置2灭菌，再输送至维持罐3中暂存，通过输送泵Ⅱ12将暂存的物料送至冷却装置11中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至料液储罐5，从料液储罐5中将物料送至一级培养罐6培养。
一级培养罐6发酵培养的条件为，温度34℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7(V/V·min)；
以同样速度将经一级培养罐6发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐8，待二级培养罐8内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐9；二级培养罐8发酵培养条件为，温度34℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.9(V/V·min)；
待芽孢培养罐9内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液；
芽孢培养罐9培养条件为，温度41℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7(V/V·min)。
一级培养罐6、二级培养罐8、芽孢培养罐9的体积比为2:2:1。
每个连续生产的周期控制在10-12天以内，在一个生产周期内每隔24小时，取样检测是否污染杂菌，一旦发现污染杂菌，立即停止，重新灭菌开始新一轮生产。从培养料A送到种子罐中接种三角瓶中的菌种，然后将培养料B灭菌后送至一级培养罐中发酵，同时将经种子罐培养后中的菌种接种至一级培养罐中发酵，再经过二级培养罐中发酵，再转入芽孢培养罐中发酵，至最后得到含有地衣芽孢杆菌的终产物发酵液，此过程为一个生产周期。
发酵液控制其流经系统的速度，使一级培养罐6和二级培养罐8内发酵液的平均滞留培养时间均为10小时，芽孢培养罐9内发酵液的平均滞留培养时间均为5小时，控制该连续系统内的平均总培养时间为25小时。
本发明的系统可实现高度机械化和自动化，减少了人为因素和与外界接触的机会，减少污染几率，能够连续获得高质量且稳定的发酵液，发酵液的地衣芽孢杆菌活菌数可达到130-150亿/mL，其芽孢率高达90％以上；
与传统的分批生产相比较，本发明各个培养罐体内的温度探头等检测仪器无须经过多次高温灭菌，减少损伤，延长各检测仪器的寿命；
本发明方法在地衣芽孢杆菌生产周期内，备料、灭菌需要10小时左右，进入培养罐后到开始收获发酵液耗时20-30小时，然后一直有产品形成，一直是生产时间，即本发明的连续系统内每个周期的平均总培养时间为20-30小时；而传统的分批生产每批次都需要备料、灭菌耗费6小时，种子罐7培养耗时20小时，培养罐耗时30小时，清洗罐体耗时4小时，即每个周期的耗时为60小时，由此可见本发明耗费在非生产的准备时间比较少，每个生产周期约生产效率提高了1倍左右。
经过连续培养得到的最终发酵液中，活菌数约为150亿/mL，其芽孢率为96.1％。
实施例3
地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持32℃，培养24小时，进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从试管中挑取1-2环活化好的地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后在32℃，100rpm的条件下，培养20小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl 1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.0，121℃灭菌20分钟：
c.种子罐7菌种培养
将上述培养好的三角瓶中的菌种按0.5％接种量接种到种子罐7中，培养温度30℃，通气量0.5(V/V·min)，转速150rpm，培养22小时；
种子罐7培养料配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO40.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0，该培养料经连消装置2灭菌后，输送至种子罐7中；
(2)取培养料：培养料配料为，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0；
(3)将步骤(2)中的培养料在配料罐1中混合均匀，送至连消装置2灭菌，再输送至维持罐3中，经过冷却装置11冷却，将冷却后的培养料输送至已灭菌处理的料液储罐5中；
从种子罐7接种0.8％的种子到一级培养罐6，培养10小时后，开始从料液储罐5以恒定速度向一级培养罐6中输入培养料，培养料的量为一级培养罐6总体积的80％；
一级培养罐6发酵培养的条件为，温度34℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6(V/V·min)；
以同样速度将经一级培养罐6发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐8，待二级培养罐8内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐9；所述的二级培养罐8发酵培养条件为，温度34℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8(V/V·min)；
待芽孢培养罐9内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出最终所得的发酵液；
芽孢培养罐9培养条件为，温度41℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6(V/V·min)。
经过连续培得到的最终发酵液中，活菌数约为148亿/mL，其芽孢率为95.2％。
实施例4
地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持35℃，培养36小时，进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.5，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从试管中挑取1-2环活化好的地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后在35℃，150rpm的条件下，培养18小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl 1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.5，121℃灭菌20分钟：
c.种子罐7菌种培养
将上述培养好的三角瓶中的菌种按1％接种量接种到种子罐7中，培养温度32℃，通气量1(V/V·min)，转速200rpm，培养18小时；
种子罐7培养料配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO40.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.5，该培养料经连消装置2灭菌后，输送至种子罐7中；
(2)取培养料：培养料配料为，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.5；
(3)从种子罐7接种1％的种子到一级培养罐6，培养12小时，然后从料液储罐5中以恒定速度输入培养料至一级培养罐6，同时以相同的速度将发酵液从一级培养罐6输入灭过菌的二级培养罐8，待二级培养罐8内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将二级发酵液从二级培养罐8输入灭过菌的芽孢培养罐9，待芽孢培养罐9内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出发酵液，进而达到培养料和发酵液恒进恒出后，维持该体系恒定运作。
经过连续培养得到的地衣芽孢杆菌发酵液中，活菌数约为149亿/mL，其芽孢率为95.5％。

Claims (7)

1.地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持32-35℃，培养24-36小时，进行菌种活化；
试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.5，121℃下灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从试管中挑取1-2环活化好的地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后在32-35℃，100-150rpm的条件下，培养18-20小时；
三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl 1g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.0-7.5，121℃灭菌20分钟；
c.种子罐菌种培养
向种子罐中输入经过灭菌的培养料A，然后将上述培养好的三角瓶中的菌种按0.5-1％的接种量接种到种子罐中，培养温度30-32℃，通气量0.5-1V/V·min，转速150-200rpm，培养18-22小时；
种子罐中的培养料A的配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO40.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；
(3)将步骤(2)中的培养料B经灭菌处理最后输送至一级培养罐，然后将经种子罐中培养好的菌种接种至一级培养罐中发酵培养；将所得的一级发酵液送至二级培养罐中培养，得到的二级发酵液送至芽孢培养罐中培养，得到含有地衣芽孢杆菌的终产物发酵液；
一级培养罐培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8V/V·min；
二级培养罐培养条件为，温度33-35℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.8-1.1V/V·min；
芽孢培养罐培养条件为，温度40-42℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.6-0.8V/V·min；所述的每次输送至一级发酵罐的培养料B的体积为一级发酵罐总容积的80％；
从种子罐接种0.5-1％的种子到一级培养罐，培养8-12小时，然后从料液储罐中以恒定速度输入培养料B至一级培养罐，得到一级发酵液，再以相同的速度将一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将二级发酵液输入灭过菌的芽孢培养罐，待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出终产物发酵液。
2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养料A灭菌处理的具体步骤是，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至种子罐中；
所述的步骤(3)中培养料B的灭菌处理步骤具体为，将配料罐中的物料通过输送泵Ⅰ输送至连消装置灭菌，再输送至维持罐中暂存，通过输送泵Ⅱ将暂存的物料送至冷却装置中冷却至30-37℃，将冷却后的物料送至料液储罐，从料液储罐中将物料送至一级培养罐培养。
3.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于，每个连续生产的周期控制在10-12天以内，在一个生产周期内每隔24小时，取样检测是否污染杂菌，如有污染杂菌，立即停止，重新灭菌开始新一轮生产。
4.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于，所述的一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐的容积比为2:2:1。
5.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的连续培养方法，其特征在于，所述的发酵液控制其流经系统的速度，使一级培养罐和二级培养罐内发酵液的平均滞留培养时间均为8-12小时，芽孢培养罐内发酵液的平均滞留培养时间均为4-6小时，控制该连续系统内的平均总培养时间为20-30小时。
6.地衣芽孢杆菌的连续培养方法，包括下述的步骤：
(1)种子培养
a.试管斜面菌种活化
将保存的地衣芽孢杆菌菌种转接到试管斜面培养基上，保持33℃，培养30小时进行菌种活化；
所述的试管斜面培养基配方为：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
b.三角瓶种子培养
从活化好的试管中挑取1-2环地衣芽孢杆菌菌种接种到三角瓶中，接种后保持33℃，120rpm，培养19小时；
所述的三角瓶培养基配方为：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.1，121℃灭菌20分钟；
c.种子罐菌种培养
向种子罐中输入经过灭菌的培养料A，然后将上述培养好的三角瓶菌种按0.8％的接种量接种到种子罐中，培养温度31℃，通气量0.8V/V·min，转速180rpm，培养20小时；
所述的种子罐培养料A的配方为：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO40.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡剂1g/L，pH7.0-7.5；该培养料经连消装置灭菌后，输送至种子罐中；
(2)取培养料B：培养料B配料为，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡剂1g/L，pH7.1；
(3)将步骤(2)中的培养料B在配料罐中混合均匀，送至连消装置灭菌后输送至维持罐中，再输送至冷却装置，经过冷却装置冷却后，将培养料B输送至已灭菌处理的料液储罐中；
从种子罐接种0.8％的种子到一级培养罐，培养10小时后，开始从料液储罐以恒定速度向一级培养罐中输入培养料B，培养料B的量为一级培养罐总体积的80％；
所述的一级培养罐发酵培养的条件为，温度34℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7V/V·min；
以同样速度将经一级培养罐发酵所得的一级发酵液输入灭过菌的二级培养罐，待二级培养罐内的二级发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度将所得的二级发酵液输送至灭过菌的芽孢培养罐；所述的二级培养罐发酵培养条件为，温度34℃，搅拌桨转速200rpm，通风量0.9V/V·min；
待芽孢培养罐内发酵液达到罐体总体积的80％后，开始以同样的速度输出终产物发酵液；
所述的芽孢培养罐培养条件为，温度41℃，搅拌桨转速150rpm，通风量0.7V/V·min。
7.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的连续培养方法专用的发酵系统，包括依次串联连接的配料罐、连消装置、维持罐、冷却装置、料液储罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐；
所述的冷却装置与一级培养罐之间并联有种子罐；
所述的芽孢培养罐连接有辅料罐；所述的配料罐与连消装置之间连接有输送泵Ⅰ；所述的维持罐与冷却装置之间有输送泵Ⅱ；
所述的储料罐、一级培养罐、二级培养罐、芽孢培养罐之间均有恒流泵。
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