CN1219871C - 气相双动态固态发酵方法及其发酵装置 - Google Patents

气相双动态固态发酵方法及其发酵装置 Download PDF

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Abstract

本发明的气相双动态固态发酵技术：将待发酵的固体物料置于压力脉动及循环流动空气的双动态环境中进行固态发酵；其发酵装置包括一设快开门的卧式圆筒形罐体，罐内设轴向放置的由4个隔板组成的截面为正方形的长方体间隔筒，隔板与罐壁的空间内设置与隔板平行放置的冷却排管，间隔筒垂向中央设置水平放置的多组冷却排管，罐内下隔板上设有轴向固定轨道，轨道上安装可在其上滚动的活动式料盘架，料盘架上设有多层浅盘，罐体后部设置强制罐内气体循环的离心式鼓风机，可完成微生物纯种培养，容易放大，发酵效价高，无三废，适用生物农药、酶制剂、农用抗生素、单细胞蛋白等发酵生产。

Description

气相双动态固态发酵方法及其发酵装置
                        技术领域
本发明属于发酵工业技术领域，特别涉及一种气相双动态固态发酵方法及其发酵装置。
                        技术背景
自从1945年由微生物学家与化学工程师合作，将弗来明发现的青霉素成功地推向工业化生产以来，液体深层发酵技术已开拓出整个现代发酵工业。固态发酵因输送、搅拌、温度、湿度、pH、供氧等诸多问题缺少工程解决手段，一直达不到现代发酵工业的要求而被忽视。关键问题是没有符合现代发酵工业要求的，成熟的固态发酵罐。这已成为一个世界性难题。
现代发酵工业对微生物纯种培养及大规模生产的严格要求，使液体深层发酵技术占据了统治地位。固态发酵工艺与设备因其易染菌，发酵条件难于控制，工业放大困难等原因，一直被认为是一种古老而落后的发酵技术。但固态发酵的诸多优点，如工艺流程简短，原料来源广泛、便宜，能耗低，无污染等，在生物反应器研制中，具有强大的吸引力与生命力。为改变固态发酵工业这种落后局面，半个世纪以来，尤其是七十年代生化工程新学科提出以来，不乏有人试图攻破这道难题，提出过多种解决方案。B.K.Lonsanc将之归纳为九种类型：(1)转鼓式，(2)木盒式，(3)加盖盘式，(4)垂直培养盒式，(5)倾斜接种盒式，(6)浅盘式，(7)传送带式，(8)圆柱式，(9)混合式。K.E.Aidou将之分成十种类型，大同小异。如果按培养基运动状态来分，则可归纳成静态与动态两大类。静态是指培养基不运动，使传质、传热、供氧困难；温度、湿度、pH难以控制。动态是指培养基处于间断或连续运动状态，虽然传质、传热、供氧大有改善，但机械部件对无菌操作不利，物料搅拌能耗高，破坏菌丝体，工程放大困难等。
人们一方面对传统固态发酵罐，如曲盘、曲箱、曲池努力进行改进，主要是使强体力劳动机械化，严格通风条件；另一方面积极研制适宜于微生物纯种培养要求的密封型机械搅拌固态发酵器。其中研究最多的是转鼓式，还有多层转盘或转耙式，多后翻根塔式，传送带式，机械提升式等。均因传动机构复杂，严格密封困难，死角不易清洗干净等原因，仍难达到现代发酵工业对纯种培养及工业放大的实际要求。
现行的生产所用的固态发酵罐还是传统的浅盘式与厚层通风池式装置，也有直接将培养基压成圆饼状或方砖块置于房间内。规模比较大的方法是遂道窑连续浅盘发酵，均为静态类型，只能用于自然发酵生产过程。从化学反应工程“三传一反”理论的角度看，为强化传质、传热，动态发酵器应是发展方向。因此密闭式动态发酵反应器曾是国内外的研究热点。尤其是转鼓式固态发酵反应器，有大量的相关的研究报导，并进入到工业试验阶段。均因难于防止杂菌污染而经受不住长期生产考验。其它类型的密闭动态发酵反应器均局限于实验室探索阶段。
                          发明内容
本发明的目的之一是解决目前固态发酵技术存在的易染杂菌、传热传质和放大困难的问题，提供一种能纯种培养、传递速率快和易放大的气相双动态固态发酵方法。
本发明的另一目的是解决目前固态发酵装置存在的易染杂菌、传热传质和放大困难的问题，提供一种能纯种培养、传递速率快和易放大的气相双动态固态发酵装置。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的气相双动态固态发酵方法，其特征在于，将待发酵的固态物料置入压力脉动及循环流动空气的双动态环境中进行固态发酵；所述的压力脉动环境为：由装在发酵罐罐体上的进气电磁阀控制向发酵罐罐体内注入无菌空气，使其压力控制在1.5-3.5Kg/cm2范围内，当压力达到该设定值时，关闭进气电磁阀，同时维持该压力1-5min，然后开启装在发酵罐罐体上的排气电磁阀，罐体内泄压，泄压后保持罐内压力为0.1-0.5Kg/cm2，关闭排气电磁阀，维压10-60秒；之后，再次开启进气电磁阀，重复上述加压和泄压过程，便实现发酵物料在脉动压力及循环流动空气的气相双动态控制下的固态发酵。
本发明提供的气相双动态固态发酵装置，包括一卧式圆筒形罐体1，罐体1的罐前端设置有可快速启、闭罐门的快开门结构6，罐体1上罐壁的两端分别安装由进气阀10控制的进气管，罐体1下罐壁的两端分别安装由排气阀11控制的排气管，其特征在于：罐体1内设有轴向放置的由4个隔板41组成的截面为正方形的长方体间隔筒，隔板41与罐壁之间的空间内设有与隔板41平行放置的冷却排管81，冷却排管81一端连有冷却水进口管811，另一端连有冷却水排水管812，长方体间隔筒的垂向中央设置水平放置的多组冷却排管8，每组冷却排管8设有各自的冷却水进口管和冷却水排水管，罐体1内的下隔板41之上设有轴向放置的罐内固定轨道16，罐内固定轨道16上安装有可在其上作滚动运动的活动式料盘架14，活动式料盘架14设有多个水平放置的供盛放固体培养基的浅盘15，所述活动式料盘架14为一排或二排；罐体1后部罐壁上连通用以强制罐内气体循环的离心式鼓风机9；所述快开门盖结构6为错齿结构：罐体前端及罐盖相对的表面上分别设有相互错开并紧密配合的呈凹凸形状的凹状错齿61和凸状错齿611，罐盖由电动机驱动与罐体前端实行错齿式闭锁；所述的轴向罐内固定轨道16与设置在罐体外的罐外活动轨道17相连接，罐外活动轨道17的另一端与设置在罐体外的罐外固定轨道18相连接，设置在罐外固定轨道18上的机械牵引车19牵引活动式料盘架14进出固态发酵罐。
本发明的基本思想是对固态发酵罐内的气相压力人为施以周期脉动，脉动的周期、振幅及波形将随不同发酵对象、发酵时间而改变；其次，在气相双动态固态发酵罐内设循环、风道及多组冷却排管，强制罐内气相空气顺次通过物料和冷却排管，强制带走物料中的热量，并强制热空气与冷却盘管热量交换，降低发酵物料的温度，并保证了发酵温度与湿度的均匀一致与可调节性。这种气相双动态方法和装置将引起三重效应：(1)加速微生物的新陈代谢；(2)加速营养物与代谢产物在细胞壁内外间的传递；(3)固态培养基堆积层内颗粒间空隙中的气相与反应器内气相主体间的传质与传热方式将由分子扩散转变成对流扩散。
传统的固态堆积发酵，固体培养料堆积层内微生物代谢产生的热量与二氧化碳散发，主要是采用薄层，机械翻动或下部鼓风方法解决。而薄层发酵是靠缩短空隙内静态分子扩散的行程，达到散热目的。机械翻动或下部鼓风是变分子扩散为对流扩散，但对菌体有很大损伤。采用气相双动态操作也可以变分子扩散为对流扩散，当气相主体压力增高时，气体会流入空隙，直至达到压力平衡。当气相主体压力降低时，空隙中的气相压力也会随之流入气相主体而使压力降低，达到低压平衡；同时，强制罐内气相空气顺次通过物料和冷却排管，保证了发酵温度与湿度的均匀一致与可调节性。
例如对纤维素酶发酵，采用气相双动态发酵所得产品酶活比恒压所得产品酶活高2～3倍。发酵时间一般缩短三分之一。例如B.t发酵，恒压时为3天，变压时为2天。对白僵菌或绿僵菌，一般为7天，变压时为5天。核黄素发酵可以从12天缩短至7天，等等。白僵菌发酵的活孢子数，实验可达800亿个/克，一般在500亿个/克以上。
本发明具有以下特点：
1.无固体层机械翻动装置，由薄层、气相双动态及循环风机达到传质与传热要求。
2.由于无固体翻动机械传动，反应器结构简单容易密封，便于工业放大。
3.反应器为一受压容器，可用压力蒸汽进行严格的空罐或实罐灭菌。无死角，便于清扫。
4.采用无菌压缩空气供氧，发酵过程中反应器为正压状态，故能严格达到纯种固态培养的要求。
5.气相双动态有促进微生物代谢、强化细胞内外的传质，减少代谢产物的反馈抑制，从而有缩短发酵周期、提高转化率的功能。
6.反应器的环形结构与循环鼓风机，使反应器内的温度、湿度均匀一致。
7.反应器内设置冷却排管，加之循环风机配合后，强制罐内气相空气顺次通过物料和冷却排管，降低发酵物料的温度，并便于反应器内温度与湿度的调控。
8.气相双动态的周期、振幅与波形由进出气阀的适时自动控制系统完成，可以随发酵过程对供氧与发热要求进行计算机在线优化控制。
本发明与传统固态发酵的本质差别有：(1)实现了严格意义上的纯种培养。实现了规模性工业化生产。(2)周期刺激使发酵毒力效价提高3--5倍。(3)发酵过程中温度、湿度、pH可控。(4)真空冷凝干燥不但不使毒力效价降低，反而有所提高.(5)无三废排放。(6)设备投资虽比传统固态发酵法高，但又比液体深层发酵低得多。
该固态发酵方法彻底改变“固体发酵是一种古老而落后的生产方法”的流行观念。现行的发酵工程与生化工程教科书将改写，在诸多方面它比液体深层发酵技术更先进。现代发酵工业技术史走过了一个螺旋阶梯。
本气相双动态固态发酵技术具有广泛的适用性与推广意义，是一种有别于液体深层发酵技术的新型固态发酵技术。实现了现代发酵工程所要求的：工艺上纯种培养，工程上大规模产业化的双重目标。这一高新技术在国际上也具有开创性，因为长期以来它也是国际上公认的世界难题。
本申请人从1984年起一直坚持对固态发酵技术及发酵装置的研究，1999年在“四传一反”非线性理论及其以法向力为动力源的“外界周期刺激强化生物反应及细胞内外传质速率”的设计原理下，开发出本发明的气相双动态固态发酵技术和装置；并从0.5升试验到800升中试，再到25000升和70000升工业规模；建成了一固态发酵大规模纯种培养苏云金杆菌可湿性粉剂的示范性工厂，显示出诸多优于液体深层发酵技术的经济指标；既是对我国苏云金杆菌产业化研究的突破，也是对固态发酵技术的突破，还有可能是对“生物反应工程”新学科基础理论的突破。
操作程序如下：首先用蒸汽对空罐(包括活动式料盘架)进行灭菌处理无菌，然后冷却，同时通入无菌空气，在无菌操作期间内通过快开门结构快速打开快开门，拉出活动式料盘架，在多层浅盘上均匀分布接入菌种后的固态发酵基质层，马上推入发酵装置的罐体内，关闭快开门，调整罐体内温度与湿度，施以气相双动态控制，发酵完毕后可以利用加热系统实施真空冷凝干燥。
●操作方法
主要操作是用无菌空气对罐内压施以周期性脉动，罐压的变化曲线如图1所示；罐体气相压力通过无菌空气的充压与泻压，在峰压与空压之间周期波动；周期时间由充压时间，峰压稳定时间，泻压时间及空压稳定时间四段组成，罐体内始终处于正压状态。峰压值一般为1.5--3.5kg/cm2，空压一般为0.1--0.5kg/cm2，充压时间较长，曲线上升平缓，一般在1～5分钟，由气源能力而定；泻压时间要求尽可能短，一般在一分钟之内，尤其是开始十秒钟，压降速度要快，使固体培养基潮湿颗粒之间的气体发生突然膨胀而使料层发生松动；峰压时间与空压时间由人为设定控制，一般峰压稳定时间大于空压稳定时间，并随发酵时间而变化，一般在对数增长期，变化频率高，延迟期与稳定期频率小。周期时间一般为15分钟到150分钟。由于罐压操作简单，自动控制容易。
附图说明
附图1为本发明的结构示意图；
附图2为本发明的长方形隔筒的纵向截面示意图；
附图3为罐内固定轨道16、罐外活动轨道17和罐外固定轨道18之间的连接示意图；
附图4为罐体前端错齿结构示意图；
附图5为罐盖的错齿结构示意图；
其中；罐体1              快开门结构6         进气阀10
      排气阀11           隔板41              冷却排管81
      冷却水进口管811    冷却水排水管812     冷却排管8
      活动式料盘架14     浅盘15              离心式鼓风机9
      罐外活动轨道17     罐外固定轨道18      机械牵引车19
      凹状错齿61         凸状错齿611         罐内固定轨道16
                          实施方式
下面结合附图及实施例进一步描述本发明：
实施例1：用图1所示的固态发酵装置和本发明的方法固态发酵生产B.t生物农药可湿性粉剂：
由图1可知，本发明的气相双动态固态发酵装置，包括一卧式圆筒形罐体1，罐体1的罐前端设置有可快速启、闭罐门的快开门结构6，罐体1上罐壁的两端分别安装由进气阀10控制的进气管，罐体1下罐壁的两端分别安装由排气阀11控制的排气管，其特征在于：罐体1内设有轴向放置的由4个隔板41组成的截面为正方形的长方体间隔筒，隔板41与罐壁之间的空间内设有与隔板41平行放置的冷却排管81，冷却排管81一端连有冷却水进口管811，另一端连有冷却水排水管812，长方体间隔筒的垂向中央设置与水平放置的多组冷却排管8，每组冷却排管8设有各自的冷却水进口管和冷却水排水管，罐体1内的下隔板41之上设有轴向放置的罐内固定轨道16，罐内固定轨道16上安装有可在其上作滚动运动的活动式料盘架14，活动式料盘架14设有多个水平放置的供盛放固体培养基的浅盘15，所述活动式料盘架14为一排或二排；罐体1后部罐壁上连通用以强制罐内气体循环的离心式鼓风机9；所述快开门盖结构6为错齿结构：罐体前端及罐盖上分别设有相互错开并紧密配合的呈凹凸形状的凹状错齿61和凸状错齿611，罐盖由电动机驱动与罐体前端实行错齿式闭锁；所述的轴向罐内固定轨道16与设置在罐体外的罐外活动轨道17相连接，罐外活动轨道17的另一端与设置在罐体外的罐外固定轨道18相连接，设置在罐外固定轨道18上的机械牵引车19牵引活动式料盘架14进出固态发酵罐。
本实施例使用的菌种：苏云金杆菌(B.t Var Kurstaki)；发酵基质：麸皮、棉子饼粉、玉米粉、米糠、玉米浆、生石灰，含水51-60％发酵控制条件：温度30℃，湿度95％，压力周期10-60分钟，振幅0.5-3.0Kg/cm2，波形：快速泄压与充压。
用本发明的气相双动态固态发酵方法、三角瓶发酵技术和瓷盘发酵技术对上述物料进行固态发酵对比试验：
其具体发酵步骤为：将待发酵的固态物料置入本实施例的压力脉动及循环流动空气的气相双动态固态发酵装置(双动态环境)中进行固态发酵；由进气电磁阀控制向发酵罐罐体内注入无菌空气，使其压力控制在1.5-3.5Kg/cm2范围内，当压力达到该设定值时，关闭进气电磁阀，同时维持该压力1-5min，然后开启装在发酵罐罐体上的排气电磁阀，罐体内泄压，泄压后保持罐内压力为0.1-0.5Kg/cm2，关闭排气电磁阀，维压10-60秒；之后，再次开启进气电磁阀，重复上述加压和泄压过程，便实现发酵物料在脉动压力及循环流动空气的气相双动态控制下的固态发酵。
三角瓶发酵技术和瓷盘发酵技术为传统的发酵技术，在此不予以赘述；
苏云金杆菌Bacillus thuringiensis(B.t)杀虫剂是国际上公认的最有效，也最具代表性的微生物生态制剂，属于生物防治范畴，用于杀灭鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目等10个目500多种碱性胃昆虫，在蔬菜、果树、棉花、茶叶、烟草、森林、玉米、水稻、大豆、粮食储存，乃至蚊、蝇等领域都具有很好的防治虫害效果。由于它只对碱性胃昆虫有毒杀作用，故对酸性胃的人、畜及鸟类无害，对环境无污染，害虫难以形成抗药性，是八十年代以来国际上迅速崛起的最重要的微生物杀虫剂。
世界卫生组织早已核实，B.t对人畜无害，对家禽、鸟类、鱼类无害。几十年来国内外从未发现B.t生产人员有过中毒现象。
我国B.t质量部颁标准有两类产品，共六个规格。一种是乳剂，毒力效价有2000IU/μl，4000IU/μl，8000IU/μl三个等级。另一种是可湿性粉剂，毒力效价有8000IU/mg，16000IU/mg，32000IU/mg。国际市场的可湿性粉剂一般为16000IU/mg。国内产品多为乳剂，毒力效价2000IU/μl。
应用本发明的气相双动态固态发酵方法，连续55罐批，平均毒力效价16000IU/mg，最高批次达23000IU/mg。与现行的液体深层发酵路线比较，气相双动态固态发酵新方法生产B.t生物农药可湿性粉剂可行性研究结论。
1、B.t可湿性粉剂为国家环保急需产品，对绿色食品生产具有特殊意义。从去年起全国各省市政府发布通令，蔬菜生产禁止使用化学农药，为B.t发展提供了新的契机。
2、气相双动态固态发酵新技术是我国自行研制开发的，在国内外均具有重大开创性意义。与国内外通行的液体深层发酵技术比较，设备投资只有四分之一，生产成本只有2.5分之一。为生态工业与生态农业的创建与发展奠定了坚实基础。
3、我国液体深层发酵法生产B.t可湿性粉剂技术尚未过关，一般以乳剂出售，保存期只有三个月，而可湿性粉剂保存期可在三年以上。本固态发酵新技术将开创我国B.t可湿性粉剂产业化的新局面。
其固态发酵对比试验结果如下表：
  发酵器类型   发酵时间(小时)     活孢子数(亿个/克)   毒力效价(IU/mg) 晶体分离率(％)
  本发明固态发酵罐   42--48     250--400   12000--20000     ＞80
  三角瓶(对比)   72     100--150   4000--6000     30--50
  瓷盘(对比)   72     150--200   6000--8000     50
实施例2：用同实施例1相同的方法和步骤进行“微生物饲料添加剂用腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DM423”的固态发酵对比试验，其结果如下表：
  发酵技术 反应器类型 发酵时间 活孢子数     成本
  (小时) (亿个/克(毫升)     (元/吨)
液体深层发酵 标准机械罐     48  30--50亿个/毫升     15000
    固态发酵 本发明固态发酵罐     48  200--300亿个/克     3000
瓷盘     48  80--200亿个/克     有染菌
实施例3：用同实施例1相同的方法和步骤进行“白僵菌生物农药生产”的固态发酵：
白僵菌是一种半知菌类的虫生真菌，寄主范围广，致病力强，对人畜林木作物无毒害，不伤害天敌，不污染环境，是应用最广泛的微生物杀虫剂之一。白僵菌属于昆虫的真菌病原菌，通过昆虫的表皮或气孔进入昆虫体内，使昆虫致病而死。对食叶害虫均有较好的杀虫效果，特别是对森林害虫有特效。市场前景广阔。目前，我国是生产和应用白僵菌杀虫剂的第一大国，每年施用面积约50万公顷，在防治松毛虫和玉米螟方面作出了重要贡献。在国外，一般采用液体发酵生产白僵菌，其生产成本高；国内大多是浅盘培养，生产规模小，污染严重，产品不稳定，只是个别林场小规模季节性生产自用。我国生产白僵菌制剂主要采用浅盘固态培养和液固两相法。本法还存在着工艺复杂、生产周期长、成本高、产品质量不稳定等问题，其产品还远远不能满足市场需要。
采用我们多年研制的周期刺激固态发酵罐生产白僵菌，可以保证纯种发酵，并易放大规模发酵，效价比浅盘培养提高23倍。白僵菌发酵的活孢子数，实验可达800亿个/克，一般在500亿个/克以上。

Claims (5)

1.一种气相双动态固态发酵方法，其特征在于，将待发酵的固态物料置入压力脉动及循环流动空气的双动态环境中进行固态发酵；所述的压力脉动环境为：由装在发酵罐罐体上的进气电磁阀控制向发酵罐罐体内注入无菌空气，使其压力控制在1.5-3.5Kg/cm2范围内，当压力达到该设定值时，关闭进气电磁阀，同时维持该压力1-5min，然后开启装在发酵罐罐体上的排气电磁阀，罐体内泄压，泄压后保持罐内压力为0.1-0.5Kg/cm2，关闭排气电磁阀，维压10-60秒；之后，再次开启进气电磁阀，重复上述加压和泄压过程；所述的循环流动空气环境为：发酵罐内设循环风道及多组冷却排管，罐体后部罐壁上连通用以强制罐内气体循环的离心式鼓风机，强制罐内气相空气顺次通过发酵物料和冷却排管，强制带走发酵物料中的热量，并强制热空气与冷却排管热量交换，降低发酵物料的温度；便实现了发酵物料在脉动压力及循环流动空气的气相双动态控制下的固态发酵。
2.一种气相双动态固态发酵装置，包括一卧式圆筒形罐体(1)，罐体(1)的罐前端设置有可快速启、闭罐门的快开门结构(6)，罐体(1)上罐壁的两端分别安装由进气阀(10)控制的进气管，罐体(1)下罐壁的两端分别安装由排气阀(11)控制的排气管，其特征在于：罐体(1)内设有轴向放置的由4个隔板(41)组成的截面为正方形的长方体间隔筒，隔板(41)与罐壁之间的空间内设有与隔板(41)平行放置的冷却排管(81)，冷却排管(81)一端连有冷却水进口管(811)，另一端连有冷却水排水管(812)，长方体间隔筒的垂向中央设置水平放置的多组冷却排管(8)，每组冷却排管(8)设有各自的冷却水进口管和冷却水排水管，罐体(1)内的下隔板(41)之上设有轴向放置的罐内固定轨道(16)，罐内固定轨道(16)上安装有可在其上作滚动运动的活动式料盘架(14)，活动式料盘架(14)设有多个水平放置的供盛放固体培养基的浅盘(15)；罐体(1)后部罐壁上连通用以强制罐内气体循环的离心式鼓风机(9)。
3.按权利要求2所述的气相双动态固态发酵技术的装置，其特征在于，所述活动式料盘架(14)为一排或二排。
4.按权利要求2所述的气相双动态固态发酵技术的装置，其特征在于，所述快开门盖结构(6)为错齿结构：罐体前端及罐盖相对的表面上分别设有相互错开并紧密配合的呈凹凸形状的凹状错齿(61)和凸状错齿(611)，罐盖由电动机驱动与罐体前端实行错齿式闭锁。
5.按权利要求2所述的气相双动态固态发酵技术的装置，其特征在于，所述的轴向罐内固定轨道(16)与设置在罐体外的罐外活动轨道(17)相连接，罐外活动轨道(17)的另一端与设置在罐体外的罐外固定轨道(18)相连接，设置在罐外固定轨道(18)上的机械牵引车(19)牵引活动式料盘架(14)进出固态发酵罐。
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