CN108541805B

CN108541805B - 一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法及发酵物及其应用

Info

Publication number: CN108541805B
Application number: CN201810189782.6A
Authority: CN
Inventors: 张仁文; 王丽; 谢丽静; 张震宇; 丁立
Original assignee: HUBEI LVXUE BIOLOGICAL INDUSTRY CO LTD
Current assignee: HUBEI LVXUE BIOLOGICAL INDUSTRY CO LTD
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: CN108541805A

Abstract

本发明属于丁酸梭菌的发酵领域和环保工程领域，具体提供了一种丁酸梭菌发酵离心废液的再利用技术及其在蛋用鹌鹑养殖中的应用。丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：每吨丁酸梭菌发酵废水加入豆粕120‑300kg、玉米粉120‑300kg、稻壳粉100‑240kg、玉米芯粉100‑200kg、碳酸钙40‑100kg；首先将豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙混合均匀加入到发酵废水中搅拌均匀，之后装袋、密封发酵至少三天；丁酸梭菌芽孢率达到90％，即结束发酵。在对丁酸梭菌发酵废水无害化处理的同时又生产出了丁酸梭菌发酵饲料。可用于动物养殖，特别用于鹌鹑养殖中效果尤其突出。

Description

一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法及发酵物及其应用

技术领域

本发明属于丁酸梭菌的发酵领域和环保工程领域，具体提供了一种丁酸梭菌发酵离心废液的再利用技术及其在蛋用鹌鹑养殖中的应用。

背景技术

丁酸梭菌能够防止病原菌及腐败菌在肠道内的异常增殖，同时还可以促进肠道有益菌群增殖、繁育，从而纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的产生，其代谢产生的活性物质能增强动物的免疫功能，促进动物的生长，提高动物的生产性能，其代谢产生的酶类可降解饲料，提高饲料营养，代谢产生的丁酸、乙酸等有机酸不仅可以改善肠道环境、促进有益菌繁殖，还可以抑制有害菌增殖，提高饲料的适口性等；其还可以在肠道内代谢产生多种酶类、氨基酸、B族维生素和维生素K等，为宿主补充营养物质兼具其他保健功能。

目前丁酸梭菌一般采用液体发酵和固体发酵方法生产，固体发酵方法操作简单，成本相对较低，但是其发酵过程难以控制，导致发酵过程中存在被环境微生物污染的问题和风险，因此在兽药生产中很少用到，固体发酵法在饲料及饲料添加剂生产中被广泛应用。丁酸梭菌液体发酵技术是目前丁酸梭菌工业化发酵生产的主要方法，对于丁酸梭菌发酵液的后处理工艺一般都是采用冷冻干燥、喷雾干燥技术和闪蒸干燥技术来对其干燥，但是这些方法都需要先对丁酸梭菌发酵液离心处理，这就导致了大量发酵污水的形成，同时由于丁酸梭菌的主要益生物质例如：部分丁酸梭菌菌体，丁酸、乙酸等有机酸，淀粉酶、蛋白酶等酶系，维生素E、维生素B等维生素，丁酸梭菌素等益生物质仍有较大量存在于离心液中，对丁酸梭菌生产和应用造成了巨大的浪费，同时也对污水处理系统带来了很大的处理成本和压力。

关于发酵废液的处理并未引起足够的重视，相关专利比较少，例如：公开号:101979648A的发明《一种利用发酵废水与补糖工艺相结合生产阿维菌素的方法》公开了一种利用发酵废水与补糖工艺相结合生产阿维菌素的方法，包括以下工艺步骤：1)阿维链霉菌种子发酵培养；2)发酵初期，向上述的发酵培养液中添加灭菌后的阿维菌素发酵处理废水；3)发酵100-140小时后，进行补糖操作；4)发酵270-300小时后发酵结束。本发明有效解决了阿维菌素发酵废水的回收利用问题，同时提高了阿维菌素发酵效价。

公开号:104489241A的发明《一种处理阿维菌素发酵废水并生产生物饲料的方法》公开了一种处理阿维菌素发酵废水并生产生物饲料的方法，涉及生物发酵与抗生素发酵废水处理技术领域，该方法用葡萄糖、酵母膏、尿素、磷酸二氢钾和水制种子培养基，再接入白地霉孢子悬液，培养白地霉种子液；将阿维菌素发酵结束后得到阿维菌素发酵废水加入尿素、磷酸二氢钾，制成白地霉发酵培养基，再将白地霉种子液接入白地霉发酵培养基中进行白地霉菌素的发酵培养，白地霉发酵培养完成后，经板压滤，所得滤饼烘干后得到的白地霉生物饲料。

上述两篇专利对发酵废液的处理均是添加发酵底物，仍然用于原菌种的发酵培养。

公开号:106477795A的发明《一种维生素B₂废水资源化综合处理方法及装置》公开的综合处理方法步骤包括：维生素B₂生产废水调节pH后送入陶瓷纳滤膜，维生素B₂大部分被截留，陶瓷纳滤膜将维生素B₂发酵废水分为陶瓷纳滤膜浓缩液和陶瓷纳滤膜透过液两部分，陶瓷纳滤膜浓缩液送入陶瓷微滤膜系统进一步浓缩，获得的陶瓷微滤膜浓缩液经重结晶制得维生素B₂产品，陶瓷纳滤膜透过液送入有机纳滤膜进一步处理，透过有机纳滤膜的废水再送入蒸发系统处理，获得蒸馏水与氯化钠结晶盐，被有机纳滤膜截留的废水与陶瓷微滤膜透过液均返回前段与原水混合再处理。虽然能够变废为宝，回收废水中的维生素B₂、盐及水，但是对设备要求高，成本也高，且工艺比较复杂。

公开号:106830571A的发明《一种抗生素发酵废水的处理系统及处理方法》抗生素发酵废水的处理系统及处理方法，包括相互连通的混凝反应池、第一沉淀池、第一中和池、厌氧池、好氧池、第二沉淀池、调酸池、Fenton反应池、第二中和池、第三沉淀池以及氧化塘；所述第一中和池、第二中和池以及Fenton反应池内均设有搅拌器，所述混凝反应池设有一混凝搅拌装置；所述厌氧池、好氧池内均设有悬浮载体，所述好氧池连接一曝气装置。本发明可有效降低制药废水中的COD，提高废水出水的可生化性。

公开号:105417844A的发明《一种发酵废水处理方法及生物饲料》公开的发酵废水处理方法包括如下处理步骤：将发酵废水通过离心机进行离心分离为清液和浓液，其中，浓液的生物质浓度大于清液的生物质浓度；将浓液送入干燥塔进行雾化干燥后得到干粉；将清液送入污水处理系统，清液在污水处理系统中调节PH至中性后再通过生化处理后排放。由此，分离后的清液经过污水处理系统降低了发酵废水中的COD和悬浮物含量，解决了发酵废水直接进入污水处理系统后不利于生化反应正常进行的技术问题，从而减轻后续污水处理的负荷，具有显著的环保效益。

公开号:104016461A的发明《一种维生素B₁₂发酵过程中发酵及分离过程中的废水综合处理工艺》公开了一种维生素B₁₂发酵过程中发酵及分离过程中的废水综合处理工艺，该工艺主要采用向废水中添加增稠剂的方式实现，所采用的增稠剂主要包括双氧水、淀粉和生石膏，本发明所提供的处理方法一改现有技术中的传统思路，可以将废水中的营养成分转化为可二次利用的动物饲料。该发明存在一些不足之处，首先该发明采用的事物理方法直接对发酵废水进行增稠处理工艺来达到利用废水的目的，该工艺存在以下弊端：1.该方法所需能耗较大，主要体现在对添加的淀粉的糊化上，淀粉糊化需要90℃以上的高温才能达到糊化的目的，因此需要很大的能耗；2.该工艺制备的粘稠性的动物性饲料，主要成分是石膏及滑石粉，很少大量的作为饲料应用于动物养殖中，少量的糊化淀粉营养价值不大，适口性差，不太适合作为动物饲料；3.该种发酵废水中存在的抗生素被包裹在制备的胶体状物质种，在作为动物饲料喂养动物过程中将抗生素直接通过饲料进入动物体内，对食品安全构成威胁。

公开号:1916155的发明《一种利用发酵废水制备发酵培养基及生产生物农药的方法》公开了一种利用发酵废水制备发酵培养基及生产生物农药的方法，分别利用沼液、酒精废水、味精废水制备发酵培养基，以灰色链霉菌或乳黄色细菌为菌种，在28℃恒温、100-150rpm转速及通气的条件下发酵7-10天，过滤、浓缩、提纯制得生物农药；利用发酵废水制备发酵培养基，继而发酵生产生物农药。但是该发明存在以下问题：1.需要对废水进行大量的稀释才能够使用，这导致了该方法效率较低；2.不同的废水理化性质不同，导致利用该技术生产的生物农药发酵水平不稳定，不利于工业化应用；3.该工艺对发酵废水的应用是液体发酵，设备要求高，但是处理效率低，不适合工业化生产。

发明内容

针对目前益生菌发酵废水再利用技术方面的欠缺，本发明提供了一种丁酸梭菌发酵离心废液再利用方法，该方法采用往离心发酵废液中投入豆粕、玉米粉、稻壳、玉米芯粉、碳酸钙等物质进行二次发酵，本发明提供的丁酸梭菌离心废液处理方法改变了传统污水处理的思路，该方法可以最大程度的利用丁酸梭菌发酵过程产生的益生物质，以及离心过程中发酵滤液中存在的丁酸梭菌菌体，使其进一步的进行二次发酵，转化为可利用的微生物饲料添加剂，应用于动物养殖。所用添加物都是动物直接可以食用的物质，不仅不会对动物养殖产生副作用，反而可以提高饲料利用率和动物的健康水平。该方法可以使丁酸梭菌类益生菌液体发酵后的离心废液得到最大程度的再利用，并且可以广泛推广应用于其他益生菌的发酵废水的处理中。

为解决丁酸梭菌发酵废水的处理问题，本发明利用含有丁酸梭菌活菌、益生物质的发酵废液与豆粕、玉米粉、稻壳、碳酸钙等物质按照一定比例混合做成半固体状饲料，供动物直接饲用，起到即可用解决发酵废水处理问题又可以提高养殖效益，生产无抗动物产品的目的，同时可以利用丁酸梭菌发酵废液中存在的离心不彻底的丁酸梭菌，以及豆粕、稻壳中存在的枯草芽孢杆菌等益生菌对上述半固体饲料进行二次发酵，利用二次发酵物制备丁酸梭菌饲料添加剂制剂，应用于鹌鹑的养殖。

丁酸梭菌发酵滤液中存在1-3％的丁酸梭菌菌体，同时滤液中还存在丁酸、乙酸等有机酸，淀粉酶、蛋白酶等酶系，维生素E、维生素B等维生素多种益生物质，可以直接作为饲喂的微生态制剂，但是发酵滤液直接应用存在运输成本高；运输过程很容易变质失去其应用价值等问题很难直接作为微生态制剂来应用于畜禽的养殖中。因此将液体状态的发酵滤液转化为固体状态的微生态制剂是丁酸梭菌发酵滤液工业化应用的前提。

丁酸梭菌二次发酵物不仅直接解决了环保问题，还间接的将兽药丁酸梭菌活菌制剂发酵废水通过二次发酵转化为饲料添加剂，这种饲料添加剂中存在大量的丁酸、乙酸等挥发性不饱和脂肪酸，由于碳酸钙的作用，将这些不饱和脂肪酸中和成稳定的盐类存在于发酵物中。而传统的生产方法丁酸梭菌制剂生产方法是通过对发酵液的离心处理来收集芽孢，发酵离心液直接废弃，这样的方法直接导致了丁酸梭菌发酵代谢产物的损失。

本发明不仅使发酵废水中的益生菌、益生物质得到了回收利用，而且还将发酵污水得到了无害化处理，同时将发酵产物在鹌鹑养殖中得到了应用。

为解决上述问题，本发明提供一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

每吨发酵废水加入豆粕120-300kg、玉米粉120-300kg、稻壳粉100-240kg、玉米芯粉100-200kg、碳酸钙40-100kg；

首先将豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙混合均匀加入到发酵废水中搅拌均匀，让这些固体物质充分吸收其中水份，之后装袋、密封发酵至少三天；通过平板计数法测定混合物中有益菌丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌活菌数，通过显微镜观察的方法测定丁酸梭菌及枯草芽孢杆菌芽孢率，丁酸梭菌芽孢率达到90％以上时，即可达到发酵终点，结束发酵，即得丁酸梭菌二次发酵物；各项指标均符合NY/T 1444微生物饲料添加剂技术通则的要求。其中功能微生物丁酸梭菌达到1.21×10¹⁰cfu/g，芽孢率达到95.54％；功能微生物枯草芽孢杆菌活菌数为：4.21×10⁷cfu/g，芽孢率达到44.88％。杂菌率<1.0％，杂菌大肠杆菌未检出，杂菌霉菌<2×10⁴cfu/g，病原菌未检出。可以作为饲料添加剂应用于动物养殖。

较佳的，所述发酵废水为丁酸梭菌发酵废水；

较佳的，所述丁酸梭菌发酵废水为一株保藏菌株丁酸梭菌的发酵滤液；所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具体为LXKJYB-1，已于2017年9月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017485，具有耐丁酸、抗逆性强的特性。

该菌种具体特征如下：

(1)耐丁酸能力：能够耐受40g/L丁酸钠；

(2)产丁酸能力强：经发酵后测定该菌株发酵液含丁酸12.19g/L。

(3)发酵能力：菌株LXKJYB-1发酵后，体系中的活菌数达到7.19×10⁹cfu/mL，芽孢率达到98.79％；

(4)抗菌活性：体外实验证明该菌株对大肠杆菌、沙门氏杆菌、单增李斯特菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达到84.34％、75.53％、73.07％、69.25％和80.03％，具有较强的应用价值。

(5)应用效果：日粮中添加0.01％～0.08％丁酸梭菌LXKJYB-1制剂都能够提高樱桃谷肉鸭成活率、促进生长及提高日增重，降低了料肉比、腹泻率和死亡率，同时增加樱桃谷肉鸭盲肠中乳酸菌和双歧杆菌的数量，降低大肠杆菌数量的作用，菌株LXKJYB-1适合作为促生长，抗腹泻，提高养殖生产水平的微生态制剂应用于樱桃谷肉鸭的养殖。

本发明所使用的这些物质具体所起作用如下：

豆粕、玉米粉作为发酵废液二次发酵的主要原材料，豆粕本身既可以作为枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌发酵的氮源，也可以作为碳源，玉米粉主要作为丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌发酵的碳源；玉米芯粉和稻壳主要起到吸收水分和分散作用，不至于使豆粕、玉米粉等结块聚集到一起，同时稻壳中存在大量枯草芽孢杆菌，为发酵过程提供枯草芽孢杆菌菌种来源，而枯草芽孢杆菌在丁酸梭菌二次发酵过程中主要起到消耗空气和酶解豆粕和玉米粉的作用；碳酸钙主要起到在丁酸梭菌二次发酵过程中稳定和维持pH的作用。

采用上述方法制备的丁酸梭菌发酵废水的二次发酵物不仅使原发酵液中的丁酸、乙酸等有机酸，淀粉酶、蛋白酶等酶系，维生素E、维生素B等维生素多种益生物质得到了利用，同时解决了处理污水的问题，使丁酸梭菌的发酵实现了绿色环保，同时也为养殖业提供了优质价廉的饲料添加剂微生态制剂，促进无抗养殖事业的发展。

丁酸梭菌废液的二次发酵物，既可以作为饲料直接喂养牛羊等反刍动物，同时还可以作为饲料添加剂应用于猪及禽类养殖，具体使用量及使用情况需要根据二次发酵物中丁酸梭菌及枯草芽孢杆菌含量来确定。

该方法适宜在35℃环境的密闭环境中进行发酵，发酵过程首先是来源于稻壳中的枯草芽孢杆菌的好氧发酵，将环境中的氧气消耗完后丁酸梭菌开始生长繁殖，进入产酸发酵阶段，产酸达到一定程度、同时环境不适宜丁酸梭菌菌体生长时，丁酸梭菌进入芽孢形成阶段，丁酸梭菌芽孢是在碳源物质几乎消耗完才进入芽孢形成阶段，芽孢形成阶段进入的早晚与玉米粉、豆粕等的添加量直接相关，因此可以通过调节豆粕粉，玉米粉的添加量来控制丁酸梭菌发酵周期及芽孢率。保藏菌种丁酸梭菌CCTCC M 2017485抗逆性强、发酵能力强、产丁酸高、耐丁酸、芽孢率高等特点使废水发酵具有容易启动，对发酵介质的要求低，发酵周期短，容易实现等优点。其二次发酵产物的丁酸含量高、芽孢率高等优点使饲喂效果甚至优于丁酸梭菌活菌制剂。

发明人对豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙的添加量进行了进一步的优化，提供较优的原料配比、发酵时间以及上述因素与活菌数的关系：

作为本发明的一种实施方式，提供配比1：每吨发酵废水加入豆粕粉120kg，玉米粉120kg，稻壳粉240kg、玉米芯粉190kg、碳酸钙50kg，最好静置培养72h，得到丁酸梭菌二次发酵物；

检测丁酸梭菌活菌数为：3.85×10⁹cfu/g，芽孢率达到94.54％；枯草芽孢杆菌活菌数为：1.16×10⁷cfu/g，芽孢率达到44.36％。各项指标均符合NY/T 1444微生物饲料添加剂技术通则的要求。

作为本发明的一种实施方式，提供配比2：每吨发酵废水加入豆粕200kg、玉米粉200kg、稻壳粉100kg、玉米芯粉200kg、碳酸钙40kg，最好静置培养96h，得到丁酸梭菌二次发酵物；

检测丁酸梭菌活菌数为：1.21×10¹⁰cfu/g，芽孢率达到95.54％；枯草芽孢杆菌活菌数为：4.21×10⁷cfu/g，芽孢率达到44.88％。各项指标均符合NY/T 1444微生物饲料添加剂技术通则的要求。

进一步所述丁酸梭菌二次发酵物的制备方法还可以包括，闪蒸干燥、粉筛，干燥后制备丁酸梭菌菌粉，丁酸梭菌活菌数达到2.49×10¹⁰cfu/g，芽孢率达到98.10％。

进一步所述丁酸梭菌二次发酵物的制备方法还可以包括载体稀释，通过加入二氧化硅、淀粉等对菌粉进行稀释，制备成丁酸梭菌活菌数不低于3.0×10⁸cfu/g的丁酸梭菌饲料添加剂产品。

本发明同时提供一种丁酸梭菌二次发酵物，可以作为微生物饲料添加剂应用于养殖业，直接饲喂或添加于饲料均可。可以为半固态、固态、粉末等多种形式。

本发明同时提供一种丁酸梭菌二次发酵物的应用，研究发现：在日粮中添加50g/t-100g/t活菌数不低于3.0×10⁸cfu/g的丁酸梭菌饲料添加剂产品对鹌鹑产蛋能力有明显的提高，能够改善和提高蛋品质，降低料蛋比，降低腹泻率；同时能够明显降低盲肠主要致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的数量，减少腹泻率，提高益生菌乳酸菌的数量添加其他形式的丁酸梭菌二次发酵物可以按照上述添加量相应换算。

发明人还发现，该技术不仅可以应用于丁酸梭菌发酵废水的处理，还可以推广到其他饲料添加剂型微生态制剂的发酵废水处理中。

有益效果

本发明与现有技术相比较具有以下优势：1.本方法所处理的废水本身是无毒无害的丁酸梭菌发酵废水，该种发酵废水中主要存的贡献COD的物质是还原糖，丁酸、乙酸等有机酸，肽类，氨基氮等；2.该发酵废水中存在0.7-2.1×10⁸cfu/ml的丁酸梭菌，该菌冻干的活菌制剂目前作为兽药广泛的应用于畜禽养殖中起到防治畜禽大肠杆菌等引起的腹泻以及促进畜禽增长的作用，因此本发明制备的饲料添加剂可以作为替抗产品安全使用；3.该发明的思路是利用丁酸梭菌发酵废水作为其二次发酵的菌种来源和水的来源；4.采用豆粕、玉米粉为主要营养物质，稻壳、玉米芯粉、碳酸钙作为二次发酵辅助物质，制备的二次发酵产物中不仅存在大量的丁酸梭菌，枯草芽孢杆菌等益生菌，同时还存在丁酸、乙酸等有机酸可以提高其益生效果和适口性，同时还存在许多肽类、氨基酸类、矿物质类以及维生素类营养物质，很适合作为饲料和饲料添加剂应用于畜禽养殖。

与现有技术相比，本发明的最大不同点在于：既可以对丁酸梭菌发酵废水的无害化处理，同时又生产出了丁酸梭菌发酵饲料。常规的污水处理方法是将离心废液调节pH后上到厌氧塔除去其中的碳源物质，再进入好养池除去其中的氮源物质最后进入MBR膜过滤后才能排放。对于间歇化生产企业来说污水处理是非常难解决的问题，该技术的应用为小规模及间歇性生产丁酸梭菌的企业带来了一种发酵污水无害化处理新方法和思路。同时该技术也使丁酸梭菌生产中的水溶性益生物质得到了最大化的利用。

本发明是将发酵废水直接使用，不需要任何稀释，大大地提高了处理效率；所处理的丁酸梭菌发酵废水方法可以针对大部分的单一菌种发酵的益生菌活菌制剂的废水处理，废水性质确定，同时生产的是活菌制剂，工艺稳定，很适合工业化应用；废水处理方法是固体发酵，同时作为饲料添加剂工艺要求低，处理效率高，很适合益生菌生产企业作为一种废水全利用方法应用于工业化生产中。

本公司兽药丁酸梭菌活菌制剂生产线采用的是液体发酵、离心固液分离、冷冻干燥工艺来生产，因此不可避免的存在污水处理问题；同时由于发酵液中存在芽孢和菌体，芽孢离心时被收集，菌体一般会随滤液一起存在于离心废液中，检测发现离心废液中存在1-3％的丁酸梭菌菌体，同时滤液中还存在丁酸、乙酸等有机酸，淀粉酶、蛋白酶等酶系，维生素E、维生素B等维生素多种益生物质，如何最大程度的利用这些物质，降低污水处理压力，做到绿色生产意义重大。采用本发明来处理丁酸梭菌发酵废水不仅解决了传统发酵污染大，污水难处理的问题，还是对水资源和丁酸梭菌发酵过程益生物质的最大化利用，可以将该技术广泛的推广到凝结芽孢杆菌等益生菌的液体发酵上废水的循环利用中。

具体实施方式：

实施例1

一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

每吨发酵废水加入豆粕粉120kg，玉米粉120kg，稻壳粉240kg、玉米芯粉190kg、碳酸钙50kg，二次发酵时间分别为24h、48h、72h，96h，环境温度控制在35℃；

所述发酵废水为保藏菌株丁酸梭菌的发酵废水；所述丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具体为LXKJYB-1，保藏编号为：CCTCC M 2017485。

其具体操作过程为：

将豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙混合均匀加入到发酵废水池中搅拌均匀，让这些固体物质充分吸收其中水份，之后装入25kg塑料袋、封口保藏，保持培养室温度在35℃左右密闭发酵；

所述上述培养物含水量为58.13％，培养过程中分别在24h、48h、72h、96h检测丁酸梭菌活菌数、枯草芽孢杆菌活菌数及大肠杆菌数，结果见表1：

表.1不同培养时间对丁酸梭菌二次发酵的影响

项目	0h	24h	48h	72h	96h
						丁酸梭菌cfu/g	1.02×10<sup>8</sup>	2.27×10<sup>8</sup>	9.89×10<sup>8</sup>	3.85×10<sup>9</sup>	3.76×10<sup>9</sup>
丁酸梭菌芽孢率(％)	0	0	0	94.54	95.13
						枯草芽孢杆菌cfu/g	2.25×10<sup>3</sup>	1.39×10<sup>6</sup>	1.19×10<sup>7</sup>	1.16×10<sup>7</sup>	1.14×10<sup>7</sup>
枯草芽孢杆菌芽孢率(％)	0	0	44.28	44.36	44.32
						大肠杆菌cfu/g	28	未检出	未检出	未检出	未检出

由结果可以看出在上述培养条件下，丁酸梭菌二次发酵物培养72h与培养96h在活菌数及芽孢率方面没有明显差异，确定最佳培养时间为72h，培养72h二次发酵物中丁酸梭菌活菌数达到3.85×10⁹cfu/g，芽孢率达到94.54％，无继续培养价值，因此结束培养；培养72h，该培养物中枯草芽孢杆菌达到1.16×10⁷cfu/g，芽孢率达到44.36％，大肠杆菌未检出，该培养物适合作为饲料直接应用于动物养殖，或者作为饲料添加剂应用于动物养殖。

发酵完成后可以将得到的二次发酵物闪蒸干燥、粉筛，得到丁酸梭菌菌粉，以方便使用。

还可以采用通用方法通过加入二氧化硅、淀粉等稀释剂对菌粉进行稀释，制备成活菌数不低于3.0×10⁸cfu/g的丁酸梭菌饲料添加剂产品。

实施例2

一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

提高培养物中主要营养物质豆饼粉和玉米粉的含量，每吨废水加入豆粕粉150kg，玉米粉180kg，稻壳粉220kg、玉米芯粉190kg、碳酸钙40kg，二次发酵时间分别为24h、48h、72h，96h环境温度控制在35℃；

其具体操作过程为：

所述上述培养物含水量为56.18％，培养过程中分别在24h、48h、72h、96h检测丁酸梭菌活菌数、枯草芽孢杆菌活菌数及大肠杆菌数，结果见表2：

表.2不同培养时间对丁酸梭菌二次发酵的影响

项目	0h	24h	48h	72h	96h
						丁酸梭菌cfu/g	1.25×10<sup>8</sup>	4.21×10<sup>8</sup>	1.57×10<sup>9</sup>	5.35×10<sup>9</sup>	5.76×10<sup>9</sup>
丁酸梭菌芽孢率(％)	0	0	0	95.12	95.47
						枯草芽孢杆菌cfu/g	1.72×10<sup>3</sup>	8.25×10<sup>5</sup>	2.25×10<sup>7</sup>	2.06×10<sup>7</sup>	2.11×10<sup>7</sup>
枯草芽孢杆菌芽孢率(％)	0	0	49.37	48.53	48.96
						大肠杆菌cfu/g	15	未检出	未检出	未检出	未检出

由结果可以看出在上述培养条件下，丁酸梭菌二次发酵物培养72h与培养96h在活菌数及芽孢率方面没有明显差异，确定最佳培养时间为72h，培养72h丁酸梭菌二次发酵物中丁酸梭菌活菌数达到5.35×10⁹cfu/g，芽孢率达到95.12％，由于丁酸梭菌已经大部分形成了芽孢，因此无继续培养价值，与培养72h在活菌数和芽孢率方面无明显差异，最终确定最佳培养时间为72h；培养72h在该培养物中枯草芽孢杆菌达到2.06×10⁷cfu/g，芽孢率达到48.53％；大肠杆菌未检出，该培养物适合作为饲料直接应用于动物养殖，或者作为饲料添加剂应用于动物养殖。

实施例3

一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

每吨发酵废水加入豆粕250kg、玉米粉120kg、稻壳粉150kg、玉米芯粉130kg、碳酸钙80kg。

首先将豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙混合均匀加入到发酵废水池中搅拌均匀，让这些固体物质充分吸收其中水份，之后装袋、封口35℃密闭发酵24h、48h、72h、96h。通过显微镜观察的方法测定丁酸梭菌及枯草芽孢杆菌芽孢率，丁酸梭菌芽孢率达到90-95％时，即结束发酵。

其具体操作过程为：

所述上述培养物含水量为57.80％，培养过程中分别在24h、48h、72h、96h检测丁酸梭菌活菌数、枯草芽孢杆菌活菌数及大肠杆菌数，结果见表3：

表.3不同培养时间对丁酸梭菌二次发酵的影响

项目	0h	24h	48h	72h	96h
						丁酸梭菌cfu/g	1.21×10<sup>8</sup>	4.57×10<sup>8</sup>	2.10×10<sup>9</sup>	6.22×10<sup>9</sup>	7.49×10<sup>9</sup>
丁酸梭菌芽孢率(％)	0	0	0	0	94.22
						枯草芽孢杆菌cfu/g	2.10×10<sup>3</sup>	8.85×10<sup>5</sup>	2.79×10<sup>7</sup>	2.46×10<sup>7</sup>	2.38×10<sup>7</sup>
枯草芽孢杆菌芽孢率(％)	0	0	50.01	49.88	49.69
						大肠杆菌cfu/g	21	未检出	未检出	未检出	未检出

由结果可以看出在上述培养条件下，丁酸梭菌二次发酵物培养96h丁酸梭菌活菌数达到7.49×10⁹cfu/g，芽孢率达到94.22％，无继续培养价值，因此结束培养；培养96h，该培养物中枯草芽孢杆菌达到2.38×10⁷cfu/g，芽孢率达到49.69％，大肠杆菌未检出，该培养物适合作为饲料直接应用于动物养殖，或者作为饲料添加剂应用于动物养殖。

实施例4

一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

每吨发酵废水加入豆粕300kg、玉米粉120kg、稻壳粉240kg、玉米芯粉100kg、碳酸钙100kg。

所述发酵废水为保藏菌株丁酸梭菌的发酵废水；所述丁酸梭菌Clostridiumbutyricum)具体为LXKJYB-1，保藏编号为：CCTCC M 2017485。

其具体操作过程为：

所述上述培养物含水量为53.76％，培养过程中分别在24h、48h、72h、96h检测丁酸梭菌活菌数、枯草芽孢杆菌活菌数及大肠杆菌数，结果见表4：

表.4不同培养时间对丁酸梭菌二次发酵的影响

项目	0h	24h	48h	72h	96h
						丁酸梭菌cfu/g	1.13×10<sup>8</sup>	4.89×10<sup>8</sup>	2.35×10<sup>9</sup>	8.88×10<sup>9</sup>	9.96×10<sup>9</sup>
丁酸梭菌芽孢率(％)	0	0	0	0	93.38
						枯草芽孢杆菌cfu/g	2.16×10<sup>3</sup>	8.99×10<sup>5</sup>	3.12×10<sup>7</sup>	3.09×10<sup>7</sup>	3.08×10<sup>7</sup>
枯草芽孢杆菌芽孢率(％)	0	0	49.35	49.22	49.28
						大肠杆菌cfu/g	23	未检出	未检出	未检出	未检出

由结果可以看出在上述培养条件下，丁酸梭菌二次发酵物培养96h丁酸梭菌活菌数达到9.96×10⁹cfu/g，芽孢率达到93.38％，无继续培养价值，因此结束培养；培养24h、48h、72h、96h，该培养物中枯草芽孢杆菌达到3.08×10⁷cfu/g，芽孢率达到49.28％，大肠杆菌未检出，该培养物适合作为饲料直接应用于动物养殖，或者作为饲料添加剂应用于畜禽养殖。

实施例5

本发明提供一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

每吨发酵废水加入豆粕200kg、玉米粉200kg、稻壳粉100kg、玉米芯粉200kg、碳酸钙40kg。

首先将豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙混合均匀加入到发酵废水池中搅拌均匀，让这些固体物质充分吸收其中水份，之后装袋、封口，35℃密闭发酵96h。通过显微镜观察的方法测定丁酸梭菌及枯草芽孢杆菌芽孢率，丁酸梭菌芽孢率达到90-95％时，即结束发酵。

其具体操作过程为：

所述上述培养物含水量为57.47％，培养过程中分别在24h、48h、72h、96h检测丁酸梭菌活菌数、枯草芽孢杆菌活菌数及大肠杆菌数，结果见表5：

表.5不同培养时间对丁酸梭菌二次发酵的影响

项目	0h	24h	48h	72h	96h
						丁酸梭菌cfu/g	1.02×10<sup>8</sup>	5.21×10<sup>8</sup>	3.15×10<sup>9</sup>	9.39×10<sup>9</sup>	1.21×10<sup>10</sup>
丁酸梭菌芽孢率(％)	0	0	0	0	95.54
						枯草芽孢杆菌cfu/g	2.25×10<sup>3</sup>	9.21×10<sup>6</sup>	4.10×10<sup>7</sup>	4.17×10<sup>7</sup>	4.21×10<sup>7</sup>
枯草芽孢杆菌芽孢率(％)	0	0	44.28	45.37	44.88
						大肠杆菌cfu/g	28	未检出	未检出	未检出	未检出

由结果可以看出在上述培养条件下，丁酸梭菌二次发酵物培养96h丁酸梭菌活菌数达到1.21×10¹⁰cfu/g，芽孢率达到95.54％，无继续培养价值，因此结束培养；培养96h，该培养物中枯草芽孢杆菌达到4.21×10⁷cfu/g，芽孢率达到44.88％，大肠杆菌未检出，该培养物适合作为饲料直接应用于动物养殖，或者作为饲料添加剂应用于畜禽养殖。

实施例6丁酸梭菌发酵废液二次发酵物在北京白羽鹌鹑养殖方面的应用

(1)本次实验以丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂直接应用于北京白羽鹌鹑的养殖中，主要考察其对北京白羽鹌鹑产蛋能力、蛋形指数等指标的考察，同时考察其对北京白羽鹌鹑盲肠主要微生物的影响。

(2)选用1日龄3000只北京白羽鹌鹑为研究对象，试验共分为5组，每组600只，每组设3个重复，每个重复200只，空白对照组为基础日粮组，1^#为添加经过载体稀释的丁酸梭菌发酵废液二次发酵物组，2^#为丁酸梭菌活菌制剂对照组，预饲期7天，饲养期80天。

(3)试验期间，每周统计耗料量，计算每组北京白羽鹌鹑的平均蛋重以及料蛋比。每天对每组蛋重量进行称重，测量蛋的长径、短径。

(4)粪便中菌群数量的测定：各组采集1.0g新鲜粪样，采用10倍梯度稀释法稀释至10^-8，选择连续三个稀释度，分别涂布于EMB、MRS、BBL等鉴别培养基平板上，接种量为100μL/9cm平板，每个稀释度做3个平行，37℃恒温培养24-48h。主要检测粪便中大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸菌。试验结果见表6、表7。

表.6丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂对北京白羽鹌鹑生产性能的影响

注：饲喂时丁酸梭菌活菌数均为3.0×10⁸cfu/g。1^#：经载体稀释的丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂；2^#：丁酸梭菌活菌制剂对照组。

表.7丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂对北京白羽鹌鹑盲肠微生物的影响

丁酸梭菌添加量	大肠杆菌logcfu/g	沙门氏菌logcfu/g	乳酸菌logcfu/g
				空白对照组	7.18	6.44	7.89
1<sup>#</sup>添加量50(g/t)	3.85	3.21	9.05
				1<sup>#</sup>添加量100(g/t)	3.99	3.32	9.13
2<sup>#</sup>添加量50(g/t)	4.34	4.41	8.47
				2<sup>#</sup>添加量100(g/t)	4.42	4.56	8.52

日粮中添加50g/t-100g/t丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂对北京白羽鹌鹑产蛋能力有明显的提高，能够改善和提高蛋品质，降低料蛋比，降低腹泻率；同时日粮中添加50g/t-100g/t丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂对北京白羽鹌鹑能够明显降低盲肠主要致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的数量，减少腹泻率，提高益生菌乳酸菌的数量。另外添加相同活菌数的丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂与丁酸梭菌活菌制剂都能够明显的提高北京白羽鹌鹑产蛋能力，改善和提高其蛋品质，降低料蛋比，减少腹泻率，降低肠道大肠杆菌、沙门氏菌数，提高乳酸菌等有益菌数量，而丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂效果优于丁酸梭菌活菌制剂组，这可能是由于丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂中大量的存在丁酸、乙酸、一些酶类等与有益菌协同作用的结果。因此可以应用丁酸梭菌发酵废液二次发酵物制剂作为提高鹌鹑产蛋能力和预防鹌鹑肠道疾病的微生物制剂应用于鹌鹑的养殖中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。

Claims

1.一种丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，包括如下步骤：

每吨丁酸梭菌发酵废水加入豆粕120-300kg、玉米粉120-300kg、稻壳粉100-240kg、玉米芯粉100-200kg、碳酸钙40-100kg；

首先将豆粕、玉米粉、稻壳粉、玉米芯粉、碳酸钙混合均匀加入到发酵废水中搅拌均匀，之后装袋、密封发酵至少三天；丁酸梭菌芽孢率达到90%，即结束发酵；

所述丁酸梭菌发酵废水为丁酸梭菌发酵滤液；所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) 具体为 LXKJYB-1，保藏编号为：CCTCC NO: M 2017485。

2.根据权利要求1所述丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，其特征在于，所述发酵温度为35℃。

3.根据权利要求1所述丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，其特征在于，原料组成为：每吨发酵废水加入豆粕粉120kg，玉米粉120kg，稻壳粉240kg、玉米芯粉190kg、碳酸钙50kg。

4.根据权利要求1所述丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，其特征在于，原料组成为：每吨发酵废水加入豆粕200kg、玉米粉200kg、稻壳粉100kg、玉米芯粉200kg、碳酸钙40kg。

5.根据权利要求1所述丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，其特征在于，步骤包括闪蒸干燥、粉筛，干燥至丁酸梭菌活菌数达到2.49×10¹⁰cfu/g，芽孢率达到98.10%。

6.根据权利要求5所述丁酸梭菌发酵废水的再利用方法，其特征在于，步骤包括载体稀释，稀释至活菌数不低于3.0×10⁸cfu/g。

7.根据权利要求1-4任一所述方法制得的丁酸梭菌二次发酵物。

8.权利要求7所述丁酸梭菌二次发酵物在制备饲料、饲料添加剂方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在鹌鹑日粮中，以活菌数不低于3.0×10⁸cfu/g的发酵物计，添加量为50g/t-100g/t。