CN113475622A - 一种生物饲料添加剂、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物饲料添加剂技术领域，具体提供了一种基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂的制备方法及应用，将屎肠球菌发酵上清液经过一定处理之后用作动物养殖中的饲料添加剂，不仅解决了传统发酵污染大、污水难处理的问题，降低废水处理的成本和环保压力，还实现对屎肠球菌发酵过程中益生物质的最大化回收利用，最大限度降低发酵和养殖成本，提高效益，达到生产无抗动物产品的目的。同时，该技术还可以推广应用到其它单一菌种液体发酵废水的回收利用中。
Description
技术领域
本发明属于动物饲料添加剂技术领域，具体涉及一种生物饲料添加剂、制备方法及其应用。
背景技术
屎肠球菌是动物肠道中的一种常见兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，因其能产生乳酸，所以归属于乳酸菌类。屎肠球菌具有良好的耐酸、耐胆盐和耐热性，它能够快速黏附肠道黏膜，通过排阻效应抑制病原菌黏附肠道；作为一种非特异性免疫调节因子，屎肠球菌在动物肠道内被摄取之后刺激细胞免疫，提高血液中的免疫球蛋白数量，增强肠道黏膜免疫和系统免疫，并诱导机体产生干扰素、细胞因子、白细胞介素等，激活免疫系统，增强肠道的非特异性免疫能力，从而提高对肠道疾病的免疫力；屎肠球菌代谢过程中产生乳酸、乙酸、细菌素和过氧化氢等物质，可以降低肠道pH值、抑制动物病原菌繁殖、维持和调整肠道微生态平衡、减少肠道内毒素与尿素酶的含量；屎肠球菌代谢还会产生维生素、氨基酸、促生长因子等，调节机体健康和生长。
目前，对屎肠球菌的工业化应用主要集中在菌体方面，通过液体发酵技术得到屎肠球菌发酵液，离心处理，保留菌体得到菌泥，再通过一定手段进行干燥浓缩得到菌体产品。而在屎肠球菌发酵液离心处理过程中会产生大量含有乳酸、乙酸、细菌素、维生素、氨基酸等营养成分的发酵废水，直接废弃不仅会造成巨大浪费，还会增加不少处理成本和环保压力。
针对目前益生菌发酵上清液废水利用技术方面的欠缺，本发明提供了一种屎肠球菌发酵离心上清液再利用方法，该方法通过对离心上清液进行加热浓缩，减少发酵上清液中水分含量，提高其中乳酸、细菌素、维生素等营养物质含量，然后添加一定量载体混合，制成固体的饲料添加剂，再添加一定量的屎肠球菌活菌，制成复合微生态制剂，应用于动物养殖中，既解决了发酵废水处理问题，又可以降低发酵和养殖成本，提高效益，达到生产无抗动物饲料产品的目的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中益生菌发酵上清液废水再利用技术方欠缺的问题。
为此，本发明提供了一种料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)离心屎肠球菌发酵液，将得到的上清液进行减压蒸发，得到水分含量小于20％的浓缩发酵上清液；
(2)向浓缩发酵上清液中加入载体，使混合物水分含量≤16％，即得饲料添加剂。
具体的，上述步骤(1)中减压蒸发温度为50-55℃、压力0.05-0.1MP。
具体的，上述步骤(2)中载体为米糠粕或豆粕。
具体的，上述步骤(2)中载体与浓缩发酵上清液质量比为1:5-1:2。
具体的，上述步骤(2)中饲料添加剂的水分含量为14-16％。
具体的，上述步骤(2)中还包括向浓缩发酵上清液中添加屎肠球菌活菌。
具体的，上述饲料添加剂中活菌数为1.0×108-2.0×108CFU/g。
由上述方法制备的饲料添加剂在肉鸡日粮中使用时，添加量为500g/t；在蛋鸡饲料中使用时，添加量为200-1000g/t。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种料添加剂的制备方法将屎肠球菌发酵上清液经过一定处理之后用作动物养殖中的饲料添加剂，不仅解决了传统发酵污染大、污水难处理的问题，降低废水处理的成本和环保压力，还实现对屎肠球菌发酵过程中益生物质的最大化回收利用，最大限度降低发酵和养殖成本，提高效益，达到生产无抗动物产品的目的。同时，该技术还可以推广应用到其它单一菌种液体发酵废水的回收利用中。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。除非特别说明，本发明所使用的试剂和设备都可通过常规市场购买。
本发明提供了一种饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)离心屎肠球菌发酵液，将得到的上清液进行减压蒸发，得到水分含量小于20％的浓缩发酵上清液；
具体的，减压蒸发温度为50-55℃、压力0.05-0.1MP；
(2)向浓缩发酵上清液中加入载体，使混合物水分含量≤16％，即得到基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂。
具体的，载体为米糠粕或豆粕，载体与浓缩发酵上清液质量比为1:5-1:2，饲料添加剂的水分含量优选为14-16％。
基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂中还存在约1-2％的屎肠球菌菌体，为了进一步提高发酵上清液浓缩物作为饲料添加剂在动物饲料中的作用效果，添加一定量的屎肠球菌活菌到发酵上清液浓缩物中，使其中屎肠球菌活菌数达到1.0×108-2.0×108CFU/g。
本发明同时提供一种饲料添加剂在蛋鸡、肉鸡饲料中的应用，研究表明：在蛋鸡日粮中添加200-1000g/t屎肠球菌发酵上清液浓缩物，提高了蛋鸡产蛋率、平均蛋重，降低了料蛋比，减少了肠道内致病菌含量，改善了肠道结构；在肉鸡日粮中添加500g/t额外添加屎肠球菌活菌的该饲料添加剂后，提高了肉鸡平均日采食量、平均日增重，降低了料重比，减少了肠道内致病菌含量，改善了肠道结构。
下面通过具体实施例对本发明提供的饲料添加剂的效果进行研究。
实施例1：
本实施例研究了饲料添加剂的制备方法中减压浓缩后水分含量的选择。
离心屎肠球菌发酵液，将得到的上清液在50℃、0.05MP下进行减压蒸发，使水分蒸发浓缩，检测不同水分含量下浓缩物中屎肠球菌、乳酸、乙酸等养分含量，结果如表1所示。
表1不同水分含量下浓缩发酵上清液中各养分含量
由表1可见，水分含量为20％时，浓缩发酵上清液中屎肠球菌、乳酸含量基本接近峰值，继续加热，养分浓缩有限，且能耗太大，因此，选择水分含量为20％时结束减压浓缩。
向水分含量为20％的浓缩发酵上清液中加入500kg米糠粕作为载体，混匀后浓缩物水分含量为14％，得到基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂。
实施例2：
本实施例研究了基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂在蛋鸡养殖方面的应用。
选取体重均匀产蛋率接近的24周龄海兰白羽蛋鸡600只，随机分为5组(对照组和试验组1-4)，每组6个重复，每个重复20只，使用基础日粮、实施例1中制备的饲料添加剂、屎肠球菌活菌，如表2所示设计试验喂养海兰白羽蛋鸡，基础日粮的组成及营养成分如表3和表4所示。
表2试验分组
表3基础日粮的组成(风干基础)
其中玉米粗蛋白含量为7.8％；豆粕粗蛋白含量为43％；预混料为每公斤日粮提供：3000IU的VA，2400IU的VD3，16IU的VE，2mg的VK3，1.6mg的VB1，6.5mg的VB2，28mg烟酸，450mg氯化胆碱，9mg泛酸钙，3.25mg的VB6，0.07mg生物素，0.8mg叶酸，0.015mg的VB12，267.5mg铁，13mg铜，95mg锰，90mg锌，1.35mg碘，0.29mg硒。
表4基础日粮中的营养成分(风干基础)
鸡舍为三层层叠式笼养，5只/笼，4笼/重复，采用人工光照和自然光照相结合的方式，每天保持05:00-21:00总共16h光照，光照强度10-15LX，使用机械通风和自然通风相结合，室温保持在15-20℃，湿度为40％-60％。每天7:30、13:30、18:30各喂料一次，喂料量以基本不剩料为标准，并记录这三个时间点舍内温湿度。定期清理粪便，每周二和周五用百毒杀带鸡消毒。每日10:00、16:30两次捡蛋，记录各个组的产蛋数、蛋重、耗料量、软破蛋数，并逐日记录当日的温度、天气变化及相应的鸡群总体精神状况，监测鸡群健康状况，记录死鸡数及其死亡原因。
试验为期42天，结束后收集试验鸡蛋，用于蛋品质指标检测。断料12h后，从各试验组的每个重复中随机选取1只鸡断颈处死，迅速提取每只鸡的肠道。取盲肠的内容物装入无菌离心管中，-20℃保存，用于检测菌群组成。取十二指肠、空肠、回肠中段1-2cm肠段置于装有甲醛固定液的10ml离心管中，用于做切片检测，观察肠道形态。
(1)不同饲喂条件对蛋鸡生产性能的影响
产蛋期间每天观察记录各组的产蛋率、软破蛋率、料蛋比、平均日产单量，结果如表5所示。
表5蛋鸡生产性能
由表5可知，在蛋鸡日粮中以200g/t的添加量加入本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂，可提高产蛋率、日产蛋量，降低料蛋比和软破壳蛋率，但与对照组相比优势不显著；以500g/t的添加量加入本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂，显著提高了蛋鸡产蛋率、日产蛋量，显著降低了料蛋比和软破壳蛋率；添加1000g/t屎肠球菌发酵上清液浓缩物，显著提高了蛋鸡产蛋率、日产蛋量，显著降低了破壳蛋率，料蛋比差异不显著；试验组4中，在基础日粮添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌活菌后，虽然也显著提高了蛋鸡产蛋率、日产蛋量，降低了料蛋比和软破壳蛋率，但与试验组2和试验组3相比，区别不大。
(2)不同饲喂条件对鸡蛋品质的影响
鸡蛋含水量和蛋黄质量是衡量鸡蛋营养含量的重要指标，含水量越高，有营养价值部分越低，可购买性越差，蛋黄相对重越大，表明鸡蛋的营养水平越高。鸡蛋中含有丰富且极易消化的蛋白质，蛋黄中蛋白质主要是卵黄高磷蛋白和卵黄蛋白；蛋清中蛋白质主要是卵清蛋白、卵铁转运蛋白、卵类黏蛋白、溶菌酶、卵黏蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和抗生物蛋白。
收集各试验组鸡蛋，检测蛋清水分、蛋黄水分、蛋黄相对重、蛋清蛋白含量、蛋黄蛋白含量，结果如表6所示。
表6鸡蛋品质检测结果
由表6结果可知，基础日粮中添加本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂后，降低了蛋清含水量、蛋黄含水量，提高了蛋黄相对重、蛋清蛋白含量、蛋黄蛋白含量，添加量为500g/t时效果最为显著，与添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌活菌的试验组4结果接近。
(3)不同饲喂条件对蛋鸡肠道微生物的影响
每组盲肠内容物各取0.5g于装有100mL灭菌生理盐水的挡板瓶中，此时内容物的稀释度为10-2。摇床处理后，采用10倍梯度稀释法将每组内容物稀释到10-7。以每个平板长30—300个菌落为标准，每组选择三个适当的稀释度，在超净工作台上，用100μL移液枪按稀释度从高到低的顺序将样品分别加到选择性培养基EMB、BS和MRS上，每个稀释度做三个重复。大肠杆菌采用涂布平板法37℃培养24h，乳酸菌和双歧杆菌采用稀释摇管法37℃培养72h。结果如表7所示。
表7蛋鸡盲肠微生物检测结果
由表7可见，在基础日粮中添加本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂后，降低了盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌这类致病菌的数量，提高了益生菌乳酸菌的数量；添加量为500g/t时效果最为显著，显著降低了大肠杆菌和沙门氏菌的数量(p<0.05)，显著提高了乳酸菌数量(p<0.05)，与添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌活菌的试验组4结果接近。
(4)不同饲喂条件对蛋鸡肠道结构的影响
取出甲醛中固定的十二指肠、空肠、回肠肠段，用石蜡包埋，采用伊红－美蓝对连续切片(5mm)进行染色。切片在光镜下观察测量，从每张切片中随机选取15根绒毛，分别测定绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度。绒毛高度是指绒毛顶端到隐窝入口处，隐窝深度是指绒毛基部到黏膜下层做切片，观察肠道形态，结果如表8所示。
表8蛋鸡肠道结构检测结果
由表8可见，在基础日粮中添加本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂后，增加了蛋鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度比值；添加量为500g/t时效果最为显著，与添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌活菌的试验组4结果接近。
综上所述，在每吨蛋鸡基础日粮中添加200-1000g本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂能够改善蛋鸡生产性能，提高蛋品质，改善肠道结构和菌群组成，从而提高蛋鸡养殖效益。优选的，在每吨蛋鸡日粮中添加500g本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂效果最优。此外，在基础日粮添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌活菌后，虽然也显著提高了蛋鸡生产性能和鸡蛋品质，改善肠道结构和菌群组成，但其效果与以500g/t的添加量添加本发明提供的基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂时区别不大，而在这个添加量下，饲料添加剂中屎肠球菌活菌数仅为2.3×109CFU/t，远小于1.0×1011CFU/t，从实际成本等方面考虑，使用本发明提供的饲料添加剂饲喂蛋鸡，效果优于直接添加屎肠球菌活菌。
实施例3：
本实施例研究了基于屎肠球菌发酵上清液的饲料添加剂在肉鸡养殖方面的应用。
向实施例1制备的饲料添加剂中添加屎肠球菌活菌，使其中屎肠球菌活菌数不低于2.0×108CFU/g，作为一种微生态制剂应用于爱拔益加肉鸡养殖中。
选用400只健康的1日龄爱拔益加肉鸡，公母各半，随机分成4个处理组(对照组和试验组1-3)，每组5个重复，每重复20羽。使用基础日粮、实施例1中制备的饲料添加剂、屎肠球菌活菌、本实施例制备的微生态制剂，如表9所示设计试验喂养爱拔益加肉鸡，试验为期42天。基础日粮组分随饲喂过程中肉鸡日龄增长更改，具体组成及营养成分如表10和表11所示。
表9试验分组
表10基础日粮的组成(风干基础)
其中玉米粗蛋白含量为7.8％；豆粕粗蛋白含量为43％；进口鱼粉粗蛋白含量为68％；每公斤肉鸡多维可提供：维生素A乙酸酯5000-10000KIU，维生素D3 2000-5000KIU，DL-α-生育酚乙酸酯≥25000mg，甲萘醌≥2400mg，硝酸硫胺≥2000mg，核黄素≥6000mg，盐酸吡哆醇≥3500mg，氰钴胺≥12mg，烟酰胺≥30000mg，D-生物素≥75mg，D-泛酸钙≥8000mg，叶酸≥950mg；每公斤肉鸡多矿可提供：铜6000-18000mg，铁30000-150000mg，锰60000-125000mg，锌50000-100000mg，碘400-900mg，硒150-300mg。
表11基础日粮中的营养成分(风干基础)
肉鸡采用地面平养，自由采食饮水，免疫程序和驱虫程序按照鸡场常规同步进行。保持固定的饲喂时间，每天3次，保证水源充足、干净。随时观察，记录每日的投料量及剩余料量、鸡死亡淘汰情况，计算平均日采食量、平均日增重、耗料增重比。
试验第20、41天晚上21:00停止供料，第22、43天早上7:00停水1h后，以每个重复为单位称取体重；试验第43天在每个重复中随机取1只鸡称活体重，然后屠宰，打开腹腔，迅速分离选取的十二指肠、空肠、回肠、盲肠段。取十二指肠、空肠、回肠中段1-2cm肠段置于装有甲醛固定液的10ml离心管中，用于做切片检测，观察肠道形态。取盲肠的内容物装入无菌EP管中，-20℃保存，用于检测肠道菌群组成。
(1)不同饲喂条件对肉鸡生产性能的影响
产蛋期间每天观察记录各组的产蛋率、软破蛋率、料蛋比、平均日产单量，结果如表12所示。
表12肉鸡生长性能
由表12可见，基础日粮中添加屎肠球菌活菌、本发明提供的饲料添加剂以及本发明提供的微生态制剂后，提高了肉鸡平均日采食量、平均日增重，降低了耗料增重比；添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌，显著提高了1-21日龄肉鸡平均日增重，显著降低1-21日龄耗料增重比；添加500g/t屎肠球菌复合微生态制剂，显著提高了1-21日龄肉鸡平均日采食量、平均日增重，显著提高了1-42日龄平均日增重，显著降低了1-21日龄、1-42日龄耗料增重比。
(2)不同饲喂条件对蛋鸡肠道微生物的影响
每组盲肠内容物各取0.5g于装有100mL灭菌生理盐水的挡板瓶中，此时内容物的稀释度为10-2。摇床处理后，采用10倍梯度稀释法将每组内容物稀释到10-7。以每个平板长30—300个菌落为标准，每组选择三个适当的稀释度，在超净工作台上，用100μL移液枪按稀释度从高到低的顺序将样品分别加到选择性培养基EMB、BS和MRS上，每个稀释度做三个重复。大肠杆菌采用涂布平板法37℃培养24h，乳酸菌和双歧杆菌采用稀释摇管法37℃培养72h。结果如表13所示。
表13肉鸡肠道微生物检测结果
由表13可见，基础日粮中添加屎肠球菌活菌、本发明提供的饲料添加剂以及本发明提供的微生态制剂后，降低了盲肠内致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的数量，提高了益生菌乳酸菌的数量；添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌、500g/t微生态制剂，显著降低了盲肠内沙门氏菌数量，显著提高了乳酸菌数量。
(3)不同饲喂条件对肉鸡肠道结构的影响
取出甲醛中固定的十二指肠、空肠、回肠肠段，用石蜡包埋，采用伊红－美蓝对连续切片(5mm)进行染色。切片在光镜下观察测量，从每张切片中随机选取15根绒毛，分别测定绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度。绒毛高度是指绒毛顶端到隐窝入口处，隐窝深度是指绒毛基部到黏膜下层做切片，观察肠道形态，结果如表14所示。
表14肉鸡肠道结构检测结果
由表14可见，肉鸡日粮中添加屎肠球菌、屎肠球菌发酵上清液浓缩物，提高了肉鸡十二指肠、空肠、回肠绒毛高度；添加1.0×1011CFU/t屎肠球菌，显著提高了十二指肠绒毛高度；添加500g/t屎肠球菌复合微生态制剂，显著提高了十二指肠、空肠绒毛高度。
综上所述，在每吨肉鸡日粮中添加500g基于屎肠球菌发酵上清液浓缩物的饲料添加剂能够改善肉鸡生长性能，提高平均日增重，降低耗料增重比，改善肠道结构和菌群组成，从而提高肉鸡养殖效益。活菌数相同的屎肠球菌活菌制剂与本实施例的微生态制剂都能够明显改善肉鸡生产性能，特别是肉仔鸡，显著提高平均日增重，降低耗料增重比，提高肠道绒毛高度，降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌数，提高乳酸菌数。由于存在大量的乳酸、乙酸、维生素、氨基酸等益生物质，微生态制剂效果优于屎肠球菌活菌制剂，这些益生物质能够与屎肠球菌协同作用，更好地促进动物生长和健康。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)离心屎肠球菌发酵液，将得到的上清液进行减压蒸发，得到水分含量小于20％的浓缩发酵上清液；
(2)向浓缩发酵上清液中加入载体，使混合物水分含量≤16％，即得饲料添加剂。
2.如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中减压蒸发温度为50-55℃、压力0.05-0.1MP。
3.如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中载体为米糠粕或豆粕。
4.如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中载体与浓缩发酵上清液的质量比为1:5-1:2。
5.如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中获得的饲料添加剂的水分含量为14-16％。
6.如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中还包括向浓缩发酵上清液中添加屎肠球菌活菌。
7.如权利要求6所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中获得的饲料添加剂中活菌数为1.0×108-2.0×108CFU/g。
8.如权利要求1-7中任意一项所述方法制备的饲料添加剂。
9.如权利要求8所述的饲料添加剂，其特征在于：在肉鸡饲料中使用时，添加量为500g/t。
10.如权利要求8所述的饲料添加剂，其特征在于：在蛋鸡饲料中使用时，添加量为200-1000g/t。
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