CN106047977A - 一种利用精制蛋白粉的金霉素发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵生产工艺领域，公开了一种利用精制蛋白粉的金霉素发酵生产方法，通过金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，以精制蛋白粉100%替代黄豆饼粉比全用黄豆饼粉放罐化学效价提高2.3%，放罐产量较改进前提高了1.8%，有效的提高了产量，通过成本核算后得到每罐可降低原料投入成本约540元，效果良好，稳定提高了发酵生产水平，为工业化生产此类抗生素及科学研究提供一个理论和应用基础。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产工艺领域，特别是一种利用精制蛋白粉的金霉素发酵生产方法。
背景技术
金霉素(Chlortetracycline，即CTC)是属于四环素类的一种广谱抗生素，在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途。尤其在畜牧业上是用于饲料药物添加剂的八大抗生素产品(金霉素，泰乐星和土霉素等)之一，金霉素以其抑菌、促生长、饲料利用率高，在机体内残留量低等特点，成为了目前及今后较长时间内在饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂。我国金霉素产品已出口到欧洲和美国等发达国家。近年来，四环素类抗生素在抗肿瘤、抑制骨吸收、促进骨形成等方面的研究，拓宽了这类产品在医药方面的应用范围。在工业生产中，金霉素的发酵水平长期维持在一定水平(金霉素发酵效价常在18000μg·mL～1左右)，因此提高金霉素的发酵水平很有必要。抗生素发酵水平的提高，主要依赖于菌种选育及培养基和培养条件的优化。
关于金霉素的研究多是从影响金霉素发酵的工艺条件或者代谢调控方面着手，而其中链霉菌培养条件优化的研究报道，仅仅采用单因素法，如研究接种量、种龄、酵母粉、温度、pH等对金霉素发酵的影响，也有通过物理或化学诱变选育金霉素高产菌的研究，及通过原生质体诱变金霉素链霉菌育种的研究，目前，还没有专门针对发酵培养基组成方面的研究报道。
金霉素的发酵生产需要氮源，黄豆饼粉为主要有机氮源之一，其为细胞生长及含氮代谢物的合成提供氮源，还提供细胞生长所需要的维生素、氨基酸等。黄豆饼粉在发酵工业中被普遍使用，但是与其它有机氮源比较，其价格相对较高，造成原料成本偏高。因此，在稳定生产的前提下，为了降低生产成本，需要寻找新的适宜氮源进行替换。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用精制蛋白粉的金霉素发酵生产方法，通过外在条件的控制并调整培养基的营养成分来达到高效生产金霉素的目的，为工业化生产此类抗生素及科学研究提供一个理论和应用基础。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，工艺步骤包括了母瓶孢子液制备保存工序、子瓶斜面孢子液制备工序、一级种子制备工序和发酵制备工序:
发酵制备工序中发酵罐内每升培养基水溶液中含有：花生饼粉18～22g、精制蛋白粉8～12g、玉米淀粉58～62g、氯化钠1～3g、硫酸铵3～5g、碳酸钙3～5g、酵母粉4～6g、玉米浆6～8g、硫酸镁0.1～0.3g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、豆油0.1～0.2g。
优选的，发酵罐内每升培养基水溶液中含有：花生饼粉20.0g、精制蛋白粉10.0g、玉米淀粉60.0g、氯化钠2.0g、硫酸铵4.0g、碳酸钙4.0g、酵母粉5.0g、玉米浆7.0g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、豆油0.11g。
其中，精制蛋白粉为棉籽蛋白粉，棉籽蛋白粉制备工艺流程如下：
预处理：称取棉籽粕粉洗净、破碎、通过100目筛后，备用；
碱液浸提：取预处理过的棉籽粕粉末加入适量蒸馏水，调节pH值为10，控制液固比为12：1，在提取温度为55～65℃下提取为50～70分钟；
离心分离：对碱液浸提混合物进行离心分离，得到提取液经浓度95%乙醇洗涤后在pH值为4.8条件下进行酸沉得到固渣，经纯水洗至中性后冷冻干燥，即得。
其中，发酵制备工序中发酵生产工艺如下：将培养基灭菌，灭菌完成后温度降至30～35℃时，将培养好的一级种子移入发酵罐，移种后发酵生产采取变温控制，接种后培养温度控制在28～34℃，菌丝长好后降温至26～32℃，培养压力控制在0.01～0.04Mpa，发酵培养粘度控制在1～35秒，发酵周期为80～130小时。
其中，母瓶孢子液制备保存工序的步骤为：将待保存的菌种斜面，在无菌条件下用接种铲将菌种斜面菌层刮下碾散后按照保存需求加入适量甘油水或无菌水，搅拌均匀后用漏斗过滤，滤下的菌液即为母瓶孢子液，按照要求分装于不同规格冷冻管中，标识后置冰箱保存待用。
其中，子瓶斜面孢子液制备工序的步骤为：从母瓶冷冻管1～2支，溶解于2～3ml/支无菌水中，搅拌均匀，用玻璃铲沾取孢子液接入子瓶斜面培养基上，接好的斜面标识后放于温度31～33℃，湿度40～60%的恒温室培养4～5天，成熟后同母瓶孢子液制备保存工序中刮取制备子瓶孢子液置冰箱保藏，且同时进行无菌检查、活孢子计数及噬菌体检查，合格备用。
其中，一级种子制备工序的步骤为：在无菌条件下，将合格的40～60mL子瓶孢子液以火焰法接种到一级种子罐中，温度控制在26～33℃，罐压控制在0.04～0.06Mpa，搅拌转速在110～140rpm条件下进行培养，培养时间22～28小时，种子生长良好可移入发酵罐。
本发明具有以下有益效果：
1．本发明通过合理优化外在条件的控制并调整培养基的营养成分来达到高效生产金霉素的目的，通过以精制蛋白粉100%替代黄豆饼粉比全用黄豆饼粉放罐化学效价提高2.3%，放罐产量平均提高144Kg/罐，比改进前提高了1.8%，效果良好，通过成本核算后得到每罐可降低原料投入成本约540元。
2．经过合理设计的金霉素发酵生产方法，通过调整氮源输入，以精制蛋白粉100%替代现有发酵生产中使用的黄豆饼粉，有效的提高了产量，降低了原料成本，效果良好，稳定提高了发酵生产水平，为工业化生产此类抗生素及科学研究提供一个理论和应用基础。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
如图1所示，本发明公开了利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，工艺步骤包括了母瓶孢子液制备保存工序、子瓶斜面孢子液制备工序、一级种子制备工序和发酵制备工序：
母瓶孢子液制备保存工序的步骤为：将待保存的菌种斜面，在无菌条件下用接种铲将菌种斜面菌层刮下碾散后按照保存需求加入适量甘油水或无菌水，搅拌均匀后用漏斗过滤，滤下的菌液即为母瓶孢子液,按照要求分装于不同规格冷冻管中，标识后置冰箱保存待用。
子瓶斜面孢子液制备工序的步骤为：从母瓶冷冻管1～2支，溶解于2～3ml/支无菌水中，搅拌均匀，用玻璃铲沾取孢子液接入子瓶斜面培养基上，接好的斜面标识后放于温度31～33℃，湿度40～60%的恒温室培养4～5天，成熟后同母瓶孢子液制备保存工序中刮取制备子瓶孢子液置冰箱保藏，且同时进行无菌检查、活孢子计数及噬菌体检查，合格备用。
一级种子制备工序的步骤为：在无菌条件下，将合格的40～60mL子瓶孢子液以火焰法接种到一级种子罐中，温度控制在26～33℃，罐压控制在0.04～0.06Mpa，搅拌转速在110～140rpm条件下进行培养，培养时间22～28小时，种子生长良好可移入发酵罐。
发酵制备工序中发酵生产工艺如下：将培养基灭菌，灭菌完成后温度降至30～35℃时，将培养好的一级种子移入发酵罐，移种后发酵生产采取变温控制，接种后培养温度控制在28～34℃，菌丝长好后降温至26～32℃，培养压力控制在0.01～0.04Mpa，发酵培养粘度控制在1～35秒，发酵周期为80～130小时，发酵制备工序中发酵罐内每升培养基水溶液中含有：花生饼粉18～22g、精制蛋白粉8～12g、玉米淀粉58～62g、氯化钠1～3g、硫酸铵3～5g、碳酸钙3～5g、酵母粉4～6g、玉米浆6～8g、硫酸镁0.1～0.3g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、豆油0.1～0.2g。
其中，精制蛋白粉为棉籽蛋白粉，棉籽蛋白粉制备工艺流程如下：
预处理：称取棉籽粕粉洗净、破碎、通过100目筛后，备用；
碱液浸提：取预处理过的棉籽粕粉末加入适量蒸馏水，调节pH值为10，控制液固比为12：1，在提取温度为55～65℃下提取为50～70min；
离心分离：对碱液浸提混合物进行离心分离，得到提取液经浓度95%乙醇洗涤后在pH值为4.8条件下进行酸沉得到固渣，经纯水洗至中性后冷冻干燥，即得。
实施例2
实验目的：为了验证不同配比的培养基对金霉素发酵生产的影响，本实施例通过对比精制蛋白粉100%代替黄豆饼粉和100%黄豆饼粉的金霉素发酵配方，并进行相应的金霉素效价测定及成本核算。
实验方法：采用实施例1中的培养方法，将实施精制蛋白粉100%代替黄豆饼粉的金霉素发酵配方组别定义为精致蛋白粉组，将实施100%黄豆饼粉的金霉素发酵配方组别定义为黄豆饼粉组，在相同条件下改变发酵制备工序中发酵罐内每升培养基配比，具体配比如下：
精制蛋白粉组：花生饼粉20g、精制蛋白粉10g、玉米淀粉60g、氯化钠2g、硫酸铵4g、碳酸钙4g、酵母粉5g、玉米浆7g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、豆油0.11g。
黄豆饼粉组：花生饼粉20g、黄豆饼粉10g、玉米淀粉60g、氯化钠2g、硫酸铵4g、碳酸钙4g、酵母粉5g、玉米浆7g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、豆油0.11g。
实验结果：
| 组别 | 精制蛋白粉组 | 黄豆饼粉组 |
| 效价（ug/ml） | 23934 | 23396 |
| 单项原料成本 | 2040 | 2580 |
从上表中可以对比看出，通过调整氮源输入，以精制蛋白粉100%替代现有发酵生产中使用的黄豆饼粉，有效的提高了产量，降低了原料成本，效果良好，稳定提高了发酵生产水平，为工业化生产此类抗生素及科学研究提供一个理论和应用基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、二级发酵生成金霉素，工艺步骤包括了母瓶孢子液制备保存工序、子瓶斜面孢子液制备工序、一级种子制备工序和发酵制备工序，其特征在于：
发酵制备工序中发酵罐内每升培养基水溶液中含有：花生饼粉18～22g、精制蛋白粉8～12g、玉米淀粉58～62g、氯化钠1～3g、硫酸铵3～5g、碳酸钙3～5g、酵母粉4～6g、玉米浆6～8g、硫酸镁0.1～0.3g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、豆油0.1～0.2g。
2.如权利要求1所述的利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，其特征在于，所述的发酵罐内每升培养基水溶液中含有：花生饼粉20.0g、精制蛋白粉10.0g、玉米淀粉60.0g、氯化钠2.0g、硫酸铵4.0g、碳酸钙4.0g、酵母粉5.0g、玉米浆7.0g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、豆油0.11g。
3.如权利要求1或2所述的利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，其特征在于：所述的精制蛋白粉为棉籽蛋白粉，所述的棉籽蛋白粉制备工艺流程如下：
预处理：称取棉籽粕粉洗净、破碎、通过100目筛后，备用；
碱液浸提：取预处理过的棉籽粕粉末加入适量蒸馏水，调节pH值为10，控制液固比为12：1，在提取温度为55～65℃下提取为50～70分钟；
离心分离：对碱液浸提混合物进行离心分离，得到提取液经浓度95%乙醇洗涤后在pH值为4.8条件下进行酸沉得到固渣，经纯水洗至中性后冷冻干燥，即得。
4.如权利要求3所述的利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，其特征在于：所述的发酵制备工序中发酵生产工艺如下：将培养基灭菌，灭菌完成后温度降至30～35℃时，将培养好的一级种子移入发酵罐，移种后发酵生产采取变温控制，接种后培养温度控制在28～34℃，菌丝长好后降温至26～32℃，培养压力控制在0.01～0.04Mpa，发酵培养粘度控制在1～35秒，发酵周期为80～130小时。
5.如权利要求1所述的利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，其特征在于：所述的母瓶孢子液制备保存工序的步骤为：将待保存的菌种斜面，在无菌条件下用接种铲将菌种斜面菌层刮下碾散后按照保存需求加入适量甘油水或无菌水，搅拌均匀后用漏斗过滤，滤下的菌液即为母瓶孢子液，按照要求分装于不同规格冷冻管中，标识后置冰箱保存待用。
6.如权利要求5所述的利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，其特征在于：所述的子瓶斜面孢子液制备工序的步骤为：从母瓶冷冻管1～2支，溶解于2～3ml/支无菌水中，搅拌均匀，用玻璃铲沾取孢子液接入子瓶斜面培养基上，接好的斜面标识后放于温度31～33℃，湿度40～60%的恒温室培养4～5天，成熟后同母瓶孢子液制备保存工序中刮取制备子瓶孢子液置冰箱保藏，且同时进行无菌检查、活孢子计数及噬菌体检查，合格备用。
7.如权利要求6所述的利用精制蛋白粉替代黄豆饼粉的金霉素发酵生产方法，其特征在于：所述的一级种子制备工序的步骤为：在无菌条件下，将合格的40～60mL子瓶孢子液以火焰法接种到一级种子罐中，温度控制在26～33℃，罐压控制在0.04～0.06Mpa，搅拌转速在110～140rpm条件下进行培养，培养时间22～28小时，种子生长良好可移入发酵罐。
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