CN106520563A - 一种耐酸性α‑淀粉酶菌株及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及耐酸性α‑淀粉酶菌株及其生产方法，可有效解决耐酸性α‑淀粉酶菌株的生产及其在生产耐酸性α‑淀粉酶中的应用问题，将酒曲摇床富集培养，稀释，选透明圈直径与菌落直径之比大的初选菌株；接入基础产酶培养基培养，测酶活，酶活最高的菌株鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，PDA斜面培养至产孢，成为活性菌种；将活性菌种接种于种子培养基中培养，得一级种子，将一级种子接入种子培养基培养，得二级种子；二级种子接种至固体培养基中发酵培养，成淡黄色或浅褐色的发酵物，烘干，粉碎，过筛，分装。本发明制备方法独特、科学，易操作，生产效率高，产品质量好，耐酸性能好，最适作用pH和动物消化道相吻合，稳定性好。

Description

一种耐酸性α-淀粉酶菌株及其生产方法
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种耐酸性α-淀粉酶菌株及其生产方法。
背景技术
酸性α-淀粉酶广泛应用于酒精生产、食品生产、饲料加工、医药等领域，可以明显的提高产品得率，降低消耗，特别是能节约工业用粮，节约工业成本，具有很大的应用潜力和开发前景。目前工业用的酸性α-淀粉酶大多来源于微生物，产酸性α-淀粉酶的微生物主要是芽孢杆菌和曲霉。黑曲霉是最早发现能够产耐酸性α-淀粉酶的菌株，在日本、欧洲等国已经有用其进行工业化应用的报道。虽然这些微生物都能产生酸性α-淀粉酶，但是不同菌株产生的酶在耐酸性，耐热性及淀粉的水解程度均有差异。大多数的酸性α-淀粉酶的最适反应温度为50-60℃，其最适pH值为4.0-5.0。目前，丹麦、日本等国家均有耐酸性α-淀粉酶的产品，其中丹麦NOVO公司的商品Fungamyl是目前销售量较好的一个品种，其最适反应pH为4.5-4.7，但价格昂贵；而我国现工业化生产的α-淀粉酶最适反应pH为6-7，其耐酸性不高，比Fungamyl的最适反应pH高1-2个单位。
淀粉是单胃动物能量的主要来源，动物所需能量的60%-80%来自于饲料中的淀粉。玉米、小麦、高粱等能量饲料高达饲料配方的50%-70%，可见淀粉在饲料配方中的比重通常是很高的。即使淀粉消化率有轻微改善，都能够对能量的利用率产生显著的影响。研究发现，4-12日龄肉鸡日粮中淀粉的回肠末端消化率不超过85%，肉仔鸡（4-21日龄）小肠末端消化率仅为82%，鸡日龄增加时消化率也没有提高的迹象。大量试验结果也证明了淀粉的低消化率。尤其是处于幼龄阶段的动物，由于消化系统发育不成熟，自身分泌的淀粉酶不足以充分消化饲料中的淀粉，影响生长性能的发挥，并造成原料的浪费。因此，动物幼龄时期使用淀粉酶是比较理想的阶段，饲料中添加淀粉酶效果会更加显著。在饲料加工工业中，配合饲料中含有淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素等多种营养成分，这些营养成分都是由生物多聚物组成，必须依靠酶类将其酶解，才能被动物肠道吸收。幼畜的自身酶系不全，酶活力不足，处于快速生长阶段，而酸性α-淀粉酶可以降解生物多聚物，强化消化功能，提高饲料利用率，促进幼畜的生长发育。
目前，饲料中常用的淀粉酶是中温α-淀粉酶。中温α-淀粉酶是一种广泛应用于食品、化纤、印染等领域的工业用酶。由于饲料工业缺乏专门针对动物胃肠道消化生理特点的淀粉酶，人们便将中温α-淀粉酶添加到饲料中。中温α-淀粉酶的耐酸性差，pH5.0 以下严重失活；胃蛋白酶对其活性破坏严重，因此无法通过胃而进入肠道发挥作用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种耐酸性α-淀粉酶菌株及其生产方法，可有效解决耐酸性α-淀粉酶菌株的生产及其在生产耐酸性α-淀粉酶中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，本发明一种耐酸性α-淀粉酶菌株为分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年12月11日，保藏号：CGMCC No.11862，该菌株的制备方法是通过紫外线(UV) 和硫酸二乙酯(DES) 协同诱变、筛选，获得产酸性α-淀粉酶的菌株，基因为18S rDNA：
制备方法是：
（1）、将酒曲（又称大曲）和富集培养基装入容器中，摇床富集培养，10倍稀释法稀释，涂布静置后的上清液于平板分离培养基，培养，用碘熏蒸法将碘轻洒在培养皿盖上后，再将装有培养基的培养皿底部倒置碘熏，选透明圈直径与菌落直径之比大的初选菌株；
（2）、将初选菌株接入基础产酶培养基培养，测酶活，酶活最高的菌株鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，PDA斜面保存；
该黑曲霉(Aspergillus niger)有效用于制备耐酸性α-淀粉酶，包括以下步骤：
（1）、菌种活化：将黑曲霉(Aspergillus niger)菌株接入马铃薯葡萄糖(PDA) 培养基斜面，培养至产孢，连续转接三次，成为活性菌种；
（2）、种子培养：将种子培养基装入容器中，灭菌，冷却，将活性菌种接种于种子培养基中，每个容器内接五环，培养，得一级种子；将一级种子接入种子培养基培养，得二级种子；
（3）、制备固体发酵培养基：由麸皮、花生壳粉、豆粕粉、玉米粉、MnSO4•H2O 、K2HPO4作原料和水制成，料液重量比为1︰1；
（4）、冷却接种：将灭菌后的固体发酵培养基冷却，二级种子接种至固体培养基中发酵培养，成淡黄色或浅褐色的发酵物；
（5）、发酵物处理：烘干，粉碎，过筛，分装。
本发明菌株为首创的黑曲霉(Aspergillus niger)，其制备方法独特、科学，易操作，所得产品有效用于制备耐酸性α-淀粉酶，生产效率高，产品质量好，耐酸性能好，最适作用pH 和动物消化道相吻合，具有较好的稳定性，包括在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性，是一种理想的饲用淀粉酶，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1 为本发明所测葡萄糖标准曲线图。
图2 为本发明的酸性α-淀粉酶作用pH曲线图。
图3 为本发明的酸性α-淀粉酶作用温度曲线图。
图4 为本发明不同金属离子对酸性α-淀粉酶的影响图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，所述的耐酸性α-淀粉酶菌株分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年12月11日，保藏号：CGMCC No.11862，该菌株的制备方法是通过紫外线(UV) 和硫酸二乙酯(DES) 协同诱变、筛选，获得产酸性α-淀粉酶的菌株，基因为18S rDNA，相关基因序列是：
1 GGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTC 60
61 ATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAAC 120
121 GGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATC 180
181 CAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAA 240
241 ATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTA 300
301 ACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATA 360
361 GCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCC 420
421 GGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAATCTCATGGC 480
481 CTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGC 540
541 AGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTG 600
601 TTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCT 660
661 GTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGG 720
721 ATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTA 780
781 GTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTTCTATTATGACCCGTTCG 840
841 GCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAA 900
901 CTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCA 960
961 ACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCT 1020
1021 TGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAA 1080
1081 TTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCATTTGCGGGCCGCTG 1140
1141 GCTTCTTAGGGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTGCGCGGCAATAACAGGTCTGTG 1200
1201 ATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGGGCCAGCGAGTACATCA 1260
1261 CCTTGGCCGAGAGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACCCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTG 1320
1321 CAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCACGAGTCATCAGCTCGTGCCGATT 1380
1381 ACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCGGTGAGG 1440
1441 CCTTCGGA 1448
制备方法是：
（1）、将1 g酒曲（又称大曲）和富集培养基100 mL装入三角瓶中，置于180rpm 摇床富集培养24 h，10倍稀释法稀释，涂布静置后的上清液于平板分离培养基，置于30℃培养3-5 d，挑取单菌落于PDA平板，培养48 h，采用碘熏蒸法将0.04 g碘轻轻洒在培养皿盖上后，再将装有培养基的培养皿底部倒置在撒有碘的培养皿盖上进行碘熏1min，选透明圈直径与菌落直径之比大的初选菌株；
所述的富集培养基是由马铃薯200 g、葡萄糖20 g、质量浓度1%链霉素3 mL加水至1000mL制成；
所述的分离培养基是由KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖 10 g、琼脂 18 g和质量浓度1%孟加拉红水溶液3.3 mL加水至1000 mL，使用时每100 mL培养基中加质量浓度1%链霉素液0.3 mL；
（2）、将初选菌株接入基础产酶培养基，30 ℃、180 r/min培养3d，测酶活，酶活最高的菌株鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，PDA斜面保存；
所述的基础产酶培养基是由淀粉20 g、蛋白胨2 g、尿素2 g、KH2PO43 g加水至1000mL，调pH 4.5制成；
该黑曲霉(Aspergillus niger)有效用于制备耐酸性α-淀粉酶，包括以下步骤：
（1）、菌种活化：将保藏的黑曲霉菌株接入马铃薯葡萄糖(PDA) 培养基斜面，30 ℃培养至产孢，连续转接三次，成为活性菌种；
（2）、种子培养：将种子培养基100 mL装入250 mL三角瓶中，在0.1Mpa 下灭菌30 min，灭菌后冷却至35 ℃待用；将活性菌种接种于已灭菌冷却后的一级种子培养基中，每个三角瓶内接五环，于30 ℃培养48 h，得到一级种子；二级种子培殖：将种子培养基400 mL装入1000 mL 的三角瓶中，接入体积比1％的一级种子，30 ℃培养68 h，得到二级种子；
所述的种子培养基是由玉米淀粉20-40 g/L、蛋白胨2 g/L、尿素2 g/L、KH2PO4 3 g/L、MnSO4•H2O 0.1-1.0 g/L 、FeSO4 •7H2O 0.01 g/L混匀，调整pH 3.0-5.0制成；
（3）、制备固体发酵培养基：制备固体发酵培养基，该培养基是由麸皮70kg、花生壳粉15kg、豆粕粉10 kg、玉米粉5 kg、MnSO4•H2O 0.05 kg、K2HPO4 0.1 kg作原料和水制成，料液重量比为1︰1（即水的加入量为麸皮、花生壳粉、豆粕粉、玉米粉、MnSO4•H2O、K2HPO4的重量和）；豆粕粉、玉米粉用部分水润湿3 h，无机盐MnSO4•H2O、K2HPO4溶解于部分水中，然后加入剩余的水、花生壳粉、麸皮及已润湿的豆粕粉、玉米粉，混匀装入灭菌锅中，常压灭菌1.5 h，成固体发酵培养基；
（4）、冷却接种：将灭菌后的固体发酵培养基冷却至35 ℃，二级种子按照重量比5%-10%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，置入发酵床培养；
（5）、发酵床培养：室温28-30 ℃，湿度90％，培养基料温度35 ℃，发酵48 h，成淡黄色或浅褐色的发酵物；
（6）、发酵物处理：首先在45 ℃下烘干，再粉碎，过0.42 mm 孔径筛，经检测合格后为成品，分装。
本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)为首创，其制备方法科学，易操作，生产效率高，产品质量好，有效用于生产耐酸性α-淀粉酶，并经测试和实验，其效果非常好，有关资料如下：
幼畜自身酶系不全，酶活力不足，处于快速生长阶段，而耐酸性α-淀粉酶可以降解生物多聚物，强化消化功能，提高饲料利用率，促进幼畜的生长发育。本发明所述的酸性α-淀粉酶产生菌对淀粉有较高的酶解效果；温度30-50 ℃时酶活稳定，在动物体温（37-42 ℃）的条件下具有较高的活性；最适作用pH为3.6，在pH 3.0-5.0范围内酶活稳定，与消化道内食糜的pH范围一致；最适作用温度为70 ℃，Mn2+、K+等多种离子对此酶有激活作用，具有很好的稳定性，包括在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、金属离子等的耐受性。
淀粉酶活性测定及表征如下：
利用DNS(3,5- 二硝基水杨酸) 法测定淀粉酶活性。在碱性条件下，二硝基水杨酸(DNS) 与还原糖发生氧化还原反应，生成的3- 氨基-5- 硝基水杨酸在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，可用分光光度计比色法测定还原糖含量。
DNS 试剂的配制：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69mL，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠制成甲液；将255 g酒石酸钾钠溶于300 mL10%NaOH溶液中，再加入880 mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液制成乙液；将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7-10 d后使用。
葡萄糖标准曲线的制作：称取0.1g的葡萄糖,溶于少量蒸馏水中,在容量瓶中定容至100 mL，分别取0、20、40、60、80、100、120 μL葡萄糖溶液加入200、180、160、140、120、100、80 μL无菌去离子水，以无菌去离子水为空白对照，各设3个平行，上述溶液与200 μL DNS溶液混合后置沸水浴中5 min，冷却至室温，定容至2.5 mL。540 nm测定吸光度。以葡萄糖质量为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线（图1）。
粗酶液的制备：将发酵液经四层灭菌纱布过滤后，8000 r离心10 min，取上清液。
酶活测定方法：180 μL底物（1%可溶性淀粉）加入20 μL酶液（CK为20 μL缓冲液），在一定温度下反应10 min，加入200 μlDNS试剂，沸水浴5 min终止反应，冷却后加蒸馏水2.1 mL，520 nm下测定吸光值。利用公式计算低温淀粉酶酶活力。
公式：A＝D*(146.52×R+6.3099)/（180.16*10）
式中：A为酶活力；D为稀释倍数；R为反应液加DNS的OD值；180.16为葡萄糖分子量；10为反应时间。
酶活力单位（U）定义为：70 ℃、pH3.6条件下每分钟从1%可溶性淀粉中释放1 μmol葡萄糖所需的酶量。
酸性α-淀粉酶产生菌的分离鉴定
平板分离：取样品1 g放入装有100 mL富集培养基（马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，1%链霉素3 mL/L）及玻璃珠的250 mL 三角瓶中，置于180 rpm 摇床富集培养24 h。10 倍稀释法，涂布静置后的上清液于平板分离培养基（KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10 g/L，琼脂18 g/L，pH5.0，1%孟加拉红水溶液3.3 mL/L。临用时每100 mL培养基中加1%链霉素液0.3 mL）。置于30℃培养3-5 d，挑取单菌落于PDA平板，培养48 h。采用碘熏蒸法[1]：将0.04 g碘轻轻洒在培养皿盖上后，将装有培养基的培养皿底部倒置在撒有碘的培养皿盖上进行碘熏1 min。选透明圈直径与菌落直径之比大的初选菌株。
菌株筛选：将初选菌株接入基础产酶培养基（淀粉20 g/L、蛋白胨2 g/L、尿素2 g/L、KH2PO4 3 g/L，pH4.5），相同条件培养3 d后测酶活。将酶活最高的菌株作为进一步研究的出发菌株。PDA斜面保存。
菌株鉴定：1、形态观察
将菌株A-5接种至PDA培养基上培养2 d，观察其形态特征。菌落生长速度快，菌落初期为淡黄色，有褶皱；后期菌落中央黄色，边缘为白色菌丝，背面黄色。产生大量黑色分生孢子。结合显微观察和电镜下观察，鉴定为黑曲霉。
2、酸性α-淀粉酶产生菌的基因序列鉴定
真菌DNA的提取采用CTAB法[2]。以基因组DNA为模板，采用真菌18S rDNA 通用引物菌株18S rRNA：PCR扩增采用引物为：NS1 (5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC -3’)；
NS8 (5’- TCCGCAGGTTCACCTACGGA -3’) PCR扩增18S rDNA 序列。PCR扩增体系为50 μL，包括无菌双蒸水19 μL，正向和反向引物各2.0 μL，模板DNA2.0 μL，Mix DNA聚合酶25 μL。每个反应30个循环，每个循环包括94 ℃变性30 S，54 ℃退火30 S，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min，首次循环在95 ℃下预变性2 min。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送华大基因测序，大小为1448个碱基。将该序列于NCBI 网站进行BLAST 核苷酸比对分析，通过GenBank数据做相似性分析，与黑曲霉的18S rDNA 序列(GenBank:KT832786.1) 同源性为100％。
诱变筛选
菌液制备：将出发菌株活化培养48 h后注入10 mL无菌水，用接种环充分搅匀，过滤掉菌丝，稀释至孢子浓度约为l0 个/mL，作为待处理的孢子悬液；
紫外线诱变：取稀释后的孢子悬液5 mL，倾入直径为9 cm的底部平整的培养皿中，在磁力搅拌器缓慢搅拌的条件下，置于15 w 紫外灯垂直距离30 cm处照射5、10、15、20、25、30、60、120 s，稀释至适当梯度，取0.1 mL涂布于筛选平板，30℃ 避光培养72 h，通过平板计数计算致死率，选取致死率70％-80％的诱变剂量，以15 s作为紫外线诱变照射时间。挑取单菌落接种斜面培养作发酵产酶实验；
硫酸二乙酯(DES)诱变：制备菌悬液方法同紫外诱变。经紫外线诱变得到的高产菌株于斜面上30℃培养48 h，在100 mL的三角瓶中加入16 mL pH7.2的磷酸缓冲溶液和4 mL菌悬液，再加入0.2 mL DES溶液混匀，36℃恒温振荡处理10，20，30，40，50，60 min，取1 mL处理液，加入0.5 mL25％Na2S2O3，终止反应。将处理液适当稀释，取0.1 mL涂布于分离培养基平板，30℃培养2-4 d。菌落计数后制作致死率曲线，确定诱变剂量并进行诱变。选用致死率70％-80％的诱变剂量，取20 min作为硫酸二乙酯诱变处理时间。
突变株的筛选：取诱变处理液稀释并涂布于分离培养基平板，于30 ℃培养箱中培养2-4 d，碘熏蒸法选取透明圈与菌落直径比值大的菌株挑斜面，纯化后进行复筛发酵，选取酶活力最高的菌株。
结果发现A-5酶活力高且产酶稳定。
酸性α-淀粉酶酶学性质
1、最适pH 值的测定
用pH分别为3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0的缓冲液(NaH2PO4-柠檬酸缓冲体系)配制底物，将酶液用相应pH的缓冲液稀释至适当倍数并测定酶活；将稀释酶液在40℃下保温1 h，40 ℃测定剩余酶活。不同pH对酶活力的影响参见附图2。
由附图2可知：pH对酶活力影响较大；pH3.6-4.6之间能保持99%以上的相对酶活，在pH为3.6时酶活力达到最强，说明此酶适宜于酸性的反应环境。继续升高酶活力逐渐减弱，pH5.6以上时酶活力呈迅速下降趋势，说明此酶耐碱性较差。
2、最适温度的测定
将酶液稀释一定倍数，与底物分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下进行反应，测定酶活；酶液分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃保温1 h，40 ℃下测定剩余酶活。不同反应温度对酶活力的影响参见附图3。
由附图3可知，在30-50℃酶活均保持较高的稳定性；酶的最适反应温度为70 ℃，70 ℃时酶活力达到最强。
3、金属离子
在反应体系中分别加入2 μmol/mL的Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、K+、Co2+，测定酶活。以未处理原酶液为对照100%，由图4可以看出金属离子对酶活的影响。
Mn2+、K+对酶活有明显的激活作用，相对酶活达到153%和121%； Ca2+对酶活没有明显影响。
本发明易于生产，方法简单，生产周期短；该酶产品有利于在动物胃肠的酸性环境中发挥水解作用，有助于营养物质的吸收，应用效果好，是绿色的饲用添加剂。固态发酵菌丝的代谢途径与液体菌丝不同，其细胞分化程度高，代谢途径复杂，因此，单位体积或重量酶产量固体发酵比液体发酵要高5-10倍；固体发酵通常以饲料原料作为产酶培养基，产物中通常含有多种酶系，这些酶系由培养基的诱导天然生成，和饲料中的底物完全匹配，并具有天然的协同作用，而液体发酵的产物往往酶种比较单一。在同等酶活情况下，固体发酵生产的耐酸性α-淀粉酶在饲料中使用的效果更加显著。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种耐酸性α-淀粉酶菌株及其生产方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 1
ggctccttgg tgaatcataa taacttaacg aatcgcatgg ccttgcgccg gcgatggttc 60
attcaaattt ctgccctatc aactttcgat ggtaggatag tggcctacca tggtggcaac 120
gggtaacggg gaattagggt tcgattccgg agagggagcc tgagaaacgg ctaccacatc 180
caaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatcccgaca cggggaggta gtgacaataa 240
atactgatac ggggctcttt tgggtctcgt aattggaatg agtacaatct aaatccctta 300
acgaggaaca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccaata 360
gcgtatatta aagttgttgc agttaaaaag ctcgtagttg aaccttgggt ctggctggcc 420
ggtccgcctc accgcgagta ctggtccggc tggacctttc cttctgggga atctcatggc 480
cttcactggc tgtgggggga accaggactt ttactgtgaa aaaattagag tgttcaaagc 540
aggcctttgc tcgaatacat tagcatggaa taatagaata ggacgtgcgg ttctattttg 600
ttggtttcta ggaccgccgt aatgattaat agggatagtc gggggcgtca gtattcagct 660
gtcagaggtg aaattcttgg atttgctgaa gactaactac tgcgaaagca ttcgccaagg 720
atgttttcat taatcaggga acgaaagtta ggggatcgaa gacgatcaga taccgtcgta 780
gtcttaacca taaactatgc cgactaggga tcggacggtg tttctattat gacccgttcg 840
gcaccttacg agaaatcaaa gtttttgggt tctgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa 900
cttaaagaaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc ctgcggctta atttgactca 960
acacggggaa actcaccagg tccagacaaa ataaggattg acagattgag agctctttct 1020
tgatcttttg gatggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctgcttaa 1080
ttgcgataac gaacgagacc tcggccctta aatagcccgg tccgcatttg cgggccgctg 1140
gcttcttagg gggactatcg gctcaagccg atggaagtgc gcggcaataa caggtctgtg 1200
atgcccttag atgttctggg ccgcacgcgc gctacactga cagggccagc gagtacatca 1260
ccttggccga gaggtctggg taatcttgtt aaaccctgtc gtgctgggga tagagcattg 1320
caattattgc tcttcaacga ggaatgccta gtaggcacga gtcatcagct cgtgccgatt 1380
acgtccctgc cctttgtaca caccgcccgt cgctactacc gattgaatgg ctcggtgagg 1440
ccttcgga 1448

Claims (2)

1.一种耐酸性α-淀粉酶菌株，该耐酸性α-淀粉酶菌株分类命名为黑曲霉(Aspergillusniger)，菌株保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年12月11日，保藏号：CGMCC No.11862，该菌株的基因为18S rDNA。
2.权利要求1所述的耐酸性α-淀粉酶菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将酒曲1 g和富集培养基100 mL装入三角瓶中，置于180 rpm 摇床富集培养24 h，10倍稀释法稀释，涂布静置后的上清液于平板分离培养基，置于30 ℃培养3-5 d，挑取单菌落于PDA平板，培养48 h，采用碘熏蒸法将0.04 g碘轻轻洒在培养皿盖上后，再将装有培养基的培养皿底部倒置在撒有碘的培养皿盖上进行碘熏1min，选透明圈直径与菌落直径之比大的初选菌株；
所述的富集培养基是由马铃薯200g、葡萄糖20g、质量浓度1%链霉素3mL加水至1000mL制成；
所述的分离培养基是由KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖 10g、琼脂 18g和质量浓度1%孟加拉红水溶液3.3mL加水至1000mL，使用时每100mL培养基中加质量浓度1%链霉素液0.3mL；
（2）、将初选菌株接入基础产酶培养基，30 ℃、180 r/min培养3d，测酶活，酶活最高的菌株鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，PDA斜面保存；
所述的基础产酶培养基是由淀粉20 g、蛋白胨2 g、尿素2 g、KH2PO43 g加水至1000mL，调pH4.5制成；
该黑曲霉(Aspergillus niger)有效用于制备耐酸性α-淀粉酶，包括以下步骤：
（1）、菌种活化：将保藏的黑曲霉菌株接入马铃薯葡萄糖培养基斜面，30 ℃培养至产孢，连续转接三次，成为活性菌种；
（2）、种子培养：将种子培养基100 mL装入250 mL三角瓶中，在0.1Mpa 下灭菌30 min，灭菌后冷却至35 ℃待用；将活性菌种接种于已灭菌冷却后的一级种子培养基中，每个三角瓶内接五环，于30℃培养48 h，得到一级种子；二级种子培殖：将种子培养基400 mL装入1000 ml 的三角瓶中，接入体积比1％的一级种子，30 ℃培养68 h，得到二级种子；
所述的种子培养基是由玉米淀粉20-40 g/L、蛋白胨2 g/L、尿素2 g/L、KH2PO43 g/L、MnSO4•H2O 0.1-1.0 g/L 、FeSO4 •7H2O 0.01 g/L混匀，调整pH3.0-5.0制成；
（3）、制备固体发酵培养基：制备固体发酵培养基，该培养基是由麸皮70 kg、花生壳粉15 kg、豆粕粉10 kg、玉米粉5 kg、MnSO4•H2O 0.05 kg、K2HPO4 0.1 kg作原料和水制成，料液重量比为1︰1（即水的加入量为麸皮、花生壳粉、豆粕粉、玉米粉、MnSO4•H2O、K2HPO4的重量和）；豆粕粉、玉米粉用部分水润湿3 h，无机盐MnSO4•H2O、K2HPO4溶解于部分水中，然后加入剩余的水、花生壳粉、麸皮及已润湿的豆粕粉、玉米粉，混匀装入灭菌锅中，常压灭菌1.5 h，成固体发酵培养基；
（4）、冷却接种：将灭菌后的固体发酵培养基冷却至35 ℃，二级种子按照重量比5%-10%的比例接种到灭菌冷却后的固体培养基中，置入发酵床培养；
（5）、发酵床培养：室温28-30 ℃，湿度90％，培养基料温度35 ℃，发酵48 h，成淡黄色或浅褐色的发酵物；
（6）、发酵物处理：首先在45 ℃下烘干，再粉碎，过0.42 mm 孔径筛，经检测合格后为成品，分装。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616211A (zh) * 2019-10-12 2019-12-27 中国科学院成都生物研究所 一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用
CN114644984A (zh) * 2022-04-28 2022-06-21 临沂大学 一种从土壤中分离产淀粉酶的微生物的方法
CN116676302A (zh) * 2023-06-26 2023-09-01 康彤(上海)生物研发有限公司 一种高产CGTase的毕赤酵母突变株的诱变与筛选方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695388A (zh) * 2013-12-16 2014-04-02 青岛蔚蓝生物集团有限公司 α淀粉酶及表达α淀粉酶的黑曲霉菌株
CN104004729A (zh) * 2014-01-23 2014-08-27 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种产α-淀粉酶的黑曲霉菌株及其应用
CN105154376A (zh) * 2015-10-19 2015-12-16 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695388A (zh) * 2013-12-16 2014-04-02 青岛蔚蓝生物集团有限公司 α淀粉酶及表达α淀粉酶的黑曲霉菌株
CN104004729A (zh) * 2014-01-23 2014-08-27 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种产α-淀粉酶的黑曲霉菌株及其应用
CN105154376A (zh) * 2015-10-19 2015-12-16 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WU,Z. ET AL: "Aspergillus niger strain UPSC 1769 18S ribosomal RNA gene, partial sequence", 《GENBANK：AF548064.1》 *
颜守保 等: "耐酸性α-淀粉酶产生菌株的筛选及其液态发酵条件研究", 《中国酿造》 *
鲍勇阳 等: "高产淀粉酶黑曲霉菌种诱变选育及固态发酵条件研究", 《井冈山大学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616211A (zh) * 2019-10-12 2019-12-27 中国科学院成都生物研究所 一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用
CN110616211B (zh) * 2019-10-12 2021-05-07 中国科学院成都生物研究所 一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用
CN114644984A (zh) * 2022-04-28 2022-06-21 临沂大学 一种从土壤中分离产淀粉酶的微生物的方法
CN116676302A (zh) * 2023-06-26 2023-09-01 康彤(上海)生物研发有限公司 一种高产CGTase的毕赤酵母突变株的诱变与筛选方法

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