CN104004729A - 一种产α-淀粉酶的黑曲霉菌株及其应用 - Google Patents

一种产α-淀粉酶的黑曲霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种α-淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明另一方面提供了一种表达上述α-淀粉酶的黑曲霉P11-51（Aspergillus niger P11-51），菌株编号为CCTCC NO:M2014017。本发明通过紫外诱变方法获得的突变菌株黑曲霉P11-51能够高效表达来源于棒曲霉的α-淀粉酶，其发酵酶活高达486.45CU/mL，是出发菌株的1.99倍。所述黑曲霉P11-51是食品安全菌（GRAS），其生产的α-淀粉酶可广泛应用于食品加工领域。所述α-淀粉酶可以使面包的比容增加10-15%，减小面包皮和面包心的硬度，改善面包质地，提高面包的焙烤品质，还能改进面包的体积，改良面包的口感，使面包等产品体积更大，颗粒更柔软，显著提高面包的品质。

Description

一种产α-淀粉酶的黑曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种产α-淀粉酶的黑曲霉诱变菌株及其应用。 
背景技术
α-淀粉酶(α-amylase)是一种内切酶，它以在淀粉分子的内部随机切开α-1,4糖苷键的方式作用于淀粉从而淀粉分子迅速降解，失去粘性，同时使水解物的还原力增加。 
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂,α-淀粉酶是较早发现并应用于工业的重要酶制剂之一。α-淀粉酶广泛应用于淀粉加工业，如制造葡萄糖、麦芽糖、各种糊精等；食品工业中，如面包烘焙、饴糖、味精、果汁、香料等行业；酿造发酵工业，如啤酒、白酒、醋、醫油等；纺织工业，α-淀粉酶用于化学纤维、高质量的丝绸及人造棉的退浆工艺；制药、医疗方面，α-淀粉酶可制成不同品种的工业酶、医用酶、消化药、诊断酶等。在洗涤剂工业中，淀粉酶与碱性蛋白酶、脂肪酶等添加到洗衣粉中协同作用，使其发挥更好的洗涤效果；还有造纸工业、饲料工业等等。 
已报道有多种α‐淀粉酶基因在不同宿主中得到表达，其中真菌α‐淀粉酶基因的异源表达主要集中在真核表达系统。与原核表达系统(如大肠杆菌表达系统或芽孢杆菌表达系统等)相比，真核表达系统在表达真核来源的异源蛋白时具有很大的优势，如翻译后加工修饰(如糖基化、二硫键的形成)、内含子的识别、信号肽的剪除和肽链的正确折叠与分泌等。此外，有多种真菌表达系统被美国FDA列为GRAS(generally recognized as safe)菌株，使得对一些食品或医药用异源蛋白的生产和应用更易获得相关机构的认可和批准。 
目前，已有大量来自曲霉属（Aspergillus.sp）的α‐淀粉酶被报道并用于工业生产，这些淀粉酶具有优良的酶学性质，但其生产菌株的表达量普遍较低，严重制约了淀粉酶的广泛应用。 
发明内容
本发明的目的是提供一种高产α‐淀粉酶的黑曲霉菌株及其应用。本发明通过将来源于棒曲霉（Aspergillus clavatus）的α‐淀粉酶基因导入黑曲霉（Aspergillus niger）中，构建得到重组表达异源α‐淀粉酶的黑曲霉工程菌株， 并经过诱变筛选后获得一种α‐淀粉酶表达量显著提高的黑曲霉突变株。 
本发明一方面提供了一种α-淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。 
编码上述α-淀粉酶的一种编码mRNA序列为SEQ ID NO:2。 
本发明另一方面提供了一种表达上述α-淀粉酶的黑曲霉P11-51(Aspergillus niger P11-51)，并已于2014年1月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，菌株编号为CCTCC NO:M2014017。 
上述黑曲霉P11-51用于生产α-淀粉酶。 
本发明通过紫外诱变方法获得的突变菌株黑曲霉P11-51能够高效表达来源于棒曲霉的α-淀粉酶，其发酵酶活高达486.45CU/mL，是出发菌株的1.99倍。所述黑曲霉P11-51是食品安全菌（GRAS），其生产的α-淀粉酶可广泛应用于食品加工领域。本发明所述α-淀粉酶可以使面包的比容增加10-15%，减小面包皮和面包心的硬度，改善面包质地，提高面包的焙烤品质，还能改进面包的体积，改良面包的口感，使面包等产品体积更大，颗粒更柔软，显著提高面包的品质。 
附图说明
图1：突变株黑曲霉P11-51与出发菌株菌丝形态对比图； 
图2：突变株黑曲霉P11-51与出发菌株菌落形态对比图； 
图3：突变株黑曲霉P11-51发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，箭头所指处即为重组表达的α-淀粉酶。 
具体实施方式
本发明用到了在遗传工程和分子生物学领域中常用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)等参考书中所记载的技术。但是，这并不意味着将本发明限定于实施例中所记载的具体方法、实验方案和试剂，本领域的普通技术人员可以选用已公开的技术来实施本发明实施例中记载的方案。 
除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,3nd Ed.(Singleton et al.,2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale et al.,2003)为技术人员提 供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释，具体如下： 
如本文所用，术语“淀粉”指植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何物质，包括具有(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。 
如本文所用，术语“α-淀粉酶”指催化1,4-α-糖苷键水解的酶。这些酶也被描述为在含有1,4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中完成1,4-α-D-糖苷键的外切或内切水解的酶。另一个用于描述这些酶的术语是“糖原酶(glycogenase)”。 
如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体是，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者所述细胞来自于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因，但这些基因异常表达、表达不足或者完全不表达。 
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。 
如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。 
如本文所用，术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。 
除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。 
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。 
如本文所用，术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。 
如本文所用，术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。 
如本文所用，术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。 
如本文所用，当描述蛋白或编码它们的基因是，用于该基因的术语一般用斜体表示(例如编码AclaP11淀粉酶的基因可以表示为AclaP11)。用于蛋白的术语一般不用斜体表示(例如，由AclaP11基因编码的淀粉酶可以表示为AclaP11)。 
与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，当被连配时，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。所述连配以及同源性或同一性百分比可以用本领域已知的任何合适的软件程序确定，例如BLAST(Altschulet al.Basic local alignment search tool.Journal of Molecular Biology,1990,215(3):403–410)。由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。 
如本文所用，术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码α-淀粉酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。 
如本文所用，术语“曲霉”或“曲霉属某种”指以前或目前被分类为曲霉属的任何真菌属。 
如本文所用，术语“培养”指使一群微生物细胞在适当条件下在液体或固体培养基中生长。 
如本文所用，有关多核苷酸或蛋白质的术语“异源”指在宿主细胞中并非天然存在的多核苷酸或蛋白质。该术语意图包含由天然发生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。 
如本文所用，有关多核苷酸或蛋白质的术语“内源”至在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。 
如本文所用，有关细胞所用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”表示该细胞含有非天然的(例如异源的)核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因组或者作为被保持多代的附加体质粒。 
在关于将核酸序列中插入细胞中的上下文中，术语“导入”表示“转染”、“转化”或“转导”，包括表示将核酸序列整合入真核或原核细胞，其中该核酸序列可以被整合入该细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA) 中、转变成自发复制子或者被瞬时表达(例如转染的mRNA)。 
如本文所用，术语“酶活力单位”指在特定条件下每给定的时间内产生给定量的产物的酶量。在一些实施方式中，术语“淀粉酶活力单位”(CU)被定义为在给定的温度及pH条件下，在过量热稳定性α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)存在的条件下，每分钟从non-reducing-end blocked p-nitrophenylmaltoheptaoside(BPNPG7)底物中释放1微摩尔对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需的酶量。 
“CGMCC”指中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京100101，中国， 
“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA20108，USA， 
“NRRL”美国北方农业研究所培养物保藏中心，Peoria，IL61604，USA， 
重组表达的酶和宿主细胞：
在本发明的一些实施方式中，微生物被遗传改造以表达异源α-淀粉酶，优选的宿主细胞是丝状真菌细胞。 
一些优选的真菌宿主细胞包括构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本木霉(A.japonicus)、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄腐镰刀菌(F.solani)。 
在一些实施方式中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属某种的菌株。有用的曲霉宿主菌株包括但不限于构巢曲霉(Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:1470-1474;Mullaney et al.,Mol.Gen.Genet.,1985,199:37-45;Johnstone et al.EMBO J.,1985,4:1307-1311)；黑曲霉(Kelly et al.,EMBO J.,1985,4:475-479)；泡盛曲霉(NRRL3112、UVK143f(USP5364770)、ATCC22342、ATCC44733和ATCC14331)和米曲霉(ATCC11490)。在进一步的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是黑曲霉菌株。 
根据本发明，包含编码α-淀粉酶(诸如AclaP11)的核酸的DNA构建物被构建以便导入宿主细胞。在一些实施方式中，通过表达载体将DNA构建物导入宿主细胞，所述表达载体包括可操纵地连接于α-淀粉酶(诸如AclaP11)编码序列的调控序列。 
在一些实施方式中，编码α-淀粉酶(AclaP11)的核酸被可操纵的连接于合适的启动子，该启动子在真菌宿主细胞中表现出转录活性。该启动子可以来源于编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白的基因。优选地，启动子是在曲霉宿主中有用的。有用的启动子的非限制性实例包括来源于编码泡盛曲 霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunberg et al.,Mol.Cell Biol.,1984,4:2306-2315;USP5364770;USP6590078;Gwynne et al.,Nat.Biotechnol.,1987,5:713-719;Boel et al.,EMBO J.,1984,3:1581-1585)、黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶和黑曲霉中性α-淀粉酶基因的启动子。在进一步的实施方式中，启动子是编码黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子。 
在一些实施方式中，α-淀粉酶(AclaP11)的编码序列可操纵的连接于信号序列。编码信号序列的DNA优选地与将被表达的基因天然相关。在进一步的实施方式中，与α-淀粉酶编码序列相连接的信号序列由编码α-淀粉酶的基因编码(例如，AclaP11的信号序列由AclaP11基因编码)。 
在一些实施方式中，表达载体也包括终止序列。有用的终止子的非限制性实例包括编码黑曲霉、塔宾曲霉(A.tubingensis)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子(Nunberg et al.,Mol.Cell Biol.,1984,4:2306-2315和Boel et al.,EMBO J.,1984,3:1581-1585)。在进一步的实施方式中，终止序列是编码塔宾曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子。 
在一些实施方式中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的实例包括但不限于赋予抗微生物剂耐性的标记(例如潮霉素、博来霉素、氯霉素和腐草霉素)。赋予代谢优势的基因，诸如营养选择性标记，也可用于本发明，包括本领域已知的那些标记如amdS、argB和pry4。在进一步的实施方式中，选择性标记是构巢曲霉amdS基因，其编码乙酰胺酶，使被转化的细胞能够以乙酰胺为氮源进行生长。构巢曲霉amdS基因作为选择性标记的应用在Kelly et al.,EMBO J.,1985,4:475-479和Penttila et al.,Gene,1987,61:155-164中被描述。 
包含带有编码α-淀粉酶的多核苷酸的DNA构建物的表达载体可以是能够在给定的真菌宿主生物中自我复制或整合进宿主DNA中的任何载体。在一些实施方式中，该表达载体是质粒。在进一步的实施方式中，表达载体中的启动子是编码黑曲霉糖化酶基因的启动子，终止子是是编码塔宾曲霉糖化酶基因的终止子，选择性标记是构巢曲霉amdS基因。 
用于将编码α-淀粉酶(诸如AclaP11)的多核苷酸插入表达载体的方法是本领域熟知的。一般是通过在方便的限制性位点进行酶切和连接反应来完成的。在一些实施方式中，所用的限制性酶切位点是AflII和NotI。 
宿主细胞的转化、表达和培养：
将DNA构建物或载体导入宿主细胞包括各种技术诸如转化、电穿孔、核微注射、转导、转染(例如脂转染法介导的转染和DEAE-Dextrin介导的转染)、与磷酸钙温浴沉淀DNA、用DNA包被的微射弹进行高速轰击和原生质体融合。一般的转化技术是本领域已知的。对于转化曲霉菌株，参考Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:1470-1474和EP238023。 
优选地，遗传稳定的转化子用载体系统构建，由此编码的α-淀粉酶(诸如AclaP11)的核酸被稳定整合进宿主菌株染色体中，然后可以通过已知的技术纯化转化子。 
在一种非限制性实例中，包含amdS标记的稳定转化子通过其在含乙酰胺的固体培养基上更快的生长速度以及形成光滑的而非边缘粗糙的圆形克隆而与非稳定转化子相区别。此外，在一些情况下，进一步的稳定性测试可以通过使转化子在固体的非选择性培养基(即缺乏乙酰胺的培养基)上生长，从该培养基收获孢子，以及确定随后发芽并在含乙酰胺的选择性培养基上生长的这些孢子的百分比来进行。可选的，本领域已知的其他方法可以被用于选择转化子。 
在一些实施方式中，用于转化的曲霉属某种的制备包括来自真菌菌丝体的原生质体的制备(参见Campbell et al.,Curr.Genet.,16:53-56)。菌丝体是从萌发的营养孢子获得的。将菌丝体用消化细胞壁的酶处理，产生原生质体。然后通过悬浮培养基中存在的渗透压稳定剂对原生质体加以保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁和类似物。通常这些稳定剂的浓度在0.8～1.2M之间变化。 
宿主菌株对DNA的摄入可以由钙离子浓度决定。一般而言，10～10mM的CaCl2可以被用在社区摄取溶液中。在摄取溶液中除了对钙离子的需求，一般被包括的其他化合物是缓冲体系诸如TE缓冲液(10mMTris(pH7.4)和1mM EDTA)或10mM MOPS(pH6.0)缓冲液和聚乙二醇(PEG)。 
通常在转化中使用含有宿主细胞或原生质体诸如曲霉属某种的原生质体或细胞的悬浮液，所述原生质体或细胞已经以约107个/mL的密度经过渗透性处理。在一些实施方式中，将大约100μL体积的这些原生质体或细胞的适当溶液(例如1.2M山梨醇和50mM CaCl2)与期望的DNA混合。在一些实施方式中，将高浓度的PEG加入摄取溶液中。可以向原生质体悬浮液中加入0.1～1体积的25%PEG4000。然而，优选地向原生质体悬浮液中加 入大约0.25体积。添加剂诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾和类似物也可以被加入到摄取溶液中并帮助转化。类似的方法可以用于其他真菌宿主细胞(参考USP6022725和6268328)。 
一般的，然后将混合物在大约0℃温浴10～30min。向混合物中加入额外的PEG以进一步加强对所需基因或DNA序列的摄取。在一些实施方式中，加入转化混合物的5至15倍体积的25%PEG4000。但是，更多或更少的体积都可能是合适的。25%PEG4000优选地是转化混合物体积的大约10倍。加入PEG后，可以将转化混合物在室温温浴或者在冰上冰浴，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后将原生质体悬浮液进一步加入到熔化的小量等份生长培养基中。当生长培养基包括生长选择条件(例如乙酰胺或抗生素)是，其仅允许转化子生长。 
一般而言，细胞被培养在含生理盐和营养剂的标准培养基中(参见Pourquie et al.,BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION,Academic Press,1988,71-86和Ilmen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63:1298-1306)。普通的商业配置培养基(例如Yeast Malt Extract(YM)肉汤、Luria Bertani(LB)肉汤和Sabouraud Dextrose(SD)肉汤)也可以用于本发明。 
培养条件也是标准的(例如将培养物在摇床培养器中，在合适的培养基中大约30℃下温浴直至达到所需的α-淀粉酶(诸如AclaP11)表达水平)。给定的丝状真菌的培养条件是本领域已知的并且可以在科学文献中和/或从该真菌的来源诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传学保存中心(FGSC)找到。 
酶表达的分析和酶活力的测定：
为了评价α-淀粉酶(诸如AclaP11)的表达，可以在蛋白水平或核酸水平进行分析。可以应用的分析方法包括Northern印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、Southern印迹、放射自显影、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)和含有适当标记的探针(基于核酸编码序列)进行的原位杂交。此外，基因表达可以通过免疫学方法，诸如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或者组织培养基的免疫试验。例如通过Western印迹或ELISA来评估。这样的免疫试验可以用于定性地和定量地评价α-淀粉酶(诸如AclaP11)的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的，并且用于实施此类方法的许多试剂是 可商业获得的。在一些实施方式中，α-淀粉酶(诸如AclaP11)的表达的通过SDS-PAGE进行分析。 
α-淀粉酶(AclaP11)的活力可以通过Miller,Anal.Chem.,1959,31:426-428中所述的DNS法来测量。酶活力也可以通过测定单位时间液化可溶性淀粉的能力来进行测定(参考GB8275-2009和GB/T24401-2009)。在一些实施方式中，α-淀粉酶的活力通过使用α-淀粉酶活力测定试剂盒(Megazyme)进行测定。 
下面结合具体实施例对本发明的α-淀粉酶和诱变菌株进行描述。 
在以下的公开内容和实验部分中，应用下列缩略语： 
AclaP11(具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的α-淀粉酶)、℃(摄氏度)、rpm(每分钟的转速)、dlH2O(去离子水，Milli-Q过滤)、kD(千道尔顿)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、cm(厘米)、μm(微米)、L(升)、mL(毫升)、μL(微升)、M(摩尔浓度)、mM(毫摩尔浓度)、CU(酶活单位)、min(分钟)、h(小时)、d(天)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)，SDS(十二烷基硫酸钠)、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)、MOPS(吗啉丙磺酸)。 
实施例1：α-淀粉酶基因AclaP11的克隆 
按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从棒曲霉CGMCC3.5289过夜培养物中提取基因组DNA。 
根据NCBI上的编号为XM_001271888的α-淀粉酶基因序列设计PCR引物，用于克隆棒曲霉中的AclaP11基因的正向引物AclaP11-F序列如下： 
5’-ACGGCCTTAAGAAGATGCCTCGGATTTGGTCCTC 
(下划线所示序列为AflII酶切位点)， 
反向引物AclaP11-R序列为： 
5’-ATTGCGGCCGCAGCTCAAGCACAGATCTTGCTTC 
(下划线所示序列为NotI酶切位点)。 
将该基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)从棒曲霉基因组DNA中扩增出来。 
扩增条件： 
第一步：98℃保持3min。 
第二步：98℃保持10s，然后72℃保持75s，此步骤重复30次。 
第三步：72℃保持10min。 
使用凝胶纯化试剂盒将上述PCR产物纯化，用限制性内切酶AflII和NotI(Fermentas)对纯化了的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和NotI对质粒pGm（遗传图谱见图1）进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。 
按照制造商的说明书，使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。将所得质粒命名为pGm-AclaP11，测序结果显示上述本发明PCR扩增得到的α-淀粉酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其翻译的氨基酸（蛋白）序列为SEQ ID NO:1。 
实施例2：PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉 
吸取黑曲霉G1孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30℃、200rpm的条件培养14～16h。 
用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30℃、200rpm的条件下温浴1～2h，用显微镜观察检测原生质体化进展。 
用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×107个/mL。 
在冰上，将100μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反应用1管。加入10μg质粒。加入12.5μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。 
将MMSA顶层琼脂试管熔化并保持在55℃。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中加入1mL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并将平板在30℃下培 养7～10d。 
溶液A：2.5mL1M K2HPO4，2.5mL1M KH2PO4，48.156g MgSO4，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 
溶液B：5mL1MTris(pH7.5)，2.77g CaCl2，109.32g山梨醇，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 
溶液C：250g PEG4000，2.77g CaCl2，5mL1MTris(pH7.5)，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 
原生质体化溶液：将0.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 
MMSA平板：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4gCsCl(Sigma)，0.52gKCl，1.52g KH2PO4，218.5g山梨醇，1mL痕量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH2O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO4。 
MMSA顶层琼脂试管：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4gCsCl(Sigma)，0.52gKCl，1.52g KH2PO4，218.5g山梨醇，1ml痕量元素(见下)，10g低熔点琼脂糖，加入dlH2O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO4，之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。 
痕量元素：在250mL dlH2O中加入1g FeSO4·7H2O，8.8g ZnSO4·7H2O，0.4g CuSO4·5H2O，0.15g MnSO4·4H2O，0.1g Na2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH2O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。 
CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。 
CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。 
待平板上长出菌落后，挑选25个菌落，按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从其过夜培养物中提取基因组DNA。按实施例1中所述实验步骤进行PCR验证，对所得PCR产物进行测序。将所得阳性克隆和黑曲霉G1（对照组）的孢子悬浮液分别接种于25mL TSB发 酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养3d，所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10min，收集上清液；将上清液在浓度为8%的SDS-PAGE胶上进行电泳检测；对在55kD处（本发明所述α-淀粉酶的理论分子量大小为55kD）有明显蛋白条带的阳性克隆，利用α-淀粉酶活力测定试剂盒(Megazyme)测定其上清液中淀粉酶的活力，选取酶活力最高的阳性克隆，命名为黑曲霉AclaP11，其酶活约为244.87CU/mL，而作为对照组，宿主细胞黑曲霉G1发酵上清液的酶活仅为46CU/mL，说明本发明构建的工程菌株黑曲霉AclaP11能高效异源表达棒曲霉的α-淀粉酶。 
实施例3出发菌株黑曲霉AclaP11的紫外诱变与筛选 
CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。 
以黑曲霉AclaP11作为出发菌株进行紫外诱变与筛选。 
紫外诱变方法： 
1、孢子悬液的制备：将黑曲霉AclaP11接种至斜面CMA培养基，30℃培养5d。加10mL的无菌生理盐水，将孢子洗下，通过带脱脂棉的漏斗过滤，置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，震荡均匀，制成单孢子悬液，在光学显微镜下用血球计数仪计数后用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到106个/mL，即为待诱变处理的孢子悬液； 
2、预热紫外灯30min；将10mL孢子悬液倒入无菌平皿(直径9cm)中，并将平皿置于距离44w紫外灯18cm的紫外诱变箱中； 
3、紫外灯预热后，开始紫外诱变，打开皿盖，计时；在0min，5min，10min，20min，30min分别吸取100μL孢子悬液，做系列梯度稀释； 
4、诱变结束后，关闭紫光灯，利用红光灯源而非白光灯以避免光修复；将上述各点取出的孢子悬液做梯度稀释；每个稀释度取出100μL涂布筛选平板，在30℃培养箱中避光培养，每个样品做三个平行； 
5、紫外诱变结果观察: 
培养36小时后，观察菌落形态，并进行菌落计数，计算紫外诱变致死率。计算公式如下: 
各个诱变时间平板上的菌落数按照三个平板的平均值来计算。 
选择致死率在95%以上的时间点进行紫外诱变，诱变后用显微镜观察诱变菌的菌丝形态，选择菌丝多分支的菌落，划线接种于CMA固体培养基平板，待其长出黑色孢子后，用无菌水洗下，接种于TSB发酵培养基中，发酵5天后测酶活，挑选酶活高的菌株，所得菌株中有一株突变菌的菌丝形态和菌落形态都发生了明显改变（如图1和图2所示）该突变菌的编号为P11-51。 
将出发菌株黑曲霉AclaP11和突变菌株P11-51的孢子悬浮液分别接种于25mL TSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养5d；所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10min，收集上清液；分别对上清液进行SDS-PAGE电泳检测和酶活测定。电泳结果如图3所示，箭头所指处的蛋白条带即为重组表达的α-淀粉酶，分子量大小为55kD，与预期值一致。 
酶活测定结果显示，在pH5.4，40℃条件下，出发菌株黑曲霉AclaP11的发酵上清液酶活仅为244.87CU/mL，而所述突变菌株P11-51的酶活高达486.45CU/mL，是出发菌株的1.99倍。 
将突变菌株P11-51命名为黑曲霉P11-51(Aspergillus niger P11-51),并于2014年1月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2014017。 
分别将出发菌株黑曲霉AclaP11和突变菌株P11-51的发酵上清液进行酶学性质分析，结果显示，两者的最适作用pH均为6.0，最适作用温度均为50℃，且两者的pH‐相对酶活曲线和温度‐相对酶活曲线没有显著的差异，从而说明与出发菌株黑曲霉AclaP11相比，本发明获得的突变菌株黑曲霉P11-51重组表达的α淀粉酶的酶学性质并没有发生变化。 
实施例4：α-淀粉酶的应用实例 
采用一次发酵法工艺制作面包。面包粉选用鹏泰的面包基础粉（未加任何添加剂）；安琪牌面包酵母；加伦牌起酥油。 
研究发现，按100-200CU/100g面粉添加本发明所述α-淀粉酶，可以使面包的比容增加10-15%，减小面包皮和面包心的硬度，改善面包质地，提高面包的焙烤品质。本发明所述α-淀粉酶还能改进面包的体积，改良面包的口感，使面包等产品体积更大，颗粒更柔软，显著提高面包的品质，可广泛应用于面食加工领域。 

Claims (5)

1.一种α-淀粉酶，其特征在于，所述α-淀粉酶的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
2.一种编码权利要求1所述的α-淀粉酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求2所述的基因。
4.一种工程菌，其特征在于，所述的工程菌为携带有权利要求3所述的重组表达载体的菌株。
5.如权利要求4所述的工程菌，为黑曲霉P11-51（Aspergillus niger P11-51），菌株编号为CCTCC NO:M2014017。
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