CN104031899B - 一种脂肪酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂肪酶，该脂肪酶的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:？1，编码该脂肪酶的基因组DNA，其序列为SEQ？ID？NO:2。本发明的脂肪酶为碱性低温脂肪酶，在洗涤、皮革、食品、饲料等方向将拥有巨大的市场前景。本发明脂肪酶在较高的碱性环境下仍有很高的酶活力，反应最佳pH9.0。在应用试验中检测脂肪酶的去污效果发现，本发明未浓缩的脂肪酶发酵液样品和诺维信6万单位的脂肪酶高浓缩样品相比，其洗涤去污能力仅相差10倍，而其生产成本远低于诺维信脂肪酶的成本，有望通过进一步的发酵优化和产品浓缩达到相同去污效果，实现产业化。<!--1-->

Description

一种脂肪酶及其应用
技术领域
本发明属于酶基因的分离和应用技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其应用，即一种来源于黑葡萄穗霉（Stachybotryschatarum）菌株的脂肪酶及其应用。
背景技术
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是指水解羧酸甘油三酯中酯键的酶。脂肪酶能催化甘油三酯来生成甘油二脂、单甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂变成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在无机溶剂中能保持高催化活力和极强稳定性。另外，脂肪酶对底物的广谱性/特殊专一性，赋予了脂肪酶在食品油脂加工工业、洗涤剂工业、酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的巨大应用价值。脂肪酶已经成为蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工业用酶。
脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的另外一个特征是可以在异相系统（如油、水界面）或有机相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反应的进行；而在有机相中，它却能催化多种合成反应：如酯化、酯交换、酯的醇解、酯的酸解等。脂肪酶的这些特性使其成为在手性化合物合成中重要的生物催化剂，多被用来催化一些酯类合成和转化反应，在食品增香、脱脂加工、污水处理及化工产品中有着广泛的应用。然而，目前脂肪酶的生产效率仍然较低且生产成本也较高，因此需要对现有的脂肪酶的种类及生产技术进行改进。
脂肪酶广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，因此微生物来源的脂肪酶比动植物来源的脂肪酶具有更广的作用pH、作用温度范围；以及高稳定性、高活性和底物专一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。因此，从霉菌和细菌中筛选出具有更好效果的脂肪酶一直是本领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶及其应用，即提供一种新的脂肪酶，从而弥补现有技术的不足。
本发明一个方面提供一种脂肪酶，该脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
用于编码上述脂肪酶的基因组DNA，其序列为SEQIDNO:2。
本发明另一个方面提供一种用于表达上述脂肪酶的重组质粒，所述的重组质粒携带有用于表达上述脂肪酶的DNA片段，其序列为SEQIDNO:3。
本发明的脂肪酶，是在曲霉细胞中生产的，是将用于表达脂肪酶的重组质粒转入曲霉宿主细胞，所述的曲霉细胞为黑曲霉细胞；
本发明的另一个方面涉及一种酶组合物，包含有上述的脂肪酶；
本发明的脂肪酶为碱性低温脂肪酶，在洗涤、皮革、食品、饲料等方向将拥有巨大的市场前景。本发明脂肪酶在较高的碱性环境下仍有很高的酶活力，反应最佳pH9.0。在应用试验中检测脂肪酶的去污效果发现，本发明未浓缩的脂肪酶发酵液样品和诺维信6万单位的脂肪酶高浓缩样品相比，其洗涤去污能力仅相差10倍，而其生产成本远低于诺维信脂肪酶的成本，有望通过进一步的发酵优化和产品浓缩达到相同去污效果，实现产业化。
附图说明
图1：本发明所用的pGm质粒的遗传图谱；
图2：本发明所用的pGm-Lip3404质粒的遗传图谱；
图3：本发明的Lip3404的表达产物的SDS-PAGE凝胶图，显示了如实施例3所述的黑曲霉转化子的Lip3404的表达情况；其中泳道1所示为蛋白标准分子量标记，由上至下为116.0kD，66.2kD，45.0kD，35.0kD，25.0kD，18.4kD和14.4kD；泳道2所示为黑曲霉宿主在发酵5d后的蛋白表达情况；泳道3所示为Lip3404的脂肪酶表达情况，在34kD附近可以看到清晰蛋白条带；
图4：本发明的脂肪酶的相对酶活与温度的曲线图；
图5：本发明的脂肪酶的相对酶活与pH的曲线图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,3ndEd.(Singletonetal.,2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleetal.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。
如本文所用，术语“脂肪酶”即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。其基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性决定于它的蛋白质结构。
如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。
如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。
术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。
术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。
与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。
由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。
术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。
如本文所用，术语“丝状真菌”指所有丝状形式的真菌亚门生物(参见INTRODUCTORYMYCOLOGY,4thEd.(Alexopoulos,2007)和AINSWORTHANDBISBYDICTIONARYOFTHEFUNGI,10thEd.(Kirketal.,2008))。这些真菌的特征是带有由几丁质、纤维素和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明所述的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延伸来完成的，碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以使，但不限于，曲霉属某种(Aspergillussp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、烟曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黄曲霉(A.flavus)，土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.oryzae))、青霉属某种(Penicilliumsp.)(例如产黄青霉(P.chrysogenum))、新萨托菌属某种(Neosartoryasp.)(例如费希新萨托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌属某种(Gliocladiumsp.)(例如粉红粘帚霉(G.roseum))、木霉属某种(Trichodermasp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、绿色木霉(T.viride)、康宁木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐质霉属某种(Humicolasp.)(例如特异腐质霉(H.insolens)和灰腐质霉(H.grisea))、金孢霉属某种(Chrysosporiumsp.)、镰刀菌属某种(Fusariumsp.)、脉孢霉属某种(Neurosporasp.)、肉座菌属某种(Hypocreasp.)和裸孢壳属某种(Emericellasp.)的细胞。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：克隆脂肪酶基因
使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组DNA。
以黑葡萄穗霉基因组DNA为扩增模板来扩增黑葡萄穗霉中的脂肪酶基因，其中所用到的正向引物P3404-F序列为(下划线所示序列为AflII酶切位点)；
5′-AACTTAAGATCATGCTGGGCTACATCCTCCTCTC-3′
反向引物P3404-R序列为(下划线所示序列为PacI酶切位点)：
5′-CCTTAATTAATTATTACGCTGCTGGTGC-3′。
将该基因用PhusionDNA聚合酶(Thermoscientific)从黑葡萄穗霉基因组DNA中扩增出来。
使用凝胶纯化试剂盒(Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶AflII和PacI(Fermentas)对纯化了的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和PacI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。所得1个质粒为pGm-Lip3404，测序结果的DNA序列为SEQIDNO:2，去掉内含子的编码区序列为SEQIDNO:3，其翻译的脂肪酶的序列为SEQIDNO:1；多个克隆的测序结果都一致。
通过NCBI中的BLAST进行蛋白质序列比对发现，本发明的脂肪酶为一新的等位基因，与现有的脂肪酶序列有明显的区别。
实施例2PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉
吸取黑曲霉GAP1孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mLCMA液体培养基中，在30℃、200rpm的条件培养14~16h。
用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30℃、200rpm的条件下温浴1~2h，用显微镜观察检测原生质体化进展。
用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×107个/mL。
在冰上，将100μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反应用1管。加入10μgDNA。加入12.5μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。
将MMSA顶层琼脂试管熔化并保持在55℃。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中加入1mL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并将平板在30℃下培养7~10d。
溶液A：2.5mL1MK2HPO4，2.5mL1MKH2PO4，48.156gMgSO4，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
溶液B：5mL1MTris(pH7.5)，2.77gCaCl2，109.32g山梨醇，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
溶液C：250gPEG4000，2.77gCaCl2，5mL1MTris(pH7.5)，加入dlH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
原生质体化溶液：将0.6g裂解酶(LysingEnzymefromTrichodermaharzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
MMSA平板：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4gCsCl(Sigma)，0.52gKCl，1.52gKH2PO4，218.5g山梨醇，1ml痕量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH2O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO4。
MMSA顶层琼脂试管：0.59g乙酰胺(Sigma)，3.4gCsCl(Sigma)，0.52gKCl，1.52gKH2PO4，218.5g山梨醇，1ml痕量元素(见下)，10g低熔点琼脂糖，加入dlH2O至终体积972.5mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO4，之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。
痕量元素：在250mLdlH2O中加入1gFeSO4·7H2O，8.8gZnSO4·7H2O，0.4gCuSO4·5H2O，0.15gMnSO4·4H2O，0.1gNa2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH2O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。
CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。
实施例3：表达黑葡萄穗霉脂肪酶Lip3404的黑曲霉的发酵和酶的表达
将表达本发明脂肪酶的黑曲霉Lip3404转化子的孢子悬浮液接种于30mLTSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养5d。所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10min，收集上清液。所得上清液即为Lip3404脂肪酶酶液。将酶液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳(图3)。
TSB发酵培养基：12gNaNO3，0.5gKCl，1.5gKH2PO4，2.05gMgSO4·7H2O，3.5gNaH2PO4·H2O，45g胰蛋白大豆肉汤，70g柠檬酸钠，1g吐温80，1mL痕量元素(见下)，加入dlH2O至终体积700mL，高压蒸气灭菌后加入300mL用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的40%麦芽糖。
痕量元素：在250mLdlH2O中加入1gFeSO4·7H2O，8.8gZnSO4·7H2O，0.4gCuSO4·5H2O，0.15gMnSO4·4H2O，0.1gNa2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH2O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
实施例4：本发明脂肪酶的应用效果测试
一、实验样品
㈠脂肪酶样品及酶活
样品名称 形态 检测方法 实测值
3404-2碱性低温脂肪酶 液体 QB/T 1803-1993 A4脂肪酶 31.64 u/ml
㈡3404-2碱性脂肪酶温度及pH曲
本发明的脂肪酶（氨基酸序列为SEQIDNO:1）的相对酶活与温度的曲线图如图4所示，其相对酶活与pH的曲线图如图5。
㈢洗涤剂样品
①蓝月亮深层洁净护理洗衣液（市场购买）；2‰浓度水溶液pH值=7.5
②白猫超浓缩无磷洗衣粉（市场购买）；1‰浓度水溶液pH值=11.2
③奥妙全自动高浓度洗衣液（市场购买）2‰浓度水溶液pH值=7.9
二、应用效果测试
对比测试加与不加3404-2碱性低温脂肪酶的洗衣粉和洗衣液对国标皮脂污布（JB-03）以及自染口红污布的去污效果。
1、实验方法：GB/T13174-2008《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》
2、实验条件：
洗涤实验设备:RHQL—Ⅲ型立式去污机（中国日用化学工业研究院）
转速:120转/分
洗涤试验温度:分别为30oC（国标洗涤温度）和20oC（相对较低温度）
洗涤实验水硬度:250ppm(Ca2+/Mg2+=3/2)
浸泡/洗涤时间:放污布前预先溶解20分钟/洗涤时间20分钟
白度计型号:WSD-3C（北京康光仪器有限公司）
R457蓝光白度：Wr（不含荧光白度）
污布种类:①JB-03（国家标准污布------皮脂，
详细组分见GB/T13174-2008附录D）
②自染口红污布
3、实验数据：
综合上述四车去污实验的数据可以看出：无论是在洗衣粉抑或是洗衣液中，添加2%的本发明的脂肪酶，都能提高洗涤剂对皮脂类污垢（如：国标皮脂污布JB-03、自染口红污布）的去污能力，从而证明本发明的脂肪酶具有很好的应用效果。

Claims (7)

1.一种脂肪酶，所述的脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.用于编码权利要求1所述的脂肪酶的基因，其序列为SEQIDNO:2。
3.一种用于表达权利要求1所述的脂肪酶的重组质粒，所述的重组质粒携带序列为SEQIDNO:3的DNA片段。
4.权利要求1所述的脂肪酶的生产方法，是在曲霉细胞中生产的。
5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，是将权利要求3所述的重组质粒转曲霉宿主细胞来生产的。
6.如权利要求4或权利要求5所述的生产方法，其特征在于所述的曲霉细胞为黑曲霉细胞。
7.一种酶组合物，所述的酶组合物包含有权利要求1所述的脂肪酶。
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脂肪酶的去污及与表面活性剂配伍性能研究;杨东杰等;《日用化学工业》;19991231(第1期);16-18 *
青霉脂肪酶在洗涤去污中的应用研究;董荣;《日用化学工业》;19911231(第5期);1-5 *
黑葡萄穗霉的研究进展;石桂英等;《卫生研究》;20050531;第34卷(第3期);358-360 *

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