CN103881992A - 一种脂肪酶突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及一种脂肪酶突变体及其用途，该突变体是由野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B（CALB）出发经过突变得到的，具体涉及一种脂肪酶突变体和其制备方法以及利用该脂肪酶突变体通过催化布洛芬类化合物的酯衍生物水解，动力学拆分得到具有光学活性的S构型布洛芬类化合物的方法。本发明中，野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B通过突变得到具有改良性质的脂肪酶，该酶在毕氏酵母工程菌中表达，该脂肪酶包括与SEQ ID NO.02至少85%同一性的氨基酸序列，并且具有对应于SEQ ID NO.02的189位残基为芳香族氨基酸残基，对应于SEQ ID NO.2的190位残基为非极性氨基酸残基。本发明通过对南极假丝酵母菌脂肪酶B进行突变，提高了其对布洛芬类化合物的对映选择性。

Description

一种脂肪酶突变体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种脂肪酶突变体及其用途，该突变体是由野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B（CALB）出发经过突变得到的，具体涉及一种脂肪酶突变体和其制备方法以及利用该脂肪酶突变体通过催化布洛芬类化合物的酯衍生物水解，动力学拆分得到具有光学活性的S构型布洛芬类化合物的方法。
背景技术
脂肪酶，即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯。脂肪酶通常被用于在水相体系中催化酯类化合物的水解反应，在非水相体系中催化醇类化合物的酯化、转酯反应化，在非水相体系中催化氨酰化反应等。（Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6,145-150.）
南极假丝酵母( Candida antarctica) 首先是在南极洲分离得到的，该南极假丝酵母可以产生两种性质完全不同的脂肪酶，分别为南极假丝酵母脂肪酶A（CALA）和脂肪酶B（CALB）。Patkar等人1993年成功分离纯化分别得到了CALA和CALB（Indian. J. Chem. 1993 32B. 76-80）。1994年，Uppenberg等研究出CALB自由酶的三维立体结构和氨基酸顺序（Structure 1994, 2, 293-308），发现CALB由317个氨基酸残基组成，分子量为33kD，与其它脂肪酶的氨基酸序列对比发现它们之间没有明显的同源性。1995年CALB被成功克隆并在米曲霉（Aspergillns oryzae）（Canadian Journal of Botany 1995, 73, 869-875.）中得到表达，该专利为诺和诺德公司所拥有。为了进一步研究CALB的性质及提高产量，CALB又陆续在许多种宿主中被克隆表达，如毕赤酵母（Pichi apastoris），酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大肠杆菌（Escherichia Coli）等。CALB对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性，是用于许多反应的催化剂，并且被用于例如立体选择性转化和聚酯合成，特别是对于仲醇的高对映选择性使得CALB目前在生物技术的使用中成为最重要的酶。
天然的CALB仍存在一定的缺陷，如热稳定性较差产量较低等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，成功修饰和改造CALB使其具有更加良好的性质是一个研究的热点。2005年Magnusson等人在Trp104处引入点突变，Trp104Ala突变株对4-庚醇和5-壬醇的特异性比野生型酶分别提高了270倍和5500倍（Chembiochem 2005, 6, 1051-1056.）。2009年Seo等将CALB分别与苹果酸脱氢酶、亚精胺腐胺周质结合蛋白质和肽基脯氨酰顺反异构酶进行融合并在大肠杆菌中表达，融合表达的CALB溶解性得到大大提高，从而增加了其表达量（BBA - Proteins & Proteomics 2009, 1794, 519-525.）。
布洛芬类化合物( profens) 是一类重要的药物，主要用于治疗疼痛、发烧、炎症等，是非甾体类抗炎药物( NSAIDs) 中重要的一类。这类药物临床已广泛应用包括萘普生、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬等（图1）。布洛芬类药物的α位含有一个手性碳原子，存在一对光学异构体，尽管目前布洛芬类药物以消旋形式存在，旦其中S构型布洛芬具有明显较高的临床效果。
利用生物催化方法合成布洛芬类化合物可通过多种生物催化剂催化的反应如水解、酯化、氧化、还原等反应来进行，其中通过脂肪酶催化的动力学拆分反应来制备光学纯的布洛芬类化合物便是可行路线之一，如脂肪酶通过水解或醇解羧酸酯、酯化羧酸等反应来拆分已有相关报导（Green Chem, 2011, 13, 2607.），但是南极假丝酵母脂肪酶B对布洛芬类化合物的酯衍生物几乎没有或仅有很低的对映选择性（Enzyme Microb Tech, 2006, 39, 924; J Org Chem,  1994, 59, 4410; Biotechnol Bioeng, 2001, 75, 559.），这就的需要对现有的方法路线进行改进，以提高脂肪酶对布洛芬类化合物的对映选择性至理想水平。
发明内容
本发明的技术方案如下：通过对南极假丝酵母菌脂肪酶B进行突变，提高其对布洛芬类化合物的对映选择性，使通过脂肪酶动力学拆分路线高效、可行。
本发明由野生型南极假丝酵母菌脂肪酶B（Candida antarctica lipase B）基因（SEQ ID NO.1）通过突变得到具有改良性质的脂肪酶，该酶在毕氏酵母工程菌中表达，该脂肪酶突变体，能够将布洛芬类化合物的酯衍生物水解，动力学拆分得到具有光学活性的S构型布洛芬类化合物（图2）。在本发明的实施方案中，该脂肪酶与天然存在的CALB野生型相比，在将底物水解为产物方面具有一个或多个改善的性质。其能够以SEQ ID NO.02蛋白质（南极假丝酵母脂肪酶B，Candida antarctic lipase B，缩写为CALB）的至少1.5倍活性将布洛芬类化合物的酯衍生物水解为至少70%对映体过量的S构型的布洛芬类化合物。
在进一方面，该重组脂肪酶包括与SEQ ID NO. 02 至少85%同一性的氨基酸序列，并且具有对应于SEQ ID NO. 02的189位残基为芳香族氨基酸残基，对应于SEQ ID NO. 2的190位残基为非极性氨基酸残基，这些氨基酸突变对于改善脂肪酶的活性剂对映选择性至关重要。
在进一方面，所述脂肪酶突变体包含以下一项或多项突变，39残基位为非极性氨基酸残基；40位残基为非极性氨基酸残基；138位残基为极性不带电荷氨基酸残基；139位残基为极性不带电荷氨基酸残基；152位残基为极性带正电荷的氨基酸残基；154位残基为非极性氨基酸残基；157位残基氨基酸残基为极性氨基酸残基。
本发明中涉及的芳香族氨基酸为Phe、Tyr，非极性氨基酸为Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met，极性不带电荷氨基酸为Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln，极性带正电荷的氨基酸残基为Lys、Arg、His。
进一方面，本发明的一些实施方案中，含有突变的脂肪酶变体针对布洛芬类化合物的酯衍生物展现出更高的活性及选择性，这些突变包含下列一项或者多项突变，氨基酸序列189位残基为Phe (SEQ ID NO. 4, 10, 12)，190位残基为Leu或Ile (SEQ ID NO. 6, 8, 10, 12)，39位残基为Ala或Val (SEQ ID NO. 34)，40位残基为Ala或Val (SEQ ID NO. 34)，138位残基为Ser、Thr或Cys (SEQ ID NO. 14, 16, 18, 36, 38, 40, 42)，139位残基为Tyr、His者Arg (SEQ ID NO. 14, 16, 36, 38, 40, 42)，152位残基为Lys或His (SEQ ID NO. 30, 32)，154残基位为Gly或Ala (SEQ ID NO. 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42)，157位残基为Ser、Thr、Asp或Gly (SEQ ID NO. 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42)。
本发明的实施方式包括编码所述脂肪酶变体的核酸，例如与编码本发明所述CALB变体的核酸序列具有至少85%的序列同一性。本发明的相关实施方式包括包含这些核酸的载体及包含该类载体的宿主细胞。
本发明还包括脂肪酶突变体在动力学拆分手性羧酸酯类化合物中的应用。所述的手性羧酸酯类化合物为如式（I）所示的化合物，
其中R1为烷基、苯基、带有取代的苯基，苯基的取代基为卤素、烷基、苯基或带有取代的苯基、杂环等；
R2为烷基；
R3为烷基、苯基或带有取代的苯基，苯基的取代基为卤素、烷基或硝基。
在pH 5-9的磷酸盐缓冲液溶液中，在本发明所述的脂肪酶突变体的催化下，手性羧酸酯类化合物进行水解，生成光学活性手性羧酸。
作为优选，所述的手性羧酸酯类化合物为布洛芬类化合物的酯衍生物，其结构如式（II）所述，布洛芬类化合物为布洛芬、氟比洛芬、阿利洛芬、非诺洛芬、萘普生或酮洛芬，
Figure 2012105611869100002DEST_PATH_IMAGE002
其中R1为式（III）所述结构；
R2为烷基、苯基或带有取代的苯基，苯基的取代基为卤素、烷基或硝基。
Figure 727806DEST_PATH_IMAGE003
在pH 5-9的磷酸盐缓冲液溶液中，加入定量的用助溶剂溶解的布洛芬类化合物的酯衍生物底物，之后加入定量的脂肪酶变体催化水解反应，该脂肪酶变体可以多种可行的方式如粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式存在。
本发明的有益技术效果：通过对南极假丝酵母菌脂肪酶B进行突变，提高了其对布洛芬类化合物的对映选择性。
附图说明
图1为布洛芬类化合物结构式。
图2为动力学拆分布洛芬类化合物酯衍生物结构式。
图3为SEQ ID NO.30突变酶动力学拆分氟比洛芬酯液相图。
图4为SEQ ID NO.30突变酶动力学拆分酮洛芬酯液相图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案描述本发明的脂肪酶突变体以及利用该酶动力学拆分布洛芬类化合物的酯衍生物。除特别指明，本发明中所用的实验方案均为本领域技术人员所公知的方法。此外，实施例应理解为说明性的，而不是限制本发明。
某些术语的定义。
动力学拆分实现对映体拆分的一种方法，在本发明中指脂肪酶催化布洛芬类化合物的酯衍生物中S构型的底物水解产生S构型的布洛芬类化合物，而R构型的底物不能反应或者反应较慢，从而达到拆分的效果。
对映体过量定义为对映体混合物中一个异构体A比另一个异构体 B多出来的量占总量的百分数，缩写为ee，公式为(A-B)/(A+B)*100%，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。
20种氨基酸缩写如下
ASP D 天冬氨酸 Ile I 异亮氨酸
Thr T 苏氨酸 Leu L 亮氨酸
Ser S 丝氨酸 Thr T 酪氨酸
Glu E 谷氨酸 Phe F 苯丙氨酸
Pro P 脯氨酸 His H 组氨酸
Gly G 甘氨酸 Lys L 赖氨酸
Ala A 丙氨酸 Arg R 精氨酸
Cys C 半胱氨酸 Trp W 色氨酸
Val V 缬氨酸 Gln Q 谷氨酰胺
Met M 甲硫氨酸 Asn N 天冬酰胺
氨基酸分类，根据侧链基团的极性或者化学结构的不同，本发明中涉及的芳香族氨基酸为Phe、Tyr，非极性氨基酸为Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met，极性不带电荷氨基酸为Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln，极性带正电荷的氨基酸残基为Lys、Arg、His。
实施例涉及培养基配方
a.     YPD培养基：10g酵母提取物、20g蛋白质胨溶于900mL蒸馏水（如配置平板，可在灭菌前加入20g琼脂），115℃高压灭菌30min，使用前加入100 mL 20%葡萄糖溶液。
b.    YPDS转化平板：YPD培养基+15g/l琼脂+1M山梨醇。
c.     10*YNB：134g YNB溶于1000mL蒸馏水，过滤除菌，4℃保存。
d.    500*生物素：20mg 生物素溶于10mL蒸馏水，取1mL稀释100倍，过滤除菌，4℃保存。
e.     10*甲醇：5mL 甲醇与95mL蒸馏水混合，过滤除菌， 4℃保存。
f.     20%葡萄糖：200g 葡萄糖溶于1000mL蒸馏水，过滤除菌， 4℃保存。
g.    10*甘油：100mL 甘油与900mL蒸馏水混合，115℃高压灭菌30min，4℃保存。
h.    BMGY培养基：10g酵母提取物、20g蛋白质胨溶于700mL蒸馏水，120，115℃高压灭菌30min，用前加入100mL 1M pH6.0磷酸钾缓冲液、100mL 10*甘油、100mL10*YNB、2mL 500*生物素。
i.     BMMY培养基：10g酵母提取物、20g蛋白质胨溶于800mL蒸馏水，115℃高压灭菌30min，用前加入100mL 1M pH6.0磷酸钾缓冲液、100mL 10*YNB、100mL 10*甲醇、2mL500*生物素。
j.     DNA裂解液（DNA lysis buffer）：Triton X-100 5%(V/V)，SDS 2%(V/V)，NaCl 10mM，Tris-Cl(pH 8.0) 1mM，EDTA(pH 8.0) 10 mM。
实施例1南极假丝酵母(cgmcc 2.2366)基因组DNA的提取及野生型脂肪酶B基因的克隆
南极假丝酵母cgmcc 2.2366 用YPD液体培养过夜后，发酵液用1mL离心管3000r/min离心5min，弃上清收集菌体，可重复几次以得到足够量的细胞；b)菌体用足够量的DNA裂解液重悬，加入0.4g酸洗玻璃珠，再加入200μL酚：氯仿：异戊醇，盖紧管盖，以防涡旋时酚漏出；c)涡旋仪高速涡旋3min；d)12000 r/min离心5min，上清液（约200μL）转移至新的离心管；e)上清液加入700加入预冷的无水乙醇后，-20℃无水放置1h，12000 r/min离心15min沉淀DNA，倒掉乙醇，沉淀用800乙醇，沉淀乙醇混悬，12000 r/min离心15min沉淀DNA，真空干燥；f)DNA用100μL 1*TE重溶。
实施例2 聚合酶链式反应（PCR）
以提得南极假丝酵母基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系如下：
TaKaRaTaq（5 U/μL） 0.25 μL
10×PCR Buffer（Mg2+ Free） 5 μL
MgCl2(25mM) 3μL
dNTP mixture (各2.5 mM) 4μL
模板DNA基因组 1μL
引物1/3(10μM)     2μL
引物2/4(10μM) 2μL
灭菌蒸馏水 补足至50 μL
扩增程序：94℃：10 Min ，（94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s）35个循环，72℃，10min 。
引物1：CALB-EcoR I-f：5Cal B-GAATTCCTACCTTCCGGTTCGGACC-3
引物2：CALB-Not I-r：5CalB-Not I-rCGCGGCCGCTCAGGGGGTGACGATGCC-3；
限制性内切酶酶切位点用下划线标出；
PCR扩增得到的DNA片段用胶回收试剂盒纯化。含有pPICZα A质粒的E.coli Top 10’ 用LB液体培养基37℃，220r/min培养过夜，质粒提取采用参照TIANprep Mini Plasmid Kit。
目的片段与质粒pPICZα A质粒限双酶切，酶切体系如下：
Not I 2μL Not I 2μL
EcoRI 2μL EcoR I 2μL
10*H buffer 10μL 10*H buffer 10μL
0.1% BSA 10μL 0.1% BSA 10μL
0.1% Triton X-100 10μL 0.1% Triton X-100 10μL
pPICZα A 25μL 目的片段 50μL
灭菌水 Up to 100μL 灭菌水 Up to 100μL
实施例3 E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化
a)从种子培养基中取0.4mL接种于20mL LB液体培养基中培养3h；b)3000r/min，5min分两次富集2mL菌体于1.5mLEP管中，弃上清；c)加入100弃上冰冷TSS溶液，重新悬浮菌体，冰浴30min；d)加入20μL连接液（空质粒pPICZα A酶切片段、目的片段酶切片段及连接液）轻轻旋转混匀，冰浴30min；e)42℃热休克60s，冰浴2min，加入600μL LB液体培养基。37℃培养，150r/min振荡培养1h；f)分别取150μL涂布于LLB (ZeocinTM)抗性平板。
实施例4       突变库的构建
突变库的构建是利用突变引物和侧翼引物，重叠延伸PCR进行的。（设计的突变引物如下：）
CALB_EcoR I_F CCGGAATTCCTACCTTCCGGTTCGGACC
CALB_Xba I_R GCTCTAGATCAGGGGGTGACGATGCC
LibA_F ACCGACGAGNDTNDTCAGCCTCAG
LibA_R CTGAGGCTGAHNAHNCTCGTCGGT
LibB_F TACAAGGGCNDTNDTCTCGCCGGC
LibB_R GCCGGCGAGAHNAHNGCCCTTGTA
LibC_F GCACCCTCCNDTTGGCAGNDTACCACCGGT
LibC_R ACCGGTGGTAHNCTGCCAAHNGGAGGGTGC
LibD_F CTCGTCCCCNDTACCNDTACCACAGGT
LibD_R ACCTGTGGTAHNGGTAHNGGGGACGAG
Pfu 0.5μl
10×Pfu Buffer（Mg2+ Plus） 5 μl
dNTP mixture (各2.5 mM) 4μl
模板DNA 0.5μl
引物F 2μl
引物R 2μl
灭菌蒸馏水 up to 50 μl
PCR扩增条件：94℃：10Min ，（94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s）35个循环，72℃，10min。
所得基因片段经过纯化，按如下PCR扩增
TaKaRaTaq 0.25μl
10×PCR Buffer（Mg2+ Plus） 5 μl
dNTP mixture (各2.5 mM) 4μl
模板1 1μl
模板2 1μl
引物F 2μl
引物R 2μl
灭菌蒸馏水 up to 50μl
所得目的片段按实施例2所述连接到载体pPICZα A上。
实施例5制备酵母感受态细胞
a)挑取P. pichia X33单菌落至5mL YPD培养基中，30℃振荡培养过夜。次日取适量活化菌液，接种50mL YPD，30mL振荡培养至OD600为1.3～1.5。b)3000 r/min ，离心5min收获菌体。c)用50mL的灭菌去离子水洗涤菌体，3000 r/min，400离心5min。d)用25mL的灭菌去离子水洗涤菌体，3000 r/min，离心15min。e)将菌体重悬于20mL 1mol/L sorbital中，3000 r/min，5min。f)菌体重悬于1mL 1mol/L sorbital中，并分别取80μl至1.5mL离心管，冰水中放置，当天使用。
实施例6线性化质粒转化酵母细胞
a)取80μl感受态细胞，加入5~10μl线性化浓缩质粒混匀。b)转入2mm电转杯中，0℃培养5min。c)电转条件：电压1800V，脉冲时间一次（5~10sec）。d)立即加入1mL的1 mol/L 山梨醇溶液到电转杯中，并转移到1.5mL消毒管中，30℃静止培养2~3h。e)分别取50-200μl电转化菌液到YPDS培养皿中涂布，30℃培养2~4天，可见单菌落。
实施例7 突变库表达
取单菌落接于96孔板深度培养(每个孔1 ml BMMY培养基zeocin (100 μg/mL)，220 rpm 28 °C培养4天，每天加1％甲醇诱导表达。后离心取上清液进行筛选。测序，得到如序列表所述的序列。
实施例8 4 -硝基苯基酯的制备
4 -硝基苯基酯的制备体系如下：0 °C，20ml二氯甲烷中加入布洛芬化合物相应酸(2.4 mmol)，4-硝基苯酚 (0.36 g, 2.6 mmol)，N， N'-二环己基碳化二亚胺(0.70 g, 3.4 mmol)。搅拌反应4小时后，过滤出去沉淀物，滤液真空干燥。液相检测。
实施例9 动力学拆分
反应体系：0.2M pH7.0磷酸钠缓冲盐200μl，如实施例7所述的上清液100 μL，底物20μl， 28 °C反应。反应液用二氯甲烷萃取2次。
实施例10高效液相色谱分析底物和产物
检测布洛芬及布洛芬对硝基酚酯的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇：TFA=93:7:0.1，流速：0.7ml/min，波长：240nm，柱温：30°C，检测器：UV检测器。
检测氟比洛芬及布氟比洛芬对硝基酚酯的条件为：色谱柱：AD-H，流动相：正己烷：乙醇：TFA=90:10:0.1，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：30°C，检测器：UV检测器。
检测酮洛芬及酮洛芬对硝基酚酯的条件为：色谱柱：AD-H，流动相：正己烷：异丙醇：TFA=87:13:0.1，流速：0.8ml/min；波长：254nm，柱温：30°C，检测器：UV检测器。
实施例11 野生及突变酶对布洛芬酯选择性测定结果。
Figure 2012105611869100002DEST_PATH_IMAGE004
 
实施例12野生及突变酶对氟比洛芬酯选择性测定结果。
Figure 632177DEST_PATH_IMAGE005
    SEQ ID NO.30 液相图见图3。
实施例13野生及突变酶对酮洛芬酯选择性测定结果。
Figure 2012105611869100002DEST_PATH_IMAGE006
SEQ ID NO.30 液相图见图4。
<110> 沈阳药科大学
<120> 一种脂肪酶突变体及其用途
 
<210> 1
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly
              50               55               60
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              65              70                75
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              80               85              90
Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
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Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
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Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr
             125              130              135
Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser
             140               145             150  
Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
             155              160              165
Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
              170              175             180
Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser
              185              190             195
Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
              200              205              210
Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
              215              220             225
Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
              230              235             240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
              245              250             255
Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln
               260             265               270
Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
             275              280             285
Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
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Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
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Thr Pro
 
<210> 3
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<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly
              50               55               60
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              65              70                75
Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu
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Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
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             140               145             150  
Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
             155              160              165
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Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
              200              205              210
Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
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Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
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Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
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Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln
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Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
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Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
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Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
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Thr Pro
 
<210> 5
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
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             140               145             150  
Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
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Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
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Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
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Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
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Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
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Thr Pro
 
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<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
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Thr Pro
 
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<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
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Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
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Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
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Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
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Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
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Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
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Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
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Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
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Thr Pro
 
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
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Thr Pro
 
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
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Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
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             155              160              165
Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
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Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
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              185              190             195
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Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
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<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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1             5               10               15
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Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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1             5               10               15
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Ala Pro Ser Gly Trp Gln Thr Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
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Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
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<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
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Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
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Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
             275              280             285
Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
              290              295              300
Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
              305              310             315
Thr Pro
 
<210> 35
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
ctaccttccg  gttcggaccc  tgccttttcg  cagcccaagt  cggtgctcga  tgcgggtctg 60
acctgccagg  gtgcttcgcc  atcctcggtc  tccaaaccca  tccttctcgt  ccccggaacc 120
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<210> 36
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly
              50               55               60
Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp
              65              70                75
Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu
              80               85              90
Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
              95               100              105
Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
              110              115              120
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr
             125              130              135
Lys Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser
             140               145             150  
Ala Pro Ser Gly Trp Gln Asp Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
             155              160              165
Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
              170              175             180
Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Phe Leu Gln Pro Gln Val Ser
              185              190             195
Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
              200              205              210
Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
              215              220             225
Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
              230              235             240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
              245              250             255
Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln
               260             265               270
Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
             275              280             285
Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
              290              295              300
Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
              305              310             315
Thr Pro
 
<210> 37
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
ctaccttccg  gttcggaccc  tgccttttcg  cagcccaagt  cggtgctcga  tgcgggtctg 60
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<210> 38
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly
              50               55               60
Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp
              65              70                75
Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu
              80               85              90
Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
              95               100              105
Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
              110              115              120
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr
             125              130              135
Lys Gly Ser His Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser
             140               145             150  
Ala Pro Ser Gly Trp Gln Asp Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
             155              160              165
Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
              170              175             180
Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Phe Leu Gln Pro Gln Val Ser
              185              190             195
Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
              200              205              210
Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
              215              220             225
Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
              230              235             240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
              245              250             255
Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln
               260             265               270
Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
             275              280             285
Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
              290              295              300
Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
              305              310             315
Thr Pro
 
<210> 39
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
ctaccttccg  gttcggaccc  tgccttttcg  cagcccaagt  cggtgctcga  tgcgggtctg 60
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<210> 40
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly
              50               55               60
Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp
              65              70                75
Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu
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Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
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Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
              110              115              120
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr
             125              130              135
Lys Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser
             140               145             150  
Ala His Ser Gly Trp Gln Ser Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
             155              160              165
Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
              170              175             180
Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Phe Leu Gln Pro Gln Val Ser
              185              190             195
Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
              200              205              210
Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
              215              220             225
Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
              230              235             240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
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Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln
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Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
             275              280             285
Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
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Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
              305              310             315
Thr Pro
 
<210> 41
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
ctaccttccg  gttcggaccc  tgccttttcg  cagcccaagt  cggtgctcga  tgcgggtctg 60
acctgccagg  gtgcttcgcc  atcctcggtc  tccaaaccca  tccttctcgt  ccccggaacc 120
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tacacaccct  gctggatctc  acccccgccg  ttcatgctca  acgacaccca  ggtcaacacg 240
gagtacatgg  tcaacgccat  caccgcgctc  tacgctggtt  cgggcaacaa  caagcttccc 300
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aacctctact  cggcgaccga  cgagtttctt  cagcctcagg  tgtccaactc  gccactcgac 600
tcatcctacc  tcttcaacgg  aaagaacgtc  caggcacagg  ccgtgtgtgg  gccgctgttc 660
gtcatcgacc  atgcaggctc  gctcacctcg  cagttctcct  acgtcgtcgg  tcgatccgcc 720
ctgcgctcca  ccacgggcca  ggctcgtagt  gcagactatg  gcattacgga  ctgcaaccct 780
cttcccgcca  atgatctgac  tcccgagcaa  aaggtcgccg  cggctgcgct  cctggcgccg 840
gcagctgcag  ccatcgtggc  gggtccaaag  cagaactgcg  agcccgacct  catgccctac 900
gcccgcccct  ttgcagtagg  caaaaggacc  tgctccggca  tcgtcacccc  ctga 954
 
<210> 42
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1             5               10               15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val
               20               25              30
Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro
             35               40                45
Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly
              50               55               60
Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp
              65              70                75
Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu
              80               85              90
Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
              95               100              105
Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
              110              115              120
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr
             125              130              135
Lys Gly Ser His Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser
             140               145             150  
Ala His Ser Gly Trp Gln Ser Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr
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Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr
              170              175             180
Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Phe Leu Gln Pro Gln Val Ser
              185              190             195
Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val
              200              205              210
Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala
              215              220             225
Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
              230              235             240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
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Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln
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Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile
             275              280             285
Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr
              290              295              300
Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val
              305              310             315
Thr Pro
 
 

Claims (18)

1.一种脂肪酶突变体，该突变体氨基酸序列具有与SEQ ID NO.02蛋白质氨基酸序列至少有85％序列同一性，并且对应于SEQ ID NO.2的189位残基为芳香族氨基酸残基，对应于SEQ ID NO.2的190位残基为非极性氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的脂肪酶突变体，所述的芳香族氨基酸残基为Phe或Tyr，优选Phe，所述的非极性氨基酸残基为Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp或Met，优选Leu或Ile。
3.如权利要求2所述的脂肪酶突变体，包括如下一个或多个氨基酸残基：39位为非极性氨基酸残基；40位残基为非极性氨基酸残基；138位残基为极性不带电荷氨基酸残基；139位残基为极性不带电荷氨基酸残基；152位残基为极性带正电荷的氨基酸残基；154位残基为非极性氨基酸残基；157位残基氨基酸残基为极性氨基酸残基。
4.如权利要求3所述脂肪酶突变体，所述的39位残基为Ala或Val；40位残基为Ala或Val；138位残基为Ser、Cys；139位残基为Tyr、His者Arg；152位残基为Lys或His；154残基位为Gly或Ala；157位残基为Ser、Thr、Asp或Gly。
5.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于，138位残基为Ser；139位残基为Tyr。
6.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于， 138位残基为Ser， 139位残基为His。
7.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于， 154位残基为Gly， 157位残基为Asp。
8.如权利要求4所述脂肪酶突变体，其特征在于，152位残基为His；154位残基为Gly； 157位残基为Ser。
9.如权利要求1所述脂肪酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40或42所示。
10.一种核酸，其能够编码权利要求1-9中任一项所述的脂肪酶突变体。
11.如权利要求10所述的核酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3，5，7，9，11，13， 15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39或41所示。
12.一种表达载体，该载体含有权利要求10或11所述的核酸且能在宿主细胞中进行表达。
13.一种宿主细胞，其含有权利要求10或11的核酸或权利要求12所述的的表达载体。
14.如权利要求13所述的宿主细胞，该宿主细胞是毕氏酵母。
15.权利要求1-9中任一项所述的脂肪酶突变体在动力学拆分手性羧酸酯类化合物中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于所述的应用包括下述方法：在pH 5-9的磷酸盐缓冲液溶液中，在权利要求1-9任一项所述的脂肪酶突变体的催化下，手性羧酸酯类化合物进行水解，生成光学活性手性羧酸。
17.如权利要求15或16所述的应用，其特征在于，所述的手性羧酸酯类化合物为如式（I）所示的化合物，
Figure 2012105611869100001DEST_PATH_IMAGE002
其中R1为烷基、苯基、带有取代的苯基，苯基的取代基为卤素、烷基、苯基或带有取代的苯基、杂环等；
R2为烷基；
R3为烷基、苯基或带有取代的苯基，苯基的取代基为卤素、烷基或硝基。
18.如权利要求16-17任一项所述的应用，其特征在于，所述的手性羧酸酯类化合物为布洛芬类化合物的酯衍生物，其结构如式（II）所述，布洛芬类化合物为布洛芬、氟比洛芬、阿利洛芬、非诺洛芬、萘普生或酮洛芬，
其中R1为式（III）所述结构；
R2为烷基、苯基或带有取代的苯基，苯基的取代基为卤素、烷基或硝基。
Figure 2012105611869100001DEST_PATH_IMAGE006
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