CN102612557A

CN102612557A - 制备单酰基化多元醇的酶促催化方法

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Publication number: CN102612557A
Application number: CN2010800515756A
Authority: CN
Inventors: B·豪尔; C·克瓦尔斯特罗姆布兰尼比; K·胡尔特; A·麦格努松; A·汉伯格
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2009-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2012-07-25
Also published as: US20120171738A1; WO2011033039A1; EP2478094A1; US20140242651A1; US8715970B2; JP2013504336A

Abstract

本发明涉及制备例如来自南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的三酰基甘油脂肪酶突变体催化的单酰基化多元醇的生物催化方法；对映选择性制备不对称单酰基化的多元醇的生物催化方法，其由相同的酶突变体催化；以及突变的三酰基甘油脂肪酶在制备单酰基化多元醇的方法中的用途。本发明还提供了新的突变体、其编码序列，和携带所述编码序列的重组微生物。

Description

制备单酰基化多元醇的酶促催化方法

本发明涉及用于制备例如来自南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶B(CALB)的三酰基甘油脂肪酶突变体催化的单酰基化多元醇的生物催化方法；对映选择性制备由同一酶突变体催化的不对称单酰基化多元醇的生物催化方法；以及突变的三酰基甘油脂肪酶在制备单酰基化多元醇的方法中的用途。本发明还提供新的突变体、其编码序列，和携带所述编码序列的重组微生物。

发明背景

三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)是例如在去污剂工业、油脂化学、食品工业和精细化学品生产中具有多种工业用途的有价值的有效催化剂(Schmid R.D.,Verger,R.,Angew.Chem.Int.Ausg.37:1608–33(1998))。脂肪酶是羧基酯水解酶，其催化甘油三酯以及其他一般疏水酯的水解作用和合成。三维晶体结构已经被阐明的所有三酰基甘油脂肪酶属于α/β-水解酶折叠蛋白质家族，其具有相似的整体结构(Ollis D.L.,Cheah,E.,Cygler,M.,Dijkstra,B.,Frolow,F.,Franken,S.M.,Harel,M.,Remingon,S.M.,Silman,L.,Schrag,J.D.,Protein Eng.5:197-211(1992))。

南极假丝酵母脂肪酶B（此处也命名为CALB）是许多反应的有效催化剂，并用于例如立体选择性转化和聚酯合成(Anderson E.M.,Larsson,K.M.,Kirk,O.,Biocat.Biotransform.16:181–204(1998))。CALB具有溶剂易进入的活性中心(Uppenberg J.,Hansen,M.T.,Patkar,S.,Jones,A.,Structure 2:293–308(1994))并且不展示相间激活(Martinelle M.,Holmquist M.,Hult K.,Biochim.Biophys.Acta 1258(3):272–6(1995))。活性中心是窄的漏斗，并且CALB为此对羧酸酯，例如辛酸乙酯比对甘油三酯具有更高的活性(Martinelle 1995,上文)。有机介质中CALB的活性与在水中的活性相当，特别是CALB对仲醇的高对映选择性这样的事实使得该酶成为目前用于生物技术中最重要的脂肪酶之一。

近期描述了通过随机诱变对CALB的修饰(Chodrorge M.,Fourage L.,Ullmann C.,Duvivier V.,Masson J.M.,Lefèvre F.,Adv.Synth.Catal.347:1022-1026(2005)。也已经在文献中报道了通过合理的酶设计改进CALB用于特定应用的若干尝试。尽管这些中的一些尝试取得了好的结果(PatkarS.,Vind J.,Kelstrup E.,Christensen M.W.,Svendsen A.,Borch K.,KirkO.,Chem.Phys.Lipids 93(1-2):95–101(1988);Rotticci D."Understandingand Engineering the Enantioselectivity of Candida antarctica Lipase Btowards sec-Alcohols".Stockholm:Royal institute of Technology 1–61(2000))，但因为对酶催化性质的了解不充分，合理的酶设计的可能性仍然是有限的。

Zhang等在Protein Engineering,16卷,8号(2003)599中报道了目的在于提高CALB对不可逆热失活的耐性实验。通过应用定向进化技术，制备了含有突变V210I、V221D或A281E的单突变体。双突变体(V210I、A281E)和三突变体(V210I、A281E、V221D)以及单突变体A281E显示，它们的熔点(T_m)相对于野生型酶的T_m具有显著提高。

Suen等在Protein Engineering,Design & Selection,17卷,2号(2004),133中描述了用于提高CALB活性和热稳定性的另一方法。DNA家族改组技术用于产生来自南极假丝酵母和Crytococcus tzukbaensis以及Hyphozyma sp.的嵌合脂肪酶B蛋白质。通过高通量筛选，可鉴定嵌合体，其对底物3-(3’,4’-二氯苯基)戊二酸盐显示更高的活性，45°C下提高的半衰期和提高的熔点(T_m)。

Magnusson等在J.Am.Chem.Soc.123(2001),4354中描述了CALB的单突变体，它们在对两种乙酯：3-羟基丁酸乙酯和2-羟基丙酸乙酯的水解方面的对映选择性不同。具体而言，其中描述了单突变体T40A和T40V。未教导或提示单酰基化多元醇的制备。

Rotticci等在ChemBiochem.2(2001),766中公开了用于提高CALB对不同旋光仲一元醇的对映选择性的实验。具体而言，已经通过合理设计制备了单一突变体S47A、S47N、S47H、T42N、T42D、T42H、T42V、W104H以及双突变体(T42V,S47A)，并进行了进一步的研究。

Branneby等在J.Am.Chem.Soc.125(2003),874中公开了CALB的单突变体S105A和S105G，以及它们在醛醇缩合反应过程中的行为。

Magnussen等在ChemBiochem.(2005)1051中公开了具有增大的底物口袋的CALB的突变体，所述突变体具有利用更大的仲一元醇的能力。具体而言，研究了单突变体T42V、S47A、W104A、W104H、W104Q和双突变体(T42V,S47A)。

结果，上述文件中没有一个文件教导或提示在单酰基化多元醇，特别是非环状多元醇的方法中利用CALB酶。

因为预期单酰基化的中间物会被同一酶快速地进一步酯化，从而预期多元醇的单酯仅是反应过程中形成的中间物并且随着酯化反应的进行，单酯化产物的比例越来越少这样的事实，认为单酰基化的多元醇的选择性制备是难以实现的。

因此，持续需要提供用于选择性单酰基化多元醇，如二元醇，特别是非环状二元醇的酶促催化方法。具体而言，需要方法，允许单酰基化多元醇的改善的优先制备。这方面的改善特征在于单酯的增加的最大产量、单酯产物与更高或完全酯化产物例如二酯的摩尔比例提高、单酯产物与总酯化产物的摩尔比例提高，和/或更高程度转化下的更高的单酯产量。

还需要用于在具有不对称碳原子的酶底物情况下对映选择性制备这种单酰基化多元醇的方法。

发明简述

令人惊奇的是，上述问题可以通过提供制备单酰基化多元醇的酶促催化方法来解决，所述方法利用突变的三酰基甘油脂肪酶，例如CALB的突变体，所述突变体经改造以显示提高的选择性，i.p.区域选择性，允许单酰基化多元醇的优先形成。

本发明允许在单酯产物产生的过程中进行多元醇酯化反应，不仅在低的多元醇转化程度，令人惊奇的是还在高的多元醇转化程度下，所述单酯产物以相对于完全酯化产物显著摩尔过量产生。例如，在高达约50到90%的转化程度上观察到至少90%的产物分布（定义为单酯与所有酯化产物总和的比例），因此允许进行反应至几乎完成，并从反应混合物中分离高产量的期望的单酯产物。

参考附图进一步解释本发明。

附图描述

图1代表了机理图，其阐明了在转酯反应过程中CALB反应中心的氨基酸残基Asp 187、Ser 105和His 224的相互作用，所述转酯反应将第一个酯ROC(O)R₁的酰基残基C(O)R₁转移到醇HOR₂上，形成新的第二个酯化合物R₂OC(O)R₁。在反应中心的氧阴离子洞（oxianion hole）中稳定四面体中间物，因此利于转酯反应。

图2示意性地阐明了CALB氧阴离子洞的位置106和40中的氨基酸残基参与稳定化转酯反应过程中形成的氧阴离子中间物中。图2A阐明了通过在氧阴离子和氨基酸残基Gln 106和Thr 40之间形成3个氢键稳定氧阴离子。所阐明的酯具有通式R₁OC(O)R。图2B显示了与图2A中相同底物的稳定化，但现在位于CALB的单突变体T40A中，其中由于Thr 40被Ala替换，一个稳定化氢键丢失，因此去稳定化所述过渡态。图2C阐明了如在丁二醇单酯HOButOC(O)R的转酯反应过程中观察到的在同一突变体T40A中出现的过渡态的稳定过程中的底物协助。二醇的游离羟基基团与氧阴离子通过氢键相互作用，以便重新获得过渡态的稳定性。所述二醇分子的所述底物协助解释了T40A突变体催化的转酯反应过程中二醇优先性。

图3阐明了在利用在乙酸乙酯中溶解的1,4-丁二醇作为底物的转酯反应中CALB野生型和CALB T40A突变体催化的转酯反应中观察到的实验结果。单乙酸酯和二乙酸酯的产量显示为%转化的函数。(A)阐明了CALB野生型的结果。(B)阐明了CALB突变体T40A获得的结果。如所见，在宽%转化范围内优选获得单乙酸酯。

图4阐明了在利用在乙酸乙酯中溶解的1,2-乙二醇作为底物的转酯反应中CALB野生型和CALB T40A突变体催化的转酯反应中观察到的实验结果。单乙酸酯和二乙酸酯的产量显示为%转化的函数。(A)阐明了CALB野生型获得的结果。(B)阐明了CALB突变体T40A获得的结果。如所见，利用T40A，在宽%转化范围内优先获得单乙酸酯。野生型酶的最大单酯产量是43%；突变体的最大单酯产量显著提高到77%，表明突变体对单酯的提高的选择性。

图5显示了在利用在乙酸乙酯中溶解的1,2-乙二醇的转酯反应中野生型和T40A CALB在产物分布上的差异。(A)和(B)中阐明的是来自同一实验的两种给定产物分布的二醇转化。对于75%的产物分布，利用野生型转化了17%的二醇，利用T40A CALB转化了99%（见（A））。90%的产物分布的相应图是利用野生型转化9%和利用T40A CALB转化78%（见（B））。

图6阐明了基于等式1-3拟合到模型的数据。显示二醇（菱形）、单酯（正方形）和二酯（三角形）的点是测量值。误差线显示了使用在等式1-3中获得的k_cat/K_M-值计算的值。(A)和(B)分别对应于野生型和T40ACALB。

图7阐明了在利用2-甲基-1,3-丙二醇作为底物和在MTBE中溶解的丁酸乙烯酯作为酰基供体的转酰基反应中单酯和二酯的产量。野生型(A)和T40A(B)CALB用作催化剂。如所见，在宽%转化范围优先获得单丁酸酯。

图8显示了在利用MTBE中溶解的丁酸乙烯酯作为酰基供体的反应中表示为1,4-丁二醇转化的函数的单酯和二酯的产量。野生型(A)和T40A(B)CALB用作催化剂。如所见，在宽%转化范围优先获得单丁酸酯。

图9显示了竞争底物的转化。二醇的转化表示为1-丁醇转化的函数。展示了两种不同的二醇：1,2-乙二醇(A)和1,4-丁二醇(B)。使用乙酸乙酯作为酰基供体和溶剂进行反应。比较了野生型（菱形）和T40A(正方形)CALB催化的反应。在A和B中，T40A催化的反应比野生型CALB催化的反应，对二醇相对于1-丁醇的选择性更高。

图10显示了竞争底物的转化。二醇的转化表示为1-丁醇转化的函数。展示了两种不同的二醇：1,2-乙二醇(A)和1,4-丁二醇(B)。使用丁酸乙烯酯作为酰基供体和MTBE作为溶剂进行反应。比较野生型（菱形）、T40A(正方形)和T40V（三角形）CALB催化的反应。在A和B中，T40A和T40V催化的反应比野生型CALB催化的反应对二醇相对于1-丁醇的选择性更高。

图11显示了随时间流逝每克酶转化的1,2-乙二醇。在A中乙酸乙酯用作酰基供体和溶剂。在B中，丁酸乙烯酯用作酰基供体，MTBE用作溶剂。反应速率在野生型和T40A CALB之间不同，说明野生型（菱形）相比于T40A（正方形）变体是更有效的催化剂。当使用乙酸乙酯而非丁酸乙烯酯作为酰基供体时，反应速率的差异更大。

图12显示了在市售酶(Novo 435)（填充的圆点代表）、A282L突变体（空白正方形）或L278S突变体（空白三角形）酶促催化后，多种转化率下4-羟基丁二醇相对于丁二醇二丙烯酸酯的过量。在各自检测范围内，两种CALB突变体在宽范围的所实现转化上显示了4-羟基丁二醇的可测量的过量。

图13显示了产物过量或转化率依赖于CALB Novo 435和CALBA282L的流速。填充的或空白的点分别代表Novo 435或A282L的转化，而填充的或空白的正方形分别代表Novo 435或A282L在给定转化下完成的4-HBA过量。

图14显示了与CALB Novo 435和本发明所选CALB突变体比较，所产生的单丙烯酸酯相对于转化程度的过量。结果基于直接从培养基中获取的样品。图14A：包含来自A282C(十字形标记);A282P(空白三角形);A282I(空白正方形);A282D(空白菱形,阴影线)的结果;图14B包含来自A282L(空白正方形);A282V(空白三角形,阴影线);A282R(空白菱形)和L278S/A282L(十字形)的结果，而在图14A和图14B中填充的点代表Novo435。

图15显示了与CALB Novo 435和本发明所选CALB突变体比较，所产生的单丙烯酸酯相对于转化程度的过量。结果基于Resindinon DiaionHP20L珠子(Resindion SRL,Mitsubishi Chemical的子公司)上固定的酶。图15A包含来自：A282I(空白三角形代表);A282R(空白菱形)，和L278S/A282L(空白正方形,阴影线)的结果;图15B包含来自A282C(空白菱形),I285F(空白正方形)和A282L/I285F(空白三角形)的结果，而在图15A和图15B中填充的点代表Novo 435。

发明详述

1.一般定义

在缺少相反信息的情况下，应该应用以下一般定义：

根据本发明，“三酰基甘油脂肪酶”根据IUBMB酶命名法表示类型E.C.3.1.1.3的酶(http://www.iubmb.unibe.ch;http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)。

根据本发明方法的特定实施方案，功能表达的三酰基甘油脂肪酶是脂肪酶B，其为来自南极假丝酵母的CALB的基因产物。描述了CALB基因(Uppenberg等,1994)，并且其核苷酸或蛋白质序列以登录号Z30645和CAA83122.1保存在GenBank。除非更精确地命名，此处CALB表示具有该登录号的核苷酸序列。三酰基甘油脂肪酶的另一实例是来自Pseudozymatsukubaensis的脂肪酶B(Suen,W.C.,Zhang,N.,Xiao,L,Madison,V.,Zaks,A.Protein Eng.Des.Sel.17(2):133-40(2004))。

“酶促催化的”或“生物催化的”方法表示所述方法在酶（包括如此处定义的酶突变体）的催化作用下进行。因此，可在存在分离（纯化、富集）或天然形式的所述酶的情况下或在存在细胞系统，具体而言天然或重组微生物细胞的情况下进行所述方法，所述微生物细胞含有活性形式的所述酶，并具有催化此处公开的转化反应的能力。

术语“选择性单酰基化多元醇”或“增加对单酰基化多元醇的选择性”一般表示在此处公开的酯化反应过程中，即在所述反应的整个过程中（即在反应开始和终止之间）、在所述反应的某个时间点上、或在所述反应的“间隔”中，以比至少一种，优选所有高级酯化多元醇组分更高的比例或量（在摩尔基础上比较）产生所述多元醇的单酯。具体而言，可在对应于多元醇底物初始量1到99%、2到95%、3到90%、5到85%、10到80%、15到75%、20到70%、25到65%、30到60%或40到50%转化的“间隔”中观察所述选择性。例如可在以下方面表述所述更高的比例或量：

-在整个反应过程中或其所述间隔中观察的单酰基化多元醇的更高最大产量；

-在多元醇的确定%转化值下更高的相对量的单酰基化产物；和/或

-更高%程度的转化值下相同的相对量的单酰基化产物；

其各自在相对于参考方法下观察，所述参考方法在利用相应的非突变脂肪酶在其他方面相同条件下进行。

术语“产物分布”描述了在此处描述的酶催化方法的过程的某一时间点上或“间隔”中形成的某一反应产物的部分量相对于所述方法形成的所有产物的总量的比例，以百分比表示。因此，某一多元醇的单酯的“产物分布”定义了所述单酯相对于酯（单酯和聚酯）的总量的比例（百分比），其在某一时间点上或在所述酶促酯化反应开始后的确定间隔中在此处定义的酶影响下产生。

“旋光”化合物是具有至少一个不对称中心，即，至少一个不对称碳原子的那些化合物。

术语“约”表明所述值±25%的可能变化，特别是±15%、±10%、±5%、±2%或±1%的可能变化。

术语“基本上”表明所述值±10%的可能变化，特别是±5%、±1%、±0,5%、±0.2%或±0.1%或更少的可能变化。

“立体选择性”或“对映选择性”描述了产生立体异构或对映异构纯形式的旋光化合物或特异地转化特定立体异构体的能力或从大量立体异构体或对映体中制备单酰基化多元醇对映体的酶促催化方法。更特别地，这表示本发明的产物针对特定立体异构体或对映体进行了富集。这可通过以下公式计算的对映体纯度%ee参数来定量：

%ee=[X_A-X_B]/[X_A+X_B]*100,

其中X_A和X_B代表对映体A和B的摩尔比例（Molenbruch）。

可获得至少90%ee，像至少95%ee，或至少98%ee或至少99%ee或更高的对映体纯度。

术语“能够形成氢键”指本发明酶分子的氨基酸残基与另一分子，例如所述酶的另一氨基酸残基或与定位在所述酶分子上或分子内的底物分子或其中间状态形成氢键的能力。

“稳定”氧阴离子过渡态的条件表示这样的条件，其使得所述氧阴离子状态如果与非稳定状态相比在能量上更有利。例如通过阴离子的负电荷的离域作用实现稳定化。

如此处定义的酶的“底物口袋”或其“反应中心”在待催化的反应过程中携带了底物分子并将其转化成通式I的产物。所述底物口袋由某些“结构元件”，即具有不同功能的所述底物口袋的部分组成。所述结构元件彼此“功能排列”，即它们在待催化的反应过程中协同作用。

“序列基序”或“模式”代表了大量氨基酸残基的特征性排列或“指纹图谱”，所述氨基酸残基在特定氨基酸序列内彼此邻接，或彼此以特定方式分隔，即由特征性长度的中间间隔序列分隔。

“扩展的底物特异性”指如果与参考酶相比，转化额外结构上不同的底物的酶。

“改变的/修饰的底物特异性”指如果与参考酶相比转化部分或完全不同组底物分子的酶。因此，术语“改变的底物特异性”可描述这样的情形，其中例如通过突变产生的脂肪酶比参考酶（例如非突变的酶）更好地适合于特定底物分子的酰基化。例如，酶变体形成的结合口袋更高的底物亲和力可引起更高的优先性或特异性。

“改变的/修饰的区域选择性”指如果与参考酶相比，以改变优先性转化底物分子的一个或多个潜在反应位点的酶。因此，术语“改变的区域选择性”可描述这样的情形，其中例如通过突变产生的脂肪酶比参考酶（例如非突变的酶）更好地适应于具有多于一个可酰基化官能团的特定底物分子的单酰基化。

由于酶促反应的可逆性，本发明也涉及此处所述生物催化酰基化反应的相应可逆（即脱酰基）反应。

2.本发明的特定实施方案

本发明提供以下特定实施方案：

1.制备单酰基化多元醇，特别是通式(I)的单酰基化二醇的生物催化酶促催化方法：

其中

R₁代表任选取代的线性或分支的饱和或不饱和烃基残基；并且

A代表任选取代的线性或分支的非环状亚烃基(hydrocarbylene)残基，特别是具有至少两个碳原子，并且具体而言，其中氧原子连接不同的碳原子；

所述方法包括

a)使通式(II)的多元醇与通式(III)的酰基供体化合物在突变的三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)存在下反应，直至形成上述通式(I)的单酰基化多元醇；

HO-A-OH (II)

其中R₁和A如上定义，具体而言，其中羟基连接不同的碳原子，并且

Don代表携带所述酰基基团的供体分子残基，并且优选选自–OR基团，其中R代表任选取代的线性或分支的饱和或不饱和烃基残基；和

b)获得单酰基化多元醇产物。

2.实施方案1的方法，其中所述突变的脂肪酶含有至少一个氨基酸突变，如果与相应的非突变脂肪酶相比，其增加了脂肪酶对所述多元醇单酰基化的选择性。

3.前述实施方案之一的方法，其中所述突变体包含至少一个突变，其从酶反应中心部分去除了稳定化功能氨基酸基团，特别是能够形成氢桥的氨基酸侧链，所述酶稳定了待形成的通式(I)的单酰基化多元醇的羰基的氧阴离子过渡态。

4.前述实施方案之一的方法，其中使所述酶突变，使得

a)获得了最大单酯产量，其比相应野生型酶获得的最大产量高至少1%，例如2到1000、5到500、10到200、15到100、10到80或15到50%；

b)在这样的多元醇转化率下达到了单酯与聚酯3:1的摩尔比例，所述多元醇的转化率比相应野生型酶获得的相应转化率高至少1%，例如2到1000、5到500、10到200、15到100、10到80或15到50%；

c)在多元醇总量的基础上产生90%(以摩尔为基础)单酰基化多元醇的反应时间的比例(T₉₀(突变体)/T₉₀(野生型))高于1，例如在约2到1000、5到500、10到200、15到100、10到80或15到50范围内。

5.前述实施方案之一的方法，其中所述酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的突变体，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在至少一个位置，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置上发生了突变。

6.实施方案5的方法，其中所述突变体包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中至少氨基酸Thr40发生了突变。

7.实施方案6的方法，其中所述突变使得在氧阴离子中间体与位置40的氨基酸残基之间基本上不会发生稳定化相互作用。

8.实施方案7的方法，其中所述突变包含单突变Thr40Ala、Thr40Val或Thr40Ser。

9.实施方案8的方法，其中所述突变体选自具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的突变体或所述突变体的变体，其具有至少60%的序列同一性，所述变体在对应于SEQ ID NO:2或4的位置Thr40的氨基酸位置中仍然含有突变。

10.实施方案7至9中一项的方法，其中所述突变体在SEQ ID NO:2或4的氨基酸位置Leu 278、Ile 285和Pro 280之一中额外地包含至少一个突变。

11.实施方案10的方法，其中所述突变体及其变体在促成酶的催化位点的其他氨基酸位置上没有发生突变。

12.实施方案11的方法，其中所述突变体在氨基酸位置Ser105、Asp187、His224(催化三联体)和Gln106上没有发生突变，并且其中所述变体在对应于那些位置的氨基酸位置上没有发生突变。

13.实施方案5至12任何一项的方法，其中在SEQ ID NO:2中或在包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸Thr40上的突变的SEQ ID NO:2中，Leu278、Ala281、Ala282或Ile285中的一个或多个发生了突变。

14.实施方案13的方法，其中一个或多个突变独立地选自：

Leu 278Ser代替Leu278,

Ala281Val或Ala281Glu代替Ala281,和

Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met或Ala282Arg代替Ala282。

15.实施方案14的方法，其中SEQ ID NO:2包含选自Ala281Val、Ala281Glu、Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met、Ala282Arg和Ile285Phe的一个突变，或其中SEQ ID NO:2包含双突变Leu278Ser和Ala282Leu。

16.前述实施方案之一的方法，其中所述反应在存在分离的酶突变体或功能表达所述突变体的重组微生物的情况下进行。

17.前述实施方案之一的方法，其中所述多元醇是通式(II)的化合物，其中A选自

-(CH₂)_n-和

-(CH₂)_m-CR₂R₃-(CH₂)_m’-

其中n是2-6的整数，

m和m’各自独立地是1-3的整数，

R₂和R₃各自独立地选自H、OH、SH、NH₂、任选取代的碳环或杂环和烃基残基，条件是R₂和R₃不同时是H。

18.前述实施方案之一的方法，其中通式(III)的所述供体选自化合物，其中R₁是C₁-C₆-烷基，并且Don是-OR残基，其中R选自C₁-C₆-烷基和C₂-C₄-烯基。

19.对映选择性制备通式(I)的不对称单酰基化多元醇的生物催化性酶促催化方法：

其中R₁代表任选取代的线性或分支的非环状饱和或不饱和烃基残基；并且

A*代表任选取代的线性或分支的不对称亚烃基残基，其具有至少两个碳原子，并且具体而言其中氧原子连接不同的碳原子；

所述方法包括

a)使通式(II’)的多元醇的立体异构混合物与通式(III)的酰基供体化合物在存在突变的三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)下反应，直至形成上述通式(I)的单酰基化多元醇；

HO-A*-OH (II′)

其中R₁和A*如上定义，具体而言，其中羟基基团连接不同的碳原子，并且

b)获得不对称的单酰基化多元醇产物。

20.实施方案19的方法，其中应用实施方案2至15任何一个中定义的酶突变体，所述突变体是分离的酶突变体形式或功能表达所述突变体的重组微生物形式。

21.实施方案19或20的方法，其中所述多元醇是通式(II’)的化合物，其中A*选自基团

-(CH₂)_m-CHR₂-(CH₂)_m’-

其中m、m’和R₂如上定义。

22.突变的三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)在制备如上定义的通式(I)或(I’)的单酰基化多元醇的方法中的用途。

23.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)突变体，其显示了SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的至少两个突变的模式，所述模式选自下文表A中显示的模式。

24.实施方案23的突变体，其额外地显示选自SEQ ID NO:2或4的序列中Val210Ile、Ala281Glu、Val221Asp的一个突变。

25.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)突变体，其在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中具有一个或多个突变，所述突变独立地选自

Leu 278Ser代替Leu278,

Ala281Val或Ala281Glu代替Ala281,和

26.实施方案25的突变体，其在SEQ ID NO:2中具有选自Ala281Val、Ala281Glu、Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met、Ala282Arg和Ile285Phe的一个突变，或在SEQ ID NO:2中具有双突变Leu278Ser和Ala282Leu。

27.实施方案23或24的突变体，其额外地具有在实施方案25或26任何一个中定义的至少一个突变。

28.核酸分子，其编码实施方案20至27之一的突变体。

29.表达载体，其包含任选地在调节性核酸序列控制下的实施方案28的至少一个编码序列。

24.微生物宿主，其携带实施方案23的至少一个表达载体或实施方案22的编码序列。

表A特定的突变类型:

2-倍突变体

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Ala	Phe
Ala	Trp
				Ala	Ala
Ala	Ser
				Ala	Asn
Ala		Leu
				Ala		Ser
Ala		Phe
				Ala		Gln
Ala			Ala
				Val	Phe
Val	Trp
				Val	Ala
Val	Ser
				Val	Asn
Val		Leu
				Val		Ser
Val		Phe
				Val		Gln
Val			Ala
				Ser	Trp
Ser	Ala

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Ser	Ser
Ser	Asn
				Ser		Leu
Ser		Ser
				Ser		Phe
Ser		Gln
				Ser			Ala

3-倍突变体

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Ala	Phe	Leu
Ala	Phe	Ser
				Ala	Phe	Phe
Ala	Phe	Gln
				Ala	Phe		Ala
Ala	Trp	Leu
				Ala	Trp	Ser
Ala	Trp	Phe
				Ala	Trp	Gln
Ala	Trp		Ala
				Ala	Ala	Leu
Ala	Ala	Ser
				Ala	Ala	Phe
Ala	Ala	Gln
				Ala	Ala		Ala
Ala	Ser	Leu
				Ala	Ser	Ser
Ala	Ser	Phe
				Ala	Ser	Gln
Ala	Ser		Ala

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Ala	Asn	Leu
Ala	Asn	Ser
				Ala	Asn	Phe
Ala	Asn	Gln
				Ala	Asn		Ala

				Val	Phe	Leu
Val	Phe	Ser
				Val	Phe	Phe
Val	Phe	Gln
				Val	Phe		Ala
Val	Trp	Leu
				Val	Trp	Ser
Val	Trp	Phe
				Val	Trp	Gln
Val	Trp		Ala
				Val	Ala	Leu
Val	Ala	Ser
				Val	Ala	Phe
Val	Ala	Gln
				Val	Ala		Ala
Val	Ser	Leu
				Val	Ser	Ser
Val	Ser	Phe
				Val	Ser	Gln
Val	Ser		Ala
				Val	Asn	Leu
Val	Asn	Ser
				Val	Asn	Phe
Val	Asn	Gln

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Val	Asn		Ala

				Ser	Phe	Leu
Ser	Phe	Ser
				Ser	Phe	Phe
Ser	Phe	Gln
				Ser	Phe		Ala
Ser	Trp	Leu
				Ser	Trp	Ser
Ser	Trp	Phe
				Ser	Trp	Gln
Ser	Trp		Ala
				Ser	Ala	Leu
Ser	Ala	Ser
				Ser	Ala	Phe
Ser	Ala	Gln
				Ser	Ala		Ala
Ser	Ser	Leu
				Ser	Ser	Ser
Ser	Ser	Phe
				Ser	Ser	Gln
Ser	Ser		Ala
				Ser	Asn	Leu
Ser	Asn	Ser
				Ser	Asn	Phe
Ser	Asn	Gln
				Ser	Asn		Ala

4-倍突变体

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Ala	Phe	Leu	Ala
Ala	Phe	Ser	Ala
				Ala	Phe	Phe	Ala
Ala	Phe	Gln	Ala

Ala	Trp	Leu	Ala
				Ala	Trp	Ser	Ala
Ala	Trp	Phe	Ala
				Ala	Trp	Gln	Ala

				Ala	Ala	Leu	Ala
Ala	Ala	Ser	Ala
				Ala	Ala	Phe	Ala
Ala	Ala	Gln	Ala

Ala	Ser	Leu	Ala
				Ala	Ser	Ser	Ala
Ala	Ser	Phe	Ala
				Ala	Ser	Gln	Ala

				Ala	Asn	Leu	Ala
Ala	Asn	Ser	Ala
				Ala	Asn	Phe	Ala
Ala	Asn	Gln	Ala

Val	Phe	Leu	Ala
				Val	Phe	Ser	Ala
Val	Phe	Phe	Ala
				Val	Phe	Gln	Ala

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Val	Trp	Leu	Ala
Val	Trp	Ser	Ala
				Val	Trp	Phe	Ala
Val	Trp	Gln	Ala

Val	Ala	Leu	Ala
				Val	Ala	Ser	Ala
Val	Ala	Phe	Ala
				Val	Ala	Gln	Ala

				Val	Ser	Leu	Ala
Val	Ser	Ser	Ala
				Val	Ser	Phe	Ala
Val	Ser	Gln	Ala

Val	Asn	Leu	Ala
				Val	Asn	Ser	Ala
Val	Asn	Phe	Ala
				Val	Asn	Gln	Ala

				Ser	Phe	Leu	Ala
Ser	Phe	Ser	Ala
				Ser	Phe	Phe	Ala
Ser	Phe	Gln	Ala

Ser	Trp	Leu	Ala
				Ser	Trp	Ser	Ala
Ser	Trp	Phe	Ala
				Ser	Trp	Gln	Ala

Thr40	Leu278	Ile285	Pro280
				Ser	Ala	Leu	Ala
Ser	Ala	Ser	Ala
				Ser	Ala	Phe	Ala
Ser	Ala	Gln	Ala

Ser	Ser	Leu	Ala
				Ser	Ser	Ser	Ala
Ser	Ser	Phe	Ala
				Ser	Ser	Gln	Ala

				Ser	Asn	Leu	Ala
Ser	Asn	Ser	Ala
				Ser	Asn	Phe	Ala
Ser	Asn	Gln	Ala

3.底物

a)多元醇

待根据本发明酰基化的多元醇一般具有通式II

HO-A-OH (II)

其中A代表任选取代的线性或分支的非环状亚烃基残基，其具有至少两个碳原子，并且其中羟基基团连接不同的碳原子；

“非环状”在该上下文中表示HO-基团不连接碳环或杂环单核或多核环。

A具体由携带根据以下通式的两个HO-基团的亚烃基骨架B形成

HO-CR₄R₄-B-CR₄R₄-OH

其中R₄残基各自独立地选自H和线性的或分支的，特别是线性的C₁-C₆-烷基，并且

B代表通式–(CR₅R₅)_z-的基团，

其中z是0、1、2、3、4、5或6的整数，并且

R₅残基各自独立地选自H、线性的或分支的，特别是线性的C₁-C₆-烷基，任选取代的C₃-C₇-环烷基和任选取代的芳基或杂芳基。

在另一实施方案中，待酰基化的二醇的羟基基团各自独立地是叔、仲或伯羟基基团。

A基团的特定实例选自以下基团，适合携带两个伯羟基基团：

-(CH₂)_n-和

-(CH₂)_m-CR₂R₃-(CH₂)_m’-

其中n是1、2、3、4、5或6的整数，

m和m’各自独立地是1、2或3的整数，

R₂和R₃各自独立地选自H、OH、SH、NH₂、碳环或杂环，具体而言，任选取代的C₃-C₇-环烷基、芳基或杂芳基；和线性的或分支的，特别是分支的C₁-C₆-烷基，条件是R₂和R₃不同时是H。

b)酰基供体

“酰基供体”分子具有为本发明的生物催化酰基反应提供酰基基团的能力。

一般地，所述供体是上述通式(III)的供体，其中

R₁代表任选取代的线性或分支的饱和或不饱和烃基残基，特别是C₁-C₃₀-烃基；并且

Don代表携带所述酰基基团的供体分子，并且优选选自-OR基团，其中R代表任选取代的线性或分支的饱和或不饱和烃基残基，特别是C₁-C₆-烃基或C₂-C₄-烯基，像甲基、乙基或乙烯基。

c)定义

本发明的“亚烃基”残基特别包含线性–(CH₂)_n-骨架，n=1、2、3、4、5、6、7或8，其可进一步如此处定义进行取代。

本发明线性或分支的饱和或不饱和“烃基”残基特别指线性的或分支的烷基或烯基残基。

“烷基”残基包含C₁-C₈-烷基基团，其为具有1到8个碳原子的线性或分支基团。其实例为：

-C₁-C₄-烷基基团，其选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基。

-C₁-C₆-烷基基团，其选自如上定义的C₁-C₄-烷基基团，还有戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基，

-C₁-C₈-烷基基团，其选自如上定义的C₁-C₆-烷基基团，还有庚基、辛基及其结构异构体，如2-乙基己基；和

-C₈-C₃₀-烷基基团，其为具有8到30个碳原子的线性或分支基团；其实例选自辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基（squalyl）、它们的结构异构体、高级同系物及其结构异构体。

“烯基”残基包含C₂-C₃₀-烯基基团，其为具有2到30个碳原子的单不饱和线性或分支烃基基团。

特定实例是：

-C₂-C₄-烯基基团，像乙烯基或乙烯基、1-或2-丙烯基、1-、2-和3-丁烯基，

-C₂-C₈-烯基基团，其包含如上定义的C₂-C₄-烯基基团以及2-甲基丙烯-3-基、2-甲基丙烯-1-基、1-、2-、3-和4-戊烯基、1-、2-、3-、4-和5-己烯基、1-、2-、3-、4-、5-和6-庚烯基、1-、2-、3-、4-、5-、6-和7-辛烯基，以及其结构异构体；以及

-C₈-C₃₀-烯基残基，其为具有8到30个碳原子的单不饱和线性或分支烃基。其实例是辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十三烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、十九烯基、二十烯基、二十一烯基、二十二烯基、二十三烯基、二十四烯基、二十五烯基、二十六烯基、二十七烯基、二十八烯基、二十九烯基、三十烯基（squalyl）、其结构异构体、高级同系物及其结构异构体。

“碳环和杂环”残基包含任选缩合的具有3到12个碳原子和任选1、2、3或4个相同或不同的环-杂原子，像N、S和O的芳香或非芳香环基团。

作为实例可提及：

-芳香碳环，像苯基和萘基。

-非芳香碳环，特别是C₃-C₇-环烷基残基，像环丙基、环丙基-甲基、环丙基-乙基、环丁基、环丁基-甲基、环戊基、环戊基-甲基、环己基、环己基-甲基、环庚基，以及其一倍或两倍不饱和类似物，例如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基；

-5-到7-元饱和或不饱和的、芳香或非芳香杂环残基，其具有选自O、N和S的1到4个环-杂原子，其中所述杂环基团可与其他杂环或碳环残基缩合。作为实例可提及吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、

唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪、吡嗪、苯并呋喃、吲哚和喹啉残基。

此处定义的“任选取代”残基的非限制性实例包含1、2、3、4、5或6个相同或不同的取代基，像HO、SH、NH₂、NO₂、卤素，像F、Cl、Br、J；低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或羟基-低级烷基，如上定义。

“低级烷基”指如上定义的C₁-C₈-烷基基团。

“低级烷氧基”优选指上文提及的低级烷基基团的C₁-C₈-烷氧基类似物。

“低级烷硫基”优选指上文提及的低级烷基基团的C₁-C₈-烷硫基类似物。实例是甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、仲丁硫基、异丁硫基和叔丁硫基。

“低级烯基”包含如上定义的C₂-C₈-烯基基团。

“低级炔基”包含上文“低级烯基”基团的炔基类似物。

术语“羟基低级烷基”指C₁-C₈-羟基烷基，其为线性或分支烷基基团，具有1到8，特别是1到4个碳原子，其中至少一个氢原子，例如1或2个氢原子被羟基基团替换。其实例是羟甲基、2-羟基-1-乙基、2-和3-羟基-1-丙基、2-、3-和4-羟基-1-丁基、2-、3-、4-和5-羟基-1-戊基、2-、3-、4-、5-和6-羟基-1-己基、2-、3-、4-、5-、6-和7-羟基-1-庚基、2-、3-、4-、5-、6-、7-和8-羟基-1-辛基、2,3-二羟基-1-丙基及其结构异构体。

a)b)和c)下提供的上述定义同时应用于通式(I’)、(II’)和(III’)的化合物。

4.本发明的酶和酶突变体

本发明不限于特别公开的三酰基甘油脂肪酶和突变体的用途，还延伸到其功能等同物。

具体公开的酶的“功能等同物”或类似物在本发明范围内是其多种多肽，其还具有想要的生物学功能或活性，例如酶活性。

例如，“功能等同物”表示这样的酶，其在用于酶活性的测试中显示出此处定义的酶的至少1到10%，或至少20%，或至少50%，或至少75%，或至少90%更高或更低的活性。

根据本发明，“功能等同物”还特别表示突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置上具有不同于具体说明的氨基酸的氨基酸，但是仍然具有上述生物活性之一。“功能等同物”因此包含通过一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸添加、取代、插入、缺失和/或倒位可获得的突变体，其中所述改变可在任何氨基酸位置上发生，只要它们产生具有本发明性质谱的突变体。如果反应性模式在突变体和未改变的多肽之间性质上一致，即如果例如以不同速率转化相同底物，那么也特别提供了功能等同物。合适的氨基酸取代的实例示于下表中：

“功能等同物”在上述意义上也是所述多肽的“前体”，以及多肽的“功能衍生物”和“盐”。

“前体”在那种情况下是多肽的天然或合成前体，具有或不具有想要的生物活性。

表述“盐”表示本发明蛋白质分子的羧基的盐或氨基的酸加成盐。羧基的盐可以已知的方式产生并包含无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，和有机碱的盐，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等的盐。酸加成盐，例如无机酸的盐，如盐酸或硫酸的盐，和有机酸的盐，如乙酸和草酸的盐也涵盖在本发明内。

可使用已知技术在功能氨基酸侧基上或在其N末端或C末端上产生本发明多肽的“功能衍生物”。此类衍生物包含例如羧酸基团的脂肪族酯，羧酸基团的酰胺，其通过与氨水或伯胺或仲胺反应获得；游离氨基的N-酰基衍生物，其通过与酰基基团反应产生；或游离羟基基团的O-酰基衍生物，其通过与酰基基团的反应产生。

“功能等同物”天然地还包含可从其他生物获得的多肽，以及天然发生的变体。例如，可通过序列比较确定同源序列区域，并且可在本发明具体参数的基础上测定等同酶。

“功能等同物”还包含片段，优选本发明多肽的单个结构域或序列基序，其例如显示了想要的生物功能。

“功能等同物”此外是融合蛋白质，其具有上述多肽序列之一或来自其的功能等同物和以功能性N末端或C末端连接（即，无融合蛋白质部分的实质性相互功能缺损）的至少一种其他功能不同的异源序列。这些异源序列的非限制性实例是例如信号肽、组氨酸锚或酶。

本发明还包括的“功能等同物”是具体公开的蛋白质的同源物。这些等同物具有上文说明的百分比同一性值。所述值指与具体公开的氨基酸序列的同一性，并可根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法进行计算。

可从BLSAT比对、算法blastp（蛋白质-蛋白质BLAST）或通过应用下文给出的Clustal设置计算%同一性值。

本发明同源多肽的百分比同一性表示特别是氨基酸残基相对于此处具体描述的氨基酸序列之一总长度的百分比同一性。

在可能的蛋白质糖基化情况下，本发明的“功能等同物”包含去糖基化或糖基化形式以及可通过改变糖基化模式获得的修饰形式的上文定义类型的蛋白质。

可通过诱变，例如通过点突变、蛋白质的增长或缩短产生本发明蛋白质或多肽的此类功能等同物或同源物。

可通过筛选突变体的组合数据库，例如缩短突变体鉴定本发明蛋白质的此类功能等同物或同源物。例如，可通过在核酸水平上组合诱变，例如通过酶促连接合成寡核苷酸的混合物产生蛋白质变体的多样化数据库。有许多这样的方法，其可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物的数据库。可在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并且所合成的基因然后可连接到合适的表达载体中。简并基因组的使用使得可以在混合物中提供所有序列，其编码想要组的可能蛋白质序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域技术人员所知(例如Narang,S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等,(1984)Science 198:1056;Ike等(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。

在现有技术中，已知若干技术用于筛选组合数据库的基因产物，其通过点诱变或缩短产生并用于筛选cDNA文库中具有所选性质的基因产物。这些技术可适合于快速筛选基因库，其通过组合诱变本发明的同源物的组合诱变产生。基于高通量分析的最经常用于筛选大基因库的技术包含在可复制的表达载体中克隆基因库、利用所得载体数据库转化合适的细胞，和在如下条件下表达组合基因，在所述条件下想要的活性的检测利于分离载体，所述载体编码其产物将被检测的基因。一种增加数据库中功能突变体频率的技术：递归总体诱变（Recursive Ensemble Mutagenesis(REM)）可用于与筛选检测组合，以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。

5.编码核酸序列

本发明还涉及编码此处定义的酶和突变体的核酸序列。

本发明还涉及与此处特异公开的序列具有特定程度“同一性”的核酸。两条核酸之间的“同一性”表示在每种情况下完整长度的核酸上核苷酸的同一性。

例如，可通过Informax(USA)公司的Vector NTI Suite 7.1程序，使用Clustal Method(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiplesequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr;5(2):151-1)，利用以下设置计算同一性：

多重比对参数：

配对比对参数:

或者可根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500，网址http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#和以下设置测定同一性

可通过已知的方式，从核苷酸结构单元化学合成，例如通过双螺旋的各重叠的互补核酸结构单元片段缩合产生此处提及的所有核酸序列（单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA）。可通过已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet,Voet,第2版,Wiley Press,New York,第896-897页)进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等(1989)中描述了通过DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应以及一般克隆技术积累合成的寡核苷酸并填充缺口，见下文。

本发明还涉及编码上述多肽及其功能等同物之一的核酸序列（单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA），其例如可使用人工核苷酸类似物获得。

本发明涉及分离的核酸分子和核酸片段，所述核酸分子编码本发明的多肽或蛋白质或其生物活性区段，所述核酸片段可用作例如杂交探针或引物，用于鉴定或扩增本发明的编码核酸。

本发明的核酸分子可额外地含有编码遗传区的3′和/或5′末端的非翻译序列。

本发明还涉及与具体描述的核酸序列或其区段互补的核酸分子。

本发明的核苷酸序列使得可以产生探针和引物，其可用于在其他细胞类型和生物中鉴定和/或克隆同源序列。此类探针或引物一般包含这样的核苷酸序列区，其在“严格”条件（见下文）下在本发明核酸序列有义链或对应反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸上杂交。

从核酸天然来源中存在的其他核酸分子中分离“分离的”核酸分子，并且如果通过重组技术产生，其还基本上没有其他细胞物质或培养基，或者如果通过化学合成，其没有化学前体或其他化学物质。

可通过分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息分离本发明的核酸分子。例如，可使用具体公开的完整序列或其区段之一作为杂交探针和标准杂交技术从合适的cDNA文库中分离cDNA（例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述）。此外，可通过聚合酶链式反应，使用在该序列基础上构建的寡核苷酸引物分离包含所公开序列或其区段之一的核酸分子。以这种方式扩增的核酸可克隆到合适的载体中，并可通过DNA测序进行表征。也可通过标准的合成方法，例如使用自动DNA合成仪产生本发明的寡核苷酸。

例如可通过一般杂交技术或PCR技术从其他细菌，例如通过基因组或cDNA文库中分离本发明的核酸序列或其衍生物，这些序列的同源物或部分。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。

“杂交”表示多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下结合几乎互补序列的能力，然而在这些条件下非互补配偶体之间不会发生非特异性结合。为此，序列可以是90-100%互补的。能够特异性结合彼此的互补序列的性质可用于例如Northern Blotting或Southern Blotting或PCR或RT-PCR中的引物结合。

保守区的短寡核苷酸有利地用于杂交。然而，也可以使用本发明核酸的更长片段或完整序列用于杂交。这些标准条件根据所用的核酸（寡核苷酸、更长片段或完整序列）或哪种类型的核酸-DNA还是RNA用于杂交而变化。例如，DNA:DNA杂合体的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂合体的解链温度低大约10°C。

例如，根据特定的核酸，标准条件表示浓度在0.1到5x SSC(1X SSC=0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.2)之间的水性缓冲溶液中，42到58°C之间的温度，或此外在50%甲酰胺存在下，例如5x SSC,50%甲酰胺中42°C。有利地，DNA:DNA杂合体的杂交条件是0.1x SSC和约20°C到45°C之间的温度，优选约30°C到45°C之间的温度。对于DNA:RNA杂合体，杂交条件有利地是0.1x SSC和约30°C到55°C之间的温度，优选约45°C到55°C之间的温度。用于杂交的这些所述温度是在缺少甲酰胺下为长度约100个核苷酸和G+C含量50%的核酸计算的解链温度值的实例。用于DNA杂交的实验条件描述于相关的遗传学教科书中，例如Sambrook等,1989中，并可使用本领域技术人员已知的公式，例如根据核酸的长度、杂合体的类型或G+C含量进行计算。本领域技术人员可从以下教科书中获得关于杂交的其他信息：Ausubel等(编辑),1985,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York;Hames和Higgins(编辑),1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford;Brown(编辑),1991,Essential Molecular Biology:A Practical Approach,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford。

特别在严格条件下进行“杂交”。此类杂交条件例如描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,in:Molecular Cloning(A LaboratoryManual),第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第9.31-9.57页或Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。

“严格的”杂交条件具体表示：在50%甲酰胺、5x SSC(750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt溶液、10%葡聚糖硫酸酯和20g/ml变性剪切的鲑精DNA组成的溶液中42°C温育过夜，随后利用0.1x SSC在65°C下洗涤滤膜。

本发明还涉及具体公开的衍生物或可衍生的核酸序列。

因此，本发明的其他核酸序列可来自此处特别公开的序列，并通过添加、取代、插入或缺失单个或若干核苷酸而不同，并且其还编码具有想要的性质谱的多肽。

本发明还包括这样的核酸序列，其包含所谓的沉默突变或根据特定原始的或宿主生物的密码子使用，与具体说明的序列相比已经发生了改变，其还包含天然发生的变体，例如其剪接变体或等位变体。

其还涉及可通过保守核苷酸取代（即正在讨论的氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或可溶性的氨基酸替换）获得的序列。

本发明还涉及由于序列多态性来自具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性因自然变异存在于群体内的个体之间。这些自然变异一般在基因的核苷酸序列中产生1到5%的变异。

本发明核酸序列的衍生物表示例如等位变体，其在衍生的氨基酸水平上，在完整序列范围内具有至少60%同源性，优选至少80%同源性，非常尤其至少90%同源性（对于氨基酸水平上的同源性，参考上文为多肽给出的详细信息）。有利地，同源性在序列的部分区域上可以更高。

此外，衍生物也可理解为本发明核酸序列的同源物，例如动物、植物、真菌或细菌的同源物，缩短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，同源物在DNA水平上与此处特别公开的序列中给定的完整DNA区具有至少40%，优选至少60%，尤其优选至少70%，非常尤其优选至少80%的同源性。

此外，衍生物理解为例如与启动子的融合。可通过至少一个核苷酸交换，至少一个插入、倒位和/或缺失修饰添加到所述核苷酸序列中的启动子，却不损坏启动子的功能性或功效。此外，可通过改变其序列或者与甚至不同属生物的更有效启动子进行完全交换提高启动子的功效。

6.本发明的构建体

本发明还涉及表达构建体，其含有在调节性核酸序列遗传控制下的编码本发明多肽或融合蛋白质的核酸序列；以及包含至少一种这些表达构建体的载体。

根据本发明，“表达单元”表示具有表达活性的核酸，其包含如此处定义的启动子，并且与待表达的核酸或基因功能连接后调节表达，即该核酸或该基因的转录和翻译。因此在该上下文中，其也称为“调节性核酸序列”。除了启动子，存在其他调节元件，例如增强子。

根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”表示这样的表达单元，其功能连接待表达的核酸或待表达的基因。与表达单元相反，表达盒因此不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，还包含因转录和翻译表达为蛋白质的核酸序列。

在本发明的上下文中，术语“表达”或“过表达”描述了微生物中一种或多种酶的细胞内活性的产生或增加，所述酶由相应的DNA编码。为此，例如可以在生物体中插入基因，通过另一基因替换现有基因、增加基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，并任选地可组合这些措施。

优选地，本发明的此类构建体包含来自各编码序列5′-上游的启动子和3′-下游的终止子序列，并任选地包含其他一般调节元件，其在各情况下功能连接编码序列。

根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”表示功能连接待转录的核酸的核酸调节该核酸的转录。

在该上下文中，“功能的”或“有效的”连接表示例如具有启动子活性的核酸之一和待转录的核酸序列之一，和任选其他调节元件，例如使得核酸能够转录的核酸序列，和例如终止子以每一调节元件在核酸序列的转录中可执行其功能的方式顺序排列。这不必要化学意义上的直接连接。遗传控制序列，如增强子序列也可在靶序列上更远位置或甚至其他DNA分子上发挥其功能。优选这样的排列，其中待转录的核酸序列位于启动子序列后面（即在3′末端），以便两条序列彼此共价结合。启动子序列和待转基因表达的核酸序列之间的距离可以少于200bp（碱基对），或少于100bp或少于50bp。

除了启动子和终止子，可提及的其他调节元件的实例是靶向序列、增强子、多聚腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。

本发明的核酸构建体具体包含选自此处特别提及的那些或其衍生物和同源物的序列，以及可来自此处特别提及的氨基酸序列的核酸序列，其有利地与用于控制，例如增强基因表达的一种或多种调节信号有效地或功能地连接。

除了这些调节序列，实际结构基因前面仍然可存在这些序列的天然调节，并任选地被遗传改变，以便关闭自然调节并增强基因的表达。核酸构建体也可以是更简单的设计，即没有任何额外的调节信号插入到编码序列前面，并且不去除天然启动子及其调节。的确，沉默天然调节序列，以便不再发生调节，并且基因表达增强。

优选的核酸构建体还有利地含有上述增强子序列中的一种或多种，其功能连接启动子，允许核酸序列的增强表达。额外有利的序列，如其他调节元件或终止子也可插入到DNA序列的3′末端。构建体可含有一个或多种拷贝的本发明核酸。所述构建体还可含有其他标记，如抗生素抗性或营养缺陷型互补基因，任选地用于在构建体上进行选择。

合适的调节序列的实例包含在启动子中，如cos-,tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacI^q-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaP_BAD)SP6-、λ-P_R-或λ-P_L启动子，其可有利地用于革兰氏阴性细菌。其他有利的调节序列包含在例如革兰氏阳性启动子ace、amy和SPO2，酵母或真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人造启动子也可用于调节。

为了表达，将载体，例如质粒或噬菌体中的核酸构建体有利地插入宿主生物中，所述载体允许基因在宿主中进行最优表达。除了质粒和噬菌体，载体也理解为表示本领域技术人员已知的所有其他载体，例如病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒，和线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制，或可随染色体复制。这些载体代表了本发明的其他实施方案。

合适的质粒是，例如在大肠杆菌（E.coli）中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE 19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI；在诺卡氏菌形放线菌（nocardioformactinomycetes）中pJAM2；在链霉菌属（Streptomyces）中，pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；在芽孢杆菌属中，pUB110、pC194或pBD214；在棒杆菌属（Corynebacterium）中，pSA77或pAJ667；在真菌中，pALS1、pIL2或pBB116；在酵母中，2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或在植物中，pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述质粒代表了一小组可能质粒。其他质粒为本领域技术人员所熟知，并可见于例如教科书Cloning Vectors(编辑Pouwels P.H.等Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中。

在载体的其他实施方案中，含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体可以线性DNA的形式有利地插入微生物中并通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。该线性DNA可包含线性化的载体，如质粒或仅本发明的核酸构建体或核酸。

为了在生物中最优表达异源基因，根据在生物中使用的特异的密码子选择有利地改变核酸序列。可在正在讨论的生物的其他已知基因的计算机估计基础上容易地确定密码子选择。

本发明表达盒的产生基于合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子信号或多腺苷酸化信号的融合。为此使用常见的重组和克隆技术，例如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)和Ausubel,F.M.等,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所述。

将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异的载体中，用于在合适的宿主生物中表达，以允许基因在宿主中最优表达。载体为本领域技术人员所熟知，并将见于例如”Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等,Publ.Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中。

7.本发明所用的宿主

根据上下文，术语“微生物”表示本发明的初始微生物（野生型）或遗传改造的微生物，或两者。

根据本发明，术语“野生型”表示相应的初始微生物，并不必对应于天然发生的生物。

通过本发明的载体，可产生重组微生物，其已经转化了例如至少一种本发明的载体，并可用于产生本发明的多肽。有利地，将如上所述本发明的重组构建体插入到合适的宿主系统中并进行表达。优选地，使用本领域技术人员熟悉的常规克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以保证所述核酸在各表达系统中的表达。合适的系统描述于例如Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等,Publ.Wiley Interscience,New York 1997,或Sambrook等MolecularCloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中。

原则上，所有的原核生物均可认为是用于本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。细菌有利地用作宿主生物。优选地，它们选自天然的或重组的细菌，其具有产生PHA-、TAG-或WE-类型的包含体的能力，特别是产生TAG的诺卡氏菌形放线菌，特别是红球菌属（Rhodococcus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、诺卡氏菌属（Nocardia）、Gordonia、Skermania和冢村氏菌属（Tsukamurella ）属；以及产生TAG的链霉菌；产生WE的不动杆菌属（Acinetobacter）和Alcanivorax属；以及埃希氏菌属（Escherichia），尤其是大肠杆菌、棒杆菌属，尤其是谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）和芽孢杆菌属，尤其是枯草杆菌（B.subtilis）的重组菌株。

本发明的宿主生物或宿主生物然后优选地含有本发明描述的至少一种核酸序列、核酸构建体或载体，其编码上述定义的酶活性。

取决于宿主生物，以本领域技术人员熟悉的方式培养或培育本发明方法中使用的生物。一般而言，微生物培养在液体培养基中，0°C到100°C之间，优选10°C到60°C之间的温度，氧通气的情况下进行培养，所述液体培养基含有碳源，一般是蔗糖形式，氮源，一般是氮的有机来源形式，如酵母提取物或盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、锰和镁盐，和任选地维生素。液体营养培养基的pH可维持在固定值，即在生长过程中进行调整或不进行调整。可分批式、半分批式或连续进行培养。营养物可在发酵开始时供应或随后半连续或连续地供应。

8.重组产生本发明的酶

本发明还涉及通过培养表达所述蛋白质的微生物并从培养基中分离想要的产物产生本发明蛋白质的方法。

可在分批式方法或补料分批式或重复补料分批式方法中连续或不连续地培养本发明所用的微生物。已知的培养方法的综述将见于Chmiel(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag,Stuttgart,1991))的教科书或Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))的教科书中。

待使用的培养基必须以适当方式满足特定菌株的需要。在参考书"Manual of Methods for General Bacteriology"of the American Societyfor Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)中给出了用于多种微生物的培养基的说明。

根据本发明使用的这些培养基一般包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可通过复杂化合物，如糖蜜，或来自糖精炼的其他副产物将糖加入到培养基中。也可有利地添加多种碳源的混合物。其他可能的碳源是油和脂肪，如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸或亚麻酸，醇如甘油、甲醇或乙醇，和无机酸如乙酸或乳酸。

氮源一般是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源，如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏和其他。氮源可单独使用或作为混合物使用。

可以存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。

无机含硫的化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，还有有机硫化合物，如硫醇和巯基化合物可用作硫源。

磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作磷源。

可向培养基中加入螯合剂，以保证金属离子保持在溶液中。尤其合适的螯合剂包含二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸，或无机酸，如柠檬酸。

本发明使用的发酵培养基也可以含有其他生长因子，如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和维生素b6。生长因子和盐通常来自培养基的复杂组分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，合适的前体可加入到培养基中。培养基中化合物的精确组成强烈地依赖于特定实验，并且必须根据各种特定情形分别决定。培养基优化的信息可见于教科书"Applied Microbiol.Physiology,A PracticalApproach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL Press(1997)第53-73页,ISBN 0199635773)。生长培养基还可从商业供应商，如Standard 1(Merck)或BHI(Brain heart infusion,DIFCO)等获得。

通过加热（1.5巴和121°C下20分钟）或通过无菌过滤将培养基的所有组分灭菌。所述组分可一起灭菌，或需要时单独灭菌。培养基的所有组分可在培养开始时存在，或任选地可以连续加入或补料分批式加入。

培养的温度通常在15°C到45°C之间，优选在25°C到40°C之间，并保持恒定，或在实验过程中改变。培养基的pH值应在5到8.5的范围内，优选在7.0左右。可通过添加碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物，如磷酸或硫酸在培养过程中控制用于培养的pH值。消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制起泡。为了维持质粒的稳定性，具有选择作用的合适物质，例如抗生素可加入到培养基中。氧气或含氧的气体混合物，例如环境空气加入到培养基中，以维持需氧条件。培养的温度通常是从20°C到45°C。连续培养，直至已经形成想要产物的最大值。这通常在10小时到160小时内达到。

可任选地通过高频率超声，通过高压，例如在弗氏细胞压碎器中，通过渗透裂解（osmolysis）、通过去污剂、裂解酶或有机溶剂的作用，通过匀浆器或通过所列若干方法的组合破碎细胞。

9.反应条件

在产生单酰基化多元醇的方法过程中存在的至少一种酶可存在于天然或重组产生一种或多种酶的活细胞、收获的细胞、死细胞、透化细胞、细胞粗提物、纯化的提取物或基本纯或完全纯的形式中。至少一种酶可存在于溶液中或作为固定在载体上的酶。一种或若干酶可同时以可溶性和固定化形式存在。

本发明的方法可在本领域技术人员所知的常规反应器中进行，并且以不同规模，例如从实验室规模（几毫升到几十升的反应体积）到工业规模（几升到数千立方米的反应体积）。如果以无活性，任选透化的细胞包被的形式，或多或少纯化细胞提取物的形式或纯化的形式使用脂肪酶，那么可以使用化学反应器。化学反应器一般允许控制至少一种酶的量、至少一种底物的量、pH、温度和反应介质的循环。当活细胞中存在至少一种酶时，方法会是发酵。在这种情况下，生物催化产生将在生物反应器（发酵罐）中发生，其中可控制活细胞合适的生活条件所必须的参数（例如，具有营养物的培养基、温度、通气、氧气或其他气体的存在或缺失、抗生素等）。本领域技术人员熟悉化学反应器或生物反应器，例如熟悉用于将化学或生物技术方法从实验室规模增大到工业规模，或优化方法参数的方法，其也广泛地描述于参考文献中（对于生物技术方法，参阅例如Crueger undCrueger,Biotechnologie–Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie,第2版,R.Oldenbourg Verlag,München,Wien,1984）。

可通过物理或机械方法，如超声或射频脉冲、弗氏细胞压碎器，或化学手段，如低渗培养基、培养基中存在的分解酶和去污剂或这些方法的组合来透化含有至少一种脂肪酶的细胞。去污剂的实例是洋地黄皂甙、正－十二烷基麦芽苷、辛基糖苷、X-100、

20、脱氧胆酸盐、CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)、

P40(乙基酚聚乙二醇醚)等。

如果固定至少一种酶，那么其附着到惰性载体上。合适的载体材料为本领域所知，并例如公开于EP-A-1149849、EP-A-1 069 183和DE-OS100193773以及其中引用的参考文献中（其所有参考文献特异地包括载体材料方面）。合适载体材料的实例是粘土、粘土矿物如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、矾土、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换物质、合成聚合物，如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃，如聚乙烯和聚丙烯。为了制备载体结合的酶，一般以细粉形式使用载体材料，其中优选多孔形式。载体材料的颗粒大小一般不超过5mm，特别不超过2mm。在至少一种酶存在于完整细胞制剂的情况下，所述完整细胞制剂可以游离或固定化形式存在。合适的载体材料是例如Ca-藻酸盐或角叉藻聚糖。酶和细胞可通过戊二醛直接连接。多种固定化方法为本领域所知(例如J.Lalonde和A.Margolin，Immobilization of Enzymes“in K.Drauz und H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,卷III,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim)。

可分批式、半分批式或连续进行转化反应。可在反应开始时或随后半连续或连续地供应反应物（任选地营养物）。

可在水性或非水性反应培养基中进行反应。

水性培养基可含有合适的缓冲液，以调整pH至5到9，例如6到8的范围。

非水性培养基可基本不含水，即含有少于约1wt.-%(重量百分比)或0.5wt.-%的水。

具体而言，在有机非水性培养基中进行本发明的方法。作为合适的有机溶剂，可提及具有例如5到8个碳原子的脂肪族碳水化合物，像戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷、卤化的脂肪族碳水化合物，像二氯甲烷、氯甲酸酯、CCl₄、二氯乙烷或四氯乙烷、芳族碳水化合物，像苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯，脂肪族非环状醚和环状醚，像二乙醚、甲基-叔-丁醚、乙基-叔-丁醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、四氢呋喃或酯，像乙酸乙酯或正乙酸丁酯或酮像甲基异丁基甲酮或二

烷或其混合物。

特别有用的是溶剂，其也作为反应剂起作用，像酰基供体乙酸乙酯。

反应剂的浓度可适合于最佳反应条件，其依赖于所应用的特定酶。例如，初始底物浓度可以在0.01到0,5M，例如10到100mM范围内。

适当时，可以摩尔过量使用一种反应剂，例如酰基供体，以将反应平衡转移到产物一侧。

反应温度可适应于最佳反应条件，其依赖于所应用的特定酶。例如，可在0到70°C，例如20到50或25到40°C的温度范围内进行反应。反应温度的实例是约30°C、约35°C、约40°C、约45°C、约50°C、约55°C和约60°C。

反应可进行，直至在底物和产物之间实现平衡，但也可提前终止。通常的反应时间在1分钟到25小时，特别是10分钟到6小时的范围内，例如在从1小时到4小时，特别是1.5小时到3.5小时范围内。

10.产物分离

本发明的方法可进一步包括回收酰基化产物的步骤，所述产物任选地是立体异构或对映体异构基本纯的形式。术语“回收”包括从培养基或反应培养基中提取、收获、分离或纯化化合物。可根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法回收化合物，所述方法包括但不限于利用常规树脂（例如，阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等）进行处理、用常规吸附剂（例如，活性碳、硅酸、硅胶、纤维素、矾土等）进行处理、改变pH、溶剂提取（例如利用常规溶剂，如醇、乙酸乙酯、己烷等）、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调节、冻干等。

可通过已知技术测定所分离产物的身份和纯度，所述技术如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、Spektroskopy(像IR、UV、NMR)、显色方法、TLC、NIRS、酶或微生物测定(参阅例如:Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32;und Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.19:67-70.Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)Bd.A27,VCH:Weinheim,S.89-90,S.521-540,S.540-547,S.559-566,575-581und S.581-587;Michal,G(1999)Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology,John Wiley and Sons;Fallon,A.等(1987)Applications of HPLCin Biochemistry in:Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology,Bd.17.)。

以下实施例仅用于说明本发明。本领域技术人员显而易见的许多可能变型也落入本发明范围。

实验部分

A.材料和方法

1.酶固定化

使用5g Accurel<1500微米MP1000/pp粉剂。粉剂浸泡在95%乙醇中5天。再次在新鲜乙醇中洗涤粉剂，在温育前将所述乙醇去除。加入21ml T40A突变的CALB，其大约浓度为2.7mg/ml，溶解在100mM PO₄缓冲液,pH 7.2中。

将来自巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）培养的含酶上清液浓缩到3g/l蛋白质浓度。pH调整至7.5。在每升酶溶液中加入100g Resindion DiaoinHP 20L珠子。浆液在振荡下温育4小时。然后过滤掉固体并在微弱气流中干燥。

对于T40V突变的CALB，使用5g Accurel<1500微米MP1000/pp粉剂。粉剂在95%乙醇中浸泡大于1小时，然后利用新鲜的乙醇洗涤。用缓冲液100mM K_xH_yPO₄,pH 7.2洗涤粉剂，在固定前去除乙醇。70ml的蛋白质溶液浓度大约为30-50mg/l。固定溶液置于

KS基础摇床上，80rpm，4°C下3天。过滤掉上清液并通过真空歧管添加3x100ml的50mM NH₄Ac(pH7)洗涤珠子。因为其蒸发，使用50mM NH₄Ac，以便珠子上不残留大量的盐。

2.用于分析不同组分的GC参数

2.1乙二醇

进口温度设置为200°C，检测器温度设置为270°C。温度程序开始为40°C，5分钟，然后是10°C/分钟的梯度至200°C，其中在最后10分钟温度保持恒定。

2.21,3-丙二醇

进口和检测器的温度均设置为200°C。温度程序开始为40°C，5分钟，然后是5°C/分钟的梯度至160°C，再然后是10°C/分钟的梯度至200°C，其中在最后5分钟温度保持恒定。

2.31,4-丁二醇

关闭进口温度并将检测器温度设置为270°C。温度程序开始为30°C，5分钟，然后是2°C/分钟的梯度至40°C，再然后是10°C/分钟的梯度至200°C，其中在最后5分钟温度保持恒定。

2.42-甲基-1,3-丙二醇和2-苯基-1,3-丙二醇

关闭进口温度并将检测器温度设置为270°C。温度程序开始为40°C，5分钟，然后是10°C/分钟的梯度至200°C，其中在最后10分钟温度保持恒定。

2.51,2-乙二醇和1,4-丁二醇

如实施例5、6或7中所述，以下参数用于突变体和测定。进口温度设置为200°C，检测器温度设置为200°C。温度程序开始为40°C，5分钟，然后是10°C/分钟的梯度至200°C，其中在最后10分钟温度保持恒定。

2.61,4-丁二醇、丙烯酸丁酯和丁二醇二丙烯酸酯

如实施例8和9中所述，以下参数用于突变体和测定。进口温度设置为220°C，检测器温度设置为225°C。温度程序开始为50°C，5分钟，然后是10°C/分钟的梯度至290°C，其中在最后10分钟温度保持恒定。

B.实施例：

实施例1：制备CALB野生型和T40A及T40V突变体和固定化

根据先前定义的方案从早期实验的内部生产中获得野生型和T40A突变的CALB[Magnusson,A.,K.Hult,和M.Holmquist,Creation of anenantioselective hydrolase by engineered substrate-assisted catalysis.Journalof the American Chemical Society,2001.123(18):第4354-4355页.Rotticci-Mulder,J.C.,等,Expression in Pichia pastoris of Candidaantarctica lipase B and lipase B fused to a cellulose-binding domain.ProteinExpression and Purification,2001.21(3):第386-392页.]。

用于T40A突变的CALB的引物是

5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’(SEQ ID NO:5)和

5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO:6)

使用从早期研究中获得的pGAPZαB CALB构建体制备T40A突变的CALB[Larsen M.W.,等,Expression of Candida antarctica lipase B inPichia pastoris and various Escerichia coli systems,Protein Expression andPurification,2008,62(1):第90-97页]。

25ng模板与100ng的引物一起使用

5’-CCCATCCTTCTCGTCCCCGGAGTCGGCACCACAGGTCCA-3’(SEQ ID NO:7)和

5’-GTCGAACGACTGTGGACCTGTGGTGCCGACTCCGGGGAC-3’(SEQ ID NO:8)。

在PCR反应中使用6%DMSO。反应在98°C进行1分钟，25个循环的98°C，10秒钟，60°C，50秒钟，和72°C，3分钟。用FastDigest DpnI消化模板DNA。用3μl的诱变反应混合物转化来自Stratagene的大肠杆菌菌株XL 10 GOLD感受态细胞。通过DNA循环测序利用BigDye-terminators测序来验证突变。使用QIAprep Spin Miniprep Kit提取质粒，并利用来自Fermentas的FastDigest AvrII将其线性化。根据手册:pGAPZ A、B、C和pGAPZαA、B、C使用BIORAD Gene Pulser通过电穿孔完成来自invitrogen的巴斯德毕赤酵母（Picchia pastoris）X33的转化。通过在10ml培养基BMGY(在1L水中含有10g酵母提取物、20g蛋白胨、100mL 1M K₂HPO₄/KH₂PO₄pH 6.0每升、13.4g无氨基酸含硫酸铵的酵母氮碱(YNB)、0.4mg生物素和10mL甘油)中接种单细胞菌落完成培养，所述接种的菌落在30°C下260rpm轨道振荡下培养。然后将500μl用于接种5l摇瓶中的0.5l BMGY。在30°C下260rpm轨道振荡3天完成培养。通过在Sorvall Super T21离心机上离心并去除细胞沉淀完成收集。

在重组酵母巴斯德毕赤酵母中完成蛋白质表达。

通过疏水性相互作用层析，然后通过凝胶过滤完成野生型和T40ACALB的纯化。先前确定的方案用于纯化野生型和T40ACALB[Rotticci-Mulder,J.C.,等,Expression in Pichia pastoris of Candidaantarctica lipase B and lipase B fused to a cellulose-binding domain.ProteinExpression and Purification,2001.21(3):第386-392页.]。通过离子交换层析纯化T40V CALB。遵循方案[Trodler P.等,Rational design of a one-steppurification strategy for Candida Antarctica lipase B by ion exchangechromatography.Journal of Chromatography A 20081179(2)第386-392页]，除了通过透析而非交叉流过滤进行缓冲液的交换。用0.5l过滤的培养基填充来自

的透析袋，其具有分子量截留14,000Da的透析膜。用4x1.5l缓冲液,10mM甲酸钠,10mM柠檬酸钠和10mM乙酸钠,pH 3.0平衡培养基，其用于离子交换层析。使用在连接

探测器的16/20柱中填充的7ml Source 15S基质完成纯化。

将酶固定在Accurel MP1000载体珠上（参阅一般方法，上文）、干燥并在饱和的氯化锂中平衡。可通过在氯化锂上分选酶一些天完成水活性的平衡。因为适合于在这种环境中储存固定化的CALB更长时间以防止丧失活性，该T40A和野生型CALB已经在氯化锂中储存了3-4年。T40VCALB在使用前在氯化锂中储存了3天。

通过活性位点滴定，使用抑制剂4-甲基伞形酮基己基膦酸甲酯验证装载在载体上的酶的量。将储存在冰箱(-20°C)中安瓿中的抑制剂溶解到在乙腈中50μM的浓度。抑制剂为先前合成并用于CALB的活性位点滴定，如Magnusson,A.O.,等,Creating space for large secondary alcohols byrational redesign of Candida antarctica lipase B.Chembiochem,2005.6(6):第1051-1056页和Rotticci,D.,等,An active-site titration method for lipases.Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids,2000.1483(1):第132-140页中所述。

在各自含有具有固定化的CALB野生型和T40A突变体的50mg酶载体珠的三个分离的瓶中进行抑制反应。野生型在一个反应瓶中进行，其他两个含有TA40A突变体。酶在溶解于乙腈中的1ml 50μM抑制剂中温育。将各瓶封闭并用铝箔纸覆盖，以防止光破坏荧光团，并持续翻转储存。2、5和9天后取出等分试样。每一等分试样含有来自温育的100μl反应溶液，其分散在Perkin Elmer 10/4mm夸脱比色杯中900μl缓冲液(100mM Tris,1mM CaCl₂,pH 8.0)中。使用Perkin Elmer LS 50B荧光计通过荧光进行分析。激发和发射波长分别是360nm和445nm。在两个不同对照样品中也测量了荧光。乙腈中的50μM抑制剂在没有酶的情况下温育，用于控制来自4-甲基伞形酮基己基膦酸甲酯自然水解的背景荧光。除了这些，50mg的各种酶在乙腈中没有抑制剂的情况下温育，用于控制来自固定化酶的任何背景荧光。从抑制反应中测量的荧光中除去来自这些样品的总荧光。相同的方法用于固定的CALB T40V的活性位点滴定。抑制两周后获得样品并进行测量，显示低水平的抑制。

抑制后测定剩余活性。固定的酶在1ml乙腈中洗涤，并在饱和的LiCl中储存3天。含有100mM 1-丁醇（≥99,5%来自Riedel-

）、20mM癸烷（≥98%来自Fluka）和溶解在MTBE（99,5%，来自Labscan）中的1M丁酸乙烯酯（≥99%来自Fluka）的溶液用作活性测定的反应溶液。向被抑制的酶中加入4ml反应溶液。为了比较，利用酶重复反应，用于控制背景荧光。调整用于活性测定的酶的量，以防止底物的高度转化，其可影响反应速率。用于反应的被抑制的固定化酶是19mg野生型和20mgT40A。从用于反应的荧光对照获得的固定化酶的量是2.8mg野生型和9.0T40A。在50到350秒之间的反应时间上从各反应中获得5等分试样。在分析部分如上文定义在GC上进行分析。

活性测定显示83%的野生型和21%的T40A突变体被抑制。剩余活性太低以至于无法测量CALB T40A。考虑到这些活性，对于T40A突变体，每克载体珠子固定4.6mg活性酶，而对于野生型，每克载体珠子固定12mg酶。固定的活性CALB T40V的量为每克载体珠子大约0.3mg。

实施例2：利用不同二元醇作为底物和乙酸乙酯作为酰基供体的酶催化酰基化反应

利用三种不同的直链伯二元醇进行反应：

1,2-乙二醇，≥99.5%来自MERCK，

1,3-丙二醇，98%来自Aldrich和

1,4-丁二醇，≥99%来自Aldrich。

此外，利用具有不同取代的1,3-丙二醇进行反应：

2-甲基-1,3-丙二醇和

2-苯基-1,3-丙二醇，

3-己酮（≥98%来自Aldrich）用作内标。

各二元醇与乙酸乙酯（≥99%，来自Fluka，其用作酰基供体和溶剂）中5mM的3-己酮一起溶解到20mM的浓度。通过向装载了野生型或T40A突变的CALB的20mg酶载体珠子中加入4ml反应溶液开始反应。在HLC旋转热块上29°C下进行反应。取50μl等分试样，通过巴斯德吸管中的绒棉过滤并在分析前利用50μl乙酸乙酯稀释。用作内标的3-己酮在整个反应和分析过程中存在于反应溶液中。

5mM 3-己酮在反应混合物中与20mM二元醇一起用作内标。在反应过程中通过取50μl反应样品获得等分试样。样品与50μl乙酸乙酯一起通过绒棉过滤，由此去除任何剩余的酶，并在分析前将反应样品稀释2倍。

利用100mg酶载体珠子重新进行T40A突变体催化的反应，用于测定最大单酯产量。在100mM浓度的二元醇和50mg的酶载体珠子下利用CALB野生型和CALB T40A突变体重新进行利用2-甲基-1,3-丙二醇和2-苯基-1,3-丙二醇的反应。完成所述反应，以测定对映体过量。

在GC，Hewlett Packard 5890系列II上分析所有反应。根据不同的底物和所分析的产物，使用两种不同的25m x 0,32mm WCOT融合的二氧化硅柱。具有CP Chirasil-Dex CB涂层的极性GC柱用于利用1,2-乙二醇和1,3-丙二醇的反应。具有CP-SIL 5CB涂层的非极性GC柱用于利用1,4-丁二醇、2-甲基-1,3-丙二醇和2-苯基-1,3-丙二醇的反应。

针对3-己酮测定各二元醇的响应因子。当所有的二元醇和单酯已经转化成二酯时，可针对癸烷测定二酯的响应因子。通过从二元醇的初始浓度中减去二酯的浓度测定各反应中单酯的浓度。

实施例3：利用不同二元醇作为底物和丁酸乙烯酯作为酰基供体的酶催化酰基化反应

利用两种不同的二元醇进行反应：

1,4-丁二醇，≥99%来自Aldrich。

2-甲基-1,3-丙二醇。

各二元醇在MTBE（99.5%，来自Lab-Scan）中与2mM的癸烷（≥98%，来自Fluka）和200mM丁酸乙烯酯（>99%，来自Fluka）一起溶解到10mM的浓度，所述MTBE用作酰基供体和溶剂。通过向装载了野生型或T40A突变的CALB的20mg酶载体珠子中加入4ml反应溶液开始反应。在HLC旋转热块上29°C下进行反应。取50μl等分试样，通过巴斯德吸管中的绒棉过滤并在分析前利用50μl乙酸乙酯稀释。用作内标的癸烷在整个反应和分析过程中存在于反应溶液中。

在GC，Hewlett Packard 5890系列II上分析所有反应。25m x 0,32mmWCOT融合的二氧化硅非极性GV柱（其具有CP-SIL 5CB涂层）用于反应。

针对癸烷测定各二元醇的响应因子。当所有的二元醇和单酯已经转化成二酯时，可针对癸烷测定二酯的响应因子。通过从二元醇的初始浓度中减去二酯的浓度测定各反应中单酯的浓度。

实施例4：利用不同二元醇作为底物与1-丁醇竞争的酶催化酰基化反应

利用两种不同直链伯二元醇进行反应：

1,2-乙二醇，≥99.5%来自MERCK，

1,4-丁二醇，≥99%来自Aldrich。

此外，1-丁醇，≥99.5%来自Riedel-de

用作竞争底物。

25mM癸烷，≥98%来自Fluka，用作内标。

使用两种不同的酰基供体：

乙酸乙酯，≥99%来自Fluka，用作溶剂和酰基供体

1M丁酸乙烯酯（≥99%，来自Fluka）与MTBE（99.5%，来自Lab-Scan）用作溶剂。

各二元醇与25mM的癸烷一起在乙酸乙酯（≥99%来自Fluka）中溶解到100mM的浓度，所述乙酸乙酯用作酰基供体和溶剂。通过向装载有野生型CALB的10mg酶载体珠子或装载有T40A突变的CALB的20mg载体珠子加入3ml反应溶液开始反应。在由HETO恒温器偶联Bom-roerder组合温度浴和磁力搅拌器组成的温度浴中在29°C下进行反应。25mM癸烷用作内标，其在整个反应和分析的过程中存在于反应溶液中。取60μl等分试样，在分析前通过巴斯德吸管中的绒棉与540μl乙酸乙酯一起过滤。通过绒棉过滤从反应溶液中去除任何剩余的酶，并在分析前将反应样品稀释10倍。

在GC，Hewlett Packard 5890系列II上分析所有反应。根据不同的底物和所分析的产物，使用两种不同的25m x 0,32mm WCOT融合的二氧化硅柱。具有CP Chirasil-Dex CB涂层的极性GC柱用于利用1,2-乙二醇的反应。具有CP-SIL 5CB涂层的非极性GC柱用于利用1,4-丁二醇的反应。

实施例5：制备CALB A282L突变体和固定化

从早期实验的内部生产中获得冰冻干燥的A282L突变的CALB[Z.Marton,V.Léonard-Nevers,P.-O.Syrén,C.Bauer,S.Lamare,K.Hult,V.Tranc和M.Graber,Mutations in the stereospecificity pocket and at theentrance of the active site of Candida antarctica lipase B enhancing enzymeenantioselectivity.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic]。

从基于结构的酶改造提出A282L。用于引入突变的引物对是5’-CCTGGCGCCGGCATTGGCAGCC-3’(SEQ ID NO:9)，和相应的反向互补序列：5’-GGCTGCCAATGCCGGCGCCAGG-3’(SEQ ID NO:10)。

携带该突变的酶显示出增强的选择性后，位置282进行饱和诱变。对于饱和诱变，使用通用形式表示的引物5’-CTGGCGCCGGCGNNNGCAGCCAT-3’(SEQ ID NO:11)

和5’-ATGGCTGCNNNCGCCGGCGCCAG-3(SEQ ID NO:12)，其中N代表A、T、C或G。因此，NNN代表随机使用任何可能的密码子三联体，因为在PCR中使用相应的引物混合物。挑取900个转化阳性菌落，以微量滴定板规模培养并表达各蛋白质。在转酯反应丙烯酸乙酯+丁二醇中的筛选选择性显示位置282对于二元醇转酯作用中的选择性是重要的。

如上指出通过饱和诱变在位置282上产生所有的突变。挑取10个微量滴定板（其包括8个对照孔（野生型(WT)，空巴斯德毕赤酵母X33的表达））各自的阳性转化体。通过加入甲醇诱导酶表达。将细胞和上清液冷冻干燥。冷冻干燥的沉淀用于转酯测定中。GC用于检测反应产物。

对于构建突变体I285F，使用以下引物对：

正向引物：5’-GCAGCCTTTGTGGCG-3’(SEQ ID NO:13)

反向引物：5’-CGCCACAAAGGCTGC-3’(SEQ ID NO:14)

通过以下引物对同时引入双突变A282L/I285F：

正向引物：5’-CCGGCGCTTGCAGCCTTTGTGGCGGGTCCAAAG-3’(SEQ ID NO:15)

反向引物：5’-CTTTGGACCCGCCACAAAGGCTGCAAGCGCCGG-3’(SEQ ID NO:16)

使用引物

正向：5’-GCTCTCTGCGCCGGC-3’(SEQ ID NO:17)

反向：5’-GCCGGCGCAGCGACG-3’(SEQ ID NO:18)，

首先通过分别引入L278S突变体并将其加入到A282L突变体中制备双突变体L278S/A282L。

如上描述的约2mg冷冻干燥的A282L CALB或其他突变体溶解在10ml100mM K_xH_yPO₄,pH 7.0中。根据A.材料和方法，1.酶固定化下描述的一般方案在1g的Accurel珠子上固定酶，以下除外：固定化溶液在室温下保持翻转24小时。固定后，利用NH4Ac洗涤并干燥，酶珠子在室温下50ml10mM MOPS,pH 7.5中再翻转洗涤24小时。珠子在真空下干燥过夜并在氯化锂中保存。

如为T40A和野生型CALB所述，通过活性位点滴定分析珠子上装载的酶的量。证实了0.17%(w/w)的酶装载。

实施例6：制备CALB A281V和A281E突变体和固定化

通过重叠延伸PCR，使用从早期研究中获得的pET22b+载体制备A281V和A281E突变的CALB变体[Larsen M.W.,等,Expression ofCandida antarctica lipase B in Pichia pastoris and various Escerichia colisystems,Protein Expression and Purification,2008,62(1):第90-97页]。在第一步中，为A281V和A281E突变的CALB进行正向和反向PCR反应。对于正向反应，对A281V变体使用反向Not引物与5’-CGGCTGCGCTCCTGGCTCCTGTAGCTG-3’(SEQ ID NO:19)，对A281E变体使用Not引物与5’-CGGCTGCGCTCCTGGCTCCTGAGGCTG-3’(SEQ IDNO:21)。对于反向反应，对A281V变体使用正向NocI引物与5’-CTGCAGCTACAGGAGCCAGGAGCGCAG-3’(SEQ ID NO:20)，对A281E变体使用正向NocI引物与5’-CAGCCTCAGGAGCCAGGAGCGCAGCCG-3’(SEQ ID NO:22)。为A281V和A281E突变的CALB进行第二次PCR。1μl正向和1μl反向反应物与正向NcoI和反向Not引物一起使用。PCR温度程序对于两个步骤是相同的，98°C，30s,30个循环（98°C，10s，65°C，15s和72°C，20s）和72°C，5分钟。正向NcoI和反向Not引物来自Thermo Scientific。使用来自Fermentas的FastDigest限制酶NotI和NcoI消化PCR产物和pET22b+。在1%琼脂糖凝胶上纯化PCR产物和线性化的pET22b+，并使用来自QIAGEN的QIAquick GelExtraction Kit进行提取。使用来自Fermentas的T4DNA连接酶将PCR产物连接回到线性化的pET22b+中。在室温下完成温育1小时20分钟。利用连接溶液转化电感受态Rosetta菌株大肠杆菌（Escherichia coli）细胞。向细胞中加入1μl含有A281V CALB的溶液和0.5μl含有A281E CALB的溶液。通过Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)测序验证突变。

根据使用大肠杆菌Rosetta菌株的周质表达CALB的预定方案完成蛋白质的表达和纯化[Larsen M.W.,等,Expression of Candida antarcticalipase B in Pichia pastoris and various Escerichia coli systems,ProteinExpression and Purification,2008,62(1):第90-97页]。使用来自GEhealthcare的PD-10柱将纯化的酶进行缓冲液交换。将缓冲液换成10mMMOPS,pH7.2，其用作固定缓冲液。

对于A281V和A281E突变的CALB，分别使用1.5g和2g Accurel酶载体珠子。固定之前，珠子在95%乙醇中洗涤2小时并然后在新鲜乙醇中洗涤。利用3x10ml固定缓冲液，10mM MOPS,pH 7.2将乙醇洗掉。在10ml 10mM MOPS,pH 7.2中完成固定溶液，在室温下保持翻转过夜。

通过活性位点滴定不能分析装载在珠子上的酶的量，所述量太低。在固定前后利用溶液样品，通过考马斯染色的凝胶验证A281V和A281ECALB的固定化。

实施例7：测定A282L、A281V和A281E的酶选择性和特异性

利用两种不同直链伯二元醇：1,2-乙二醇（≥99.5%来自MERCK）和1,4-丁二醇（≥99%来自Aldrich）进行反应，所述反应使用如实施例5和实施例6中描述的CALB突变体。使用两种不同的酰基供体：乙酸乙烯酯（≥99%来自Fluka）和丁酸乙烯酯（>99%来自Fluka）。癸烷（≥99%来自Fluka）用作内标。MTBE（99.5%来自Lab-Scan）用作溶剂。

各二元醇与MTBE中的1M酰基供体和20mM癸烷一起溶解到100mM的浓度。通过向特定量的酶载体珠子中加入3ml反应溶液开始反应。不同量的酶载体珠子用于不同反应。对于利用1,2-乙二醇和乙酸乙烯酯的反应，使用19.7mg野生型、22.5mg A282L、50.5mg A281V和45.5A281ECALB。对于利用1,2-乙二醇和丁酸乙烯酯的反应，使用19.3mg野生型、19.7mg A282L、40.5mg A281V和40.6A281E CALB。对于利用1,4-丁二醇和乙酸乙烯酯的反应，使用17.6mg野生型、22.5mg A282L、69mgA281V和54A281E CALB。对于利用1,4-丁二醇和丁酸乙烯酯的反应，使用20.3mg野生型、25.4mg A282L、52.2mg A281V和53A281E CALB。通过磁力搅拌器在反应瓶中均匀分布酶。所述瓶子在反应过程中保持在29°C水浴中用于温控。取10μl的等分试样，通过巴斯德吸管中的绒棉过滤并在分析前利用90μl MTBE稀释。用作内标的癸烷在反应和分析过程中存在于反应溶液中。

20mM癸烷在反应混合物中与100mM二元醇一起用作内标。通过获取10μl反应样品在反应过程中获得等分试样。样品与90μl MTBE一起通过绒棉过滤，由此去除任何剩余的酶，并将反应样品在分析前稀释10倍。

利用更高量的酶载体珠子重新进行A281V突变体催化的反应，以检测选择性测定。对于利用1,2-乙二醇和乙酸乙烯酯的反应，使用具有A281VCALB的121mg珠子。对于利用1,2-乙二醇和丁酸乙烯酯的反应，使用具有A281V CALB的122.9mg珠子。对于利用1,4-丁二醇和丁酸乙烯酯的反应，使用具有A281V CALB的127.8mg珠子。

在GC,Hewlett Packard 5890系列II上分析所有的反应。根据不同的底物和所分析的产物，使用两种不同的25m x 0,32mm WCOT融合二氧化硅柱。具有CP Chirasil-Dex CB涂层的极性GC柱用于利用1,2-乙二醇的反应。具有CP-SIL 5CB涂层的非极性GC柱用于利用1,4-丁二醇的反应。针对癸烷测定各二元醇的响应因子。当所有的二元醇和单酯已经转化成二酯时，可针对癸烷测定二酯的响应因子。通过从二元醇的初始浓度中减去二酯的浓度确定各反应中单酯的浓度。

实施例8：微型反应器规模的酶促催化

在750ml微型工程反应器中利用酶柱上的水流循环和柱子(50ml柱子)上部分水流作为稳定剂检查丁二醇和丙烯酸乙酯向4-羟基丁基丙烯酸酯(4-HBA,丁二醇单丙烯酸酯)和丁二醇二丙烯酸酯(BDDA)的酶促转化。

使用3.75g固定的CALB(

435,此处也称为Novo 435或Novo435;Novozymes A/S,Denmark)或A282L（如实施例5中制备并根据在材料和方法中描述的方法在Diaion HP 20L上固定，蛋白质装载：3%）、50.0g 1,4-丁二醇(0.555摩尔)和555.7g丙烯酸乙酯(5.55摩尔)，产生1:10摩尔比的丁二醇：丙烯酸乙酯。反应混合物的总重量是0.606kg。包括200ppm氢醌单甲醚(MeHQ,121mg)和200ppm吩噻嗪(121mg)作为稳定剂。将离析物填充到反应器中。允许反应混合物经过固定化的酶之前，将反应混合物在100毫巴(100hPa)加热到回流。在多个时间点上获取样品，并通过气相层析进行分析（50°C到290°C温度增加的梯度：10°C/分钟，注射温度：220°C）。

实施例9：底物转化和产物过量对流速的依赖性

为了测定多种流速对底物转化和产物过量的影响，使用附着到Desaga泵和Ministat上的49ml总体积的双层玻璃外壳珠（加热部分的体积:26ml，含酶部分的体积：23ml，酶材料的填充高度：167mm）。用实施例8中描述的CALB Novo 435或4.4g CALB A282L（在Diaion HP 20L上固定，3%蛋白质装载）填充柱子。反应混合物包含90.0g(1.0摩尔)1,4-丁二醇和1400g(14摩尔)丙烯酸乙酯。以在10ml/h到1000ml/h范围内的流速操作反应器，根据流速，流过135–280ml反应混合物后取得样品，通过实施例8中所述的气相层析进行分析。

实施例10：测定A282T、A282C、A282P、A282I、A282D、A282V、A282M、A282R、I285、A282L/I285F和L278S/A282L的酶选择性和特异性

50ml Duran玻璃瓶中300mg或另一特定量的各酶（在HP20L载体上）与440μl 1,4-丁二醇、5,4ml丙烯酸乙酯和2g分子筛(0,5nm)在40°C下振荡水浴中(200rpm)一起温育。在2、4、6、24和48小时时取样品。在气相层析之前，将160μl样品和240μl二

烷混合并过滤。

C．结果：

实施例2的结果：利用不同二元醇作为底物和乙酸乙酯作为酰基供体的酶促酰基化反应

表1.最大单酯产量：

物质	T40A	WT
			1,2-乙二醇	77%	43%
1,3-丙二醇	50%	33%
			1,4-丁二醇	49%	25%
2-Me-1,3-丙二醇	55%	42%
			2-Ph-1,3-丙二醇	55-65%	52%

表2.3:1的转化（单酯：二酯）

物质	T40A	WT
			1,2-乙二醇	99%	17%
1,3-丙二醇	22%	19%
			1,4-丁二醇	64%	<5%
2-Me-1,3-丙二醇	55%	30%
			2-Ph-1,3-丙二醇	>95%	46%

表3.9:1的转化（单酯：二酯）

物质	T40A	WT
			1,2-乙二醇	78%	<9%
1,3-丙二醇	19%	10%
			1,4-丁二醇	26%	<5%

表1-3显示了野生型和T40A突变的CALB之间相对于单酯针对二醇的选择性上的差异。在溶解在乙酸乙酯中20mM初始浓度的二元醇处获得所呈现的结果，所述乙酸乙酯用作酰基供体和溶剂。选择反应条件用于在两种催化剂之间进行比较。反应条件的进一步优化可以产生更高的产量。因为二元醇在反应中耗尽，所形成的单酯将更利于反应并形成二酯，这是因为浓度的差异。表1显示当与野生型CALB相比时，使用T40ACALB突变体增加了所有测试的二元醇的单酰基化二元醇的最大产量。表2和3表明了在给定的产物纯度下可获得哪种最大转化；3:1和9:1(单酯:二酯)。表2和3中的中数据显示当比较TA40突变的CALB和野生型CALB时，在产物纯度下降到给定水平下之前可转化更多的二元醇。

在反应中通过使用乙酸乙酯作为溶剂和酰基供体以及20mM的二元醇浓度实现酰基供体和二元醇之间浓度的巨大差异。因此，根据以下反应线路，认为反应是不可逆的：

(线路1)

不可逆反应条件验证了以下等式：

[A] = {[A]}_{0} e^{- k_{1} t} - - - (eq . 1)

[B] = \frac{{[A]}_{0} k_{1}}{k_{2} - k_{1}} (e^{- k_{1} t} - e^{k_{2} t}) - - - (eq . 2)

[C] = {[A]}_{0} {1 + \frac{1}{k_{1} - k_{2}} (k_{2} e^{- k_{1} t} - k_{1} e^{- k_{2} t})} - - - (eq . 3)

A、B和C分别对应于二元醇、单酯和二酯。k₁和k₂分别对应于二元醇和单酯酰基化的反应速率。

反应速率取决于酶浓度和对底物的k_cat/K_M。通过将随时间测定的浓度拟合到等式中并使用活性位点滴定测定的酶浓度，获得了以下结果。

表4.野生型CALB针对二元醇和单酯的特异性和选择性

表5.T40A CALB针对二元醇和单酯的特异性和选择性

表6.T40A和野生型CALB针对二元醇相比于单酯的选择性之间的差异

在表4-6中给出了野生型和T40A CALB针对二元醇和单酯的k_cat/K_M的值。表4给出了野生型的k_cat/K_M，表5给出了T40A CALB的k_cat/K_M。此外，给出了针对二元醇相比于单酯的选择性(k_cat/K_M)_二元醇/(k_cat/K_M)_单酯。从这些选择性中计算了活化能的差ΔΔG。表4和5中的选择性已经转移到表6，用于在野生型和T40A突变体之间进行比较。给出T40A/野生型CALB的选择性之间的比例和活化能中相关差异ΔΔΔG的数据显示了CALB中的T40A突变的效果。所检测的二元醇因为T40A突变的影响优于其相应的单酯。

在图3、4、5和6中图解概述了其他结果：

在图3和4中阐明了比较野生型和T40A CALB催化的反应的单酯和二酯产量的实例。在图3和4中分别给出了利用1,2-乙二醇和1,4-丁二醇的反应。在两个图中，通过使用T40A而非野生型CALB提高了最大单酯产量。

图5显示了野生型和T40A CALB催化的利用1,2-乙二醇的反应的产物分布的实例。通过以下等式计算产物分布：

75%的产物分布对应于3:1，单酯：二酯，90%对应于9:1，单酯：二酯。

图6给出了对于野生型或T40A CALB催化的1,2-乙二醇和乙酸乙酯反应二元醇、单酯和二酯的浓度怎样随时间变化的图解。误差线代表了等式1-3拟合到测量值的模型。所述模型给出了表4-6中给出的k_cat/K_M的值。

实施例3的结果：利用不同二元醇作为底物和丁酸乙烯酯作为酰基供体的酶催化的酰基化反应

表7.最大单酯产量：

二元醇	T40A	WT
			1,4-丁二醇	44	25
2-甲基-1,3-丙二醇	56	34

表7显示了野生型和T40A CALB之间所测量的最大产量的差异。T40A比野生型CALB针对二元醇相比于其对应的单丁酸酯的选择性更高。这些结果与表1中给出的结果一致。

在图7和8中总结了结果。

表7和8显示了在利用丁酸乙烯酯的反应中来自2-甲基-1,3-丙二醇和1,4-丁二醇的单酯和二酯的产量。MTBE用作溶剂。在图中阐明了野生型（7A、7B）和T40A（7B、8B）针对二元醇相比于其相应的单酯的选择性的差异。

实施例4的结果：比较野生型、T40A和T40V CALB的选择性的竞争实验

100mM二元醇

100mM 1-丁醇

25mM癸烷作为内标

乙酸乙酯用作溶剂和酰基供体。或者1M丁酸乙烯酯和MTBE。

在图9和10中概述了结果：

在图9和10中，二元醇的转化表达为1-丁醇转化的函数。乙酸乙酯用作图9中给出的实验的酰基供体和溶剂。丁酸乙烯酯用作图10中给出的实验的酰基供体，MTBE用于溶剂。在图9和10中的图中进行野生型和T40A CALB之间的比较。此外，图10中的图显示了T40A CALB催化的反应。可在所有给出的图中观察到野生型和T40A CALB之间的显著差异。当使用T40A而非野生型CALB时，二元醇比1-丁醇转化得更快。由此，利用T40A比利用CALB能够实现针对二元醇相比于1-丁醇的更高选择性。

当1,2-乙二醇而非1,4-丁二醇用作底物时，观察到二元醇相比于1-丁醇的更高选择性。这些观察与表6中给出的结果一致，其中比较在野生型和T40A CALB之间针对二元醇相比于单酯的选择性。在图9和10以及表6中观察到了针对1,2-乙二醇的最高选择性。

当比较T40V和野生型CALB时获得相似的结果。低酶表达水平组合针对测试底物的低活性产生了低反应速率。因此，仅准确测定了T40V变体的含丁酸乙烯酯的反应。对于这些反应，利用1,4-丁二醇的反应比含有1,2-乙二醇的反应进行更长时间。因此，在含有1,4-丁二醇的反应中测量到了更高的转化。此处，可以看到T40V比野生型CALB针对1,4-丁二醇相比于1-丁醇的选择性更高。来自利用1,2-乙二醇的反应的结果提示在这种情况下选择性更高。

图11显示了野生型和T40A CALB催化的1,2-乙二醇的反应的反应速率的差异。每克酶转化摩尔1,2-乙二醇的量表示为时间的函数。在11A中，乙酸乙酯用作酰基供体和溶剂。在11B中丁酸乙烯酯用作酰基供体，MTBE用作溶剂。

表8.初始反应速率

在表8中，为野生型和T40A CALB催化的反应给出了初始反应速率。在利用两种不同酰基供体、乙酸乙酯和丁酸乙烯酯的酰基转移反应中使用两种不同的二元醇：1,2-乙二醇和1,4-丁二醇。第三列中给出的速率比是T40A相比于野生型CALB中剩余活性的量度。T40A相比于野生型CALB针对丁酸乙烯酯比针对乙酸乙酯的速率比更高。当从乙酸乙酯改变成丁酸乙烯酯时，速率决定步骤从酰化作用向脱酰基作用的偏移可解释这些差异。在酰化作用步骤中没有底物辅助，所述酰化作用步骤减缓从乙酸乙酯的酰化作用，而非从丁酸乙烯酯的酰化作用，因为丁酸乙烯酯是更活化的酯。

T40A相比于野生型CALB针对丁酸乙烯酯和乙酸乙酯的速率比的差异以及针对二元醇相比于1-丁醇的选择性支持T40A中对二元醇具有底物辅助催化的假说。

实施例7的结果：野生型、A282L、A281V和A281E CALB的选择性的比较

检测了CALB催化的酰基转移反应中增加单酯产量的不同方法。进行突变A282L、A281V和A281E以防止单酰基化二元醇反应。认为突变选择性地在立体上阻碍较大的底物，但不阻碍较小的底物。因此，二元醇比其相应的单酯是更好的底物。在表9和10中给出了结果。利用相比于二元醇10倍过量的酰基供体进行反应，并认为不可逆。在实施例2的结果下讨论的反应路线1和等式1-3是有效的。MTBE用作溶剂。

表9显示了野生型、A282L、A281V和A281E针对二元醇相比于单酯的选择性。直接从通过拟合实验数据到等式1-3获得的速率常数计算选择性。因为酶浓度对两个酰化作用步骤相同，k₁/k₂等于(k_cat/K_M)_二元醇/(k_cat/K_M)_单酯。此外，选择性已经重新计算成能量差，ΔΔG。ΔΔG对应于过渡态下能量的差异。所检测的二元醇是1,2-乙二醇和1,4-丁二醇，其与乙酸乙烯酯或丁酸乙烯酯反应。二元醇和酰基供体均影响对二元醇相比于单酯的选择性。所有三种突变体针对所有检测的底物选择性比野生型的更高。CALB变体之间的最大差异是A282L和野生型CALB针对1,2-乙二醇和丁酸乙烯酯的差异。

表9.选择性和活化能中的相关差异

^*k₁/k₂是等式1-3中的常数并对应于(k_cat/K_M)_二元醇/(k_cat/K_M)_单酯。

^＊＊从所给出的k₁/k₂计算ΔΔG的值，并且其对应于底物之间过渡态能量的差异。

表10含有关于表9给出的一些反应的更详细信息。显示了野生型和A282L CALB针对1,2-乙二醇和1,4-丁二醇及其对应的单酯的特定常数，使用乙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯作为酰基供体形成所述单酯。在所检测的情况下，针对二元醇的特异性因A282L突变而增加。在利用丁酸乙烯酯的反应中针对1,2-乙二醇的特异性从1.6增加至8.1s^-1mM^-1。在大多数情况下，针对单酯的特异性因A282L突变增加。例外是针对单酰基化的1,2-乙二醇，其对A282L突变引起的空间位阻而言太小了。如表9中给出，因A282L突变，针对二元醇相比于其对应单酯的选择性增加。表10中给出的针对二元醇和单酯的特异性的改变促进了增加的选择性。

表10.野生型和A282L CALB针对利用多种酰基供体形成的多种二元醇和单酯的各特异性

^*酯是相应的酰基供体单酰基化的相应二元醇。

表11显示了野生型和A282L CALB催化的反应的初始反应速率。所检测的二元醇是1,2-乙二醇和1,4-丁二醇。用于酰基转移反应的酰基供体是乙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯。A282L相比于野生型CALB的初始反应速率的比较在最后一列中给出为百分比。初始反应速率无显著降低可观察为A282L突变的结果。实际上，在4例中的3例中可以看到显著增加。增加的初始反应速率的可能解释是A282L CALB针对二元醇相比于单酯的选择性比野生型的高，如上文表9和10中所讨论。一旦形成单酯，其与二元醇竞争作为酶的底物。结果，二元醇转化率降低。初始反应速率增加的另一可能性是V_max，因此A282L CALB针对底物的k_cat比野生型的高。增加的k_cat表示A282L突变体是比野生型CALB用于二元醇单酰基化的更好催化剂。

表11.初始反应速率

实施例8的结果：在微型反应器条件下使用A282L的单丙烯酸酯的过量

在实验过程中，反应器外壳和反应器底部的温度分别保持在55°C和41°C。在反应器主要部分运行的过程中，柱温度适当地保持在39°C。从丁二醇、4-羟基丁二醇和丁二醇二丙烯酸酯的实验测定量计算转化程度和4-羟基丁二醇相比于丁二醇二丙烯酸酯的过量。如图12中所述，在A282L突变体或L278S的酶促催化后，在宽范围底物转化内实现了4-羟基丁二醇相比于丁二醇二丙烯酸酯的更高过量。Novo 435的酶促催化后获得的过量被测定为较低。

实施例9的结果：底物转化和产物过量的流速依赖性

反应器运行开始后，如表12中所示获取样品：

表12：

流速[ml/h]	取样时间[hh:mm]	取样时流过柱的体积[ml]
			1000	00:00	0
1000	00.17	280

400	00:00	0
			400	00:35	230


			200	00:00	0
200	01:23	277

100	00:00	0
			100	02:00	200

			50	00:00	0
50	02:43	135

10	00:00	0
			10	15:48	155

表13显示了通过CALB A282L装载柱后表12的各结束时间点上获取的样品的1,4-丁二醇、4-羟基丁二醇和丁二醇二丙烯酸酯的含量。

表13:

在图13中显示了产物过量与转化率和流速的依赖性。在400ml/h和更高的流速下CALB Novo 435和CALB A282L转化后，想要的产物过量是相当的。由于在所有流速下CALB A282L对底物更高的转化，本发明的突变体在这些范围内优于CALB Novo 435。当比较大约相同转化下的Novo435和A282L时，A282L产生的单丙烯酸酯过量更高。

实施例10的结果：A282T、A282C、A282P、A282I、A282Asp、A282V、A282M、A282R、I285、A282L/I285F和L278S/A282L的酶选择性和特异性的测定

图14A和图14B的结果基于含有固定在HP20L Diaion上的300mg酶的反应，图15A和15B的结果基于134mg酶(A282I)、117mg酶(A282R)、140mg酶(A282C)、300mg酶(A282L/I285F)和115mg酶(I285F)的反应。从图14A、图14B和图15A、图15B显示的结果清晰地看出，突变A282C、A282P、A282I、A282Asp、A282L、A282V、A282R、I285F以及双突变体L282S/A282L当与CALB Novo 435比较时引起可测量的增加单丙烯酸酯过量。双突变体A282L/I285F导致单丙烯酸酯过量相比于转化程度稍微的降低。

明确参考此处引用的参考文献和所附序列表。

Claims

1.制备通式(I)的单酰基化多元醇的生物催化方法：

其中

A代表任选取代的线性或分支的亚烃基残基，其具有至少两个碳原子，

所述方法包括

a)将通式(II)的多元醇与通式(III)的酰基供体化合物在存在突变的三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)下反应，直至形成上述通式(I)的单酰基化多元醇；

HO-A-OH (II)

其中R₁和A如上定义，并且

Don代表携带所述酰基基团的供体分子残基；和

b)获得单酰基化多元醇产物。

2.权利要求1的方法，其中所述突变的脂肪酶含有至少一个氨基酸突变，如果与相应的非突变脂肪酶相比，所述突变增加了脂肪酶对所述多元醇的单酰基化的选择性。

3.前述权利要求之一的方法，其中所述突变体包含至少一个突变，其从酶反应中心部分去除了稳定性功能氨基酸，所述稳定性功能氨基酸稳定待形成的通式(I)的单酰基化多元醇的羰基的氧阴离子过渡态。

4.前述权利要求之一的方法，其中

a)获得了最大单酯产量，其比通过相应野生型酶获得的最大产量高至少1%；

b)在这样的多元醇转化率下达到了单酯与聚酯3:1的摩尔比例，所述多元醇的转化率比相应野生型酶获得的相应转化率高至少1%；和/或

c)在多元醇总量的基础上产生90%单酰基化多元醇的反应时间的比例(T₉₀(突变体)/T₉₀(野生型))高于1。

5.前述权利要求之一的方法，其中所述酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的突变体，其包含SEQ ID NO:2的在至少一个位置上发生了突变的氨基酸序列。

6.权利要求5的方法，其中所述突变体包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中氨基酸Thr40发生了突变。

7.权利要求6的方法，其中所述突变使得在氧阴离子中间体与位置40的氨基酸残基之间基本上不会发生稳定化相互作用。

8.权利要求7的方法，其中所述突变包含单突变Thr40Ala、Thr40Val或Thr40Ser。

9.权利要求8的方法，其中所述突变体选自具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的突变体或所述突变体的具有至少60%的序列同一性的变体，所述变体在对应于SEQ ID NO:4的位置Thr40的氨基酸位置上仍然含有突变。

10.权利要求7至9中一项的方法，其中所述突变体额外地在SEQ IDNO:2或4的氨基酸位置Leu 278、Ile 285和Pro 280之一上包含至少一个突变。

11.权利要求10的方法，其中所述突变体和其变体在促成酶的催化位点的其他氨基酸位置中没有发生突变。

12.权利要求11的方法，其中所述突变体在氨基酸位置Ser105、Asp187、His224(催化性三联体)和Gln106上没有发生突变，并且其中所述变体在对应于那些位置的氨基酸位置上没有发生突变。

13.权利要求5至12任何一项的方法，其中在SEQ ID NO:2中或在包含根据SEQ ID NO:4在氨基酸Thr40上突变的SEQ ID NO:2中，Leu278、Ala281、Ala282或Ile285中的一个或多个发生了突变。

14.权利要求13的方法，其中一个或多个突变独立地选自：

Leu278Ser、

Ala281Val或Ala281Glu，和

Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met或Ala282Arg。

15.权利要求14的方法，其中SEQ ID NO:2包含选自Ala281Val、Ala281Glu、Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met、Ala282Arg和Ile285Phe的一个突变，或其中SEQ ID NO:2包含双突变Leu278Ser和Ala282Leu。

16.前述权利要求之一的方法，其中在分离的酶突变体或功能性表达所述突变体的重组微生物的存在下进行所述反应。

17.前述权利要求之一的方法，其中所述多元醇是通式(II)的化合物，其中A选自

-(CH₂)_n-和-(CH₂)_m-CR₂R₃-(CH₂)_m’-

其中

n是2-6的整数，

m和m’各自独立地是1-3的整数，

18.前述权利要求之一的方法，其中通式(III)的所述供体选自化合物，其中R₁是C₁-C₆-烷基，并且Don是-OR残基，其中R选自C₁-C₆-烷基和C₂-C₄-烯基。

19.对映选择性制备通式(I)的不对称单酰基化多元醇的酶促催化方法：

其中

A*代表任选取代的线性或分支的不对称亚烃基残基，其具有至少两个碳原子；

所述方法包括

a)将通式(II’)的多元醇的立体异构混合物与通式(III)的酰基供体化合物在突变的三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)存在下反应，直至形成上述通式(I)的单酰基化多元醇；

HO-A*-OH (II′)

其中R₁和A*如上定义，并且

Don代表携带所述酰基基团的供体分子残基；和

b)获得不对称的单酰基化多元醇产物。

20.权利要求19的方法，其中应用权利要求2至15任何一项中定义的酶突变体，所述突变体是分离的酶突变体形式或功能性表达所述突变体的重组微生物的形式。

21.权利要求19或20的方法，其中所述多元醇是通式(II’)的化合物，其中A*选自

-(CH₂)_m-CHR₂-(CH₂)_m’-

其中m、m’和R₂如上定义。

23.南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)突变体，其显示了SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少两个突变的模式，所述模式选自表A中显示的模式。

24.权利要求23的突变体，其额外地显示选自Val210Ile、Ala281Glu、Val221Asp的一个突变。

Leu278Ser，

Ala281Val或Ala281Glu，和

26.权利要求25的突变体，其在SEQ ID NO:2中具有选自Ala281Val、Ala281Glu、Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met、Ala282Arg和Ile285Phe的一个突变，或在SEQ ID NO:2中具有双突变Leu278Ser和Ala282Leu。

27.权利要求23或24的突变体，其额外地具有在权利要求25或26任何一项中定义的至少一个突变。

28.核酸分子，其编码权利要求20至27之一的突变体。

29.表达载体，其包含任选地在调节性核酸序列控制下的权利要求28的至少一个编码序列。

30.微生物宿主，其携带权利要求29的至少一个表达载体或权利要求28的编码序列。