JP5992142B2 - エノエートレダクターゼを用いるα−およびβ−デヒドロアミノ酸の酵素的還元法 - Google Patents
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Description
R1、R2は、それぞれ独立して、H、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、場合により置換されてもよい炭素環もしくは複素環式の芳香族もしくは非芳香族基、またはアルキルアリール基、またはカルボキシル基(-COOR)であり、
R3は、H、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、BOC、またはAllocであり、
Rは、H、C1-C6アルキル、またはアリールである]
式(1)または(2)の化合物を、
(i) 配列番号1、2、3、4、5、6のポリペプチド配列の少なくとも1つを含むか、または
(ii) 配列番号1、2、3、4、5、6と80%以上の配列同一性を示す、機能的に等価なポリペプチド配列を有する、
レダクターゼの存在下で還元することによる上記方法に関する。
- C1-C6-アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシル、および1回以上分岐する類似基、例えばi-プロピル、i-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、i-ペンチルまたはネオペンチル、特に上記のC1-C4-アルキル基が好ましい;
- C2-C6-アルケニル、特に炭素原子数2〜6の上記アルキル基のモノ不飽和類似基、特に対応するC2-C4-アルケニル基が好ましい;
- 炭素環もしくは複素環式の芳香族もしくは非芳香族環、特に3〜12個の炭素原子および場合によりN、S、O(特にNまたはO)のような1〜4個のヘテロ原子を有する、場合により縮合した環。その例として以下が挙げられる:シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、これらのモノまたはポリ不飽和の類似環、例えばシクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル;フェニルおよびナフチル;ならびにO、NおよびSから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜7員の飽和もしくは不飽和複素環式基(ここで、該複素環はさらなる複素環または炭素環に縮合してもよい)。特に、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、モルホリン、ピロール、フラン、チオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピラン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、クマロン、インドールおよびキノリンから誘導される複素環式基が挙げられる。これらの環式基のみならず、上記のアルキルおよびアルケニル基もまた、場合により1回以上(例えば1、2または3回)置換されてもよい。適当な置換基の例として、ハロゲン、特にF、Cl、Br;-OH、-SH、-NO2、-NH3、-SO3H、C1-C4-アルキルおよびC2-C4-アルケニル、C1-C4-アルコキシ;およびヒドロキシ-C1-C4-アルキルが挙げられ、ここで、アルキルおよびアルケニル基は先に定義したとおりであり、アルコキシ基は先に定義した対応するアルキル基から誘導される;
- BOCはtert-ブトキシカルボニル(保護)基である;
- Allocはアリルオキシカルボニル(保護)基である。
本発明の方法では、pHをpH4〜12、好ましくはpH4.5〜9、特に好ましくはpH5〜8の範囲に保持することが有利である。少なくとも98%eeが達成される。
基質の不斉バイオ還元は、次の一般的プロトコールに従って、単離酵素YqjM、OPR1、OPR3およびZymomonas mobilis(アルコール発酵菌)レダクターゼを用いて行った。
NADH/FDH系
Trisバッファー50mM pH7.5 (0.8ml)中の基質(5mM)、酸化型補因子NAD+ (100μM)、ギ酸アンモニウム(20mM)の混合物に、酵素(100〜200μg)を加えてからFDH (10u)を添加し、この反応を30℃(140rpm)で48時間実施した。
Trisバッファー50mM pH7.5 (0.8ml)中の基質(5mM)、酸化型補因子NAD+ (100μM)、グルコース(20mM)の混合物に、酵素(100〜200μg)を加えてから(D)-GDH (10u)を添加し、この反応を30℃(140rpm)で48時間実施した。
Trisバッファー50mM pH7.5 (0.8ml)中の基質(5mM)、酸化型補因子NADP+ (10μM)、グルコース-6-リン酸(20mM)の混合物に、酵素(100〜200μg)を加えてからG6PDH (10u)を添加し、この反応を30℃(140rpm)で48時間実施した。
OPR1のアリコートを、基質2-アセトアミドアクリル酸メチル(5mM)、補基質2-プロパノール(3〜60mM、0.6〜12モル当量)および酸化型補因子NAD+ (100μM)を含むTris-HCl緩衝溶液(0.8ml、50mM、pH7.5)に添加した。ADH-A(約2〜3U)を添加し、この混合物を120rpm、30℃で42時間撹拌した。生成物を酢酸エチル(2×0.5ml)により抽出し、有機相を合わせてNa2SO4で乾燥させ、得られたサンプルをアキラルGCにより分析した。
Claims (9)
- 一般式(1)のα-デヒドロアミノ酸から一般式(3)のアミノ酸を酵素的に調製する方法であって、
R1、R2は、それぞれ独立して、H、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、場合により置換されてもよい炭素環もしくは複素環式の芳香族もしくは非芳香族基、アルキルアリール基、またはカルボキシル基(-COOR)であり、
R3は、H、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、BOC、またはAllocであり、
Rは、H、C1-C6アルキル、またはアリールである]
式(1)の化合物を、
(i) 配列番号1、2、4、5、6のポリペプチド配列の少なくとも1つを含む、または
(ii) 配列番号1、2、4、5、6と90%以上の配列同一性を示す、機能的に等価なポリペプチド配列を有する、
レダクターゼの存在下で還元することによる上記方法。 - 補因子としてNADPHまたはNADHを用いて前記還元を実施する、請求項1に記載の方法。
- 用いる補因子を酵素的に再生する、請求項2に記載の方法。
- 補因子をグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼまたは第2級アルコールにより再生する、請求項3に記載の方法。
- 前記還元を水性、水性-アルコール性、またはアルコール性の反応媒体中で実施する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レダクターゼが固定化された状態で存在する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素が枯草菌(Bacillus subtilis)およびプチトマト(Lycopersicum esculentum)由来のレダクターゼの中から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- R1がH、R2がH、R3がアセチルである式(1)の化合物を反応させる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応を0〜45℃の範囲の温度および/または6〜8の範囲のpHで実施する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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