PT1499716E - Adi de rhodococcus erythropolis - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ADI DE RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS" A presente invenção lida com uma álcool desidrogenase (ADI, ADI-RE) do organismo Rhodococcus erythropolis. A invenção é também direcionada, inter alia, a um processo para preparação de polipéptidos com atividade de álcool desidrogenase e o seu uso. Um catalisador da célula inteira especial ou um sistema enzimático acoplado é também reivindicado. A produção de compostos orgânicos oticamente ativos, e.g. álcoois e α-aminoácidos, usando uma rota biocatalitica, está a tornar-se cada vez mais importante. 0 uso acoplado de duas desidrogenases com regeneração de cofator tem sido demonstrado como uma rota para a sintese em escala industrial destes compostos (DE19753350).

Esquema de reação 1:

VCOOH

+ ikO NH2 HOOONB*

Regeneração in situ do NADH usando formato desidrogenase dependente de NAD durante a aminação redutora do trimetilopiruvato para dar L-tert-leucina (Bommarius et al. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 2851-2888). 2

As álcool desidrogenases (ADIs) são de interesse similar nesta conexão, mas elas permitem, num sistema enzimático acoplado paralelo, inter alia a preparação de álcoois enantiomericamente enriquecidos partindo de cetonas ou de álcoois racémicos (DE10037101; para uma revisão compreensiva atualizada da técnica prévia, ver: W. Hummel, Adv. Biochem. Engineering/Biotechnology 1997, 58, 145-184). 2

CosHbstrat© red.

Cosubstrato GX.

As ADIs estão classificadas na classe E.C. 1.1.1.1 e assim pertencem às assim chamadas oxidorredutases. Elas são encontradas num número de organismos (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz e H. Waldmann, 1995, VCH, Vol. II, 595 ff) . As assim chamadas enzimas "de banda larga" que reagem estereoseletivamente numa ampla gama de substratos são de interesse.

Três ADIs diferentes, de levedura (ADIL), de figado de cavalo (ADIFG) e de Thermoanaerobium brockii (ADITB), que são usadas para preparar álcoois estão já comercialmente disponíveis para aplicações preparativas numa escala laboratorial. Adicionalmente, outras ADIs podem ser adquiridas mas estas são mais suscetíveis, como os seus nomes sugerem, de reagirem com substratos específicos tais como e.g. algumas desidrogenases de esteroides que reagem 3 preferencialmente com grupos álcool em estruturas de esteroides ou a glicerol desidrogenase que reage com a glicerina ou finalmente também várias enzimas que reagem com açúcares tais como glucose Dl. A maioria das ADIs até agora divulgadas na literatura são "S-especificas" (em que os termos S e R podem também por vezes estar invertidos na nomenclatura por razões técnicas). De acordo com o nosso conhecimento, no entanto, as ADIs de estirpes de Lactobacillus são R-especificas (ver C.W. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532) bem como outra ADI divulgada na literatura, de Pseudomonas (P. Hildebrandt, T. Riermeier, J. Altenbuchner, U.T. Bornscheuer, Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1207), a qual foi recentemente descrita pelo grupo de estudo Altenbuchner e Bornscheuer. O grupo de estudo incluindo Keinan e Lamed relataram uma ADI de Thermoanaerobium brockii (E. Keinan, E.K. Hafeli, K.K. Seth, R. Lamed, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 162) a qual mostra (R)-especificidade para pequenos substratos mas é (S) -especifica para grandes substratos.

Embora um grande número de representantes de álcool desidrogenases (S)-especificas seja conhecido, a sua adequabilidade industrial é geralmente muito restrita. Isto demonstra os muito poucos processos industriais que realmente usam estas enzimas em contraste com o grande número de ADIs conhecidas. A (S)-ADI de levedura é uma enzima dependente de NAD. É muito barata, mas converte substancialmente somente álcoois primários (ou aldeídos), logo esta enzima não é muito útil para a preparação de álcoois quirais. Adicionalmente, esta enzima é extremamente sensível e caracterizada por um alto grau de instabilidade, em particular no que respeita a solventes orgânicos. A (S)- 4 ADI dependente de NAD de fígado de cavalo (ADIFG) é indubitavelmente a álcool desidrogenase mais frequentemente usada até agora, particularmente na área académica, como demonstrado pelo grande número de publicações usando esta enzima (ver e.g. uma revisão em: K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4a edição, Springer-Verlag, 2000, p. 184 et seq.). Infelizmente, esta enzima não é realmente adequada para uso industrial devido à falta de disponibilidade. Adicionalmente, a (S)-ADI de fígado de cavalo é muito cara (1 U custa cerca de 0,5 Euros), e não está correntemente disponível na forma recombinante. Também, o espetro do substrato compreende preferencialmente cetonas cíclicas; as cetonas com cadeias laterais aromáticas (o tipo acetofenona) não são convertidas. No entanto, esta classe de substâncias compreendendo cetonas aromáticas é de importância particular de um ponto de vista industrial devido ao grande número de aplicações como intermediários-chave no setor farmacêutico (para exemplos selecionados, ver: a) R.A. Holdt, S.R. Rigby (Zeneca Limited), EUA 5580764, 1996; b) T.J. Blacklock, P. Sohar, J.W. Butcher, T. Lamanec, E.J.J. Grabowski, J. Org. Chem. 1993, 58, 1672-1679; c) R.A. Holdt, Chimica Oggi - Chemistry Today 1996, 9, 17-20; d) F. Bracher, T. Litz, Arch. Pharm. 1994, 321, 591-593; e) S.Y. Sit, R.A. Parker, I. Motoc, W. Han, N. Balasubramanian, J. Med. Chem. 1990, 33, 2982-2999; f) A. Zaks, D.R. Dodds, Drug Discovery Today 1997, 2, 513-530). A ADI dependente de NADP (a NADP é 5-10 vezes mais cara do que a NAD) da bactéria Thermoanaerohium hrockii (ADITB), por outro lado, está disponível na forma recombinante. No entanto, o seu espetro de substrato está restrito a cetonas alifáticas. As cetonas com cadeias laterais aromáticas (o tipo acetofenona), por exemplo, não são convertidas. 5

Além do uso de enzimas isoladas, o uso de catalisadores de célula inteira que contêm álcool desidrogenases é também conhecido, em que existem desvantagens em princípio em comparação com o uso de enzimas isoladas. Estas desvantagens, as quais são descritas, inter alia, em K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 4a edição, Springer-Verlag, 2000, p. 193 et seq., incluem baixas produtividades e rendimentos em reações catalisadas por microrganismos em comparação com enzimas isoladas. Por exemplo, os tempos de reação quando se usa levedura de pasteleiro, a qual é provavelmente o mais popular catalisador de célula inteira usado, estão não raramente na região de vários dias para a reação. Outra desvantagem é o difícil processo de manipulação do produto (separação da fonte de carbono, do material da célula e dos produtos secundários adicionados) bem como os problemas envolvidos devido ao facto de que várias ADIs estão usualmente presentes nas células, atuando estas ao mesmo tempo e frequentemente resultando em reações secundárias indesejadas e rendimentos e enantioseletividades reduzidas para os produtos desejados. Não obstante, alguns exemplos são conhecidos da literatura onde catalisadores de célula inteira nativos são usados numa grande escala, sem que tais processos alcancem geralmente uma escala industrial (= escala da tonelada). Por exemplo, a Zeneca Life-Science Co (R.A. Holdt, S.R. Rigby (Zeneca Limited), EUA 5580764, 1996) de screve a conversão do diedro-6-metilo-4-tieno-tiopiran-4-ona-7,7-dióxido no correspondente composto de 4-hidroxi usando uma ADI de Neurospora crassa (um fungo filamentoso) , em que a enzima não é isolada mas, como mencionado acima, são usadas células inteiras. A Bristol-Myers-Squib converteu o 6-benziloxi-3,5-dioxo-hexanoato de etilo no correspondente composto de 3,5-diidroxi usando uma enzima presente no extrato de célula de Acinetobacter 6 calcoaceticus (bactéria) (R.N. Patel, C.G. McNamee, A. Banerjee, L.J. Szarka (E.R. Squib & Sons), EP569998, 1993). Além disso, a conversão do 4-cloro-3-oxo-butirato de metilo no correspondente composto de 3-hidroxi usando uma ADI de Geotrichum candidum (uma levedura) foi descrita (Patel, R. N., McNamee, C.G., Banerjee, A., Howell, J.M., Robinson, R. S., Szarka, L.J., Enzyme Microb. Technol. 1992, 14, 731). A Eli Lilly publicou a transformação da 3,4-metileno-dioxiacetofenona para dar o correspondente álcool usando uma ADI de Zygosaccharomyces rouxii (uma levedura) (J.T. Vicenzi, M.J. Zmijewski, M.R. Reinhard, B.E. Landen, W.L. Muth, P.G. Marler, Enzyme Microb. Technol. 1997, 20, 494). A Merck converteu um derivado de piridina com Candida sorbophila (uma levedura) (Chartrain, M., Chung, J., Roberge, C. (Merck & Co., Inc.), EUA 5846791, 1998).

Uma publicação japonesa descreve a redução do 4-cloro-3-oxo-butirato de metilo com ADI num catalisador de célula inteira recombinante. Uma ADI adequada ("cetoredutase" não comercial) e uma enzima de regeneração de coenzima são clonadas em conjunto em células de E. coli (Kataoka, M., et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 48, 699; Kataoka, M., et al. Biosci., Biotechnol., Biochem. 1998, 62, 167). uma

Com referência a enzimas (S)-específicas, uma (S)-ADI do organismo Rhodococcus erythropolis é já conhecida a partir da aplicação de patente DE4209022. No entanto, isto é obviamente um sistema enzimático que tem pouca estabilidade térmica e tem uma temperatura ótima a 45°C após incubação durante 10 minutos. Uma vez que a estabilidade térmica está diretamente ligada à estabilidade operacional e à estabilidade em solventes (Suzuki, Y., K. Oishi, H. Nakano e T. Nagayama. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 546), somente uma adequabilidade moderada para processos 7 industriais seria expetável para a enzima mesofilica descrita nesse documento.

Assim, existe obviamente ainda uma necessidade para ADIs adicionais, opcionalmente melhoradas, que possam ser usadas em sinteses industriais. Assim, o objeto da presente invenção foi o de proporcionar álcool desidrogenases (ADIs) adicionais, ou os ácidos nucleicos codificando-as, com propriedades opcionalmente melhoradas em comparação com enzimas conhecidas. Em particular, as ADIs devem ser capazes de uso eficaz numa escala industrial para preparar álcoois enriquecidos em enantiómero tal que estes tipos de processos de produção possam ser realizados vantajosamente, de um ponto de vista económico e ecológico, numa escala comercial, isto requerendo uma ADI acima da média no que diz respeito à seletividade, à estabilidade, à estabilidade e/ou à atividade.

Este objeto é alcançado de acordo com as Reivindicações.

Tornar disponível uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um polipéptido com atividade de álcool desidrogenase escolhida do grupo: a) uma sequência de ácido nucleico com a sequência dada na Seq. ID NO: 1, proporciona a oportunidade, de numa maneira preferencial, de se ser capaz de preparar, em quantidades adequadas e usando técnicas recombinantes, as enzimas requeridas para um processo industrial enzimático para produzir compostos enriquecidos em enantiómero. Usando as sequências de ácido nucleico, é possível obter os polipéptidos com altos rendimentos a partir de organismos hospedeiros que crescem rapidamente. Adicionalmente a um espetro de substrato invulgarmente amplo, os polipéptidos de acordo com a invenção são também, ao contrário das expectativas, resistentes ao calor.

Elas convertem, inter alia, cetonas alifáticas e aromáticas, aldeidos e 2- ou 3-cetoésteres. Invulgar e inesperado, como mencionado, é o facto de que os polipéptidos codificados pelas sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção exibem virtualmente nenhuma desativação em 15 minutos a 65°C, embora tenham origem numa bactéria que ela própria já não cresce a 37°C e portanto não é termofilica. Adicionalmente a esta estabilidade térmica muito alta, que é vantajosamente acompanhada por altas estabilidade operacional e resistência ao solvente (Suzuki, Y. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 546 (ver acima)), o presente polipéptido, e assim também a sequência de ácido nucleico codificando esta enzima, difere da enzima mencionada em DE4209022 na estrutura e no tamanho. Enquanto as 4 subunidades no polipéptido de acordo com a invenção têm cada uma uma massa molar de 36 kDa (± 2 kDa) , as 2 subunidades em DE4209022 têm uma massa molar de 72 kDa (±5). 0 procedimento para melhorar os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou os polipéptidos codificados por eles usando os métodos de mutagénese é suficientemente bem conhecido de uma pessoa perita na técnica. Métodos adequados de mutagénese são todos os métodos disponíveis para este propósito a uma pessoa perita na técnica. Em particular, estes incluem mutagénese de saturação, mutagénese aleatória, métodos de recombinação in vitro e mutagénese sitio-dirigida (Eigen, M. e Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering baseei on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56, 967-978; Chen, K. e Arnold, F., Enzyme engineering for non-aqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in 9 polar organic media. Bio/Technology 1991, 9, 1073-1077; Horwitz, M. e Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sei EUA 83, 1986, 7405-7409; Dube, D. e L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 1989, 28, 5703-5707; Stemmer, P.C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389-391 e Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sei EUA 91, 1994, 10747-10751).

As novas sequências de ácido nucleico obtidas são clonadas num organismo hospedeiro (ver abaixo para referências da literatura), usando os métodos citados abaixo, e os polipéptidos expressos desta maneira são detetados e depois isolados usando métodos de rastreio adequados. Para os propósitos de deteção, todas as possiveis reações de deteção para as moléculas formadas com este polipéptido são basicamente adequadas. Em particular, um teste fotométrico através da NADH formado ou consumido, CLAR ou métodos de CG podem ser aqui usados para detetar os álcoois formados com esta enzima. Adicionalmente, para detetar novos polipéptidos modificados por meio de técnicas de engenharia genética, são também adequados métodos eletroforéticos com gel de deteção ou métodos de deteção usando anticorpos.

Esta aplicação também descreve sequências de ácido nucleico que hibridam sob condições estringentes com as sequências de ácido nucleico de cadeia única de acordo com a invenção ou sequências de ácido nucleico de cadeia única que são complementares daquelas. Por exemplo, a sonda de gene de acordo com a Seq. 13 ou o iniciador mencionado nas Seq. 3-12 são considerados como tais sequências. 10 A expressão "sob condições estringentes" é para ser entendida aqui da mesma maneira como é descrita em Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). A hibridação estrigente de acordo com a presente invenção está preferencialmente presente quando, após crescimento durante uma hora com 1 x CSS (cloreto de sódio a 150 mM, citrato de sódio a 15 mM, pH 7,0) e DSS a 0,1% (dodecilo sulfato de sódio) a 50°C, preferencialmente a 55°C, mais preferencialmente a 62°C e o mais preferencialmente a 68°C e mais preferencialmente durante uma hora com 0,2 x CSS e DSS a 0,1% a 50°C, preferencialmente a 55°C, mais preferencialmente a 62°C e o mais preferencialmente a 68°C, um sinal de hibridação positivo é ainda observado.

Além disso, a presente aplicação proporciona polipéptidos (enzimas) escolhidos do grupo a) polipéptidos codificados por uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção, b) polipéptidos contendo uma sequência de acordo com a

Seq. ID No: 2.

Os polipéptidos de acordo com a invenção são muito fáceis de usar em processos industriais devido à estabilidade indicada acima e ao amplo espetro de substrato.

Num próximo desenvolvimento, a invenção proporciona plasmideos ou vetores contendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção.

Plasmideos ou vetores adequados são em principio todas as formas de realização que estejam disponíveis a uma pessoa perita na técnica para este propósito. Estes tipos de plasmideos e vetores podem ser encontrados e.g. em Studier et al. (Studier, W.F.; Rosenber A.H.; Dunn J.J.; Dubendroff 11 J.W.; Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 1990, 185, 61-89) ou em folhetos de empresa emitidos pela Novagen, pela Promega, pela New England Biolabs, pela Clontech ou pela Gibco BRL. Outros plasmideos e vetores preferenciais podem ser encontrados em: Glover, D.M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. e Denhardt, D.T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D.V., Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 1990, 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.

Os plasmideos com os quais os constructos de gene contendo ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser clonados de uma maneira muito preferencial no organismo hospedeiro são: pUC18 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) ou pET (Novagen), ou pKAl (Fig. 1).

Do mesmo modo, a invenção também proporciona microrganismos contendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção. O microrganismo no qual os plasmideos que contêm as sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção são clonados é usado para multiplicar e obter uma quantidade suficiente da enzima recombinante. Os processos usados para este propósito são bem conhecidos de uma pessoa perita na técnica (Sambrook, J.; Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). Os microrganismos que podem ser referidos são em principio todos os 12 organismos conhecidos de uma pessoa perita na técnica que sejam adequados para este propósito tais como e.g. leveduras tais como Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, procariotas, E. coli, Bacillus subtillis ou eucariontes, tais como células de mamifero, células de inseto. Estirpes de E. coli são preferencialmente usadas para este propósito. As seguintes são muito particularmente preferenciais: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5oí, TOP 10" ou HB101. Os plasmideos com os quais o constructo de gene contendo o ácido nucleico de acordo com a invenção é preferencialmente clonado no organismo hospedeiro são mencionados acima.

Um aspeto adicional da invenção proporciona iniciadores para preparação das sequências de gene de acordo com a invenção por meio de todos os tipos de RCP. Iniciadores senso e antissenso codificando as correspondentes sequências de aminoácidos, ou sequências de ADN complementares, são incluídas. Iniciadores adequados podem ser obtidos em princípio por processos conhecidos de uma pessoa perita na técnica. A procura de iniciadores de acordo com a invenção é realizada pela comparação com sequências de ADN conhecidas ou pela translação das sequências de aminoácidos detetadas a olho no codão preferencial do organismo sob consideração (e.g. para Streptomyces: Wright F. e Bibb M.J. (1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55-65). Características comuns na sequência de aminoácidos de proteínas das assim chamadas superfamílias são também de utilidade a este respeito (Firestine, S.M.; Nixon, A.E.; Benkovic, S.J. (1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779-783). Informação adicional sobre este tópico pode ser encontrada em Gait, M.J. (1984), Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press 13

Ltd., Oxford; Innis, M.A.; Gelfound, D.H.; Sninsky, J.J. e White, T.J. (1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego. Os seguintes iniciadores são extremamente preferenciais:

Iniciador-5'J MH3 ÂAG <303{C} ATC CAG TAG ACG(C) CGGÍCÍ ATC (Seq. 3}

Iniciador-3'í GCC GGT ACC AAT(C) GAC (G) AAC(G) CGC GTA (Seg. 4)

Iniciador-5' ϊ ATC CAG TAC ACG CGC ATC GGC GCG GAA (Seg. S)

Xnioíador-3'J GCC TCC GCG AAG TTT CGG CAG AGA ACG (Seq. 6}

Tnlci-âdor—5 £ GCG GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG (Seq. 7)

Ini.ciador-3* CGC AAG CTT CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC {Seq, 8)

Irai ci ador-5' ϊ GAG 0TC GGT CAT ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG OGT ATC GGC (Seg. 9)

Iniciador-3' ; CGC GGA TCC CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC (Seq. 10) miciador-5 ‘ : GGT GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG CGT ATC GGC (Seg. 11) iniciador-3' : CGC AAG CTT CTA GTQ GTG GTG GTG GTG GTG CAG ACC AGG GAC (Seg. 12)

Num aspeto adicional, a presente aplicação descreve um processo para preparação de rec-polipéptidos melhorados com atividade de álcool desidrogenase partindo de sequências de 14 ácido nucleico de acordo com a invenção, em que o seguinte protocolo é aplicado: a) as sequências de ácido nucleico são sujeitas a mutagénese, b) as sequências de ácido nucleico obteniveis de a) são clonadas num vetor adequado e estas são depois transferidas para um sistema de expressão adequado e c) os polipéptidos com atividade e/ou seletividade e/ou estabilidade melhorada formados são detetados e isolados. A presente aplicação descreve adicionalmente rec-polipéptidos ou sequências de ácido nucleico codificando estes que são obteniveis por um processo como o acabado de ser descrito. A preparação das sequências de ácido nucleico requeridas para produzir os rec-polipéptidos melhorados e a sua expressão em hospedeiros são descritas em baixo e conformemente aplicam-se aqui.

Os polipéptidos e rec-polipéptidos de acordo com a invenção são preferencialmente usados para preparar compostos orgânicos enriquecidos em enantiómero quirais tais como e.g. sec-álcoois com um centro estereogénico.

Surpreendentemente, o novo tipo de álcool desidrogenases e as álcool desidrogenases previamente conhecidas, e.g. ADIs de R. erythropolis, exibem propriedades bioquimicas muito diferentes, em particular no que diz respeito ao padrão do substrato e também à enantioseletividade produzida. A nova ADI mostra ser particularmente adequada para a preparação de álcoois secundários aromáticos, o que leva a um alto nivel de atratividade industrial para a nova ADI, simplesmente por causa da importância comercial desta classe de substâncias. 15

No que se segue em particular as diferenças e vantagens quando comparadas com as ADIs prévias de R. erythropolis são descritas. A álcool desidrogenase de R. erythropolis agora reivindicada exibe diferenças significativas quando comparada com ADIs mais antigas (descritas por exemplo em DE 4209022, 1991, J. Peters et ai., J. Biotechnol. 1994, 33, 283 e J. Peters, Dissertação, Univ. Dusseldorf, 1993) as quais foram usadas quer diretamente do extrato em bruto, quer parcialmente purificadas. Estas diferenças relacionam-se, como mencionado acima, quer com propriedades fisicas tais como estrutura, estabilidade térmica e estabilidade em meios orgânicos, quer também com propriedades bioquimicas, em particular no que diz respeito à aceitação do substrato.

As diferenças significativas nas caracteristicas bioquimicas (aceitação do substrato) da "nova" ADI de R. erythropolis, quando comparada com as ADIs já conhecidas mencionadas acima (= técnica prévia), são descritas abaixo. Nas Tabelas dadas abaixo, isto é explicado usando exemplos exemplares e também graficamente. Neste caso, como é normal, a atividade medida para um composto é definida como 100% e a(s) atividade/atividades do(s) outro(s) composto(s) é(são) determinada(s) em relação àquela. A partir das atividades relativas quando comparadas com outros substratos, pode ser reconhecido se tal outro substrato é aceite num grau maior ou menor.

Um primeiro exemplo significativo é aqui mostrado na Tabela 1. Neste caso, a atividade medida de cada vez para a p-metiloacetofenona foi definida como 100%. Surpreendentemente foi mostrado que a nova ADI levou a uma aceitação grandemente melhorada com o substrato p- 16 cloroacetofenona, com uma atividade relativa de 189%. Em contraste, uma atividade reduzida em comparação com a p-metiloacetofenona, somente 81%, foi determinada para a ADI mais antiga (descrita em DE 4209022, 1991).

Tab. 1: AI>I acordo Nova ADI expr, cós DS 4209022 est S, eoli

Notai As atividades dadas nesta tabela são atividades relativas e são dadas com referência ã atividade medida para a p-metiloacetofenona

Outra comparação interessante é mostrada na Tabela 2. Aqui, as atividades relativas são dadas no que diz respeito à p-fluoroacetofenona. Neste caso, é mostrado que a nova ADI aceita preferencialmente o substrato p-metoxiacetofenona (atividade rei.: 195%), enquanto o efeito oposto é observado para a ADI previamente conhecida (de acordo com DE 4209022, 1991) (atividade rei. de somente 90% para a p-metoxiacetofenona comparada com 100% para a p-fluoroacetofenona). 17 Tab. 2:

de acorda ccist DS 420S022 h3co

O

ch3 90% 195% f

O

ch3 100% 100%

Nota,: as atividades dadas nesta tabela são atividades relativas e são dadas côa referência à atividade raedida para a p-fluoroacetofenona

No entanto, as diferenças significativas não estão restritas à área de cetonas aromáticas diferentemente substituídas, mas são também detetadas somente numa comparação geral com β-cetoésteres alifáticos (Tabela 3) . Assim sendo, os ésteres de β-cetoetilo são de longe mais prontamente aceites pela forma de ADI já conhecida (de J. Peters, Dissertação, 1993) do que o é a p-cloroacetofenona como um representante das cetonas aromáticas (250% vs. 100%). Mesmo o substrato de cetoéster acetoacetato de metilo muito menos prontamente aceite tem a mesma atividade do que a p-cloroacetofenona. A tendência oposta é exibida pela nova forma de ADI: aqui, em comparação o éster de metilo, a p-cloroacetofenona tem mais do que 9 vezes a atividade (909% vs. 100%). Mesmo em comparação com o éster de β-cetoetilo, a p-cloroacetofenona tem uma atividade maior quando se usa a nova ADI (909% vs. 773%) . Assim sendo, este exemplo também prova a mudança qualitativa significativa na aceitação do substrato quando se compara a nova ADI com as ADIs previamente conhecidas de acordo com J. Peters, Dissertação, Universidade de Diisseldorf, 1993. 18 Tab. 3;

Yb XH,

H,G

ch3 Y xh3 ADI d-a acordo ooiu J. Petsrs. Disseri&ç&c

Nova ADI expr, «a S. ooli 100% 250% 100% 100% 773% 909%

Ci

Nota* As atividades dadas nesta tabela são atividades relativas e são dadas cora referência à atividade medida para o acetoacetato de metilo

Finalmente pode ser mencionado que diferenças qualitativas significativas no que diz respeito à aceitação do substrato são também encontradas em cetonas funcionalizadas de uma maneira diferente. Isto é mostrado por exemplo por uma comparação de cetonas de alquilo de cadeia longa puras com a fenoxiacetona, como um representante de uma cetona de dialquilo substituída no heteroátomo (Tabela 4). 19 T&fo. 4: ADI íle acordo ccta Nova ADI expr. J, Pet-ers,- Dissertação «a E, coli o

100% 100% h3c

79% 71% 76% 126%

Nota: As atividades -dadas nesta tabela são atividades relativas e são dadas coia referência à atividade medida para a 2-fceptanoria

Assim sendo, o padrão de substrato para a forma conhecida de ADI de J. Peters, Dissertação, 1993 demonstra claramente uma preferência por cetonas de alquilo de cadeia longa. Atividades mais altas foram determinadas para ambas a 2-heptanona (100%) e a 2-decanona (79%) do que para a fenoxiacetona (71%) . A nova ADI, no entanto, exibe um padrão de substrato completamente diferente. Aqui, a atividade de longe mais alta, 126%, foi determinada para a fenoxiacetona, enquanto as cetonas de alquilo tiveram atividades muito mais baixas (100% e 76%). A tendência nas cetonas de 2-alquilo com uma preferência para cetonas-C7 ao invés de para cetonas-ClO, no entanto, é similar para todas as ADIs, como demonstrado pelas atividades geralmente mais altas da 2-heptanona quando comparadas com aquelas da 2-decanona.

Interessantemente portanto, para resumir é encontrado, um biocatalisador nesta nova ADI que exibe propriedades 20 modificadas ou mesmo complementares em comparação com ADIs mais antigas, e.g. de R. erythropolis, as quais foram usadas quer diretamente a partir do extrato em bruto, quer parcialmente purificadas. Estas diferenças significativas abrem novas e interessantes áreas de aplicação e ao mesmo tempo documentam a novidade deste novo biocatalisador. Assim, as ADIs compreendendo as ADIs mais antigas de R. erythropolis, oriundas de um extrato em bruto ou na forma parcialmente purificada, têm propriedades muito diferentes no que diz respeito às suas propriedades bioquímicas quando comparadas com a "nova" ADI que é um biocatalisador novo e também melhorado. Em particular, podem ser vistas claras vantagens na preparação da classe industrialmente altamente interessante de substâncias compreendendo álcoois aromáticos oticamente ativos.

Além disso, as sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção, as quais podem ser também adicionalmente melhoradas, que codificam os polipéptidos envolvidos são preferencialmente adequadas para a preparação de catalisadas de célula inteira. A preparação de tais biocatalisadores é descrita em princípio abaixo e é suficientemente bem conhecida de uma pessoa perita na técnica. A invenção também proporciona um catalisador de célula inteira contendo um gene clonado para uma álcool desidrogenase dependente de NADH e um gene clonado para uma enzima que seja adequada para a regeneração da NADH, em particular uma formato desidrogenase ou uma enzima regeneradora dq NAD tal como NADH oxidase. O catalisador de célula inteira adicionalmente preferencial, por outro lado, é caracterizado pelo facto de 21 que a álcool desidrogenase é uma de R. erythropolis, em particular de acordo com a invenção, uma de DSM 43297.

No caso da presença de uma formato desidrogenase no catalisador de célula inteira, esta deve ser a formato desidrogenase derivada de Candida boidinii e no caso da presença de uma NADH oxidase esta deve ser a NADH oxidase derivada de Lactobacillus brevis. Um organismo tal como um mencionado em DE10155928 é preferencialmente usado como o organismo hospedeiro. A vantagem de um organismo deste tipo é a expressão simultânea de ambos os sistemas de polipéptido, em que somente um rec-organismo tem de estar envolvido na reação. De modo a coincidir as taxas de reação para a expressão dos polipéptidos, as correspondentes sequências de ácido nucleico podem estar localizadas em diferentes plasmideos com diferentes números de cópia e/ou diferentes promotores de força para diferente expressão de força das sequências de ácido nucleico podem ser usados. Neste tipo de sistema de enzima coincidente, uma acumulação de um composto intermediário opcionalmente inibidor não ocorre vantajosamente e a reação envolvida pode proceder a uma taxa global ótima. No entanto, isto é muito bem conhecido de uma pessoa perita na técnica (Gellissen, G.; Piontek, M. ; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J.W.; DiCosimo, R.; Anton, D.L.; Janowick, Z.A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M. ; London, M. ; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A.W.; DE19920712).

Adicionalmente a isto, a presente invenção proporciona, num próximo aspeto, um sistema de reação enzimática acoplado tendo transformação enzimática dependente de cofator de um 22 composto orgânico com um polipéptido de acordo com a invenção e regeneração enzimática do cofator. A regeneração enzimática do cofator deve ser vantajosamente realizada com a formato desidrogenase derivada da formato desidrogenase de Candida boidinii ou um NADH oxidase derivada da NADH oxidase de Lactobacillus brevis. 0 sistema de reação pode ser entendido como sendo qualquer vaso no qual a reação de acordo com a invenção possa ser realizada, isto é, reatores de qualquer tipo (reator em circuito, tanque agitado, reator de membrana de enzima, etc.)/ ou conjuntos de diagnóstico em qualquer forma de todo.

Quando se usa uma formato desidrogenase, a regeneração do cofator é realizada usando ácido fórmico ou os seus sais como um agente redutor. Alternativamente, no entanto, podem também ser usados outros sistemas enzimáticos ou regeneradores de cofator baseados no substrato.

Um uso final da álcool desidrogenase de acordo com a invenção ou do catalisador da célula inteira de acordo com a invenção relaciona-se com o seu uso num processo para a redução assimétrica de cetonas. Soluções de tampão aquosas são adequadas para a conversão das cetonas.

As reações são realizadas na gama de pH que é tipica para reações enzimáticas, em que os valores de pH de entre 4 e 9, em particular entre 5,5 e 7,5 têm provado ser particularmente adequados.

As temperaturas de reação para as conversões redutoras são preferencialmente na gama entre 15 e 65°C, em particular entre 20 e 40°C.

As sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção pode assim ser vantajosamente usadas para preparar rec-polipéptidos. Usando técnicas recombinantes que são bem conhecidas de uma pessoa perita na técnica, são obtidos 23 organismos que são capazes de proporcionar o polipéptido envolvido em quantidades que sejam suficientes para um processo industrial. Os rec-polipéptidos de acordo com a invenção são preparados usando processos de engenharia genética que são bem conhecidos de uma pessoa perita na técnica (Sambrook, J.; Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque; Balbas, P. e Bolívar, F. (1990), Design and construction of expression plasmld vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R.L. e Denhardt, D.T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham). No que diz respeito aos procedimentos gerais (RCP, clonagem, expressão, etc.) é também feita referência à seguinte literatura e às referências citadas nela: Manual de Usuário do Conjuunto GenomeWalker™ Universal, Clontech, 3/2000 e a literatura citada nele; Triglia T.; Peterson, M.G. e Kemp, D.J. (1988), A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outsider the boundaries of known sequences, Nucleic Acid Res. 16, 8186; Sambrook, J.;

Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque; Rodriguez, R.L. e Denhardt, D.T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham.

Para aplicação, o polipéptido envolvido pode ser usado na forma livre como compostos purificados homogéneos ou como uma enzima preparada recombinante. Além disso, o polipéptido pode ser também usado como um constituinte de um organismo hóspede digerido ou em combinação com o material da célula digerido e qualquer material da célula altamente purificado de todo do organismo hospedeiro. É 24 também possível usar as enzimas na forma imobilizada (Sharma B.P.; Bailey L.F. e Messing R.A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien - Techniken und Anwendung, Angew. Chem. 94, 836-852). Vantajosamente, a imobilização é alcançada por liofilização (Paradkar, V.M.; Dordick, J.S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305) . A liofilização na presença de substâncias ativas à superfície tais como Aerosol OT ou polivinilopirrolidona ou polietileno glicol (PEG) ou Brij 52 (dietileno glicol de éter de mono-cetilo) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378) é muito particularmente preferencial. A imobilização em Eupergit®, em particular Eupergit C® e Eupergit 250L® (Rohm), é extremamente preferencial (para uma revisão, ver: E. Katchalski-Katzir, D.M. Kraemer, J. Mol. Catai. B: Enzym. 2000, 10, 157). Similarmente preferencial é a imobilização em Ni-ANT em combinação com o polipéptido modificado pela anexação de um Marcador-His (hexa-histidina) (Petty, K.J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography Em: Ausubel, F.M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Nova Iorque; John Wiley and Sons) . O uso de CERs é também uma possibilidade (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A.L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380- 25 383). Por meio destas medidas, é possível gerar, a partir de polipéptidos que sejam instáveis em solventes orgânicos, aqueles que possam operar em misturas de solventes aquosos e orgânicos ou inteiramente em meios orgânicos.

Num último desenvolvimento, a presente invenção proporciona o uso dos vetores preparados a partir dos vetores de "alto número de cópias" (A) e de vetores de "número de cópias moderado" (B) para preparar proteínas recombinantes tendendo a formar corpos de inclusão, em que pelo menos a origem de replicação é retirada do vetor (B) e pelo menos os elementos de clonagem e de expressão são retirados do vetor (A). 0 pETlla é preferencialmente usado como vetor (A) e o pACYC184 é preferencialmente usado como vetor (B). 0 vetor pAKl é um protótipo de tais estruturas. Este vetor é composto, como mencionado acima, por um segmento do vetor de "alto número de cópias" pETlla da Novogen Co. com origem de replicação ColEl e o vetor de "número de cópias moderado" pACYC184 com origem de replicação pl5A. 0 pETlla contém o gene da ampicilina (AMP) como um marcador de seleção, o pACYC184 contém dois marcadores de seleção, cloramfenicol (CAM) e tetraciclina (TET). Como resultado da ligação do fragmento de pETlla em pACYC184, adicionalmente aos marcadores de seleção, o seu promotor T7, gene lacl e LCM (Local de Clonagem Múltipla; Poliligante) são também introduzidos no pACYC184.

Quando se usa o vetor pKAl preparado de acordo com a invenção para a preparação recombinante da ADI de acordo com a invenção de E. coli, uma atividade de ADI de cerca de 70 U/mg é obtida no extrato em bruto, enquanto somente cerca de 6 U/mg de atividade e uma alta proporção de corpos de inclusão insolúveis são obtidos com o plasmídeo de "alto número de cópias" pKK223-3 da Amersham. 26

Para preparar polipéptidos nativos de acordo com a invenção, células recolhidas de R. erythropolis são decompostas por moagem num moinho de esférulas de vidro e os constituintes sólidos são separados por centrifugação. Após purificação do liquido sobrenadante isento de células da centrifugação usando cromatografia de permuta iónica e em sefarose de fenilo, durante cujo processo a atividade das frações é continuamente testada, é obtida uma fração de polipéptido que permite a análise da sequência de aminoácidos. A sequência de iniciação determinada e os motivos conservados obtidos pela comparação com ADIs conhecidas são usados para construir iniciadores degenerados (Seq. 3 e 4), com o auxilio dos quais um fragmento com 500 pb de comprimento pode ser obtido por RCP. Usando este fragmento, uma sonda de gene (Seq. 13) é preparada com os iniciadores homólogos (Seq. 5 e 6).

Sequência de nucleótidos da sonda (Seq. 13)

GAAGGCGCAGGCAAGGTCGCCGCCGTCGGCGAGGGTGTCGAAGGTCTCGACATCGGAAC caatgtcgtcgtctacgggccttggggttgtggcaactgttggcactgctcacaaggao

TGACCTCGACCCGGTCAAGACGGTGCCGCTGACCGACGCCGGTCTGACGCCGTATCACG

CGATCAAGCGTTCTOTGCCGAAACTTCGCGGAGGCTCG O ADN genómico de R. erythropolis é depois clivado com EcoRI e hibridado com a sonda, após separação dos fragmentos usando eletroforese em gel e transferências. A deteção da hibridação é realizada através de um sinal muito especifico a 5,2 kb. Isto indica que o gene a ser procurado está localizado numa EcoRI com 5,2 kb de comprimento. 27

De modo a obter a sequência de gene completa, o ADN genómico de R. erythropolis foi novamente digerido com EcoRI, os fragmentos de ADN com um comprimento entre 5 e 6 kb foram isolados e clonados no vetor de clonagem pUC18. 0 plasmídeo pRE-ADH produzido foi transformado em E. coli XL1 Blue e os clones foram rastreados por RCP com o auxilio dos iniciadores homólogos. A sequência inteira do gene para a ADI pode ser depois determinada com o auxilio dos iniciadores homólogos. 0 polipéptido nativo de R. erythropolis tem uma estrutura tetramérica e tem um peso molecular de 36.206 kDa por subunidade. Com base na sequência de aminoácidos, a álcool desidrogenase de R. erythropolis (ADI-RE) pertence obviamente ao grupo das desidrogenases de cadeia média. O alto grau de homologia com as enzimas neste grupo e a presença de um local de ligação do zinco tipica ("dedo de zinco") são pontos em favor disto. As propriedades dos representantes desta classe de desidrogenases têm sido definidas no que diz respeito à ADI de fígado de cavalo, tendo isto sido o mais minuciosamente investigado. Um número de enzimas com diferentes propriedades catalíticas é agora conhecido dentro deste grupo.

Uma pesquisa na base de dados "biblioteca de genes" usando os algoritmos de pesquisa BlastNT e EMBL através da Internet demonstrou a alta homologia da ADI-RE com outras álcool desidrogenases contendo zinco, ADIs quer de cadeia longa, quer de cadeia média. A homologia mais alta foi produzida com uma feniloacetaldeído redutase de Corynebacterium sp. ST-10. Uma comparação dos dois genes produziu os pontos de concordância mostrados na Fig. 3. 28

Pontisaçã* dtoi 1A8020760.2 |ABQ2Q760 gene de Corvnebacterium sp, ST-10 para. . 2218 amb ΐΑ£35β592.1 i SC9H11 cosmídeo 9Hii de Streptomyces coelicolor . 86 dbl ÍABQ17438..1ÍÃB0Í7438 orfl, orf2 de Streptomyces coelicolor,. 86 esib {211497.X1 BLAWSAG gene ansA de B. líchenif ormis para espargo . . , 44 crbl AC006518.171AC006518 cab RPCI11-14402 12pl3 de Homo sapiens , . 42 mbjA£>096811,1 [SCX30A cosmideo I30Ade Streptoiuyees coelicolor, .. 40

Ctb | L155S8.1 f TRBRPP9X proteína ribossoraal PO de TrypaPOSOffia cruti- . 40 <TblÃF263912.1jAF263912 nist.de StreptoKVces noursei ATCC 11455 . * 38 gb|AS003796.1ÍAE003786 estr, genómiaa de Drosophila me lano gas t er -. 38 qblAF170068.1lAF170068 o-ziiose iso. de S trep tcurçyces chibaensisJ- - . 38 ffb { AC00643 4.51 AC006434 Sequência genrárdca para Arabidopsis fcha - - - 38 gb|085909,1 jΑΡ085909 oosmídeo pPSR-22 de Mireofoasidiuin pullulans. 38 gb 1062928,1 j APU6292B resist. Kiuitidrogas de Aureobasidium pullulans. 38 gmtb} ΑΧ·021487.1} CSY45F10B eossiideo Y45F de Caenorhabditis elegans. . 38 emb j 297559.1IMTCY261 Mycobacterium tubérculos is H37Rv compl.., 38 gbtL27467,liOROP4lA proteína ígssni) ds Drosophi 1 a melaiiogas ter... . 38 ernb IAL049913,11K3ÚCB1610 co SMticleo B1610 de Mycobacteriuin lepraa. . 38 eicib IX68127,11MAR1RE1>M2 KtftRN cie JJ* aurâtus para riijoiiaeleôtidjo TB· . » . 38 ffbi L27468.11 DR0P41B proteína ícsABN2) de Drosophila melâíiogas t èr. . . 38 gb 1M21659.1 jMIAATB1 Anafoaena sp. (clanes lambda~An~700 e ... 29 A comparação da sequência de gene da álcool desidrogenase de R. erythropolis com o gene altamente homólogo da feniloacetaldeído redutase de Corynebacterium sp. ST-10 (Fig. 3) mostra na série superior a sequência base da ADI-RE, na inferior aquela de Corynebacterium. As bases correspondentes estão marcadas com uma linha. As sequências de proteína nos dois polipéptidos correspondem em 316 aminoácidos ao longo do gene inteiro (82%). A concordância é ainda mais alta quando são comparadas regiões específicas. A partir do terminal-N, existe uma concordância de 100% na sequência de aminoácidos até ao aminoácido que é determinado pelo codão 946-948. Após isso, começando a partir da sequência de Corynebacterium, existe uma deleção em Rhodococcus que leva a uma alteração da grelha de leitura a partir desta posição e assim leva a uma sequência de aminoácidos diferente. Se a sequência de gene é convertida na correspondente sequência de aminoácidos então, começando a partir do terminal-N, os aminoácidos 1-316 são absolutamente idênticos nos dois polipéptidos e depois, devido à alteração da grelha de leitura do gene, completamente diferentes. A este respeito, é feita também referência ao exemplo 4 neste documento. A transformação e a expressão da sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção em E. coli são realizadas pela clonagem do gene de ADI no vetor pKK223-3 da Amersham Pharmacia Biotech. Para uma melhor taxa de expressão, o codão AGA para o aminoácido arginina na posição 8 foi alterado para CGT o qual também codifica a arginina. Ao mesmo tempo, foi gerado um novo vetor (pKAl - Fig. 1) , e este foi transformado em E. coli BL21 (DE3) após ligação do gene de ADI no vetor. No extrato em bruto isento de células, uma atividade de 70 U/mg foi mostrada no que diz respeito à conversão da p-Cl-acetofenona. Em comparação com 30 essa, a atividade no extrato em bruto de R. erythropolis com a p-Cl-acetofenona foi cerca de 2,5 U/mg.

Os aspetos e diferenças vantajosos mencionados acima no que diz respeito à melhoria na estabilidade, em comparação com as álcool desidrogenases previamente conhecidas de R. erythropolis estão resumidos na Tabela 5 e na Fig. 4. Para melhor comparação, a atividade de enzima relevante medida a 45°C foi definida como 100%.

Aqui, para a nova álcool desidrogenase muito pura, foram produzidas altas estabilidades térmicas ao longo de uma ampla gama de temperaturas que se estende até 65 °C. Os valores de estabilidade neste caso são de 100 a 105°C. Em contraste, uma sensibilidade à temperatura significativa foi observada com as álcool desidrogenases previamente conhecidas de R. erythropolis, com uma diminuição marcada na gama de temperaturas de 45 e 60 °C de uma atividade relativa de 100% para somente 38%.

Tabela 5.

Condições de incubação a 10 min ADI de acordo com (DE 4209022, 1991) nova ADI 45°C 100% (1,7 U/mL) 95% (110 U/mL) 50 °C 91% (1,55 U/mL) 95% (110 U/mL) 55 °C 78 (1,33 U/mL) 99% (115 U/mL) o 0 O 38% (0,65 U/mL) 97% (112 U/mL) O 0 LO 100% (116 U/mL)

Outra diferença notável das álcool desidrogenases de R. erythropolis, associadas a uma melhoria considerável na enantioseletividade, é vista pela comparação da mudança na enantioseletividade durante uma reação usando células de R. 31 erythropolis, o extrato em bruto divulgado na literatura e a nova ADI de R. erythropolis.

Os nossos resultados com células inteiras de R. erythropolis indicam que esta estirpe contém várias ADIs, incluindo pelo menos uma com enantioseletividade oposta. Se as células inteiras que tenham sido imobilizadas com (1,5 mM; 3 mL por h) numa coluna (5 cm de altura empacotada alginato sejam feitas reagir continuamente com p-cloroacetofenona, 1,2 cm de diâmetro; 5,7 mL de volume de empacotamento), é inicialmente obtido (S)-p-cloro-2-feniloetanol enantiomericamente puro na descarga com conversão quase completa. No entanto, este alto valor de ee é retido durante somente cerca de 10 h (cerca de 3 mudanças de volume), depois o valor de ee cai drasticamente enquanto a conversão permanece ao mesmo nivel elevado. Após 25 h (cerca de 9 mudanças de volume), é obtido (S)-p-cloro-2-feniloetanol com 70% de ee e após 50 h (cerca de 18 mudanças de volume) o álcool exibe somente cerca de 5% de ee. A "nova" álcool desidrogenase descrita aqui converte a p-cloroacetofenona completamente na forma enantiomericamente pura. Mesmo quando usada várias vezes ou a concentrações mais elevadas, a formação de (R)-p-cloro-2-feniloetanol nunca é observada. Assim, a enzima foi usada na forma imobilizada repetidamente 11 vezes (ver exemplo 8), em que o produto foi sempre o (S)-álcool enantiomericamente puro.

Compostos oticamente enriquecidos (enantiomericamente enriquecidos, enriquecidos em enantiómero) no contexto desta invenção são entendidos como significando a presença de > 50 mol% de um antípoda ótico misturado com o outro. 32 A expressão sequências de ácido nucleico destina-se a incluir todos os tipos de ADN de cadeia única ou de cadeia dupla e também ARN ou misturas dos mesmos.

Uma melhoria na atividade e/ou na seletividade e/ou na estabilidade significa, de acordo com a invenção, que os polipéptidos são mais ativos e/ou mais seletivos e são mais estáveis sob as condições de reação usadas. Enquanto a atividade e estabilidade de enzimas para aplicação industrial deva naturalmente ser tão alta quanto possível, no que diz respeito à seletividade, uma melhoria é referida como quer quando a seletividade do substrato diminui, quer quando a enantioseletividade das enzimas aumenta. Para a expressão não substancialmente reduzido, usada nesta conexão, a mesma definição aplica-se mutatis mutandis. A expressão "homologia" (ou identidade) como usada aqui pode ser definida pela equação H(%) = [1 - V/X] x 100, onde H significa homologia, X é o número total de núcleobases/aminoácidos na sequência de comparação e V é o número de núcleobases/aminoácidos diferentes na sequência sendo considerada com referência à sequência de comparação. Isto também se aplica à região parcial de uma sequência de gene com as bases 1-948 na Fig. 3. Em cada caso, a expressão sequências de ácido nucleico que codificam polipéptidos inclui todas as sequências que parecem ser possíveis, de acordo com a degeneração do código genético.

Exemplo 1:

Purificação da álcool desidrogenase e obtenção de dados de sequência parciais A R. erythropolis foi cultivada no meio DSM 65 (por 1 litro: 4 g de glucose, 4 g de extrato de levedura, 10 g de 33 extrato de malte; pH 7,2) durante 3 dias a 30°C sob condições aeróbicas. Após recolha das células, estas foram ressuspensas usando um tampão (adição de 1,5 de mL de tampão tris-HCl, pH 7,4 por 1 g de células) e decompostas por moagem com esférulas de vidro. Os constituintes sólidos e os fragmentos de célula foram removidos por centrifugação e o liquido sobrenadante isento de células foi usado como o extrato em bruto para purificação adicional.

Uma primeira purificação pode ser alcançada por cromatografia de permuta iónica (MonoQ-Material, Pharmacia) (tampão móvel: tampão de TAA a 50 mM, pH 7,0; eluição com um gradiente de NaCl de 0-1 M) . Um teste fotométrico (medição a 340 nm) com p-Cl-acetofenona (p-Cl-acetofenona a 1,5 mM, tampão de NADH a 0,25 mM e Kpi a 0,1 M, pH 6,0) mostrou que a enzima desejada é eluida a cerca de NaCl a 0,8 Μ. A fração com a atividade mais alta é tratada com sulfato de amónia (concentração final de 1,8 M) e aplicada numa coluna de fenilosefarose CL-4B (Pharmacia). Para a eluição, um gradiente decrescente de sulfato de amónia (1-0 M) foi usado; a enzima desejada foi depois eluida a quase 0 M de sulfato de amónia. Novamente aqui, a fração mais ativa é também tratada com sulfato de amónia (concentração final de 1 M) e aplicada noutra coluna enchida com butilosefarose FF. A proteina desejada eluiu aquando da aplicação de um gradiente decrescente de sulfato de amónia (1-0 M) a cerca de sulfato de amónia a 0,1 M. O material de proteina obtido nesta fase provou ser suficientemente limpo para ser usado para análise da sequência de aminoácidos (degradação de Edman automatizada usando um Sequenciador Automatizado 4774 (Applied Biosystems) com CLAR 120 A online) . A sequência leu: MKAIQYTRI. 34

Exemplo 2:

Determinação da sequência de gene

Pesquisas em bases de dados mostram que as enzimas que pertencem ao grupo de álcool desidrogenases têm regiões conservadas características. Estas regiões são e.g.: sequência de gene 1 ’ EPELTSIPKPEPGPGEVLLEVTAÃGVÇHSDDF (Seq. 14) «•quénoia de 2: PLTLGHEGAGKVAAVGEGVEGLDIGT (Seq. 15) sequência de gene 3 t CGNCWHCSQGLEMYG (Seq. 16) sequência de gene 4 t HLVPIGDLDPVKTVPLTDAGLTPYHAIKRSLPKLRGGSYAVVIGTGGL (Seq. 17) .

As sequências enfatizadas pelo sublinhado são motivos que podem ser classificados como funcionais: nas sequências 1, 2 e 3, estes são motivos que são responsáveis pela ligação do zinco ("dedo de zinco"), na sequência 4 alguns dos aminoácidos responsáveis pela ligação da NAD.

As sequências destas regiões conservadas podem ser usadas, em conjunto com a sequência N-terminal, para o isolamento do gene para álcool desidrogenases. Para o isolamento da enzima desejada de R. erythropolis, são usados iniciadores degenerados da sequência N-terminal MKAIQYTRI (Iniciador-5") e a sequência YAVVIGTG (Iniciador-3') obtidos da informação da base de dados. 0 seguinte foi usado como o iniciador-5': 5' ATG AAG GCG(C) ATC CAG TAC ACG(C ) CGG{C) ATO 3' (Seq. 3) 35 e o seguinte como o iniciador-3': 5'- GCC GGT ACC AAT(C) GACÍG) AAC(G) CGC GTA~ 3' ÍSeq.

Uma reação de RCP foi realizada com estes iniciadores, por meio da qual um fragmento com cerca de 500 pb de comprimento pôde ser amplificado. A análise de sequência e pesquisas em bases de dados mostrou um alto grau de homologia com a feniloacetaldeido redutase de Corynebacterium sp. e com outras álcool desidrogenases contendo zinco (ver acima).

Para isolar o gene completo, foi preparada uma sonda a partir do fragmento com 500 pb de comprimento e esta foi usada para realizar hibridação de transferência de Southern. De modo a garantir a especificidade da reação de hibridação, foram construídos iniciadores homólogos de sequências internas do fragmento de 500 pb de modo a preparar a sonda.

Os seguintes foram usados como iniciadores homólogos:

InicíiadorH-5 (Seq. 5)

IniciadorH-3 {Seq. 6) 5' -ATC CAG TAC ACG CGC ATC GGC GCG GAA- 3' 5'-GCC TCC GCG AAG TTT CGG CAG AGA ACG-3 '

Pela digestão do ADN genómico com diferentes endonucleases de restrição, foi compilada uma biblioteca de genes e foi obtido um sinal específico a 5,2 kb por hibridação de transferência de Southern subsequente. Isto mostrou que o gene a ser procurado está localizado num fragmento de EcoRI com 5,2 pb de comprimento. 36

Usando iniciadores específicos, derivados dos locais de clivagem de enzimas de restrição e sequências do fragmento de 500 pb, fragmentos adicionais são depois obtidos por meio de RCP, em que, com o auxilio de sequências de ADN sobrepostas e do codão de terminação, a sequência inteira pode ser definida. A partir da estrutura primária, o peso molecular da ADI-RE pode ser determinado, sendo este 36.206 kD. Uma vez que um peso molecular de cerca de 150.000 foi determinado usando filtração com gel (Superdex G-200, Pharmacia), a ADI-RE na forma nativa é uma enzima com uma estrutura tetramérica.

Exemplo 3: Clonagem e expressão heteróloga da ADI-RE a) Clonagem do gene da ADI-RE (tipo selvagem) no vetor PKK223-3

Para a expressão do gene da ADI-RE, o plasmideo pKK223-3 foi primeiramente selecionado (Amersham Pharmacia Biotech). O gene de ADI foi amplificado usando RCP sob as seguintes condições:

Para a desnaturação do ADN, este foi incubado durante 3 min a 94°C. Isto foi depois seguido por 30 ciclos consistindo em:

45 seg ; 94°C 30 seg ; 64°C 110 seg ; 68°C 10 min ; 68°C 6°C

Desnaturação: Emparelhamento: Extensão:

Passo concludente: Arrefecimento: 37 0 volume de reação foi de 50 yL. A AdvanTaq ADN polimerase (CLONTECH) foi usada como polimerase para a reação.

Uma vez que o ADN genómico de R. erythropolis GC era rico (63%), foi adicionado 5% de DMSO à mistura de modo a aumentar a eficácia da reação de RCP. Os seguintes iniciadores de oligonucleótido com locais de clivagem de restrição para as endonucleases de restrição EcoRI e HindIII foram usados (Metabion):

Iniclador-E' : 5' -GCG GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG-3 ' (Seq. 7)

Iniciador—3r: 5'-CGC AAG CTT CTA CAG ACC AGG GAC CAC AAC-3 ' (Seq. 8)

Para clonar o gene, o produto da RCP e o vetor pKK223-3 de ADN plasmidico (1-2 yg) foram digeridos com as endonucleases de restrição EcoRI e HindIII (10 U) (37°C, 2 h). As endonucleases foram inativadas no final da reação pelo aquecimento a 65°C durante 20 min.

As misturas de restrição foram separadas por peso molecular em gel de agarose e o ADN isolado do gel (Conjuntos de

Extração do Gel QIAquick, Qiagen). O vetor pKK223-3 foi desfosforilado (6 U de fosfatase alcalina de camarão), de modo a evitar a religação do ADN do vetor linearizado. Esta reação foi realizada a 37°C durante 1 hora, a enzima foi depois inativada pelo aquecimento a 65°C durante 15 min. 38 0 produto de RCP (inserção) foi ligado com o vetor (quantidades equimolares). A mistura de ligação continha 5 U de ligase T4 e a ligação foi realizada a 25°C.

Para expressar o gene da ADI-RE, o plasmídeo pRE-ADI 1 que foi produzido foi transformado em células de E. coli JM 105 competentes. O crescimento das células de E. coli recombinantes teve lugar em placas de ágar com meio LBarnp (meio LB com ampicilina a 100 yg/mL como marcador de seleção) a 37°C durante 16 h.

As colónias nas placas de ágar foram cultivadas em 5 mL de meio LBamp liquido durante 16 h a 30°C para expressão. Esta cultura foi usada como a pré-cultura para uma cultura principal (inoculados 1:100). A expressão do gene foi induzida a uma densidade ótica (D06oo nm) de 0,3 pela adição de IPTG a 1 mM, as células induzidas continuaram depois a crescer durante outras 16 h a 30°C num agitador cilindrico (120 rpm).

Para o teste de atividade, as células foram recolhidas (15 min de centrifugação a 14000 rpm, 4°C) e degradadas após ressuspensão com tampão KPi a 100 mM, pH 6,0 (1,5 mL de tampão por 1 g de células). Para os propósitos da degradação, a suspensão foi tratada com ultrassons (2 x 30 seg, potência de 100%, pulso de 50), depois o caldo celular foi centrifugado. O liquido sobrenadante é o extrato em bruto solúvel, o sedimento é a fração insolúvel. Ambas as frações foram testadas fotometricamente quanto à atividade da álcool desidrogenase (teste padrão com p-Cl-acetofenona e NADH). Na fração solúvel, foi medida uma atividade de enzima especifica de 6 U/mg (1 U = diminuição de 1 μΜοΙ de NADH por minuto). b) Clonagem do gene da ADI-RE (mutantes) no vetor pKAl 39

De modo a alcançar uma taxa de expressão melhor em E. coli, uma mutação foi introduzida com a qual o codão AGA codificando o aminoácido arginina na posição 8 no codão foi alterado para CGT também codificando a arginina (Substituição de "codões menores") (Chen, G.T., Inouye, M., Nucleic Acids Res. Vol. 18 (1990), 1465; Chen, G.T.,

Inouye, M., Genes Dev. Vol. 8 (1994), 2641). - Produção de mutantes com um codão modificado: O gene foi amplificado usando RCP, em que foram usadas as seguintes condições de RCP:

Para desnaturar o ADN, este foi incubado durante 3 min a 94°C. Isto foi depois seguido por 30 ciclos consistindo em:

45 seg ; 94°C 30 seg ; 64°C 110 seg ; 68°C 10 min ; 68°C 6°C

Desnaturação: Emparelhamento:

Extensão:

Passo concludente: Arrefecimento: 0 volume de reação foi de 50 yL. A AdvanTaq ADN polimerase (CLONTECH) foi usada como polimerase para a reação. Os seguintes iniciadores de oligonucleótido com os locais de clivagem de restrição Ndel e BamHI foram usados:

InÍGÍadQE-5' 5' ~GAG QTC GGT CAT ATG AAG GCA ATC C&G TAC ACG CGT ATC GGC- 3 * (Seq. 9) 0 Iniciador-5' contém a substituição de AGA por CGT. 40

Iniciador-3‘ S'~ CGC GGA TCC CTA CAG ÃCC AGG GAC CAC AAC - 3' <Seq. 10) - Construção do plasmídeo pKAl

Este plasmídeo foi construído a partir do vetor plasmídico pETlla, origem de replicação ColEl (Novagen) e do vetor plasmídico de número de cópias moderado pACYCl84, origem de replicação pl5A (Biolabs). O pETlla contém o gene resistente à ampicilina (Amp) como um marcador de seleção, o pACYC184 contém dois marcadores de seleção, os genes para resistência ao cloramfenicol (Cam) e resistência para a tetraciclina (Tet). 0 plasmídeo pETlla foi digerido com as nucleases de restrição HindIII e NruI. 0 fragmento com 2500 pb de comprimento continha os elementos de expressão lac I, promotor T 7, terminador T 7. Este fragmento foi ligado no plasmídeo pACYC184 através dos locais de clivagem HindIII e NruI. Neste caso, o plasmídeo pACYC184 foi clivado com as duas endonucleases de restrição HindIII e NruI. Isto inativou o gene de resistência à tetraciclina (Tet). O plasmídeo pKAl (comprimento de 5559 pb) que foi produzido foi transformado em E. coli XL1 Blue e plaqueado em placas de ágar com LB com cloramfenicol, 40 yg/mL.

De modo a verificar o comprimento do plasmídeo experimentalmente, duas colónias foram escolhidas das placas de ágar LBcam e cultivadas durante 16 h em 5 mL de LBcam. Os plasmídeos foram isolados e usados para análise de restrição: os plasmídeos foram clivados com EcoRI e o comprimento determinado num gel de agarose (0,8%). Um comprimento de 5559 pb foi determinado desta maneira. Este plasmídeo foi usado para clonar e expressar a ADI-RE. 41

Para a clonagem e a expressão da ADI-RE no vetor pKAl, o fragmento de gene contendo a mutação (ver acima) e o vetor pKAl foram digeridos com as endonucleases de restrição Ndel e BamHI, os fragmentos foram aplicados em gel de agarose a 0,8% e purificados a partir do gel (Conjuntos de Extração do Gel QIAquick, Qiagen) . 0 vetor e a inserção foram ligados (quantidades equimolares). A ligação foi realizada a 25°C com 5 U de ligase T4. O constructo pRE-ADI4 foi primeiramente transformado em células de E. coli XL1 Blue e incubado em placas de ágar com LBcam durante 16 h a 37°C. O sucesso da clonagem foi verificado usando análise de restrição. Aqui cinco colónias foram escolhidas das placas de ágar e os plasmídeos foram isolados (Conjunto QIAprep Spin Miniprep, Qiagen) e sequenciados.

Para a expressão, E. coli BL21 (DE3) foi usada como hospedeiro. As células recombinantes foram multiplicadas no meio LBcam a 37 °C. A uma DOeoo de 0,5, a expressão foi induzida com IPTG a 25 μΜ, depois as células foram multiplicadas durante 12 h a 30 0 0 > ω células foram recolhidas após centrifugação durante 15 min a 5000 rpm, o sedimento foi ressuspenso em tampão Kpi a 100 mM (1,5 mL por 1 g de células) e decompostas usando ultrassons. O extrato em bruto isento de células exibiu uma atividade de enzima de 70 U/mg (medida com p-Cl-acetofenona e NADH).

Exemplo 4:

Comparação bioquímica da álcool desidrogenase de R. erythropolis com a aldeído redutase de Corynebacterium sp.

Quando se compara a sequência de gene para a ADI de R. erythropolis com sequências nas bases de dados, foi mostrado que a ADI-RE tem um alto grau de homologia com uma 42 aldeído redutase de Corynebacterium sp. Na publicação sobre aldeído redutase é descrito um número de propriedades bioquímicas desta enzima (Itoh, N., R. Morihama, J. Wang, K. Okada e N. Mizuguchi (1997), Purification and characterisation of phenylacetaldehyde reductase from a styrene-assimilating Corynbacterium strain, ST-10, Appl. Environ. Microbiol. 63_: 3783-378). Alguns dos substratos (de aldeído) descritos nessa publicação foram portanto também convertidos usando ADI-RE e comparados usando as atividades relativas da redutase. A Tabela 6 resume estes resultados com aldeídos, adicionalmente são também dadas as atividades das duas enzimas no que diz respeito à reação com acetofenona. Comparações adicionais das duas enzimas usando o material de dados publicado não são significativas porque a enzima de Corynebacterium foi exclusivamente testada com o feniloacetaldeído como substrato, mas a ADI-RE foi caracterizada até agora usando a p-Cl-acetofenona.

Tabela 6:

Uma comparação da ADI-RE com a aldeído redutase de Corynebacterium sp. no que diz respeito à atividade para a redução da acetofenona e alguns aldeídos. Os dados sobre a enzima de Corynebacterium foram retirados da publicação por Itoh et al. (ver acima); os dados sobre a ADI-RE são as nossas próprias medições (homogénea = enzima homogénea muito pura). Para uma comparação usando atividades relativas, a atividade das duas enzimas foi dada no que diz respeito ao feniloacetaldeído = 100%. 43

Substrato Corynebacterium Rhodococcus Acetofenonas 22,4 U/mg (homogéneas) 348 U/mg (homogéneas) Feniloacetaldeido 100 100 p-Cl-acetofenona 338 288 Acetofenona 35 87 Valeraldeido 181 433 Aldeido caprilico 1220 522

Os resultados mostraram que as diferenças na sequência exterminai nas duas enzimas resultam também em diferentes propriedades bioquímicas. As atividades das duas enzimas altamente purificadas diferem consideravelmente; a ADI de Rhodococcus é cerca de 15 vezes mais ativa relativamente à acetofenona do que a enzima de Corynebacterium. 0 espetro de substrato relativo também exibe diferenças: a alta atividade da enzima de Corynebacterium relativamente ao aldeido caprilico (12 vezes aquela no que diz respeito à acetofenona) não ocorre com a enzima ADI-RE, aqui a atividade relativamente ao aldeido caprilico é somente 5 vezes aquela relativamente à acetofenona. Igualmente, a razão p-Cl-acetofenona/acetofenona é diferente: para

Corynebacterium, é cerca de 10:1, mas para a ADI-RE é de 3:1.

Estes exemplos mostram que as duas enzimas diferem significativamente uma da outra e estas diferenças são atribuídas às diferenças de sequência na região C-terminal.

Exemplo 5:

Caracterização bioquímica da álcool desidrogenase de R. erythropolis 44 a) Espetro do substrato

Tabela 7: Especificidade do substrato da nova ADI de R. erythropolis para cetonas e cetoésteres. A Tabela 7 dada abaixo mostra que a álcool desidrogenase de R. erythropolis aceita um número de cetonas e de cetoésteres e assim é adequada para a preparação de álcoois secundários aromáticos e alifáticos. Neste caso, a atividade relativa é dada no que diz respeito à atividade medida para a acetofenona.

Substrato Atividade relativa (%) Cetonas Acetofenona 100 p-Cl-acetofenona 1198 m-Cl-acetofenona 2384 p-F-acetofenona 194 p-metilo-acetofenona 640 p-metoxi-acetofenona 232 Fenoxiacetona 4180 Heptan-2-ona 3328 Decan-2-ona 2521 Oxoésteres Acetoacetato de metilo 134 Acetoacetato de etilo 1020 b) Valores de Km

Para a reação de redução, a ADI-RE exibe um valor de Km de 0,5 mM para o substrato p-Cl-acetofenona e para a coenzima NADH de 0,025 mM. Para a reação de oxidação, o valor para a (S)-p-Cl-feniloetanol é de 0,28 mM e o valor para a NAD é de 0,082 mM. c) pH ótimo para a atividade e estabilidade 45 Ο ρΗ ótimo para a ADI -RE é a pH 6,0 para a reação de redução (medido usando p-Cl-acetofenona).

Aquando do armazenamento da enzima a 4°C e à temperatura ambiente durante 1 e 2 dias, não existe desativação na gama 7,5-8,5 (tampão tris-HCl, 0,1 M).

Exemplo 6:

Aplicações preparativas da ADI de R. erythropolis O potência preparativo da enzima será indicado pela reação de alguns ceto-compostos. a) Reações de redução A redução tem de ser acoplada com uma reação de regeneração para a coenzima NADH, por exemplo a reação com formato desidrogenase e formato. No entanto, todas as outras reações que produzem NADH podem ser também usadas. O produto é analisado por meio de cromatografia gasosa, em que a fase estacionária na coluna de GC é capaz de separar os álcoois enantioméricos tal que possa ser obtida informação sobre os valores ee do produto enzimaticamente preparado.

Uma tal mistura para redução contém:

Ceto-composto a 10 mM

NAD a 0,5 mM

formato de Na a 100 mM

Formato desidrogenase a 1 U/mL 46 Álcool desidrogenase a 0,5 U/mL (parcialmente purificada por meio de cromatografia de permuta iónica; as unidades são fotometricamente medidas no teste padrão usando p-Cl-acetofenona e NADH).

Aos tempos 0,5 min e 10 min são tiradas amostras (100 pL), extraídas com 100 pL de clorofórmio e a fase de clorofórmio é analisada usando cromatografia gasosa.

Análise da GC:

Coluna: CP-Chirasil-DEX CB comprimento: 25 m, diâmetro: 25 pm (Chrompack) . Programa de temperaturas: 5 min a 60°C, depois 5°C/min até 190°C (para hexanona/hexanol: 30 min a 60°C, depois 10°C/min até 195°C). Fluxo da coluna 1,3 mL/min; gás: hélio.

Os seguintes foram usados como ceto-compostos: p-Cl-acetofenona, acetofenona, 2-oxobutirato de etilo, 2-hexanona e 2-heptanona. A Tabela 8 resume os dados sobre a pureza do produto. Todos os compostos estavam totalmente convertidos após 10 min; a análise por cromatografia gasosa mostrou que somente um enantiómero foi formado com cada reagente. A enzima reduziu assim os ceto-compostos de uma maneira altamente enantioseletiva. 47

Tabela 8: Prova da pureza do enantiómero dos produtos formados por redução enzimática

Substrato (tempo de retenção) Tempo de retenção do produto Conversão após 10 min [%] ee [%] do produto Acetofenona (16,9 min) 21,2 min > 95% > 99% 4-Cl-acetofenona (21,8 min) 24,2 min > 95% > 99% 2-oxobutirato de etilo (10,4 min) 14,1 min > 95% > 99% 2-hexanona 22,4 min > 95% > 99% 2-heptanona 15,2 min > 95% > 99% b) Reações de oxidação

Por meio da oxidação enantioseletiva de um álcool, um álcool enriquecido em enantiómero ou puro em enantiómero, por exemplo, pode ser obtido a partir de um racemato. A titulo de exemplo, isto foi demonstrado para a produção de (R)-feniloetanol: 0 que se segue foi usado: (R,S)-feniloetanol a 10 mM, NADH a 0,5 mM, tampão tris-HCl a 50 mM pH 7,5 com DTT a 2 mM, 1 U de ADI de R. erythropolis e 2 U de NADH oxidase (de Lactobacillus brevis DSM 20054 de acordo com DE10140088).

Foram tiradas amostras após 0, 1 e 2 h e separadas por cromatografia gasosa (coluna: CP-Chirasil-DEX CB comprimento: 25 m, diâmetro: 25 pm (Chrompack). Programa de temperaturas: 5 min a 60°C, depois 5°C/min até 190°C; taxa de fluxo da coluna 1,3 mL/min; gás: hélio. Neste caso, quer o pico da acetofenona (produto; tempo de retenção = 16,9 min) , quer também os enantiómeros do feniloetanol 48 (reagentes; tempos de retenção R-feniloetanol = 20,8 min e S-feniloetanol = 21,1 min) foram registados. A análise mostrou que o (S)-feniloetanol estava totalmente oxidado após 2 h e numa quantidade correspondente do produto da oxidação acetofenona pôde ser encontrada por cromatografia gasosa. O (R)-feniloetanol permaneceu intocado logo um valor de ee de > 99% é obtido para este enantiómero.

Exemplo 7:

Imobilização da enzima A ADI-RE pode ser imobilizada usando uma variedade de métodos de acoplamento e materiais de suporte. Por exemplo, a enzima pode ser ligada a materiais de suporte tais como Eupergit® através de uma ligação covalente. a) Imobilização em Eupergit® (nome comercial; Rõhm/Degussa)

Eupergit® e Eupergit C 250L® foram usados em misturas paralelas, cada uma sendo carregada com ADI-RE parcialmente purificada (referência de literatura relacionando-se com a imobilização do Eupergit: E. Katchalski-Katzir, D.M. Kraemer, J. Mol. Catai. B: Enzym. 2000, 10, 157). 0 que se segue foi usado para o teste: p-Cl-acetofenona a 1,5 mM (dissolvida em tampão de formato de Na a 0,1 M, tampão KPi a 0,05 M, pH 6,0) NAD a 0,5 mM 30 mg de imobilizado 49

Formato desidrogenase (FDI) a 1 U/mL

Estes materiais de teste foram incubados a 30°C, uma amostra (100 pL) foi retirada de cada mistura após 0, 5, 10 e 15 min, esta foi extraída com 100 pL de clorofórmio e a fase de clorofórmio foi analisada para qualquer feniloetanol formado usando cromatografia gasosa. A atividade da enzima imobilizada pode ser calculada a partir da cinética da formação do feniloetanol e foram obtidos valores de 11,8 U/g de suporte para o Eupergit® e 8 U/g de suporte para o Eupergit C 250L®. No que diz respeito à quantidade de enzima usada, esta correspondeu a rendimentos de acoplamento de 1% (Eupergit®) e de 0,8% (Eupergit C 250L®) .

b) Imobilização em Ni-ANT

Para a imobilização em Ni-ANT, a enzima foi proporcionada com um His-Tag (hexa-histidina) no terminal-C, usando técnicas de engenharia genética. - Modificação do gene de ADI-RE:

Os seguintes iniciadores de nucleótidos foram construídos de modo a produzir um grupo de hexa-histidina no terminal-C:

Inicíack>r-5' J 5'- GGT GAA TTC ATG AAG GCA ATC CAG TAC ACG CGT ATC GGC -3 f - ÍSeq, 11>

Uma mutação silenciosa para o aminoácido na posição 8 (substituição do codão de arginina AGA por CGT) através do Iniciador-5'. 50

Iiiiciad.oi?-3' * 5 * - CGC .AAG CTT CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CAG ACC AGG GAC - 3' ÍSeq. 12}

Este iniciador, com 6 codões para histidina, facilita a introdução de 6 grupos de histidina no terminal-C da ADI-RE. O gene foi amplificado com estes iniciadores usando RCP sob as condições descritas previamente. O vetor plasmídico pKK223-3 e o produto de RCP foram digeridos com EcoRI e HindIII. Após ligação dos dois fragmentos (reação a 25°C com 5 U de ligase T4) , o plasmideo pRE-ADI5 produzido foi primeiramente transformado em E. coli XL1 Blue e incubado com meio LBamp durante 16 h a 37°C em placas de ágar. O sucesso da clonagem pode ser monitorizado usando análise de restrição. Para a expressão, o vetor pRE-ADI5 foi transformado em E. coli JM105 e cultivado durante 16 h em meio LBamp a 37 °C. Aquando do alcance de uma DO50 de 0,5, a expressão de gene foi induzida pela adição de IPTG a 1 mM. Após 12 horas adicionais de crescimento, as células puderam ser recolhidas e a atividade da ADI-RE testada.

Foi medida uma atividade da enzima de 7 U/mg. Este valor de atividade mostrou que a modificação do gene pela ligação de um grupo de hexa-histidina ao terminal-C não teve efeito na atividade da enzima. - Realização da imobilização: Células de E. coli JM105/pRE-ADI5 recombinantes foram decompostas num tampão contendo imidazol (NaH2P04 a 50 mM; NaCl a 300 mM; imidazol a 10 mM, pH 8,0) e um extrato em bruto foi preparado da maneira descrita previamente. Para a 51 imobilização, 1 mL de solução de enzima (ADI-RE a 13 U/mL, extrato em bruto da cultura de E. coli JM105/pRE-ADI5; 8 mg/mL de proteína) foi adicionado a 300 mg de material de suporte de Ni-ANT (Qiagen) e incubado durante 10 min a 0°C (banho de gelo) . Após centrifugação da suspensão, 3 U/mL podiam ainda ser detetados como atividade residual no líquido sobrenadante como enzima não ligada. O imobilizado foi feito reagir com p-Cl-acetofenona para detetar a atividade ligada.

Para este propósito, o que se segue foi usado por 1 mL de volume total: 30 mg de imobilizado p-Cl-acetofenona a 3 mM (substrato; dissolvida em formato de Na a 100 mM, tampão Kpi a 50 mM pH 6,0)

NAD a 0,5 mM 1 U de formato desidrogenase A mistura de teste foi incubada da mesma maneira como descrita acima (imobilização em Eupergit®) , foram tiradas amostras e estas foram analisadas usando cromatografia gasosa. A Fig. 2 mostra a cinética da reação; com base na cinética da formação do p-Cl-feniloetanol, uma atividade de 0,21 U pode ser calculada daí. Tomando em consideração o facto de que este teste foi realizado com 30 mg de imobilizado e que 10 U de ADI-RE se tinham ligado a 300 mg de material de suporte, 1 U foi assim introduzido na mistura de teste com os 30 mg. Uma vez que foi registada uma atividade de 0,21 U, foi obtido um rendimento de imobilização de 21%. A pureza do enantiómero (valor ee) do álcool formado com o imobilizado foi > 99%. 52

PROTOCOLO DA SEQUÊNCIA <110> Degussa AG <120> Álcool desidrogenase de Rhodococcus erythropolis

<130> 020137 AM <140> <141> <160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 1047 <212> ADN <213> Rhodococcus erythropolis <22 0>

<221> SCA <222> (1) .. (1047) <4 0 0> 1 53 atg aag gca ate cag tac acg aga ate ggc gcg gaa ccc gaa etc acg 48 Met Lys Ala Ile Gin Tyr Thr Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 gag ate cec aaa ccc gag CCC ggt cca ggt gaa gtg etc ctg gaa gtc 96 Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Vai Leu Leu Glu Val 20 25 30 acc gct gee ggc gtc tgc cac teg gac gac ttc ate atg age ctg ccc 144 Thr Ala Ala Giy Vai Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro 35 40 45 gaa gag cag tac aec tac ggc ctt ccg etc acg etc ggc cac gaa ggc 192 Glu Glu Gin Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly 50 55 50 gca ggc aag gtc gee gee gtc ggc gag ggt gtc gaa ggt etc gac ate 240 Ala Gly Lys Vai Ala Ala Vai Gly Glu Gly Vai Glu Gly Leu Asp Ile 65 70 75 80 gga acc aat gtc gtc gtc tac ggg cct tgg ggt tgt ggc aac tgt tgg 288 Gly Thr Asn Vai Vai Vai Tyr Gly Pro Trp Gly Cys giy Asn Cys Trp 85 90 95 cac tgc tea caa gga etc gag aac tafc tgc tet ege gee caa gaa etc 336 His Cys Ser Gin Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gin Glu Leu 100 105 110 gga ate aat cct ccc ggt etc ggt gca ccc ggc gcg ttg gee gag ttc 384 Gly ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe 115 120 125 atg ate gtc gat tet cct ege cac ctt gtc eeg ate ggt gac etc gac 432 Met Ile Vai Asp Ser Pro Arg His Leu Vai Pro Ile Gly Asp Leu Asp 130 135 140 ccg gtc aag acg gtg ccg ctg acc gac gee ggt ctg acg ccg tat cac 480 Fro Vai Lys ' Thr ' Vai Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pxo Tyr His 145 150 155 160 gcg ate aag egt tet ctg ccg aaa ctt ege gga ggc teg tac gcg gtt 528 Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val 165 170 175 gtc att 831 acc ggc ggg etc ggc cac gtc gee att cag etc etc egt 576 Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His val Ala Ile Gin Leu Leu Arg 180 185 190 cac etc teg gcg gca acg gtc ate gct ttg gac gtg age gcg gac aag 624 His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp val Ser Ala Asp Lys 195 200 205 etc gaa ctg gca acc aag gta ggc gct cac gaa gtg gtt ctg toe gac 672 Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Giy Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp 210 215 220 aag gac ©cg gee gag aac gtc ege aag ate act gga agt caa ggc gee 720 Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Lys lie Thr Gly Ser Gin Gly Ala 225 230 235 240 54 gca Ala ctg leu gtt Vai etc gac Leu Asp 245 ttc Phe gtc Vai ggc Gly tac Tyr cag Gin 250 ccc Pro acc Thr ate Ile gac Asp acc gcg Thr Ala 255 768 atg Mst gcc Ala gtc Vai gcc Ala 260 ggc Gly gtc Vai gga Gly tea Ser gac Asp 265 gtc Val acg Thr ate Ile gtc Val ggg Gly 270 ate ggg Ile Gly 816 gac Asp ggc Gly cag Gm 275 gcc Ala cac His gcc Ala aaa Lys gtc Val 280 ggg Gly ttc Phe ttc Phe caa Gin agt Ser 285 ect Pro tac Tyr gag Glu 864 gct Ala tcg Ser 290 gtg Vai aca Thr gtt Val ccg Pro tat Tyr 295 tgg Trp ggt Gly gcc Ala ege Arg aac Asn 300 gag Glu ttg Leu ate Ile gaa Glu 912 fctg leu 305 ata Ila gac Asp cte Leu gcc Ala cac His 310 gcc Ala ggc Gly ate Ile ttc Phe gac Asp 315 ate Ile gcg Ala gtg Val gag Glu acc Thr 320 960 ttc Phe agt Ser cfcc Leu gac Asp aac Asn 325 ggt Gly gcc Ala gaa Glu gcg Ala tat Tyr 330 cga Arg cga Arg ctg Leu gct Ala gcc gga Ala Gly 335 1008 acg Thr cta Leu age Ser ggc cgt Gly Arg gcg Ala gtt Val gtg Val gtc Val cct Pro ggt Gly ctg Leu tag 1047 340 345

<210> 2 <211> 348 <212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis <400> 2 55

Met L ys Ala Ile Gin Tyr Thr Arg Ile GlY Ala Glu Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Vai Leu Leu Glu Vai 20 25 30 Thr Ala Ala Gly Vai Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro 35 40 45 Glu Glu Gin Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 Ala Gly Lys Vai Ala Ala Vai Gly Glu Gly Vai. Glu Gly Leu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Thr Asn Vai Vai Vai Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp 85 90 95 His Oys Ser Gin Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gin Glu Leu 100 105 110 Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe 115 120 125 Met Ile Vai Asp Ser Pro Arg His Leu Vai Pro Ile Gly Asp Leu Asp 130 135 140 Pro Vai Lys Thr Vai Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His 145 150 155 160 Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Vai 165 170 175 Vai Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Vai Ala Ile Gin Leu Leu Arg 180 185 190 His Leu Ser Ala Ala Thr Vai Ile Ala Leu Asp Vai Ser Ala Asp Lys 195 200 205 Leu Glu Leu Ala Thr Lys Vai Gly Ala His Glu Vai Vai Leu Ser Asp 210 215 220 Lys Asp Ala Ala Glu Asn Vai Arg Lys Ile- Thr Gly Ser Gin Gly Ala 225 230 235 240 Ala Leu Vai Leu Asp Phe Vai Gly Tyr Gin Pro Thr Ile Asp Thr Ala 245 250 255 Met Ala Vai Ala Gly Vai Gly Ser Asp Vai Thr Ile Vai Gly Ile Gly 260 265 270 Asp Gly Gin Ala His Ala Lys Vai Gly Phe Phe Gin Ser Pro Tyr Glu 275 280 285 Ala Ser Vai Thr Vai Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu 290 295 300 Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Ala Vai Glu Thr 305 310 315 320 Phe Ser Leu Asp Asn Gly Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Ala Gly 325 330 335 Thr Leu Ser Gly Arg Ala Vai Vai Vai Pro Gly Leu 340 345

<210> 3 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência sintética 56 <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: Iniciador-5' <4 0 0> 3 atgaaggcsa tccagtacac scgsatc <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: Iniciador-3' <4 0 0> 4 gccggtacca aygasaascg cgta <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: IniciadorH-5' <4 0 0> 5 atccagtaca cgcgcatcgg egcggaa <210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: IniciadorH-3' 57 27 <4Ο0> 6 gectccgega agtttcggca gagaacg <210> 7 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência <4 0 0> 7 gcggaattca tgaaggcaat ccagtacacg <210> 8 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência <4 0 0> 8 cgeaagcttc tacagaccag ggaccacaac <210> 9 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência 30 30 <400> 9 42 gaggtcgafcc atafcaaaggc aatccagtac acgcgtatcg ge 58 <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: <4 0 0> 10 cgcggatccc taeagaceag ggaccacaac <210> 11 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: <4 0 0> 11 ggtgaattca tgaaggcaat ccagtacacg cgtatcggc <210> 12 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: Iniciador-3 Iniciador-5 Iniciador-3 <4 0 0> 12 cgcaagcttc tagtggtggt ggfeggtggfcg cagaccaggg ac 30 <210> 13 <211> 510 59

<212> ADN <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: sonda de gene <400> 13 atccagcaca cgagaatcgg cgcggaaccc gaactcacgg agafctcccaa acccgagcce 60 ggtccaggCg aagtgctcct ggaagtcaçc gcfcgccggcg tctgec&ctc ggacgacttc 120 atcatgagcc fcgcccgaaga geagtacacc tacggccfctc cgctcacgct cggccacgaa 180 ggcgcaggca aggtcgccgc cgtcggcgag ggtgtcgaag gtctcgacafc cggaaccaat 240 gtcgtcgtct acgggccttg gggttgtggc aactgttggc actgctcaca aggactcgag 300 aactattgct ctcgcgccca agaactcgga atcaatcctc ccggtctcgg tgcacccggc 360 gcgttggccg agfctcatgat cgtcgattct cctcgccacc ttgtecegat cggtgacctc 420 gacccggtca agacggtgcc gctgaccgac gccggtctga cgccgtatca cgcgatcaag 480 cgfcfcctctgc egaaaefctcg cggaggctcg S10

<210> 14 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: regiões conservadas <400> 14

Glu Pr o Glu Leu Thr Glu lie Pro Lys Fro Glu Pr o <3ly Pro Gly Glu 15 10 15

Vai Leu Leu Glu Vai Thr Ala Ala Gly Vai Cys Eis Ser Asp Asp Phe 20 25 30

<210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: regiões conservadas 60 <4 0 0> 15

Cys Gly Asn Cys Trp His Cys Ser Gin Gly Leu Gin Asn Tyr Cys 15 10 15 <210> 16 <211> 15

<212> PRT <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: regiões conservadas <400> 16

Cys Gly Asn Cys Trp His Cys Ser Gin Gly Leu Glu Asn Tyr Cys 1 S 10 15

<210> 17 <211> 48 <212> PRT <213> Sequência sintética <22 0> <223> Descrição da sequência sintética: regiões conservadas <4 0 0> 17

His Leu Vai Fro Ile Gly Asp Leu Asp Pro Vai Lys Thr Vai Pro Leu 15 10 15

Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro 20 25 30

Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Vai Vai Ile Gly Thr Gly Gly Leu 35 40 45

Lisboa, 30 de Abril de 2013

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um polipéptido com atividade de álcool desidrogenase, tendo uma sequência de ácido nucleico com a sequência dada na Seq. ID NO: 1.

2. Um polipéptido escolhido do grupo a) polipéptidos codificados por uma sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 1 b) um polipéptido tendo uma sequência de acordo com a Seq. ID NO: 2.

3. Plasmideos, vetores, microrganismos tendo um ou mais ácidos nucleicos de acordo com a Reivindicação 1.

4. 0 uso dos polipéptidos de acordo com a Reivindicação 2 para preparar compostos orgânicos enriquecidos em enantiómero quirais tais como e.g. aminoácidos ou álcoois.

5. Uso das sequências de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 1 para preparar catalisadores de célula inteira.

6. Catalisadores de célula inteira tendo um gene clonado para uma álcool desidrogenase dependente de NADH de acordo com a Reivindicação 1 e um gene clonado para uma formato desidrogenase ou NADH oxidase.

7. Um catalisador de célula inteira de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por 2 a formato desidrogenase ser derivada da formato desidrogenase de Candida boidinii e a NADH oxidase ser derivada da NADH oxidase de Lactobacillus brevis.

8. Um sistema de reação enzimática acoplado tendo uma transformação enzimática dependente de cofator de um composto orgânico com um polipéptido de acordo com a Reivindicação 2 e regeneração enzimática do cofator.

9. Um sistema de reação de acordo com a Reivindicação 8 caracterizado por a regeneração enzimática ser realizada com uma formato desidrogenase derivada da formato desidrogenase de Candida boidinii ou uma NADH oxidase derivada da NADH oxidase de Lactobacillus brevis.

10. Uso do catalisador de célula inteira da Reivindicação 6 num processo para a redução assimétrica de cetonas. Lisboa, 30 de Abril de 2013