DE10337614A1 - Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen D-Aminosäuren gerichtet. Insbesondere wird dabei ein Gemisch aus D- und L-Aminosäuren derart mit einem enzymatischen Reaktionssystem behandelt, dass die L-Form der Aminosäure aus dem System entfernt wird, so dass nur die D-Form der Aminosäure übrig bleibt. DOLLAR A Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein derart arbeitendes Reaktionssystem sowie ein für das erfindungsgemäße Verfahren einsetzbarer Ganzzellkatalysator.

Description

• Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen D-Aminosäuren gerichtet. Insbesondere wird dabei ein Gemisch aus D- und L-Aminosäuren derart mit einem enzymatischen Reaktionssystem behandelt, dass die L-Form der Aminosäure aus dem System entfernt wird, so dass nur die D-Form der Aminosäure übrig bleibt.
• Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein derart arbeitendes Reaktionssystem.
• Enantiomerenreine D-Aminosäuren und insbesondere deren sterisch anspruchsvolle Vertreter stellen nach wie vor lohnende Ziele für die organische Synthese dar, können sie doch als Zwischenstufen für die Herstellung von bioaktiven Molekülen oder Katalysatoren von Nutzen sein.
• Zur Herstellung von enantiomerenreinen sterisch anspruchsvollen D-Aminosäuren wurden bis dato eine Reihe von chemischen und biokatalytischen Racematspaltungen entwickelt.
• In der DE1952911 erfolgt deren Herstellung über die enzymatische Racematspaltung mittels Hydantoinasen. Allerdings wird hier eine zweite, nachgeschaltete chemische Reaktion zur Spaltung des entstandenen N-Carbamoyl-Intermediats benötigt. Damit erhöht sich die Gesamtzahl an Reaktionsschritten ausgehend von der racemischen Aminosäure auf drei, angefangen von der Überführung in das racemische Hydantoin, der Bildung der optisch aktiven N-Carbamoyl-D-Aminosäure und der bereits erwähnten N-Decarbamoylierung. Eine weitere Methode zur Herstellung von sterisch anspruchsvollen D-Aminosäuren am Beispiel von D-tert-Leucin wird von Laumen et al. beschrieben [K. Laumen et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65, 1977-1980.]. Hierbei erfolgt eine enzymatische Esterhydrolyse von racemischem N-Acetyl-tert-Leucinchlorethylester. Problematisch erscheint bei dieser Route neben der bei Esterhydrolysen generell auftretenden potentiellen Bildung von Amiden als unerwünschte Nebenprodukte auch die Gesamtzahl an Verfahrensschritten, bestehend aus einer (zweistufigen) Derivatisierung der racemischen Aminosäure, gefolgt von der enzymatischen Racematspaltung und von der Abspaltung der N-Acetylgruppe.
• Ein Reaktionssystem, welches auf der gekoppelten Reaktion einer Leucindehydrogenase (LeuDH), NAD(H) und einer NADH-Oxidase beruht, und L-Aminosäuren oxidiert, ist von Kiba et al. für analytische Zwecke entwickelt worden. Gemessen werden die Blutwerte von verzweigtkettigen L-Aminosäuren, wobei das hierbei entstehende H₂O₂ mittels Luminol-Fluoreszens ausgewertet wird (Kiba et al. Analyt. Chim.
• Acta 1998, 375, 65-70; Kiba et al. J. Chrom. 1996, 724, 354-7).
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein weiteres Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten, insbesondere sterisch anspruchsvollen D-Aminosäuren anzugeben, welches die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik überwinden hilft. Insbesondere sollte das gegenständliche Verfahren im technischen Maßstab im Hinblick auf ökonomische und ökologische Gesichtspunkte und gerade auch in Bezug auf die Anzahl der Syntheseschritte Vorteile bieten.
• Diese und weitere nicht näher ausgeführte sich jedoch aus dem Stand der Technik dem Fachmann in naheliegender Weise erschließende Aufgaben werden durch ein Verfahren, das Gegenstand des Anspruchs 1 ist, gelöst. Ansprüche 2 bis 8 beziehen sich auf bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Anspruch 9 ist auf ein Reaktionssystem gerichtet. Anspruch 10 schützt einen erfindungsgemäß arbeitenden Ganzzellkatalysator.
• Dadurch, dass man in einem Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren ein Gemisch aus D- und L-Aminosäuren mit einem enzymatischen Reaktionssystem aufweisend eine Leucindehydrogenase (LeuDH), NAD(H) oder NADP(H) und ein Mittel zur Oxidation von NRDH oder NADPH ausgewählt aus der Gruppe enthaltend eine NADH-Oxidase bzw. eine elektrochemische Anordnung zur Reaktion bringt, gelangt man überraschenderweise zur vorteilhaften Lösung der gestellten Aufgabe.
• Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, in einem Schritt auch sterisch anspruchsvolle D-Aminosäuren in hohen Enantiomerenreinheiten ausgehend vom leicht zugänglichen racemischen Gemisch, herzustellen. Die Umsetzung wird durch nachfolgendes Schema beispielhaft veranschaulicht.
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• Die Abkürzung NOX steht dabei für NADH-Oxidase. Alternativ kann anstelle dieser in obiger Abbildung geschilderten enzymatischen Oxidation auch eine elektrochemische Oxidation des Cofaktors NADH unter Bildung von NAD⁺ erfolgen.
• Dass das gegenständliche Verfahren mitnichten nahegelegen ist, geht aus der überraschenden Tatsache hervor, dass – wie im Vergleichsbeispiel 1 erwähnt – eine ähnlich wirkende PheDH aus Rhodococcus sp. aufgrund von Inhibierungseffekten im vorliegenden Verfahren nicht einsetzbar ist. Inhibierungseffekte können insbesondere durch die im Substratgemisch vorliegende D-Aminosäurekomponente, die im Falle eines Racemats bei 50%-Mengenanteil liegt, hervorgerufen werden. Im Gegensatz zur biokatalytischen Oxidation reiner L-Aminosäuren wäre demnach gerade beim Einsatz von Racematen mit einer erheblichen Verminderung der Reaktionsrate bzw. mit einer unvollständigen Bildung der D-Aminosäure zu rechnen gewesen.
• Nicht minder vorteilhaft ist der Aspekt zu bewerten, dass keine zusätzlichen ggf. Nebenprodukte bildenden Hilfsreagenzien in die Synthese eingesetzt werden, welche mühsam wieder abgetrennt werden müssen. Dies hilft weiterhin Stoffeinsatzkosten sparen.
• Die Mittel, die zur Oxidation von NADH oder NADPH eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt. Es sind dies insbesondere die NADH-Oxidasen. Besonders geeignete Vertreter sind in der EP1285962 und der dort zitierten Literatur beschrieben (s. auch weiter unten). Auch elektrochemische Verfahren können hier zur Anwendung kommen. Die prinzipielle Eignung der elektrochemischen Oxidation zur Regenerierung von NAD⁺ aus NADH findet sich beispielsweise – für Oxidationsreaktionen mit Alkoholen – beschrieben in Kelly, R. M.; Kirwan, D. J., Biotechnol. Bioeng. 19 (1977) 1215-1218 und Schroder, I.; Steckhan, E.; Liese, A. Journal of Electronanalytical Chemistry 541 (2003) 109-115. Eine Übersicht über diesbezügliche elektrochemische Arbeiten findet sich in Gorton, L. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions 1' Physical Chemistry in Condensed Phases 82 (1986) 1245-1258.
• Vorteilhaft ist der Einsatz von sterisch besonders anspruchsvollen Aminosäuren. Sterisch anspruchsvoll bedeutet im vorliegenden Fall solche Aminosäuren mit einem verzweigten Rest in α-Stellung zur Carboxylgruppe. Als sterisch anspruchsvoll können z.B. die in EP692538 diesbezüglich erwähnten Verbindungen angesehen werden. Dies sind insbesondere Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend tert.-Leucin, Neopentylglycin, Adamantylglycin.
• Als Leucindehydrogenase kann im Prinzip jede dem Fachmann geläufige und für den ins Auge gefassten Zweck zu verwendende LeuDH eingesetzt werden. LeuDHs können z.B. gefunden werden in A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg.: K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Kapitel 15.3. Bevorzugt zum Einsatz kommen kann die LeuDH gemäß der aus Bacillusarten. Ganz besonders bevorzugt ist diejenige gemäß der aus Bacillus cereus, B. stearothermophilus oder B. sphaericus. Es sei angemerkt, dass die erwähnten Enzyme auch als weiterentwickelte und durch Mutagenese verbesserte Mutanten, in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kommen können. Mutageneseverfahren, die eine verbesserte Stabilität, beispielsweise Thermostabilität, Lagerstabilität, und/oder Selektivität der LeuDH hervorbringen können, sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese, die Random-Mutagenesis, Shuffling-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis (Eigen M. and Gardinger W. (1984) Evolutionary molecular engineering based on RNA replication. Pure & Appl. Chem. 56(8), 967-978; Chen & Arnold (1991) Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073-1077; Horwitz, M. And L. Loeb (1986) "Promoters Selected From Random DNA-Sequences" Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America 83(19): 7405-7409; Dube, D. And L. Loeb (1989) "Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene" Biochemistry 28(14): 5703-5707; Stemmer PC (1994). Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature. 370; 389-391 und Stemmer PC (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 91; 10747-10751). Unter verbesserter Selektivität wird erfindungsgemäß entweder eine Erhöhung der Enantioselektivität und/oder eine Verringerung der Substratselektivität unter Erreichen eines breiteren Substratspektrums verstanden.
• NADH-Oxidasen, die beim gegenständlichen Verfahren einsetzbar sind, sind dem Fachmann geläufig (Nishiyama, Y. et al. J. Bacteriol. Vol. 183 (2001), 2431-2438; Lopez de Felipe, F. et al., J. Bacteriol. Vol. 180 (1998), 3804-08;). Vorzugsweise werden solche eingesetzt, die als Reduktionsprodukt in irreversibler Weise inertes Wasser liefern, da hierdurch eine Nebenproduktbildung im Gegensatz zu Wasserstoffperoxyd bildenden NADH-Oxidasen vermieden werden kann. Diese können z.B. aus dem Organismus Lactobacillus stammen. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz der NADH-Oxidase gemäß der aus Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis. Eine ganz besonders bevorzugt einsetzbare NADH-Oxidase kann der DE1014088 entnommen werden. Bezüglich des Einsatzes von verbesserten Mutanten sei auf das oben in Bezug auf LeuDHs Gesagte verwiesen.
• Bevorzugt wird im vorliegenden Verfahren das enzymatische Reaktionssystem in Form eines Ganzzellkatalysators eingesetzt, der klonierte Gene für beide Enzyme aufweist. Bevorzugt sollte der erfindungsgemäße Ganzzellkatalysator eine NADH-Oxidase bzw. Leucindehydrogenasen aufweisen. Insbesondere die oben angesprochenen Vertreter sind im besonderen Maße geeignet.
• Die Herstellung eines solchen Organismus ist dem Fachmann geläufig (PCT/EP00/08473; PCT/US00/08159; Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F. 1990; Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymology 185, 14-37; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R.L. Rodriguez & D.T. Denhardt, Eds: 205-225).
• Der Vorteil eines solchen Organismus ist die gleichzeitige Expression beider Enzymsysteme, womit nur noch ein rec-Organismus für die Reaktion angezogen werden muss. Um die Expression der Enzyme im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die entsprechend codierenden Nukleinsäurefragmente auf unterschiedlichen Plasmiden mit unterschiedlichen Kopienzahlen untergebracht werden und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Gene verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (PCT/EP00/08473; Gellissen et al,. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 46, 46-54). Als Organismus kann vorteilhafterweise der der DE10155928 herangezogen werden.
• Das Verfahren wird vorzugsweise bei pH-Werten im Bereich von 4 bis 9, besonders bevorzugt bei 5 bis 8 durchgeführt. Der Temperaturbereich liegt in der bevorzugten Ausführungsform bei 15 bis 100°C, bevorzugt bei 20 bis 50 °C, und insbesondere bei 25 bis 40°C.
• Vorteilhaft kann es auch sein, dass Verfahren in einem Zweiphasengemisch aus Wasser und einer organischen Phase, in dem sich die Ketosäure sehr gut löst, durchzuführen. Die enzymatische Reaktion findet dabei in der wässrigen Phase statt, wobei die entstehende Ketosäure sich in der organischen Phase anreichert und so gut vom restlichen Substanzgemisch getrennt werden kann.
• Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein enzymatisches Reaktionssystem aufweisend eine Leucindehydrogenase (LeuDH), NAD(H) oder NADP(H) und eine NADH-Oxidase sowie ein Gemisch aus der D- und L-Form einer Aminosäure. Ein solches System ist bisher in der Literatur nicht beschrieben worden und kann ganz besonders vorteilhaft – wie dargelegt – zur Herstellung von D-Aminosäuren eingesetzt werden.
• Für die Anwendung kann das jeweils betrachtete Enzym in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindung verwendet werden. Weiterhin kann das Enzym auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus. Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing, "Immobilisierte Biomaterialien – Techniken und Anwendungen", Angew. Chem. 1982, 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Dordick et al. J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009-5010; Okahata et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1971-1974; Adlercreutz et al. Biocatalysis 1992, 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Goto et al. Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375-378). Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St Clair et al. Angew Chem Int Ed Engl 2000 Jan, 39(2), 380-383).
• In einer generellen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird ein racemisches Gemisch einer vorzugsweise aliphatischen Aminosäure in Wasser bei pH-Werten um 8,5 gelöst und mit einem entsprechend gepufferten Medium aufweisend NAD⁺, LeuDH und NADH-Oxidase kontaktiert. Dabei beginnt die Umsetzung der L-Aminosäure zur entsprechenden Ketosäure. Übrig bleibt die enantiomerenreine D-Aminosäure, die leicht nach gängigen Methoden aus dem vorliegenden Reaktionsgemisch abgetrennt und isoliert werden kann.
• Eine extrem vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung bietet sich, wenn man die bei der Reaktion entstehende Ketosäure wieder reduktiv aminiert. Dies kann entweder nicht selektiv oder beliebig stark D-selektiv geschehen. Aus einem Ansatz Racemat lassen sich so bis zu 100% der D-Aminosäure erhalten, wenn man den beschriebenen Zyklus mehrmals hintereinander ausführt (Schema nachfolgend).
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• Diese in situ-verlaufende reduktive Aminierung kann dabei nach dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen. Denkbar sind chemokatalytische Hydrier- oder auch enzymatische Verfahren.
• Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten, enantiomerenreinen) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in >50 mol-% verstanden.
• Der Organismus Lactobacillus brevis DSM 20054 oder Lactobacillus kefir DSM 20587 ist bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen unter der entsprechenden Nummer hinterlegt und öffentlich zugänglich. Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als von der Offenbarung mitumfasst.
• Das Verfahren wird durch die nachfolgenden Beispiele verdeutlicht.
• Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
• Bei der Anwendung der Aminosäure-Dehydrogenasen für die Racemattrennung zur Gewinnung enantiomerenreiner D-Aminosäuren ist aufgefallen, dass bei der Phenylalanin-Dehydrogenase (PheDH), anders als bei der LeuDH, kein Umsatz beobachtet wurde (Nachweis jeweils über HPLC). Es wurden daher Photometertests durchgeführt, um den Einfluss von D-Phe und Phenylpyruvat auf die Oxidierbarkeit von L-Phe zu testen. Der Assay wurde gemäß nachfolgendem photometrischen Assay für Phe-DH (Rhodococcus sp.) durchgeführt:

  
• Gemessen wurden Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeiten, die als Aktivität in nachfolgender 1 aufgetragen sind. Die Abbildung zeigt, dass die Oxidation von L-Phe durch 5 mM D-Phe stark inhibiert wird. Auch das Oxidationsprodukt Phenylpyruvat hemmt die Oxidation von L-Phe. Ein Einsatz der PheDH für die Racemattrennung ist daher nicht möglich (1).
• Beispiel 2
• Das Volumen der Reaktionsmischung zur enzymatischen Oxidation beträgt 1 mL. Diese Reaktionsmischung, die 290 μl Trispuffer (50 mM, pH 8.0), 100 μl D,L-tert-leucine (100 mM), 10 μl NAD+ (20 mM), 100μl NADH-Oxidase (42U·mL^–1), und 500 μl Leucindehydrogenase (0.5 U·mL^–1) enthält, wird bei 30°C inkubiert. Eine Unit-Einheit der Leucindehydrogenase entspricht dabei der Menge an Leucindehydrogenase, die die Oxidation von 1μmol L-tert-Leucin pro Minute katalysiert in Gegenwart von 20 mM D,L-tert-Leucin bei pH 8.0 (0.1 M Kaliumphosphatpuffer). Die Proben werden in den in nachfolgender 2 aufgezeigten Zeitintervallen entnommen und anschließend mit Hilfe einer HPLC (Kromasil 100 C18; 250×4 mm; 5 μm; Puffer A: 23 mM Natriumacetat, pH 6.00; Puffer B: Acetonitril/H₂O 10/1.5) nach Derivatisierung mit o-Phthalaldehyd und N-Isobutyryl-L-cystein (0.1 M Natriumboratpuffer, pH 10.4) vermessen. Die Reaktion wird dabei durch 5-minütiges Erhitzen der Probe auf 95°C beendet. Die Ergebnisse sind in nachfolgender 2 dargestellt.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gemisch aus der D- und L-Form einer Aminosäure mit einem enzymatischen Reaktionssystem aufweisend eine Leucindehydrogenase (LeuDH), NAD(H) oder NADP(H) und einem Mittel zur Oxidation von NADH oder NADPH ausgewählt aus der Gruppe enthaltend eine NADH-Oxidase oder eine elektrochemische Anordnung zur Reaktion bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sterisch anspruchsvolle Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe enthaltend tert.-Leucin, Neopentylglycin, Adamantylglycin einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Leucindehydrogenase (LeuDH) diejenige aus Bacillus-Arten oder Mutanten derselben verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als NADH-Oxidase diejenige aus Lactobacillus oder Mutanten derselben verwendet.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das enzymatische Reaktionssystem in Form eines Ganzzellkatalysators einsetzt, der klonierte Gene für beide Enzyme aufweist.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem pH-Bereich von 4 bis 9 durchführt.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem Temperaturbereich von 15 bis 100°C durchführt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Reaktion entstehende Ketosäure reduktiv aminiert.
9. Enzymatisches Reaktionssystem aufweisend eine Leucindehydrogenase (LeuDH), NAD(H) oder NADP(H) und eine NADH-Oxidase sowie ein Gemisch aus der D- und L-Form einer Aminosäure.
10. Ganzzellkatalysator aufweisend ein kloniertes Gen für eine Leucindehydrogenase und ein kloniertes Gen für eine NADH-Oxidase.