WO2009033957A1 - Verfahren zur herstellung von enantiomerenangereicherten aminen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von enantiomerenangereicherten aminen Download PDF

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WO2009033957A1
WO2009033957A1 PCT/EP2008/061260 EP2008061260W WO2009033957A1 WO 2009033957 A1 WO2009033957 A1 WO 2009033957A1 EP 2008061260 W EP2008061260 W EP 2008061260W WO 2009033957 A1 WO2009033957 A1 WO 2009033957A1
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amino acid
alpha
nad
ketone
dehydrogenase
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Kai Doderer
Wolfgang Wienand
Harald GRÖGER
Claudia Rollmann
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Evonik Degussa Gmbh
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines

Definitions

  • Enantiomerically pure amines are used as chiral building blocks, so-called “chiral building blocks", in the production of pharmaceutical and agrochemicals.
  • Prominent examples of these are rivastigmine, cephalosporin and chiral 1-amino-1-arylalkanes. Individual representatives of these compounds are already produced in quantities of more than 1000 tons.
  • optically pure amines are required because only either the (R) or the (S) -enantiomer achieves the desired effect. In some cases, the unwanted enantiomer may even exert a deleterious effect. Therefore, there is a need for processes for the preparation of enantiomerically enriched amines.
  • the most widely used route to enantiomerically enriched or enantiomerically pure amines is the racemate resolution starting from the amine in racemic form.
  • the racemate resolution takes place via diastereomeric salts.
  • stoichiometric amounts of a chiral carboxylic acid are added to the amine in racemic form and the resulting diastereomeric salts are then separated by fractional crystallization. Thereafter, the chiral carboxylic acid must be separated again and usually recycled for cost reasons.
  • the undesired enantiomer must either be discarded or transferred to the racemate and recycled to the production process.
  • racemate resolution via diastereomeric salts is the biocatalytic racemate resolution, in which an amine derivative is generated enantioselectively by means of an enzyme from a racemic amine or enantioselectively liberated amine from a racemic amine derivative becomes.
  • lipases, acylases, proteases and many other hydrolases can be used, which are known to be able to stereospecifically cleave racemates.
  • Such methods are known from Bornscheuer and Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim, and enzymes Catalysis in Organic Synthesis, 2 nd Edition (2002) ed. Drauz and Waldmann, Wiley-VCH Weinheim.
  • Racemate cleavage strategies can be avoided by asymmetric synthesis using prochiral starting materials.
  • the known asymmetric syntheses using transition metal-containing catalysts often do not achieve the requisite enantioselectivity.
  • the use of the transition metal-containing catalysts may also result in undesirable levels of transition metals in the resulting product for pharmaceutical applications.
  • Another known enzymatic route to enantiomerically enriched amines is the transaminase-catalyzed exchange of keto and amino groups between two substrates.
  • transaminases are enantioselective both with respect to the Amin tendencydonors used and in terms of the amine formed.
  • enantiomerically enriched amines are formed during the reaction.
  • the reaction is an equilibrium reaction and therefore, as a rule, only a part of the prochiral ketone used is converted into the desired enantiomerically enriched amine.
  • Lactate dehydrogenase or acetolactate synthase is further implemented.
  • the restriction to alanine as an amine substrate significantly restricts the choice of transaminases.
  • Transaminases are required and the amine substrate must also be in the (R) -form. This requires the use of D-alanine in this method, which is accessible only with additional effort.
  • the alternative is the use of DL-alanine, but it remains L-alanine in the reaction mixture and must be separated and disposed of.
  • L-glutamic acid dehydrogenase L-glutamic acid dehydrogenase, a hydrogenase, a transaminase, a hydrogen acceptor dye, an electron transport system, a nitrogen source and gaseous hydrogen.
  • the process has the disadvantage that the hydrogen acceptor dyes used are strong cell poisons.
  • the method is limited to the amino acid-specific L-glutamic acid dehydrogenase and can not be used with amino acid dehydrogenases that tolerate different amino acids as a substrate.
  • a catalytic system comprising the following components: a) an amino acid transaminase, b) an alpha-amino acid , which is a substrate of the amino acid transaminase, c) an amino acid dehydrogenase suitable for the production of the alpha-amino acid, d) NAD (P) + and e) an NAD (P) + reducing enzyme, the NAD (P) + with the reducing agent to NAD (P) H converts.
  • Amino acid transaminases in the sense of the invention are amine-group-transferring enzymes of the enzyme class EC 2.6.1.X, which accept an alpha-amino acid as a substrate.
  • Amino acid dehydrogenases according to the invention are enzymes which convert alpha-ketocarboxylic acids with ammonia to alpha-amino acids and at the same time oxidize NAD (P) H to NAD (P) + .
  • NAD (P) + represents both nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) and its salts as well as
  • Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ) and its salts.
  • NAD (P) H stands for both
  • NADH Dihydronicotinamide adenine dinucleotide
  • NADPH dihydronicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the inventive method couples three enzymatically catalyzed reactions to a total process.
  • a first reaction catalyzed by an amino acid transaminase the ketone is reacted with an alpha-amino acid to form the enantiomerically enriched amine and the alpha-keto carboxylic acid corresponding to alpha-amino acid.
  • a second reaction catalyzed by an amino acid dehydrogenase the alpha-ketocarboxylic acid is reacted with ammonia or an ammonium salt and NAD (P) H to recover the alpha-amino acid and form NAD (P) + .
  • NAD (P) + is labeled with a third reaction catalyzed by an NAD (P) + reducing enzyme
  • the following formula scheme shows the coupling of the three enzymatic reactions to the process of the invention using the example of ammonium formate as the reducing agent and Ammonium salt and formate dehydrogenase as NAD + reducing enzyme.
  • ASTA denotes an amino acid transaminase
  • ASDH an amino acid dehydrogenase
  • FDH a formate dehydrogenase.
  • the present invention thus also relates to the use of a catalytic system comprising
  • NAD (P) + reducing enzyme which converts NAD (P) + with the reducing agent to NAD (P) H
  • transaminases suitable for the conversion of ketones can be used for the process according to the invention.
  • Suitable amino acid transaminases are known from Yun et al. , Applied and Environmental Microbiology 70 (2004) 2529-2534; Shin et al. , Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65 (2001) 1782-1788; Kaulmann et al. , Enzymes and Microbial Technology 41 (2007) 628-637; Shin et al. , Applied Microbiology and Biotechnology 61 (2003) 463-471; Shin et al. , Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206-211; Matcham et al. , Chimia 53 (1999) 584-589; and WO 99/46398.
  • omega transaminases known from EP 0 404 146 are used.
  • any alpha-amino acid which is a substrate of the amino acid transaminase can be used.
  • a proteinogenic amino acid is used as the alpha-amino acid, wherein both the natural L-amino acids and their D-enantiomers or any mixtures of the enantiomers, such as. B. a racemic
  • amino acids are leucine, alanine, phenylalanine and glutamic acid.
  • the alpha-amino acid can be used in the process according to the invention in a catalytic amount.
  • the total amount of alpha-amino acid and the alpha-amino acid of corresponding alpha-keto acid, based on the total amount of ketone is in the range of 1 to 50 mol%, preferably 2 to 10 mol%.
  • not the alpha-amino acid is initially introduced, but the alpha-keto-carboxylic acid corresponding to the alpha-amino acid, which has a keto group instead of the amino group.
  • This embodiment is particularly advantageous for the preparation of enantiomerically enriched amines which must be prepared using a D-amino acid or a non-proteinogenic L-amino acid, since instead of an inaccessible amino acid, the more readily accessible alpha-ketocarboxylic acid corresponding to the amino acid is used for the process can be.
  • amino acid dehydrogenase any NAD (P) H cofactor-dependent dehydrogenase can be used, with which the alpha-amino acid can be produced from the corresponding alpha-amino acid alpha-ketocarboxylic acid.
  • Suitable amino acid dehydrogenases are disclosed in Oshima et al., International Industrial Biotechnology 9 (1989) 5-11; Ohsima et al. , European Journal of Biochemistry 191 (1990) 715-720; Khan et al. , Bioscience, Biotechnology and
  • the amino acid dehydrogenase is a leucine dehydrogenase, an alanine dehydrogenase, a phenylalanine dehydrogenase or a glutamate dehydrogenase.
  • alanine dehydrogenases from Bacillus sphaericus, in particular Bacillus sphaericus strain DSM642; Glutamate dehydrogenases from Bacillus subtilis, especially Bacillus subtilis strain ISW1214; Phenylalanine dehydrogenases from Rhodococcus sp. , in particular Rhodococcus sp. Strain M4, Bacillus sphaericus and Thermoactinomyces intermedius.
  • D-amino acids is preferably a
  • Diaminopimelic acid D-dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum is Diaminopimelic acid D-dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum.
  • an amino acid transaminase and an amino acid dehydrogenase are used in combination, which are matched in their stereoselectivity with respect to the alpha-amino acid, i. either the amino acid dehydrogenase selectively converts the alpha-amino acid corresponding alpha-keto acid to the S-enantiomer of the alpha-amino acid and the amino acid transaminase selectively converts the S-enantiomer of the alpha-amino acid with the alpha-amino acid
  • the method according to the invention also uses a reducing agent in combination with an NAD (P) + reducing enzyme which converts NAD (P) + with the reducing agent to NAD (P) H.
  • Suitable NAD (P) + reducing enzymes are enzymes of Catalysis in Organic Synthesis, 2 nd Edition (2002), ed. Drauz and Waldmann, Wiley-VCH Weinheim known.
  • a salt of formic acid and as NAD (P) + reducing enzyme is used as a reducing agent a formate dehydrogenase.
  • the reducing agent is ammonium formate, which can also be generated in situ from formic acid and ammonia.
  • a formate dehydrogenase from Candida boidinii or a mutant derived therefrom is used.
  • the by Tishkov et al. in Biomolecular Engineering 23 (2006) 89-11 described formate dehydrogenases is used. This embodiment has the advantage that only carbon dioxide is produced as the reaction product of the reducing agent, which simplifies the work-up of the reaction mixture.
  • glucose is used as the reducing agent and a glucose dehydrogenase is used as the NAD (P) + reducing enzyme.
  • glucose dehydrogenases from Bacillus subtilis, Bacillus megaterium and Thermoplasma acidophilum.
  • a Phosphitdehydrogenase can be used as a reducing agent, a salt of phosphorous acid and as NAD (P) + reducing enzyme.
  • Suitable phosphite dehydrogenases are from Relyea et al. , Bioorganic Chemistry 33 (2005) 171-189.
  • glucose-6-phosphate as a reducing agent in combination with a glucose-6-phosphate dehydrogenase as NAD (P) + reducing enzyme.
  • NAD (P) + or NAD (P) H can be used in catalytic amounts.
  • the total amount of NAD (P) + and NAD (P) H, based on the total amount of ketone, is in the range of 0.001 to 5 mol%, preferably 0.01 to 1 mol%.
  • NAD (P) + and NAD (P) H can be submitted.
  • the enzymes used in the process according to the invention ie the amino acid transaminase, amino acid dehydrogenase and the NAD (P) + reducing enzyme can be used in the process either dissolved or immobilized on a support.
  • the enzymes are used in the form of a whole-cell catalyst, ie in the form of a cell expressing all three enzymes.
  • a recombinant Whole Cell Catalyst ie, a cell genetically engineered to express at least one of the three enzymes from a non-native gene sequence.
  • the recombinant whole cell catalyst is a bacterium, in particular an Escherichia coli bacterium, which overexpresses amino acid transaminase, amino acid dehydrogenase and the NAD (P) + reducing enzyme.
  • the reaction is preferably carried out in an aqueous reaction medium.
  • the aqueous phase may additionally be a water-miscible
  • Solvent preferably in an amount of 1 to 20 wt .-% based on the total reaction mixture.
  • Suitable solvents are alcohols, in particular methanol, ethanol and isopropanol, glycols, in particular
  • the aqueous reaction medium preferably has a pH in the range of 6 to 9, more preferably 7 to 8, on.
  • a pH in this range is adjusted by a buffer of a suitable inorganic or organic acid and its ammonium salt.
  • the adjustment of the pH may be carried out by buffers of phosphoric acid and an ammonium phosphate or buffer of a carboxylic acid and its ammonium carboxylate.
  • the pH can also be adjusted by pH-controlled metered addition of ammonia or an inorganic or organic acid to the reaction medium.
  • the reaction is carried out in a two-phase system of an aqueous and an organic phase.
  • the organic phase may consist of the ketone used and / or the amine formed.
  • a water immiscible solvent added.
  • Suitable solvents are aliphatic hydrocarbons, in particular hexane and heptane, aromatic hydrocarbons, in particular toluene and xylenes, dialkyl ethers, in particular methyl tert-butyl ether and
  • Ethyl tert-butyl ether and carboxylic acid esters, in particular ethyl acetate.
  • the reaction in a two-phase system also allows for the use of poorly water-soluble ketones or in the production of poorly water-soluble amines high volume yield, which is not limited by the solubility of ketone or amine.
  • inhibitions of one of the enzymes used by the ketone or the amine formed can be avoided.
  • Two-phase system also allows easy separation of the amine product from the enzymes used and their recovery by a phase separation, optionally after prior adjustment of a pH in the range of 9 to 11.
  • the ketone used is preferably dialkyl ketones, alkylaryl ketones, alkyl heteroaryl ketones and alkylaralkyl ketones, it being possible for the alkyl groups, aryl groups and heteroaryl groups to be substituted by non-enzyme-inhibiting groups.
  • the ketone can be initially introduced in the process according to the invention at the beginning of the reaction. Preferably, however, only part of the ketone to be reacted is initially charged at the beginning of the reaction, and the remaining part of the ketone to be reacted is added to ketone in accordance with the conversion. Such a metered addition of the ketone makes it possible to avoid inhibiting the enzymes used by the ketone.
  • Ketones with a melting point of more than 30 ° C. are preferably used as solutions in a solvent, both the water-miscible solvents described above and those described above water-immiscible solvents can be used.
  • the total amount of ketone based on the reaction volume is more than 10 g / l, particularly preferably more than 50 g / l and in particular more than 100 g / l.
  • the upper limit for the total amount of ketone relative to the reaction volume results from the solubilities of ketone used and amine formed, in particular from the solubility of the ammonium salt corresponding to the amine, when the reaction is carried out at a pH below the pKa of this ammonium salt becomes.
  • the total amount of ketone based on the reaction volume is less than 500 g / l.
  • ammonia or the ammonium salt required in the process according to the invention can be initially charged as well as metered into the ketone during the reaction in accordance with the conversion.
  • ammonia or ammonium salt are initially charged and, if appropriate, metered in so that during the reaction the total amount of ammonia and ammonium salt is always present in a stoichiometric excess to the ketone.
  • the process according to the invention can be carried out both batchwise and continuously.
  • the reaction is preferably carried out in a Ruhrkesselreaktor or in a membrane reactor.
  • the reaction is preferably carried out in a membrane reactor or with an immobilized on a solid support enzyme in a fixed bed reactor.
  • the reaction in a membrane reactor enables simple retention of the enzymes used in the process according to the invention in the reactor.
  • the enzymes can also be recovered by separating the cells by filtration or centrifugation.
  • amino acid alanine
  • transaminase amino acid
  • amino acid dehydrogenase, NADH, formate dehydrogenase and ammonium formate were given a 3.5-fold higher final yield of 1-phenylethylamine from acetophenone (15.1% of theory according to Example 9). This was surprising and unpredictable, and represents a major advantage over the prior art.
  • the process according to the invention thus makes it possible to prepare enantiomerically enriched amines from ketones without the need for stoichiometric amounts of a chiral auxiliary and has the advantage over the known processes that virtually any of them can be replaced by a suitable combination of alpha-amino acid or alpha-keto acid and amino acid dehydrogenase
  • Amino acid transaminase can be used for the implementation of the ketone, so that for each ketone in each case the amino acid transaminase can be used, with which the best enantioselectivity can be achieved.
  • the plasmids pGR15, an E. coli expression plasmid for the expression of Vibrio fluvialis transaminase under the rhamnose promoter (SEQ ID NO: 1) and pCR4, an E. coli expression plasmid for the expression of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis under the rhamnose promoter (SEQ ID NO: 2 ) were obtained from Geneart (Regensburg, Germany) as synthetic constructs.
  • the plasmids were transformed into E. coli according to the usual molecular biological methods (eg Sambrook, J., EF Fritsch and T. Maniatis (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, CoId Spring Harbor, NY, CoId Spring Harbor Laboratory) LB. Agar plates with 100 ⁇ g / mL ampicillin for selection.
  • alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis, 50 ml LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin was cultivated for the plasmid selection E. coli DSM14459 (pCR4). Expression was initiated immediately by addition of 2 g / L L-rhamnose. After 24 h incubation at 30 0 C while shaking, the cells were centrifuged, suspended in 10 ml of sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.5) and disrupted with ultrasound. The supernatant after centrifuging the cell fragments was used for further experiments (crude cell extract). The protein content was determined according to Bradford and the enzyme activity was determined by the amino acid dehydrogenase activity test.
  • Phenylethylamine was 24.2 min, for acetophenone was 24, 9 min.
  • the amino acid dehydrogenase activity was determined spectrophotometrically. For this purpose, the decrease in NADH concentration was monitored by the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. In a 0.1 cm quartz glass cuvette, 1 ml of substrate solution was added
  • the formate dehydrogenase activity was determined spectrophotometrically. To this end, the increase in NADH concentration was monitored by the increase in absorbance at a wavelength of 340 nm. In a 0.1 cm quartz glass cuvette, 1 ml of substrate solution was added
  • the glucose dehydrogenase activity was determined spectrophotometrically. To this end, the increase in NADH concentration was monitored by the increase in absorbance at a wavelength of 340 nm.
  • 100 mmol / L D-glucose in a potassium phosphate buffer 100 mmol / L, pH 7.0
  • 10 .mu.l of the enzyme sample 100 mmol / L, pH 7.0
  • the extinction coefficient ⁇ 6300 1 / (mol cm)
  • the layer density and the change in absorption over time the activity was calculated.
  • the transaminase activity was determined by gas chromatography. To this was added to 1 ml of substrate solution containing 10 mmol / L sodium pyruvate, 50 mmol / L 1-phenylethylamine in a potassium phosphate buffer (pH 7 100 mmol / L) mixed with the enzyme sample and incubated the reaction solution at 30 0 C while shaking. At regular intervals, 100 .mu.l reaction solution were taken as sample mixed with 50 .mu.l 1 M sodium hydroxide solution and extracted with 500 .mu.l toluene. The organic phase was removed and the content of 1-phenylethylamine and acetophenone gas chromatographic determined.
  • Phenylethylamine determined. The maximum conversion of acetophenone was reached after 48 h.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherte Aminen durch Umsetzung eines Ketons mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz und einem Reduktionsmittel in Gegenwart eines katalytischen Systems mit den Komponenten: a) eine Aminosäuretransaminase, b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist, c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase, d) ein NAD(P)+ und e) reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt. Das Verfahren kann mit katalytischen Mengen an alpha-Aminosäure und NAD(P)+ durchgeführt werden und ermöglicht eine enantioselektive reduktive Aminierung von Ketonen.

Description

Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten
Aminen
Enantiomerenreine Amine finden Anwendung als chirale Bausteine, sogenannte „Chiral Building Blocks", bei der Herstellung von pharmazeutischen und Agrowirkstoffen .
Prominente Beispiele dafür sind Rivastigmin, Chephalosporin und chirale 1-Amino-l-arylalkane . Einzelne Vertreter dieser Verbindungen werden bereits in Mengen von mehr als 1000 Tonnen produziert. Für die Herstellung von pharmazeutischen und Agrowirkstoffen werden optisch reine Amine benötigt, da nur entweder das (R)- oder das (S) -Enantiomer die erwünschte Wirkung erzielt. In einigen Fällen kann von dem nicht erwünschten Enantiomer sogar eine schädliche Wirkung ausgehen. Deshalb besteht ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen.
Der bisher am meisten genutzte Weg zu enantiomerenangereicherten oder enantiomerenreinen Aminen ist die Racematspaltung ausgehend vom Amin in racemischer Form. Klassisch erfolgt die Racematspaltung über diastereomere Salze. Dazu werden stöchiometrische Mengen einer chiralen Carbonsäure zum Amin in racemischer Form gegeben und die resultierenden diastereomeren Salze werden dann durch fraktionierende Kristallisation getrennt. Danach muss die chirale Carbonsäure wieder abtrennt werden und in der Regel aus Kostengründen recycliert werden. Das unerwünschte Enantiomer muss entweder entsorgt oder in das Racemat überführt und in den Produktionsprozeß zurückgeführt werden. Diese Schritte sind mit erheblichem Aufwand und Kosten verbunden.
Eine Alternative zur Racematspaltung über diastereomere Salze ist die biokatalytische Racematspaltung, bei der mittels eines Enzyms aus einem racemischen Amin enantioselektiv ein Aminderivat erzeugt wird oder aus einem racemischen Aminderivat enantioselektiv Amin freigesetzt wird. Hierzu können Lipasen, Acylasen, Proteasen und viele andere Hydrolasen eingesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie Racemate stereospezifisch spalten können. Solche Verfahren sind bekannt aus Bornscheuer und Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim, sowie Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition (2002 ), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim.
Bei diesen Verfahren entfallt der Einsatz stochiometrischer Mengen an chiralen Hilfsreagenzien . Es bleibt aber der Nachteil einer Limitierung der theoretischen Ausbeute auf 50% bezogen auf den als Racemat vorliegenden Ausgangsstoff und gegebenenfalls der zusatzliche Arbeitsschritt für das Recycling des ungewunschten Enantiomers mit den damit verbundenen Kosten.
Diese Nachteile, die prinzipiell für alle
Racematspaltungstrategien gelten, lassen sich durch eine asymmetrische Synthese unter Verwendung von prochiralen Ausgangsverbindungen vermeiden. Die bekannten asymmetrischen Synthesen unter Verwendung von ubergangsmetallhaltigen Katalysatoren erreichen allerdings oft nicht die erforderliche Enantioselektivitat . Darüber hinaus können sich aus der Verwendung der ubergangsmetallhaltigen Katalysatoren auch für pharmazeutische Anwendungen unerwünschte Gehalte an Ubergangsmetallen im resultierenden Produkt ergeben.
Ein weiterer bekannter enzymatischer Weg zu enantiomerenangereicherten Aminen ist der durch Transaminasen katalysierte Austausch von Ketogruppe und Aminogruppe zwischen zwei Substraten.
Figure imgf000003_0001
Die bekannten Transaminasen sind enantioselektiv sowohl hinsichtlich des eingesetzten Amingruppendonors als auch hinsichtlich des gebildeten Amins. Ausgehend von prochiralen Ketonen werden bei der Reaktion deshalb enantiomerenangereicherte Amine gebildet. Nachteilig ist allerdings, dass es sich bei der Umsetzung um eine Gleichgewichtsreaktion handelt und deshalb in der Regel nur ein Teil des eingesetzten prochiralen Ketons in das gewünschte enantiomerenangereicherte Amin umgesetzt wird.
Aus Matcham et al . , Chimica Oggi 14 (1996) 20-24; Matcham et al., Chimia 53 (1999) 584-589; sowie WO99/46398 ist bekannt, dass sich das Gleichgewicht der Reaktion auf die gewünschte Produktseite verschieben lässt, wenn Isopropylamin als Aminsubstrat verwendet wird (R3, R4 = CH3) und das bei der Reaktion gebildete Aceton destillativ aus der Reaktionsmischung entfernt wird. Das Verfahren kann allerdings nur mit Transaminasen durchgeführt werden, die Isopropylamin als Amingruppendonor akzeptieren. Unter den Prozessbedingungen, die für die Entfernung von Aceton erforderlich sind, sind allerdings nur wenige Transaminasen ausreichend stabil.
In Shin et al . , Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206-211 und EP 1 818 411 wird vorgeschlagen, das Gleichgewicht durch die Entfernung des gebildeten Ketons zu verschieben, indem Alanin als Aminsubstrat eingesetzt wird und das daraus gebildete Pyruvat enzymatisch mit einer gleichzeitig eingesetzten Pyruvatdecarboxylase,
Lactatdehydrogenase oder Acetolactatsynthase weiter umgesetzt wird. Die Beschränkung auf Alanin als Aminsubstrat schränkt die Wahl der Transaminasen allerdings deutlich ein. Um enantiomerenangereicherte Amine mit (R) -Konfiguration herzustellen, sind (R) -selektive
Transaminasen erforderlich und das Aminsubstrat muss ebenfalls in der (R) -Form vorliegen. Das setzt bei diesem Verfahren die Verwendung von D-Alanin voraus, welches nur mit zusätzlichem Aufwand zugänglich ist. Die Alternative ist die Verwendung von DL-Alanin, dabei verbleibt aber L-Alanin im Reaktionsgemisch und muss abgetrennt und entsorgt werden.
US 3,183,170 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Umsetzung einer alpha-Ketocarbonsäure mit L-Glutaminsäure in Gegenwart einer
L-Glutaminsäuredehydrogenase, einer Hydrogenase, einer Transaminase, eines Wasserstoffakzeptorfarbstoffs, eines Elektronentransportsystems, einer Stickstoffquelle und von gasförmigem Wasserstoff. Das Verfahren hat den Nachteil, dass die verwendeten Wasserstoffakzeptorfarbstoffe starke Zellgifte sind. Außerdem ist das Verfahren beschränkt auf die aminosäurespezifische L-Glutaminsäuredehydrogenase und kann nicht mit Aminosäuredehydrogenasen angewendet werden, die unterschiedliche Aminosäuren als Substrat tolerieren.
Es besteht deshalb Bedarf an einem Verfahren, mit dem sich enantiomerenangereicherte Amine aus Ketonen herstellen lassen und das nicht die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aufweist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenangereicherten Amins, bei dem ein Keton mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz und einem Reduktionsmittel umgesetzt wird in Gegenwart eines katalytischen Systems, das folgende Komponenten umfasst: a) eine Aminosäuretransaminase, b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist, c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase, d) NAD(P)+ und e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt.
Aminosäuretransaminasen im Sinne der Erfindung sind amingruppentransferierende Enzyme der Enzymklasse E. C. 2.6.1.X, die eine alpha-Aminosäure als Substrat akzeptieren .
Aminosäuredehydrogenasen im Sinne der Erfindung sind Enzyme, die alpha-Ketocarbonsäuren mit Ammoniak zu alpha- Aminosäuren umsetzen und gleichzeitig NAD(P)H zu NAD(P)+ oxidieren .
NAD(P)+ steht sowohl für Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+) und dessen Salze als auch für
Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP+) und dessen Salze. In gleicher Weise steht NAD(P)H sowohl für
Dihydronicotinamidadenindinucleotid (NADH) und dessen Salze als auch für Dihydronicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) und dessen Salze.
Das erfindungsgemäße Verfahren koppelt drei enzymatisch katalysierte Reaktionen zu einem Gesamtverfahren. In einer ersten durch eine Aminosäuretransaminase katalysierten, Reaktion wird das Keton mit einer alpha-Aminosäure zum enantiomerenangereicherten Amin und der der alpha- Aminosäure entsprechenden alpha-Ketocarbonsäure umgesetzt. In einer zweiten durch eine Aminosäuredehydrogenase katalysierten Reaktion wird die alpha-Ketocarbonsäure mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz sowie NAD(P)H umgesetzt unter Rückbildung der alpha-Aminosäure und Bildung von NAD(P)+. In einer dritten durch ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym katalysierten Reaktion wird NAD(P)+ mit einem
Reduktionsmittel umgesetzt und so NAD(P)H zurückgebildet. Als Gesamtreaktion resultiert eine enantioselektive reduktive Aminierung des Ketons, bei der die alpha- Aminosäure und NAD(P)+ nur in katalytischen Mengen benötigt werden und für die Herstellung des enantiomerenangereicherten Amins nicht verbraucht werden.
Das nachfolgende Formelschema zeigt die Kopplung der drei enzymatischen Reaktionen zum erfindungsgemäßen Verfahren am Beispiel von Ammoniumformiat als Reduktionsmittel und Ammoniumsalz und Formiatdehydrogenase als NAD+ reduzierendem Enzym. Dabei bezeichnet ASTA eine Aminosauretransaminase, ASDH eine Aminosauredehydrogenase und FDH eine Formiatdehydrogenase.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die Verwendung eines katalytischen Systems, umfassend
a) eine Aminosauretransaminase,
b) eine alpha-Aminosaure, die ein Substrat der Aminosauretransaminase ist,
c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosaure geeignete Aminosauredehydrogenase,
d) NAD(P)+ und
e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt,
zur Herstellung eines enantiomerenangereicherten Amins aus einem Keton. Für das erfindungsgemäße Verfahren können prinzipiell alle zur Umsetzung von Ketonen geeigneten Transaminasen verwendet werden. Geeignete Aminosäuretransaminasen sind aus Yun et al . , Applied and Environmental Microbiology 70 (2004) 2529-2534; Shin et al . , Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65 (2001) 1782-1788; Kaulmann et al . , Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 628-637; Shin et al . , Applied Microbiology and Biotechnology 61 (2003) 463- 471; Shin et al . , Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206-211; Matcham et al . , Chimia 53 (1999) 584-589; sowie WO 99/46398 bekannt.
Vorzugsweise werden omega-Transaminasen verwendet, die aus EP 0 404 146 bekannt sind. Besonders geeignet sind omega- Transaminasen aus Vibrio fluvialis, insbesondere Vibrio fluvialis Stamm JS17; Alcaligenes denitrificans , insbesondere Alcaligenes denitrificans Stamm Y2K-2; Klebsiella pneumoniae, insbesondere Klebsiella pneumoniae Stamm YS2F; sowie Bacillus thuringiensis, insbesondere Bacillus thuringiensis Stamm JS64.
Als alpha-Aminosäure kann jede alpha-Aminosäure eingesetzt werden, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist. Vorzugsweise wird als alpha-Aminosäure eine proteinogene Aminosäure verwendet, wobei sowohl die natürlichen L-Aminosäuren als auch deren D-Enantiomere oder beliebige Mischungen der Enantiomere, wie z. B. eine racemische
Mischung, verwendet werden können. Besonders bevorzugte Aminosäuren sind Leucin, Alanin, Phenylalanin und Glutaminsäure .
Die alpha-Aminosäure kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer katalytischen Menge eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Gesamtmenge an alpha-Aminosäure und der alpha-Aminosäure entsprechender alpha-Ketosäure, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 1 bis 50 mol-%, vorzugsweise 2 bis 10 mol-%. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu Beginn der Umsetzung nicht die alpha- Aminosäure vorgelegt, sondern die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketocarbonsäure, die an Stelle der Aminogruppe eine Ketogruppe aufweist. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft für die Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen, die unter Verwendung einer D-Aminosäure oder einer nicht proteinogenen L-Aminosäure hergestellt werden müssen, da an Stelle einer schwer zugänglichen Aminosäure die der Aminosäure entsprechende leichter zugängliche alpha-Ketocarbonsäure für das Verfahren eingesetzt werden kann.
Als Aminosäuredehydrogenase kann jede NAD (P) H-Cofaktorabhängige Dehydrogenase verwendet werden, mit der sich die alpha-Aminosäure aus der der alpha-Aminosäure entsprechenden alpha-Ketocarbonsäure herstellen lässt. Geeignete Aminosäuredehydrogenasen sind aus Oshima et al, International Industrial Biotechnology 9 (1989) 5-11; Ohsima et al . , European Journal of Biochemistry 191 (1990) 715-720; Khan et al . , Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry 69 (2005) 1861-1870; Hummel et al . , Applied Microbiology and Biotechnology 26 (1987) 409-416 und Bommarius in Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition (2002) , ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim bekannt.
Vorzugsweise ist die Aminosäuredehydrogenase eine Leucindehydrogenase, eine Alanindehydrogenase, eine Phenylalanindehydrogenase oder eine Glutamatdehydrogenase. Besonders geeignet sind Alanindehydrogenasen aus Bacillus sphaericus, insbesondere Bacillus sphaericus Stamm DSM642; Glutamatdehydrogenasen aus Bacillus subtilis, insbesondere Bacillus subtilis Stamm ISW1214; Phenylalanindehydrogenasen aus Rhodococcus sp . , insbesondere Rhodococcus sp. Stamm M4, Bacillus sphaericus und Thermoactinomyces intermedius . Besonders bevorzugt wird eine Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus verwendet. Für die Herstellung von D-Aminosäuren wird vorzugsweise eine
D-Aminosäuredehydrogenase verwendet, die in Vedha-Peters et al . , Journal of the American Chemical Society 128 (2006) 10923-10929 beschrieben ist als Mutante der meso-
Diaminopimelinsäure-D-dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum.
Vorzugsweise werden eine Aminosäuretransaminase und eine Aminosäuredehydrogenase in Kombination verwendet, die in ihrer Stereoselektivität bezüglich der alpha-Aminosäure aufeinander abgestimmt sind, d.h. dass entweder die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum S-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das S-Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem
Keton umsetzt oder dass die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum R-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das R-Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird außerdem ein Reduktionsmittel eingesetzt in Kombination mit einem NAD(P)+ reduzierenden Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt. Geeignete NAD(P)+ reduzierende Enzyme sind aus Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition (2002) , ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Reduktionsmittel ein Salz der Ameisensäure und als NAD(P)+ reduzierendes Enzym eine Formiatdehydrogenase verwendet. Besonders bevorzugt ist das Reduktionsmittel Ammoniumformiat, das auch in situ aus Ameisensäure und Ammoniak erzeugt werden kann. Vorzugsweise wird eine Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii oder eine davon abgeleitete Mutante verwendet. Ebenfalls geeignet sind die von Tishkov et al . in Biomolecular Engineering 23 (2006) 89-11 beschriebenen Formiatdehydrogenasen . Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass als Reaktionsprodukt des Reduktionsmittels nur Kohlendioxid entsteht, was die Aufarbeitung der Reaktionsmischung vereinfacht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als Reduktionsmittel Glucose und als NAD(P)+ reduzierendes Enzym eine Glucosedehydrogenase verwendet. Besonders geeignet sind Glukosedehydrogenasen aus Bacillus subtilis, Bacillus megaterium und Thermoplasma acidophilum.
Alternativ kann als Reduktionsmittel ein Salz der phosphorigen Säure und als NAD(P)+ reduzierendes Enzym eine Phosphitdehydrogenase verwendet werden. Geeignete Phosphitdehydrogenasen sind aus Relyea et al . , Bioorganic Chemistry 33 (2005) 171-189 bekannt.
Ebenfalls geeignet ist Glucose-6-phosphat als Reduktionsmittel in Kombination mit einer Glucose- 6-phosphatdehydrogenase als NAD(P)+ reduzierendem Enzym.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können NAD(P)+ bzw. NAD(P)H in katalytischen Mengen eingesetzt werden.
Vorzugsweise liegt die Gesamtmenge an NAD(P)+ und NAD(P)H, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 0,001 bis 5 mol-%, vorzugsweise 0,01 bis 1 mol-%. Zu Beginn der Umsetzung kann wahlweise sowohl NAD(P)+ als auch NAD(P)H vorgelegt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme, d.h. die Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P)+ reduzierende Enzym können im Verfahren sowohl gelöst als auch auf einem Träger immobilisiert eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme in Form eines Ganzzellkatalysators eingesetzt, d.h. in Form einer Zelle, die alle drei Enzyme exprimiert. Vorzugsweise wird ein rekombinanter Ganzzellkatalysators verwendet, d.h. eine Zelle, die gentechnisch so verändert wurde, dass sie mindestens eines der drei Enzyme aus einer nicht nativen Gensequenz exprimiert. Besonders bevorzugt wird als rekombinanter Ganzzellkatalysator ein Bakterium, insbesondere ein Escherichia coli Bakterium, verwendet, das Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P)+ reduzierende Enzym überexprimiert .
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in einem wässrigen Reaktionsmedium. Die wässrige Phase kann zusätzlich ein mit Wasser mischbares
Lösungsmittel enthalten, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 20 Gew.-% bezogen auf die gesamte Reaktionsmischung.
Geeignete Lösungsmittel sind Alkohole, insbesondere Methanol, Ethanol und Isopropanol, Glykole, insbesondere
Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie Tetrahydrofuran,
Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
Das wässrige Reaktionsmedium weist vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 9, besonders bevorzugt 7 bis 8, auf. Vorzugsweise wird ein pH-Wert in diesem Bereich durch einen Puffer aus einer geeigneten anorganischen oder organischen Säure und deren Ammoniumsalz eingestellt. Beispielsweise kann die Einstellung des pH-Werts durch Puffer aus Phosphorsäure und einem Ammoniumphosphat oder Puffer aus einer Carbonsäure und deren Ammoniumcarboxylat erfolgen. Alternativ kann der pH-Wert auch durch pH-geregelte Zudosierung von Ammoniak oder einer anorganischen oder organischen Säure zum Reaktionsmedium eingestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Umsetzung in einem Zweiphasensystem aus einer wässrigen und einer organischen Phase. Die organische Phase kann dabei aus dem eingesetzten Keton und/oder dem gebildeten Amin bestehen. Vorzugsweise wird aber zur Bildung einer organischen Phase ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel zugesetzt. Geeignete Lösungsmittel sind aliphatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere Hexan und Heptan, aromatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere Toluol und Xylole, Dialkylether, insbesondere Methyl-tert-butylether und
Ethyl-tert-butylether, sowie Carbonsäureester, insbesondere Essigsäureethylester . Die Umsetzung in einem Zweiphasensystem ermöglicht auch bei Einsatz von schlecht wasserlöslichen Ketonen oder bei der Herstellung von schlecht wasserlöslichen Aminen eine hohe Volumenausbeute, die nicht durch die Löslichkeit von Keton oder Amin limitiert ist. Darüber hinaus lassen sich bei der Umsetzung in einem Zweiphasensystem auch Inhibierungen eines der verwendeten Enzyme durch das eingesetzte Keton oder das gebildete Amin vermeiden. Die Umsetzung in einem
Zweiphasensystem ermöglicht außerdem eine einfache Abtrennung des Aminprodukts von den eingesetzten Enzymen und deren Rückgewinnung durch eine Phasentrennung, gegebenenfalls nach vorheriger Einstellung eines pH-Werts im Bereich von 9 bis 11.
Als Keton werden vorzugsweise Dialkylketone, Alkylarylketone, Alkylheteroarylketone und Alkylaralkylketone eingesetzt, wobei die Alkylgruppen, Arylgruppen und Heteroarylgruppen mit nicht enzyminhibierenden Gruppen substituiert sein können. Das Keton kann im erfindungsgemäßen Verfahren zu Beginn der Umsetzung vorgelegt werden. Vorzugsweise wird aber zu Beginn der Umsetzung nur ein Teil des umzusetzenden Ketons vorgelegt und der restliche Teil des umzusetzenden Ketons entsprechend dem Umsatz an Keton zudosiert. Durch eine solche Zudosierung des Ketons lässt sich eine Inhibierung der verwendeten Enzyme durch das Keton vermeiden. Ketone mit einem Schmelzpunkt von mehr als 300C werden vorzugsweise als Lösungen in einem Lösungsmittel eingesetzt, wobei sowohl die zuvor beschriebenen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel als auch die zuvor beschriebenen mit Wasser nicht mischbaren Losungsmittel verwendet werden können. Vorzugsweise betragt die Gesamtmenge an Keton bezogen auf das Reaktionsvolumen mehr als 10 g/l, besonders bevorzugt mehr als 50 g/l und insbesondere mehr als 100 g/l. Die obere Grenze für die Gesamtmenge an Keton bezogen auf das Reaktionsvolumen ergibt sich aus den Loslichkeiten von eingesetztem Keton und gebildetem Amin, insbesondere aus der Loslichkeit des dem Amin entsprechenden Ammoniumsalzes, wenn die Umsetzung bei einem pH-Wert unterhalb des pKa-Werts dieses Ammoniumsalzes durchgeführt wird. Vorzugsweise betragt die Gesamtmenge an Keton bezogen auf das Reaktionsvolumen weniger als 500 g/l.
Der im erfindungsgemaßen Verfahren benotigte Ammoniak oder das Ammoniumsalz können sowohl zu Beginn vorgelegt als auch wahrend der Umsetzung entsprechend dem Umsatz an Keton zudosiert werden. Vorzugsweise werden Ammoniak oder Ammoniumsalz so vorgelegt und gegebenenfalls zudosiert, dass wahrend der Umsetzung die Gesamtmenge an Ammoniak und Ammoniumsalz stets in einem stochiometrischen Überschuß zum Keton vorliegt.
Das erfindungsgemaße Verfahren kann sowohl im Batch als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Bei einer Reaktionsfuhrung im Batch erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in einem Ruhrkesselreaktor oder in einem Membranreaktor. Bei einer kontinuierlichen Reaktionsfuhrung erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in einem Membranreaktor oder mit einem auf einem festen Trager immobilisierten Enzym in einem Festbettreaktor. Die Umsetzung in einem Membranreaktor ermöglicht eine einfache Ruckhaltung der im erfindungsgemaßen Verfahren verwendeten Enzyme im Reaktor. Bei Verwendung eines rekombinanten Ganzzellkatalysators können die Enzyme auch durch Abtrennung der Zellen mittels Filtration oder Zentrifugation zurückgewonnen werden.
Wie das Vergleichsbeispiel zeigt, konnten mit den Reduktionsbedingungen gemäß Shin und Kim et al . Biotechnology and Bioengineering 65 (1999), Seite 206-211, also mit einer Transaminase und einer Aminosäure (Alanin) aus dem Substrat Acetophenon nur Endausbeuten von 4.3% d. Th. 1-Phenylethylamin erhalten werden.
Durch Anwendung eines erfindungsgemäßen Reduktionssystems aus Aminosäure (Alanin) , Transaminase,
Aminosäuredehydrogenase, NADH, Formiatdehydrogenase und Ammoniumformiat wurde dagegen eine 3,5fach höhere Endausbeute an 1-Phenylethylamin aus Acetophenon erhalten (15,1 % d. Th. gemäß Beispiel 9) . Dies war überraschend und nicht vorhersehbar und bedeutet einen großen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen aus Ketonen, ohne dass dazu stöchiometrische Mengen eines chiralen Hilfsstoffs erforderlich wären und hat gegenüber den bekannten Verfahren den Vorteil, dass durch eine geeignete Kombination von alpha-Aminosäure bzw. alpha- Ketosäure und Aminosäuredehydrogenase praktisch jede Aminosäuretransaminase für die Umsetzung des Ketons verwendet werden kann, so dass für jedes Keton jeweils die Aminosäuretransaminase eingesetzt werden kann, mit der sich die beste Enantioselektivität erzielen lässt.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen, stellen jedoch keine Beschränkung in den Ausführungsformen dar.
Methoden:
Beispiel 1
Konstruktion der Expressionsstamme
Die Plasmide pGR15, ein E. coli Expressionsplasmid zur Expression der Transaminase aus Vibrio fluvialis unter dem Rhamnosepromotor (SEQ ID NO: 1) und pCR4, ein E. coli Expressionsplasmid zur Expression der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis unter dem Rhamnosepromotor (SEQ ID NO: 2) wurden von Geneart (Regensburg, Deutschland) als synthetische Konstrukte bezogen.
Die Plasmide wurde nach den gangigen molekularbiologischen Methoden (z.B. Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis (1989) . Molecular cloning : a laboratory manual . CoId Spring Harbor, N. Y., CoId Spring Harbor Laboratory) in E. coli transformiert und auf LB . Agarplatten mit 100 μg/mL Ampicillin zur Selektion kuliviert.
Beispiel 2
Rekombinante Expression der Transaminase aus Vibrio fluvialis in E. coli DSM14459:
Zur Expression der Transaminase aus Vibrio fluvialis wurde in 50 ml LB Medium enthaltend 100 μg mL-1 Ampicillin zur Plasmidselektion E. coli DSM14459 (pGR15) kultiviert. Die Expression wurde sofort initiiert durch Zugabe von 2 g/L L- Rhamnose. Nach 24 h Inkubation bei 370C unter Schuttein wurden die Zellen abzentrifugiert, in 10 ml
Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen. Der Überstand nach Abzentrifugieren der Zellbruchstucke wurde für weitere
Experimente eingesetzt (Zellrohextrakt) . Der Proteingehalt wurde nach Bradford und die Enzymaktivitat wurde mit dem Transaminase Aktivitatstest bestimmt.
Beispiel 3
Rekombinante Expression der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis in E. coli DSM14459:
Zur Expression der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis wurde in 50 ml LB Medium enthaltend 100 μg/mL Ampicillin zur Plasmidselektion E. coli DSM14459 (pCR4) kultiviert. Die Expression wurde sofort initiiert durch Zugabe von 2 g/L L-Rhamnose. Nach 24 h Inkubation bei 300C unter Schuttein wurden die Zellen abzentrifugiert, in 10 ml Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen. Der Überstand nach Abzentrifugieren der Zellbruchstucke wurde für weitere Experimente eingesetzt (Zellrohextrakt) . Der Proteingehalt wurde nach Bradford und die Enzymaktivitat wurde mit dem Aminosauredehydrogenase Aktivitatstest bestimmt.
Beispiel 4
Gaschromatographische Bestimmung der 1-Phenylethylamin- und Acetophenonkonzentration
Die Trennung von 1-Phenylethylamin und Acetophenon wurde mit einer WCOT Chrompack 7422-Saule (Lange: 25 m, CP-WAX Phase durchgeführt. Als Tragergas wurde Helium mit einem Fluß von 1 mL/min verwendet. Die Trennung erfolgte mit einem 2-stufigen Temperaturgradienten, beginnend bei 500C mit einer Aufheizrate von 0,5°C/min bis 600C, dann mit einer Aufheizrate von 100°C/min bis 2200C welche dann für 6 min gehalten wurden. Die Detektion erfolgte mit einem Flammenionisationsdetektor. Die Retentionszeit von 1-
Phenylethylamin betrug 24,2 min, die für Acetophenon betrug 24, 9 min. Beispiel 5
Aminosauredehydrogenase Aktivität
Die Aminosauredehydrogenase Aktivität wurde spektrophotometrisch bestimmt. Dazu wurde die Abnahme der NADH Konzentration anhand der Abnahme der Absorption bei einer Wellenlange von 340 nm verfolgt. In einer 0,1 cm Quarzglaskuvette wurden 1 mL Substratlosung enthaltend
1 mmol/L NADH, 2,5 mmol/L Natriumpyruvat bzw. Natriumketoleucin, 400 mmol/L Ammoniumchlorid in einem Kaliumphosphatpuffer (50 mmol/L, pH 8,2) mit 10 μl der Enzymprobe vermischt und die Absorption bei einer Wellenlange von 340 nm über 10 min bei 300C vermessen. Mit dem Extinktionskoeffizienten ε=6300 1/ (mol cm) , der Schichtdichte und der Änderung der Absorption über die Zeit wurde die Aktivität berechnet.
Beispiel 6
Formiatdehydrogenase Aktivität
Die Formiatdehydrogenase Aktivität wurde spektrophotometrisch bestimmt. Dazu wurde die Zunahme der NADH Konzentration anhand der Zunahme der Absorption bei einer Wellenlange von 340 nm verfolgt. In einer 0,1 cm Quarzglaskuvette wurden 1 mL Substratlosung enthaltend
2 mmol/L NADH, 400 mmol/L Natriumformiat in einem Kaliumphosphatpuffer (50 mmol/L, pH 8,2) mit 10 μl der Enzymprobe vermischt und die Absorption bei einer Wellenlange von 340 nm über 10 min bei 300C vermessen. Mit dem Extinktionskoeffizienten ε=6300 1/ (mol cm), der Schichtdichte und der Änderung der Absorption über die Zeit wurde die Aktivität berechnet.
Beispiel 7 Glucosedehydrogenase Aktivität
Die Glucosedehydrogenase Aktivität wurde spektrophotometrisch bestimmt. Dazu wurde die Zunahme der NADH Konzentration anhand der Zunahme der Absorption bei einer Wellenlange von 340 nm verfolgt. In einer 1 cm Quarzglaskuvette wurden 1 mL Substratlosung enthaltend 0,25 mmol/L NADH, 100 mmol/L D-Glucose in einem Kaliumphosphatpuffer (100 mmol/L, pH 7,0) mit 10 μl der Enzymprobe vermischt und die Absorption bei einer Wellenlange von 340 nm über 10 min bei 300C vermessen. Mit dem Extinktionskoeffizienten ε=6300 1/ (mol cm), der Schichtdichte und der Änderung der Absorption über die Zeit wurde die Aktivität berechnet.
Beispiel 8
Transaminase Aktivität
Die Transaminase Aktivität wurde gaschromatographisch bestimmt. Dazu wurde zu 1 ml Substratlosung enthaltend 10 mmol/L Natriumpyruvat, 50 mmol/L 1-Phenylethylamin in einem Kaliumphosphatpuffer (100 mmol/L, pH 7) mit der Enzymprobe vermischt und die Reaktionslosung bei 300C unter Schuttein inkubiert. In regelmäßigen Abstanden wurden 100 μL Reaktionslosung als Probe entnommen mit 50 μL 1 M Natronlauge versetzt und mit 500 μL Toluol extrahiert. Die organische Phase wurde abgenommen und der Gehalt an 1- Phenylethylamin und Acetophenon gaschromatographische bestimmt .
Beispiel 9
(mit Beeinflussung der Gleichgewichtslage, nach dem Schema auf S. 6 des Anmeldetextes) : Es wurden in 1 mL Kaliumphosphatpuffer (100 mmol/L, pH 7) 20 mmol/L Acteophenon, 200 mmol/L Alanin, 90 mmol/L Ammoniumformiat und 0,3 mmol/L NADH gemischt und mit Vibrio fluvialis Transaminase bis zu einer Endkonzentraion von 20 U/mL, mit Alanindehydrognase aus Bacillus subtillis bis zu einer Endkonzentration von 400 U/mL und mit Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (Jülich, jetzt Codexis) bis zu einer Endkonzentration 24 U/mL versetzt. Diese Lösung wurde unter Schütteln bei 300C inkubiert und nach 1, 3, 5, 24 und 48 h der Acetophenon- und 1-
Phenylethylamingehalt bestimmt. Der maximale Umsatz von Acetophenon wurde nach 48 h erreicht.
Die Ausbeute an 1-Phenylethylamin betrug dabei 8,5% d. Th nach 24 h und 15,1% d. Th. nach 48 h (jeweils 100% Selektivität) .
Vergleichsbeispiel 1 (ohne Beeinflussung der Gleichgewichtslage) :
Es wurden in 1 mL Kaliumphosphatpuffer (100 mmol/L, pH 7) 30 mmol/L Acteophenon und 300 mmol/L Alanin gemischt und mit Vibrio fluvialis Transaminase bis zu einer Endkonzentraion von 20 U/mL versetzt. Diese Lösung wurde unter Schütteln bei 300C inkubiert und nach 1, 3, 6 und
24 h der Acetophenon und 1-Phenylethylamingehalt bestimmt. Der maximale Umsatz von Acetophenon wurde nach 24 h erreicht .
Dabei wurde 1-Phenylethylamin in einer Ausbeute vom 4,3% d. Th Lösung (100% Selektivität) erhalten.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenangereicherten Amins aus einem Keton, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz und einem Reduktionsmittel umgesetzt wird in Gegenwart eines katalytischen Systems, umfassend
a) eine Aminosäuretransaminase,
b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der
Aminosäuretransaminase ist,
c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase,
d) NAD(P)+ und
e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum S-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das S- Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum R-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das R- Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel ein Salz der Ameisensäure und das NAD(P)+ reduzierende Enzym eine Formiatdehydrogenase ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel Glucose und das NAD(P)+ reduzierende Enzym eine Glucosedehydrogenase ist.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuredehydrogenase ausgewählt ist aus Leucindehydrogenasen, Alanindehydrogenasen,
Phenylalanindehydrogenasen und Glutamatdehydrogenasen.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P)+ reduzierende Enzym in Form eines rekombinanten Ganzzellkatalysators eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Ganzzellkatalysator ein Bakterium, vorzugsweise ein Escherichia coli Bakterium, ist, das Aminosäuretransaminase,
Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P) reduzierende Enzym überexprimiert .
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das Keton ausgewählt ist aus Dialkylketonen, Alkylarylketonen,
Alkylheteroarylketonen und Alkylaralkylketonen, wobei die Alkylgruppen, Arylgruppen und Heteroarylgruppen mit nicht enzyminhibierenden Gruppen substituiert sein können .
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn der Umsetzung an Stelle der alpha-Aminosäure die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure vorgelegt wird.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem wässrigen Reaktionsmedium bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem Zweiphasensystem aus einer wässrigen und einer organischen Phase erfolgt.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn der Umsetzung nur ein Teil des umzusetzenden Ketons vorgelegt wird und der restliche Teil des umzusetzenden Ketons entsprechend dem Umsatz an Keton zudosiert wird.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge an alpha-Aminosäure und der alpha-Aminosäure entsprechender alpha-Ketosäure, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 1 bis 50 mol-%, vorzugsweise 2 bis 10 mol-%, liegt.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge an NAD(P)+ und NAD(P)H, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 0,001 bis 5 mol-%, vorzugsweise 0,01 bis 1 mol-% liegt.
16. Verwendung eines katalytischen Systems, umfassend
a) eine Aminosäuretransaminase,
b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist, c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase, d) NAD(P)+ und
e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt, zur Herstellung eines enantiomerenangereicherten Amins aus einem Keton.
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