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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer
neuen sekundären
Alkoholdehydrogenase (Dehydrogenase für sekundäre Alkohole), die für die Herstellung
von einem Alkohol, einem Aldehyd und einem Keton, insbesondere für die Herstellung
eines optisch aktiven Alkohols, nützlich ist, ein Verfahren für die Herstellung
des Enzyms, ein DNA-Segment, das für das Enzym codiert, ein Mikroorganismus
transformiert mit der DNA und ein Verfahren zum Herstellen von einem
Alkohol, einem Aldehyd und einem Keton, insbesondere von einem optisch
aktiven Alkohol unter Verwendung des Enzyms.
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Stand der
Technik
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Von
den sekundären
Alkolholdehydrogenasen mikrobieller Herkunft, die Nikotinamidadenindinukleotidphosphat
erfordern (hiernach als NADP+ abgekürzt), ist diejenige, die von
Thermoanaerobium brockii abgeleitet ist, gut dokumentiert (J. Am.
Chem. Soc. 108, 162–169
(1986)). Zusätzlich
wurde von den sekundären Alkoholdehydrogenasen,
die Nikotinamidadindinukleotid (hiernach als NAD+ abgekürzt) erfordern,
die folgenden vorgestellt, abgeleitet von Pichia sp. NRRL-Y-11328
(Eur. J. Biochem. 101, 401–406
(1979)), Pseudomonas sp. SPD6 (Bioorg. Chem. 19, 398–417 (1991)),
Pseudomonas fluorescence NRRL B-1244 (Tokkai Sho, 59-17982), Pseudomonas
maltophilia MB11L (FEMS Microbiol. Lett. 93, 49–56 (1992)), Pseudomonas sp. PED (J.
Org. Chem. 57, 1526–1532
(1992)), Pseudomonas sp. ATCC 21439 (Eur. J. Biochem. 119, 359–364 (1981)),
Candida boidinii SAHM (Biochim. Biophys. Acta 716, 298–307 (1992)),
Mycobactericum vaccae JOB-5 (J. Gen. Microbiol. 131, 2901–2907 (1985)),
Rhodococcus rhodochrous PNKb1 (Arch. Microbiol. 153, 163–168 (1990)),
Comamonas terrigena (Biochim. Biophys. Acta 661, 74–86 (1981)),
und Arthrobacter sp. SBA (Tokkai Sho 51-57882).
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Jedoch
ist die stereochemische Substratspezifität dieser sekundären Alkoholdehydrogenasen
für die praktische
Anwendung nicht befriedigend. Beispielsweise wurde in Bezug auf
2-Butanol – eines
der am häufigsten
erwähnten
Substrate für
die sekundäre
Alkolholdehydrogenase – von
keinem Enzym berichtet, welches (S)-2-Butanol stereospezifisch zu
2-Butanon oxidieren wird. (Die Enzyme, die von Pseudomonas sp. ATCC 21439,
Pseudomonas sp. SPD6, Comamonas terrigena, Candida boidinii SAHM
oder Pichia sp. NRRL-Y-11328 abgeleitet sind, oxidieren das (R)-Isomer
vorzugsweise, während
das Enzym, das von Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244 abgeleitet
ist, keine bestimmte definierte stereochemische Substratspezifität aufzeigt,
und die Spezifizät
der Enzyme, die von Mycobacterium vaccae JOB-5, Rhodococcus rhodochrous PNKb1, Pseudomonas
sp. PED oder Pseudomonas maltophilia MB11L abgeleitet sind, ist
nicht bekannt.) Desweiteren, obwohl die primäre Alkoholdehydrogenase (SADH-1),
abgeleitet von Bäckerhefe
(Saccaromyces cerevisiae), dafür
bekannt ist, 2-Butanol mit S-Konfiguration bevorzugt zu oxidieren,
ist die relative Aktivität,
so niedrig wie etwa 1% der Aktivität für Ethanol, für die praktische
Verwendung nicht geeignet (Arch. Biochem. Biophys. 126, 933–944 (1968),
J. Biol. Chem. 268, 7792–7798
(1993)).
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WO-A-93-18138
offenbart eine ketonische Esterreduktase mit einem Molekulargewicht
von etwa 67 kD isoliert aus Candida parapsilosis. Das Enzym verwendet
NADH als ein Coenzym und hat ein breites Substratspektrum. Es reduziert
Aldehyde und Ketone um bevorzugt die korrespondierenden primären und
sekundären
(S)-Alkohole zu bilden, welche in der umgekehrten Umsetzung oxidiert
werden, um Aldehyde und Ketone zu bilden.
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Es
gab einen großen
Bedarf für
ein weiteres Enzym, das hochspezifisch für sekundäre Alkohole ist, insbesondere
eine sekundäre
Alkoholdehydrogenase, welche bevorzugt (S)-2-Butanol oxidieren wird.
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Es
gab auch einen hohen Bedarf für
das Klonieren von DNA, die für
das Enzym codiert, da es dadurch möglich sein wird, das Enzym
in einem großen
Maßstab
durch Techniken des genetischen Engineerings unter Verwendung des
geklonten Gens dieses Enzyms zu produzieren.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Während des
breit angelegten Screenens von Mikroorganismen mit der Fähigkeit,
vorzugsweise (S)-2-Butanol
zu oxidieren, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckt,
daß der
Mikroorganismus, der zu dem Genus Candida gehört, insbesondere Candida parapsilosis,
die Aktivität
aufwies, vorzugsweise (S)-2-Butanol zu oxidieren, sie haben das
Enzym zum Oxidieren von (S)-2-Butanol
aus Zellen von Kulturen dieses Mikroorganismus aufgereinigt, und
sie haben dessen enzymatische Eigenschaften studiert und herausgefunden,
daß das
Enzym die Fähigkeit
hat, (S)-2-Butanol mit einer hohen stereochemischen Spezifität zu oxidieren
und ebenso verschiedene andere sekundäre Alkohole stereospezifisch zu
oxidieren. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Enzym
mit den folgenden physiochemischen Eigenschaften zur Verfügung zu
stellen, wie in 1) bis 9) definiert:
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1) Funktionen
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Das
Enzym oxidiert Alkohol mit NAD+ als Coenzym, um das entsprechende
Keton oder den entsprechenden Aldehyd zu produzieren und reduziert
ebenso Ketone oder Aldehyde mit NADH als Coenzym, um den entsprechenden
Alkohol zu produzieren.
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2) Substratspezifität
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Das
Enzym verwendet alipathische Alkohole einschließlich derjenigen mit einer
aromatischen Substitution als sein zu oxidierendes Substrat, hat
eine relativ höhere
Aktivität
gegenüber
sekundären
Alkoholen als gegenüber
primären
Alkoholen und oxidiert bevorzugt 2-Butanol mit der S-Konfiguration.
Das Enzym verwendet ebenso Aldehyde oder alipathische Ketone mit
einer aromatischen Substitution.
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3) Molekulargewicht
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Das
anscheinende Molekulargewicht des Enzyms wird auf ungefähr 40.000
durch SDS-PAGE eingeschätzt.
Physikochemische ebenso wie enzymatische Eigenschaften des Enzyms
der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:
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4) Optimaler pH-Wert und
pH-Bereich für
die Enzymstabilität
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Der
optimale pH-Wert für
die Oxidation von (S)-2-Butanol rangiert von 8,5 bis 9,5, und derjenige
für die
Reduktion von 2-Butanon rangiert von 5,5 bis 6,5. Das Enzym ist
in dem pH-Bereich von 8,0 bis 10,0 relativ stabil.
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5) Optimaler Temperaturbereich
für die
enzymatische Reaktion
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Das
Enzym zeigt die hohe Aktivität
bei der Temperatur im Bereich von 25–55°C, wobei 50°C als optimal für die enzymatische
Reaktion angesehen werden.
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6) Thermische Inaktivierung
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Das
Enzym behält
mehr als 90% der ursprünglichen
Aktivität
sogar nach der Hitzebehandlung bei 40°C für 10 Min. bei.
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7) Inhibierung und Stabilisierung
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Die
Aktivität
des Enzyms wird durch SH-Reagenzien inhibiert, so wie p-Mercuribenzoesäure, Quecksilberchlorid,
Zinkchlorid und N-Ethylmaleimid, und ebenso durch Reduktionsmittel,
einschließlich
2-Mercaptoethanol
und Dithiothreitol. Die Enzymaktivität wird durch o-Phenanthrolin
inhibiert, aber nicht durch Ethylendiamintetraessigsäure.
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8) Aufreinigung
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Das
Enzym kann bis zu einer einzelnen Proteinbande auf der Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektophorese
(hiernach abgekürzt
als SDS-PAGE) durch Kombinieren der konventionellen Aufreinigungsverfahren
für normale
Proteine, umfassend beispielsweise Protaminsulfatpräzipitation
nach dem Zerstören
der mikrobiellen Zellen, Ammoniumsulfatfraktionierung des zentrifugierten Überstandes,
gefolgt durch eine Kombination einer anionen Austauschchromatographie,
einer hydrophoben Chromatographie und einer Gelfiltration aufgereinigt
werden.
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9) Isoelektrischer Punkt
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Auch
wenn das Enzym verschiedene Banden nach dem isoelektrischen Fokussieren
zeigt, ist der isoelektrische Punkt der Hauptproteinbande bei einem
pH von 6,7 angeordnet.
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Die
Aktivität
aller sekundärer
Alkoholdehydrogenasen einschließlich
des Enzyms, das in den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Beschreibung beschrieben ist, wurde wie folgt überprüft: (S)-2-Butanol (50 μmol) und
das Enzym wurden in einer Umsetzungsmischung enthaltend Tris-HCl
(50 μmol, pH
9,0) und NAD+ (2,5 μmol)
bei 30°C
inkubiert, und die Geschwindigkeit der NADH-Bildung wurde bei 340 nm
beobachtet. Eine Einheit des Enzyms wurde definiert als die Enzymmenge,
die erforderlich ist, um die Bildung eines μmols NADH pro Minute unter den
Assaybedingungen zu katalysieren.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein DNA-Segment
zur Verfügung
zu stellen, das für
die sekundäre
Alkoholdehydrogenase codiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben das auf gereinigte Enzym mit Lysylendopeptidase verdaut, die
verdauten Fragmente durch Umkehrphasenchromatographie aufgereinigt
und einen Teil der Aminosäuresequenz
unter Verwendung eines Proteinsequenzierers bestimmt. PCR (Polymerasekettenreaktion)
wurde unter Verwendung von Primern ausgeführt, die basierend auf der
Aminosäuresequenz,
die oben bestimmt wurde, synthetisiert wurden, und der chromosomalen
DNA von Candida parapsilosis als Template. Ein Teil des Gens, das
für die
sekundäre
Alkoholdehydrogenase codiert, wurde amplifiziert und dessen Basensequenz
(Kernsequenz) wurde bestimmt. Dann, um die Basensequenz in der flankierenden
Region der DNA-Sequenz, die oben bestimmt wurde (Kernsequenz) zu
bestimmen, wurde die chromosomale DNA von Candida parapsilosis mit
HaeII verdaut, einem Restriktionsenzym ohne einen Restriktionsort
in der Kernzsequenz. Die Template-DNA, die für die Umkehr-PCR verwendet
wurde (Nucleic Acids, Res. 16, 8186 (1988)), wurde durch Autorezyklisierung
von DNA-Fragmenten hergestellt, die oben erhalten unter Verwendung
von T4-DNA-Ligase
wurden. Basierend auf der Kernsequenz wurden Primer hergestellt,
die als Initiierungsort für
die DNA-Synthese
dienten, wobei sich die DNA von der Kernsequenz aus ausdehnte, und
die flankierenden Bereiche der Kernsequenz wurden durch Umkehr-PCR
amplifiziert. Durch Ergründen
der erhaltenen DNA-Sequenz wurde bestätigt, daß der gesamte codierende Bereich
der sekundären Alkoholdehydrogenase
in der autorezirkularisierten DNA beinhaltet war, wie gezeigt in 6, 7 und 8.
Weiterhin wurde bestätigt,
daß das
Produkt der Expression des klonierten Gens in Escherichia coli Wirtszellen
eine enzymatische Aktivität
aufweist, die ähnlich
zu der der sekundären
Alkoholdehydrogenase ist, die von Candida parapsilosis abgeleitet
ist.
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DNA,
die für
die sekundäre
Alkoholdehydrogenase der vorliegenden Erfindung codiert, beinhaltet
die Basensequenz, die für
das Protein codiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die im
wesentlichen ähnlich
zu der Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 2 ist, und die in den 6, 7 und 8 gezeigt
ist. "Im wesentlichen" bedeutet in diesem
Fall, daß die
Aminosäuresequenz,
die in den 6, 7 und 8 gezeigt
ist, durch Deletion, Insertion oder Substitution von gewissen Aminosäuren modifiziert
sein kann, so lange, wie resultierende Proteine die sekundäre Alkoholdehydrogenaseaktivität beibehalten.
Natürlich
beinhaltet die DNA der vorliegenden Erfindung die DNA, die aus 1008
Basen besteht, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1 und in 6, 7 und 8,
aber nicht auf diese beschränkt
ist. Eine DNA-Modifizierung,
welche zu einer Deletion, Insertion oder Substitution in der Aminosäuresequenz
führt,
für die
die DNA codiert, wird geeigneterweise durch ein konventionelles
Verfahren erzielt, so wie die ortsspezifische Mutation unter Verwendung
von synthetischen Oligonukleotiden. Ferner kann DNA mit einer zufälligen Mutation
durch Ausführen
einer PCR unter Verwendung von DNA erhalten werden, die aus 1008
Basen besteht, wie in den 6, 7 und 8 gezeigt ist,
oder durch geeignetes Modifizieren der DNA als Template in der Gegenwart
von Mn2+ (normalerweise 0,5–10 mM)
oder einer abgesenkten Konzentration gewisser Nukleotide. Natürlich umfassen
die so erhaltenen DNAs gemäß der vorliegenden
Erfindung DNA, die für
das Protein mit der sekundären
Alkoholdehydrogenaseaktivität
codiert.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus
zur Verfügung
zu stellen, welcher stabil mit dem DNA-Molekül transformiert ist, das für das Protein
mit eine Aminosäuresequenz
codiert, die im wesentlichen ähnlich
zu der ist, die in den 6, 7 und 8 gezeigt
ist, und die in der Lage ist, die sekundäre Alkoholdehydrogenase zu
produzieren.
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Jeder
Mikroorganismus, der mit dem DNA-Segment transformiert werden kann,
das für
ein Peptid mit der sekundären
Alkoholdehydrogenaseaktivität
codiert und welcher in der Lage ist, diese Aktivität zu exprimieren,
wird ein Gegenstand der Transformation der vorliegenden Erfindung
sein. Tatsächlich
umfaßt
dieser Mikroorganismus Bakterien, Hefen und Pilze, deren Wirt-/Vektorsystem
gut entwickelt ist. Bakterien beinhalten Escherichia, Bacillus,
Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus
und Lactobacillus. Hefen beinhalten Saccharomyces, Kluyveromyces,
Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon,
Rhodosporidium, Hansenula, Pichia und Candida. Pilze beinhalten
Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium und Trichoderma.
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Eine
Prozedur oder ein Verfahren zum Herstellen eines Transformanten
kann gemäß der konventionellen
Technik ausgeführt
werden, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie, Biotechnologie
und dem genetischen Engineering verwendet wird.
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Um
das Gen der vorliegenden Erfindung in einem Mikroorganismus zu exprimieren,
ist es erforderlich, das Gen in den Plasmidvektor oder den Phagenvektor
zu inserieren, der stabil in dem Mikroorganismus vorhanden ist.
Zum Exprimieren der DNA der vorliegenden Erfindung in Mikroorganismen
ist es ebenso erforderlich, die genetische Information, die in dem
Gen beinhaltet ist, zu transkribieren und zu translatieren. Dies
kann durch das Einfügen
eines Promoters und eines Terminators erreicht werden, der Kontrolleinheit
für die
Transkription und Translation, in den Upstream- bzw. den Downstream-Bereich des
5'-Endes der DNA
der vorliegenden Erfindung. Zu diesem Zweck ist es wichtig, einen
Promoter und einen Terminator zu verwenden, welcher dafür bekannt
ist, in dem Mikroorganismus zu funktionieren, der als Wirtszelle
verwendet werden soll. Promotoren und Terminatoren, die mit verschiedenen
Mikroorganismen verwendbar sind, sind detailliert in "Biseibutsugaku Kisokoza
(Basic Microbiology), Vol. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan
(1990)" beschrieben, insbesondere
diejenigen, die in Hefe verwendbar sind in "Adv. Biochem. Eng. 43, 75–102 (1990)" oder "Yeast 8, 423–488 (1992)". Beispielsweise
beinhalten mögliche
Plasmidvektoren für
die Verwendung mit Escherichia, insbesondere mit Escherichia coli,
den Plasmid der pBR- und der pUC-Serie, und geeignete Promotoren
für die
Verwendung beinhalten den lac-Promoter (β-Galactosidase), das trp-Operon
(Tryptophanoperon), und den tac-Promoter (lac-trp-Promoter), und λ-Phagen PL- oder PR-abgeleitete
Promotoren. Desweiteren beinhalten mögliche Terminatoren für die Verwendung
trpA- oder Phagen-abgeleitete rrnB-ribosomale Terminatoren.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Bacillus beinhalten die Plasmide der pUB110-Serie oder
der pC194-Serie,
welche direkt in das Chromosom inseriert werden können. Außerdem beinhalten
mögliche
Promotoren oder Terminatoren für
die Verwendung mit dieser Spezies apr (Alkalinprotease), npr (neutrale Protease)
und amy (α-Amylase) Promotoren.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Pseudonomas, insbesondere mit Pseudonomas putida
und Pseudonomas cepacia beinhalten das neu entwickelte Wirtsvektorsystem,
so wie pKT240, einen Vektor mit einem breiten Wirtszellenspektrum
abgeleitet vom TOL-Plasmid, das an der Toluolzersetzung teilnimmt
(der Vektor beinhaltet ebenso das Gen, das für die autonome Replikation
erforderlich ist, abgeleitet von RSF1010 und anderen), und mögliche Promotoren
und Terminatoren beinhalten das Lipasegen (JPH5-284973).
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Brevibacterium, insbesondere mit Brevibacterium lactofermentum
beinhalten pAJ43, und mögliche
Promotoren und Terminatoren für
die Verwendung sind die gleichen wie diejenigen, die mit Escherichia
verwendet werden.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Corynebacterium, insbesondere mit Corynebacterium
glutamicum beinhalten pCS11 (JPS57-183799) und pCB101 (Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)).
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Streptococcus beinhalten jene wie pHV1301 (FEMS Microbiol.
Lett. 26, 239 (1985)) und pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94
(1985)).
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Lactobacillus sind diejenigen, die für die Verwendung
mit Streptococcus entwickelt wurden, so wie pAMβ1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979)),
und mögliche
Promotoren für
die Verwendung sind diejenigen für
die Verwendung mit Escherichia.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae
beinhalten diejenigen der Serie YRp, YEp, YCp und YIp.
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Der
Integrationsvektor, (z. B. in EP537456) zusammengesetzt durch die
Verwendung von homologer Rekombination aus ribosomaler DNA mit einer
multiplen Kopie in dem Chromosom, ist nützlich für die Insertion einer multiplen
Kopie und für
die stabile Generhaltung. Zusätzlich
sind Plasmidvektoren, die ADH (Alkoholdehydrogenase), GAPDH (Glyceraldehyd
3-Phosphatdehydrogenase),
PHO (Säurephosphatase),
GAL (β-Galactosidas), PGK
(Phosphoglyceratkinase) und ENO (Enolase) tragen, ebenso nützlich als
Promoter oder Terminator mit dieser Art.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung mit Kluyveromyces, insbesondere Kluyveromyces lactis
beinhalten 2 μm
Serienplasmide abgeleitet von Saccaromyces cerevisiae, pKD1 Serienplasmide
(J. Bacteriol. 145, 382–390
(1981)), pGK11-abgeleitete Plasmide, die zur Killeraktivität in Bezug
stehen, Plasmide der KARS-Serie mit dem autonomen Replikationsgen
von Kluyveromyces und den Integrationsvektor (z. B. in EP537456),
welcher in das Gen durch homologe Replikation mit ribosomaler DNA
integrieren kann. Vektoren, in die das Gen, das für ADH oder
PGK codiert, eingefügt
wurde, sind ebenso als Promoter oder Terminator verwendbar.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung in Schizosaccaromyces beinhalten diejenigen mit der Einfügung von
a) ARS (Gen in Bezug auf die autonome Replikation) abgeleitet von
Schizosaccharomyces pombe, b) den selektiven Marker abgeleitet von
Saccharomyces cerevisae und komplementär zur Auxotropie (Mol. Cell
Biol. 6, 80 (1986)), und c) ADH-Promoter abgeleitet von Saccharomyces
pombe (EMBO J. 6, 729, (1987)).
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung in Zygosaccharomyces beinhalten pSB3 abgeleitet von Zygosaccharomyces
rouxii (Nuclei Acids Res. 13, 4267 (1985)), PHO5-Promoter abgeleitet
von Saccharomyces cerevisiae, und GAP-Zr (tragend das Gen für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase)
Promoter abgeleitet von Zygosaccharomyces rouxii (Agri. Biol. Chem.
54, 2521 (1990)).
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung in Hansensula beinhalten das Wirtsvektorsystem, das in
Hasenula polymorpha entwickelt wurde, umfassend HARS1 und HARS2,
die autonome Replikationssequenz von Hansenula polymorpha, welche
wiederum relativ unstabil sind. Daher ist der Integrationsvektor,
der die multiplen Kopien im Chromosom trägt, nützlich (Yeast 7, 431–448 (1991)).
Promotoren für
Methanol-induzierbare AOX (Alkoholdehydrogenase) oder FDG (Formatdehydrogenase)
sind ebenso nützlich.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung in Pichia beinhalten das Wirtsvektorsystem, das in Pichia
pastoris entwickelt wurde unter Verwendung des Gens, das an der
autonomen Replikation in Pichia teilnimmt (Mol. Cell. Biol. 5, 3376
(1985)) und den potenten Promoter für AOX induzierbar durch die
Hochkonzentrationskultur in der Gegenwart von Methanol (Nucleic
Acid Res. 15, 3859 (1987)).
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Als
mögliche
Plasmidvektoren für
die Verwendung in Candida wurde das Wirtsvektorsystem in Candida
maltosa, Candida albicans und Candida tropicalis entwickelt. In Candida
maltosa wurde der Plasmidvektor mit der Insertion der klonierten
ARS (autonome Replikationssequenz), abgeleitet von Candida maltosa
(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), für die Verwendung entwickelt.
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Mögliche Plasmidvektoren
für die
Verwendung in Aspergillus, einem der am gründlichsten studierten Pilze,
beinhalten den Vektor, der durch die Integration des Gens in den
Plasmid oder in das Chromosom und den Promoter für die extrazelluläre Protease
oder Amylase (Trends in Biotechnology 7, 283–287 (1989)) konstruiert wurde.
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Als
mögliche
Plasmidvektoren für
die Verwendung in Trichoderma wurde das Wirtsvektorsystem in Trichoderma
reesei entwickelt, und der Promoter für die extrazelluläre Cellulase
ist für
die Vektorkonstruktion nützlich
(Biotechnology 7, 596–603).
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Ein
Verfahren zum Herstellen des Enzyms der vorliegenden Erfindung umfaßt das Kultivieren
der Zellen, die zu dem Genus Candida oder deren Mutanten gehören, mit
der Fähigkeit
zur Produktion des Enzyms mit den folgenden Eigenschaften 1) bis
3) oder rekombinanter Zellen, die mit der Fähigkeit zur Produktion des Enzyms
durch Inserieren des Gens, das für
das Enzym codiert, in einem fremden Mikroorganismuswirt ausgestattet
sind.
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1) Funktion
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Das
Enzym oxidiert Alkohol mit NAD+ als Coenzym und produziert korrespondierende
Ketone oder Aldehyde. Ebenso reduziert das Enzym Ketone oder Aldehyde
mit NADH als Coenzym und produziert den korrespondierenden Alkohol.
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2) Substratspezifität
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Das
Enzym verwendet alipathische Alkohole mit aromatischer Substitution
als Substrat für
den Oxidationsreaktion, zeigt eine höhere Aktivität gegenüber sekundären Alkoholen,
verglichen mit primären
Alkoholen und oxidiert (S)-2-Butanol bevorzugt. Aldehyde oder Ketone
mit aromatischer Substitution sind die Substrate für die Reduktionsreaktion
des Enzyms.
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3) Molekulargewicht
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Das
anscheinende Molekulargewicht des Enzyms wird auf etwa 40.000 durch
SDS-PAGE eingeschätzt.
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Desweiteren
kann das Enzym der vorliegenden Erfindung oder der Mikroorganismus,
der das Enzym enthält
(einschließlich
vom mutierten Stämmen
und rekombinanten Mikroorganismen) oder das bearbeitete Produkt
daraus verwendet werden, um mit dem racemischen aliphatischen Alkolhol
mit einer möglichen
aromatischen Substitution, so wie 2-Butanol, 2-Octanol, Phenylethanol,
1,3-Butanediol und
Ethyl β-Hydroxy-n-butylat
umgesetzt zu werden, wobei nur eines der optisch aktiven Isomere
oxidiert wird (z. B. (S)-Isomer in dem Fall von 2-Butanol, 2-Octanol,
Phenylethanol, 1,3-Butanediol und Ethyl β-Hydroxy-n-butylat) und wodurch das andere
optisch aktive Isomer (R-Isomer im Falle von 2-Butanol, 2-Octanol,
Phenylethanol, 1,3-Butanediol und Ethyl β-Hydroxy-n-butylat) hergestellt wird. Bei dieser
Oxidationsreaktion wird das Coenzym NAD+ zu NADH reduziert.
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Das
so produzierte NADH kann zu NAD+ beispielsweise durch die mikrobielle
Fähigkeit,
NADH zu NAD+ umzuwandeln, umgewandelt (regeneriert) werden.
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NAD+
kann dadurch regeneriert werden, daß das Enzym mit der Aktivität, NADH
zu NAD+ zu oxidieren, so wie Glutamatdehydrogenase, Glukosedehydrogenase,
NADH-Dehydrogenase
und NADH-Oxidase oder Mikroorganismen, die diese Enzyme enthalten
oder bearbeitete Produkt daraus zu dem Reaktionssystem hinzugesetzt
werden. Wenn man aus der Substratspezifität des Enzyms der vorliegenden
Erfindung einen Nutzen zieht, kann eine simultane Regeneration von
NAD+ mit dem Enzym alleine durch Hinzufügen von preiswerten Substraten
für die
Reduktionsreaktion des Enzyms, so wie Aceton oder 2-Butanon zu dem
Reaktionssystem, erreicht werden.
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Auch
kann ein optisch aktiver Alkohol durch die Behandlung der entsprechenden
ketonischen Verbindung mit der sekundären Alkoholdehydrogenase der
vorliegenden Erfindung oder mit Mikroorganismen, die das Enzym produzieren
(einschließlich
dessen Mutantenstämmen
oder rekombinanten Zellen) oder den bearbeiteten Produkten daraus
produziert werden; beispielsweise (S)-2-Butanol aus 2-Butanon, (S)-Octanol
aus 2-Octanon, (S)-1-Phenylethanol
aus Acetophenon, (S)-1,3-Butanediol aus 4-Hydroxy-2-butanon, (S)-β-Hydroxy-n-butylsäureester
aus Acetoessigsäureester.
Durch diese Reduktionsreaktion wird das Coenzym NADH oxidiert, um
NAD+ zu bilden.
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Das
so produzierte NAD+ kann zu NADH beispielsweise durch die Aktivität von Mikroorganismen, NAD+
zu NADH umzuwandeln, umgewandelt (regeneriert) werden. Die NAD+-reduzierende Aktivität kann durch
das Hinzufügen
von Glucose, Ethanol oder Format zu dem Umsetzungssystem verstärkt werden.
NAD+ kann ebenso durch das Hinzufügen des Enzyms, das in der
Lage ist, NAD+ zu NADH zu reduzieren, so wie Formatdehydrogenase,
Malatdehydrogenase und Glucosedehydrogenase oder durch das Hinzufügen von
Mikroorganismen, die diese Enzyme enthalten oder der bearbeiteten
Produkte daraus zu dem Umsetzungssystem reduziert werden. Wenn man
einen Vorteil aus der Substratspezifität des Enzyms zieht, kann die
simultane Regeneration von NADH mit dem Enzym alleine dadurch erzielt
werden, daß das
Substrat der oxidativen Reaktion des Enzyms, so wie Isopropanol
oder Ethanol, zu dem Umsetzungssystem hinzugefügt wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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1 zeigt
das Elektrophorese-Muster der aufgereinigten sekundären Alkoholdehydrogenase
auf einem Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel.
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2 zeigt
die Wirkung von pH-Werten auf die (S)-2-Butanol oxidierende Wirkung der sekundären Alkoholdehydrogenase,
ausgedrückt
relativ zu der maximalen Aktivität
(100%) bei optimalem pH-Wert.
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3 zeigt
die Wirkung von pH-Werten auf die 2-Butanon-reduzierende Aktivität der sekundären Alkoholdehydrogenase,
ausgedrückt
relativ zu der maximalen Aktivität
(100%) bei optimalem pH.
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4 zeigt
die Wirkung von pH-Werten auf die verbleibende Aktivität der sekundären Alkoholdehydrogenase
nach der Behandlung des Enzyms bei 30°C für 30 Minuten, ausgedrückt relativ
zu der initialen Aktivität
(100%).
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5 zeigt
die Wirkung des Erhitzens auf unterschiedliche Temperaturen für 10 Minuten
auf die verbleibende Aktivität
der sekundären
Alkoholdehydrogenase, ausgedrückt
relativ zu der initialen Aktivität (100%).
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6 zeigt
die Basensequenz der DNA, die für
die sekundäre
Alkoholdehydrogenase kodiert, die abgeleitete Aminosäuresequenz
von dieser Basensequenz und die PCR-Bereiche und die reversen PCR-Primer in
der Sequenz.
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7 zeigt
die Basensequenz der DNA, die für
die sekundäre
Alkoholdehydrogenase kodiert, die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz
abgeleitet ist und die PCR-Bereiche und die reversen PCR-Primer
bei der Sequenz (Fortführung
von 6).
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8 zeigt
die Basensequenz der DNA, die für
die sekundäre
Alkoholdehydrogenase kodiert, die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz
abgeleitet ist, und die PCR-Bereiche und die reversen PCR-Primer
bei dieser Sequenz (Fortführung
von 7).
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9 zeigt
die Basen- und Aminosäuresequenz
der gemischten PCR-Primer (CpN und CpT10). Mehrere Basen, die derselben
Position in der Figur zugewiesen sind, zeigen an, dass der Primer
eine Mischung aus Primern ist, mit mehreren Codons für die entsprechende
Aminosäure.
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10 zeigt
die Konstruktion des Plasmids pCPA6R.
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11 zeigt
die Konstruktion des Expressionsvektors pKK-CPA1.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
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In
dem folgenden Abschnitt beschreiben bevorzugte Ausführungsformen
die vorliegende Erfindung detaillierter. Jedoch ist die vorliegende
Erfindung nicht auf die Beispiele, die hier angegeben werden, beschränkt.
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Beispiel 1 (Aufreinigung
der sekundären
Alkoholdehydrogenase)
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Der
Candida parapsilosis IFO 1396 Stamm wurde in einem YM-Medium enthaltend
Glukose (10 g), Bactopepton (5 g), Hefeextrakt (3 g) und Malzextrakt
(3 g) pro Liter bei pH 6,0 wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation geerntet. Die so erhaltenen nassen Zellen wurden
in einem Hochdruckzelldisintegrator zerstört und zentrifugiert, um Zellrückstand
zu entfernen. Zu dem zellfreien Extrakt wurde Protaminsulfat hinzugefügt, um Nukleinsäuren und
Mikrosome zu entfernen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand
zu einer 70%-igen Sättigung
mit Ammoniumsulfat gebracht, und das Präzipitat wurde gesammelt, einer Anionenaustauschchromatographie
auf Q-Sepharose FF ausgesetzt, mit einem Dichtegradienten von NaCl eluiert,
und die Peakfraktion, die die sekundäre Alkoholdehydrogenaseaktivität enthielt,
wurde gesammelt. Die aktive Fraktion wurde dann einer hydrophoben
Chromatographie auf einer Säule
aus Phenylsepharose ausgesetzt, die mit einem Puffer equilibriert
wurde, der 1,62 M Ammoniumsulfat enthielt, und die aktive Fraktion wurde
durch Reduzieren der Ammoniumsulfatkonzentration auf 0 M eluiert
(die Enzymaktivität
wurde in einem Assay, wie hiervor beschrieben, überprüft). Nachdem die aktive Fraktion
zu einer Red-Sepharose-Affinitätssäule hinzugefügt wurde,
wurde die nicht zurückbehaltende
Fraktion einer Superdex 200 Gelfiltration ausgesetzt. Die zurückgewonnene
aktive Fraktion wurde einer Anionenaustauschchormatographie auf
einer Mono-Q-Säule
ausgesetzt und mit einem Dichtegradienten aus NaCl eluiert. Nur
aktive Fraktionen, die eine einzelne Bande in dem Reinheitstest
auf SDS-Page ergaben, wurden gesammelt.
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Auf
einer Polyacrylamidgelelektorphorese (nativ-Page) ergab die aufgereinigte
sekundäre
Alkoholdehydrogenase eine Haupt- und mehrere daran angrenzende schwache
Nebenprotein-Banden. Nach dem Aktivitätsfärben zeigten alle Proteinbanden
die sekundäre
Alkoholdehydrogenaseaktivität,
und auf SDS-Page migrierte diese Enzympräparation als eine einzelne
Proteinbande.
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Das
anscheinende Molekulargewicht des aufgereinigten Enzyms wurde durch
SDS-Page auf etwa 40000 eingeschätzt
(1).
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Tabelle
1 fasst das Verfahren zusammen, das in einer Aufreinigung des Enzyms
mit einer spezifischen Aktivität
von 1370 Einheiten pro mg resultierte.
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Beispiel 2 (pH-Optimum
der sekundären
Alkoholdehydrogenase)
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Die
Wirkung des pHs auf die (S)-2-Butanol-oxidierende Aktivität und auf
die 2-Butanon-reduzierende Aktivität (überprüft unter den Bedingungen für (S)-2-Butanol-oxidierenden Aktivitätsassay
in der Gegenwart von NADH (0,4 μmol
anstelle von NAD+, folgend der Oxidationsgeschwindigkeit
von NADH bei 340 nm) wurde unter unterschiedlichen pH-Werten unter
Verwendung von Kaliumphosphat (KPB), Tris-HCl und Briton-Robinson-Puffer überprüft. Die
Enzymaktivität
wird relativ zu der maximalen Aktivität (100%) in den 2 und 3 gezeigt.
Das pH-Optimum für
die Oxidation von (S)-2-Butanol
war 8,5 bis 9,5, während
das pH-Optimum für die
Reduktion von 2-Butanon 5,5 bis 6,5 war.
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Beispiel 3 (optimale Umsetzungstemperatur
für die
sekundäre
Alkoholdehydrogenase)
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Die
sekundäre
Alkoholdehydrogenaseaktivität
wurde unter den Standardassaybedingungen bei unterschiedlichen Temperaturen,
wie in Tabelle 2 gezeigt, überprüft. Die
optimale Umsetzungstemperatur des Enzyms beträgt 50°C.
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Beispiel 4 (pH-Stabilität der sekundären Alkoholdehydrogenase)
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Nachdem
das aufgereinigte Enzym in Tris-HCl (pH 8,0 bis 9,0) und Briton-Robinson-Puffer
(pH 5,0 bis 12,0) bei 30°C
für 30
Minuten inkubiert wurde, wurde die verbleibende Aktivität überprüft. Das
Enzym war am stabilsten bei einem pH-Bereich von 8 bis 10,0 (4).
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Beispiel 5 (Thermostabilität der sekundären Alkoholdehydrogenase)
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Nachdem
das aufgereinigte Enzym bei pH 8,0 und bei 30°C bis 70°C für 10 Minuten inkubiert wurde, wurde
die verbleibende Aktivität überprüft. Sogar
nach der Inkubation bei 40°C
für 10
Minuten wurden mehr als 90% der ursprünglichen Enzymaktivität beibehalten
(5).
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Beispiel 5 (Substratspezifität der sekundären Alkoholdehydrogenase)
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Die
oxidierenden und die reduzierenden Aktivitäten des Enzyms mit unterschiedlichen
Alkoholen und Aldehyden als Substrat, respektive, sind in den Tabellen
3 und 4, respektive, zusammengefasst, verglichen mit der (S)-2-Butanol-oxidierenden
Aktivität
(100%) und der 2-Butanon-reduzierenden
Aktivität
(100%), respektive.
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Beispiel 7 (Inhibitor
der sekundären
Alkoholdehydrogenase)
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Nachdem
das Enzym bei 30°C
für 30
Minuten in der Gegenwart von verschiedenen Reagenzien inhibiert
wurde, wurde die verbleibende Aktivität überprüft und als Prozentsatz relativ
zu der des oben behandelten Enzyms (100) ausgedrückt (Tabelle 5).
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Die
enzymatische Aktivität
wurde durch Dithiothreitol (DTT), Iodacetamid, p-Chlormercuribenzoesäure, Quecksilberchlorid,
Zinkchlorid, Metallchelatoren (bei hoher Konzentration) und 2-Mercaptoethanol
bemerkenswert inhibiert.
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Beispiel 8 (Analyse der
teilweisen Aminosäuresequenz
der sekundären
Alkoholdehydrogenase)
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Das
aufgereinigte Enzym (0,152 mg) in 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) enthaltend
4 M Harnstoff wurde mit Lysylendopeptidase (0,53 μg) bei 30°C für 6 Stunden
verdaut. Die so erhaltenen Peptidfragmente wurden durch eine Umkehrphasen
HPLC (auf einer TSK ODS-120T-Säule,
TOSO) fraktioniert und mit einem Acetonitrildichtegradienten in
0,1% Trifluoressigsäure
eluiert. Die Aminosäuresequenz
der fraktionierten Peptide wurde durch einen Proteinsequenzierer
477A (ABI) bestimmt, und ist in den 6, 7 und 8 (unterstrichen)
gezeigt.
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Beispiel 9 (PCR-Klonieren
eines Gens, das für
sekundäre
Alkoholdehydrogenase kodiert)
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Ein
DNA-Fragment der Sequenz, die von der Aminosäuresequenz in der Nähe des N-Terminus
abgeleitet ist, wurde unter in-Erwägung-Ziehung von dessen Degeneriertheit
als ein gemischter PCR-Primer (CpN) synthetisiert. Eine weitere
DNA-Sequenz, die komplementär
zu dieser war, die von der Aminosäuresequenz in der Nähe des C-Terminus
abgeleitet war, wurde als ein weiterer gemischter PCR-Primer synthetisiert
(CpT10). Diese Basensequenzen sind in 9 gezeigt.
Die DNA-Synthese wurde mit einem ABI-DNA-Synthetisierer 381 A ausgeführt.
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Beispiel 10 (Herstellung
von chromosomaler DNA aus Candida parapsilosis)
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Candida
parapsilosis IFO 1396 wurde in einem YEPD-Medium (100 ml) (1% Hefeextrakt,
2% Polypepton und 2% Glukose) wachsen gelassen und zentrifugiert.
Die Zellen wurden in 0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
enthaltend 25 mM Sorbitol suspendiert und wurden erneut zentrifugiert.
Zu den zurückgewonnenen
Zellen, suspendiert in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,5, 10 ml) enthaltend
1 M Sorbitol, 0,1 M 2-Mercaptoethanol, wurde Chymolyase (0,4 ml)
hinzugefügt,
und die Mischung wurde bei 30°C
inkubiert, um Protoplasten zu erhalten. Nachdem die Bildung von
Protoplasten unter dem Mikroskop bestätigt wurde, wurde die Mischung
zentrifugiert. Zu den zurückgewonnenen
Zellen, resuspendiert in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4, 12 ml) enthaltend
20 mM EDTA, wurde 10% SDS (Natriumdodecylsulfat, 1,2 ml) hinzugefügt, gründlich gemischt,
und bei 65°C
80 Minuten inkubiert. Dann, nach dem Hinzufügen von 5 M Kaliumacetat (pH
5,0, 3,6 ml), wurde die Mischung auf Eis 60 Minuten lang belassen,
um das denaturierte Protein zu präzipitieren.
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Nach
dem Entfernen des denaturierten Proteins durch die Zentrifugation
wurde ein gleiches Volumen von Isopropanol zu dem zurückgewonnenen Überstand
hinzugefügt,
und es wurde vorsichtig gemischt. Die präzipitierte DNA wurde durch
Zentrifugation gesammelt, getrocknet, in 10 mM Tris-HCL (pH 7,4)
enthaltend 1 mM EDTA gelöst.
Zu dieser Mischung wurde RNase (1 mg/ml, 0,75 ml) hinzugefügt, und
es wurde bei 37°C für eine Stunde
inkubiert, um kontaminierende RNA abzubauen. Dann, nach der anschließenden Extraktion mit
Phenol, Phenol/Chloroform, und Phenol wurde die DNA durch Ethanolpräzipitation
zurückgewonnen
und als Template für
die PCR verwendet, die in Beispiel 11 beschrieben ist.
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Beispiel 11 (Klonieren
des sekundären
Alkoholdehydrogenasegens durch PCR)
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Unter
Verwendung der chromosomalen DNA von Candida parapsilosis (50 ng),
hergestellt in Beispiel 10, als Template, wurde PCR zur Amplifikation
in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (ph 8,3), 50 mM KCL, 1,5 mM
MgCl2, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,01% Gelatin,
und 2 Einheiten TagDNA-Polymerase
(Roche)] mit einem Satz der gemischten PCR-Primer (CpN und CpT10, 100 pmol jeweils),
synthetisiert in Beispiel 9, durchgeführt. Nach 30 Zyklen der Hitzedenaturierung
(94°C, 30
Sekunden), des Annealens (45°C,
30 Sekunden) und der Extension (40°C, 2 Minuten) wurde die PCR-Mischung
auf 4°C
abgekühlt,
und die Amplifikation der DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese
der PCR-Produkte bestätigt.
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Beispiel 12 (Subklonieren
der DNA amplifiziert durch PCR)
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Die
DNA, amplifiziert durch PCR in Beispiel 11, wurde in pUC18 mit einem
SureClone Ligation Kit (Pharmacia) subkloniert. Die Basensequenz
des Konstruktes, bestimmt mit einem ABI-DNA-Sequenzierer 373A schien
aus 971 Basen zu bestehen, einschließlich der Sequenz der PCR-Primer,
CpN und CpT10, welche die DNA-Sequenz zwischen ihnen, wie in den 6, 7 und 8 gezeigt,
einschlossen. Diese Sequenz wird hiernach als „Kernsequenz" bezeichnet.
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Beispiel 13 (Klonieren
von Basensequenzen, die die Kernsequenz umgeben, durch reverse PCR)
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Die
Basensequenz, die komplementär
zu einem Bereich in der Nähe
der 5'-Seite der
Kernsequenz ist, CAATTGACCCGCTTTGGGC (CPA-MUN) und diejenige zu
einem Bereich in der Nähe
der 3'-Seite, TTCGAATCTTGGGATGTTTTTG
(CPA-NSP) wurden als reverse PCR-Primer synthetisiert. Bereiche
dieser Primer in dem DNA-Molekül,
das für
die sekundäre
Alkoholdehydrogenase kodiert, sind in den 6, 7 und 8 gezeigt.
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Chromosomale
DNA von Candida parapsilosis wurde mit einem Restriktionsenzym HaeII
verdaut, und der Verdau wurde durch die T4-DNA-Ligase selbstzirkularisiert,
um als Template bei der reversen PCR verwendet zu werden.
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Die
PCR wurde in dem PCR-Puffer ausgeführt, (beschrieben in Beispiel
11), enthaltend das Autorezirkularisierungsprodukt (50 ng) und einen
Satz der synthetischen Primer, CPN-MUN und CPA-NSP (jeweils 20 pmol).
Nach 30 Zyklen der Hitzedenaturierung (94°C, 30 Sekunden), dem Annealen
(50°C, 30
Sekunden) und der Extensionsumsetzung (70°C, 2 Minuten) wurde das amplifizierte
DNA-Fragment in pUC18 mit einem SureClone Ligations Kit (Pharmacia)
subkloniert, und dann wurde die gesamte Basensequenz mit einem ABI-DNA-Sequenzierer,
wie in Beispiel 12 beschreiben, bestimmt.
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Beispiel 14 (Synthese
des Gens, das für
eine sekundäre
Alkoholdehydrogenase kodiert, durch PCR)
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Der
Restriktionsort wurde durch PCR mit entsprechenden Primern in das
DNA-Molekül
eingeführt,
das für
das Enzym kodiert. Unter Verwendung der DNA, hergestellt in Beispiel
10 als das Template, wurde PCR zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes
von etwa 1030 Basenpaaren mit einem 5'-Primer [CPA-ATG] (5'-TCGCGAATTCAATGTCAATTCCATCAAGCCAG-3') mit einem EcoRI-Restriktionsort und
einem 3'-Primer [CPA-TAG]
(5'AGATCTTACTATGGATTAAAAACAACTCTA-3') mit einem BglII-Restriktionsort
ausgeführt.
Die DNA wurde mit einem ABI-DNA-Synthetisierer 381A in Beispiel
11 synthetisiert.
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Beispiel 15 (Subklonieren
von DNA, die durch PCR amplifiziert wurde)
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Das
PCR-Fragment, amplifiziert wie in Beispiel 14 beschrieben, wurde
in den Dmal-Ort von pUC18 mit Multikonierungsorten mit dem SureClone
Ligationskit (Pharmacia) (10) subkloniert.
In das konstruierte Plasmid (designiert als pCPA6R) wurde der Laktosepromotor
in gegenläufiger
Richtung inseriert (eingeschlossen in dem Bereich, bezeichnet als „lac z" in 10.
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Beispiel 16 (Konstruktion
des Plasmids pKK-CPA1, Gen für
die Expression von sekundärer
Alkoholdehydrogenase)
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Das
Gen der sekundären
Alkoholdehydrogenase wurde in den Expressionsvektor pKK223-3 (Pharmacia)
durch das folgende Verfahren subkloniert, und das Konstrukt wurde
als pKK-CPA1 bezeichnet.
Das Plasmid pCPA6R wurde mit EcoICRI (Promega) verdaut, verbunden
mit dem HindIII-Linker (Takara) und dann mit EcoRI (Takara) und
HindIII (Takara) gespalten, um das DNA-Fragment zu extrahieren,
das für
die sekundäre Alkoholdehydrogenase
kodiert. Dann wurde das DNA-Fragment mit dem gespaltenen Produkt
des Expressionsvektors, pKK223-3 mit den Restriktionsenzymen EcoRI
und HindIII, verbunden, um den Genexpressionsvektor für die sekundäre Alkoholdehydrogenase,
pKK-CPAI (11), zu konstruieren.
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Beispiel 17 (Herstellung
der sekundären
Alkoholdehydrogenase)
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Kompetente
Escherichia coli JM109 wurden hergestellt und mit dem Expressionsvektor
pKK-CPAI transformiert, um einen Stamm zu produzieren, der sekundäre Alkoholdehydrogenase
produziert. Dieser Stamm wurde in einem LB-Medium (bestehend aus
1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt und 1,0% NaCl, pH 7,2) enthaltend
Ampicillion (0,1 mg/ml) bei 30°C
für 3 Stunden
wachsen gelassen. Nach der Hinzufügung von Isopropylthiogalactosid
(IPTG) bis zu einer 1 mM Konzentration, wurde die Kultur für weitere
5 Stunden inkubiert, dann wurde die Kultur zentrifugiert, um die
Zellen zu sammeln.
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Beispiel 18 (Aktivitätsbewertung
der transformierten Zellen durch enzymatische Umsetzung)
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Die
Zellen, hergestellt gemäß Beispiel
17, wurden in 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) enthaltend 0,01% 2-Mercaptoethanol
suspendiert und sonifiziert, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. Die Enzymlösung wurde
zu einer Umsetzungsmischung hinzugegeben, bestehend aus 50 mM Tris-HCl
(pH 9,0), 50 mM (S)-1,3-Butandiol und 2,5 mM NAD+,
und die Geschwindigkeit der NAD+-Reduktion
wurde bei 340 nm verfolgt. Die Resultate der (S)-1,3-Butandiol-oxidierenden Aktivität, die somit überprüft wurde,
sind in Tabelle 6 gezeigt. Als Kontrolle sind die Ergebnisse von ähnlichen
Aktivitätstests
der Escherichia coli-Wirtszellen
gezeigt, welche nicht mit dem Expressionsplasmid pKK-CPA1 transformiert
wurden, ebenso in Tabelle 6.
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Beispiel 19 (Produktion
von (R)-1,3-Butandiol durch rekombinante bakterielle Zellen)
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Zu
den Zellen, hergestellt gemäß Beispiel
17, wurde racemisches 1,3-Butandiol und CaCO3 bis
zu einer finalen Konzentration von 5% und 0,8% hinzugefügt, und
die Mischung wurde in Teströhrchen
mit 21 mm Durchmesser bei 30°C
für 17
Stunden unter Schütteln
(250 RPM) inkubiert. Die Zellkonzentration zu Beginn der Umsetzung
wurde auf A650 = 20 angepasst. Nach der
Umsetzung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand
(500 μl)
wurde mit NaCl gesättigt,
und dann wurde das verbleibende 1,3-Butandiol mit Ethylacetat (2
ml) extrahiert. Nach der Entfernung des Lösungsmittels aus dem Extrakt
wurde der Rückstand
durch die Hinzufügung
von Acetylchlorid (100 μl)
acetyliert. Acetyliertes 1,3-Butandiol wurde in n-Hexan (1 ml) gelöst, und
die optische Reinheit wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie
auf einer optisch auflösenden
Säule [Chiralcel
OB (Daicel Chem. Ind.); Lösungsmittel,
n-Hexan/2-Propanol = 19/1; Wellenlänge, 220 nm; Elusionsgeschwindigkeit,
1,0 ml/min; Temperatur, 40°C]
(Retentionszeit: (S)-Isomer; 15 Minuten; (R)-Isomer, 19,3 min) überprüft.
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Weiterhin,
nachdem der oben beschriebene Überstand
entsprechend mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, wurde die Konzentration
von 1,3-Butandiol darin durch Gaschromatographie bestimmt [Säule (3 mm
Durchmesser × 2,1
m Länge),
Thermon 3000 5%/Chromosorb W 80–100
Mesh (Shinwakako); Temperatur, 130°C]. Die optische Reinheit und
die Ausbeute von 1,3-Butandiol wurden in Tabelle 7 zusammengefasst. Als
Kontrolle wurden die Resultate von einem ähnlichen Test mit den Escherichia
coli-Wirtszellen,
welche nicht mit dem Expressionsplasmid pKK- CPA1 transformiert wurden, ebenso in
Tabelle 7 aufgeführt.
Die Ausbeute in Tabelle 7 ist „das
molare Verhältnis
des verbleibenden 1,3-Butandiols nach der Umsetzung zu dem initialen racemischen
1,3-Butandiol, das hinzugefügt
wurde".
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Durch
die vorliegende Erfindung wurde es möglich, eine neue sekundäre Alkoholdehydrogenase
mit stereochemischer Spezifität,
die DNA, die für
das Enzym kodiert, und Mikroorganismen, die mit DNA transformiert
wurden, die für
das Enzym kodiert, zu erhalten.
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Unter
Verwendung des Enzyms, des Mikroorganismus (einschließlich dessen
Mutanten und Transformanten), die das Enzym produzieren, oder der
verarbeiteten Produkte daraus wurde es möglich, einen optisch aktiven
Alkohol aus einem racemischen Alkohol oder einem asymmetrischen
Keton zu produzieren.
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