DE602004012918T2 - Carbonyl Reduktase, Gene und Methoden zu deren Expression, sowie Verwendung derselben zur Herstellung optisch aktiver Alkohole - Google Patents

Carbonyl Reduktase, Gene und Methoden zu deren Expression, sowie Verwendung derselben zur Herstellung optisch aktiver Alkohole Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Carbonyl-Reductasen, welche abhängen von reduziertem β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (im Folgenden auch bezeichnet als NADPH). Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polynukleotide, welche diese Enzym-Proteine kodieren, Verfahren zum Herstellen der Enzyme und Verfahren zum Herstellen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol unter Verwendung der Enzyme.
  • Hintergrund der Erfindung
  • (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol wurde konventionell hergestellt durch Reduzieren von 3,4-Dimethoxyphenylaceton unter Verwendung von Mikroorganismen (siehe die nicht geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. (JP-A) Hei 8-325188 sowie JP-A Hei 8-89261 ). Jedoch sind diese Verfahren nicht sehr produktiv und führen nur zum Produkt in einer Konzentration von 1% oder weniger. Aus diesem Grund bestand ein Bedürfnis auf dem Gebiet, ein einfaches und hoch ökonomisches Verfahren zum Erhalten von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol mit einer hohen optischen Reinheit und einer hohen Reaktions-Ausbeute zu etablieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren bereitzustellen, zum effizienten Erzeugen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol mit einer hohen optischen Reinheit.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Enzyme bereitzustellen, welche 3,4-Dimethoxyphenylaceton reduzieren durch Einsatz von NADPH als ein Coenzym, um (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol mit einer hohen optischen Reinheit zu erzeugen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, DNA zu isolieren, welche Enzyme kodiert, umfassend die gewünschte Eigenschaft, und die DNA in Form einer rekombinanten DNA zu erhalten. Des Weiteren ist eine weitere Aufgabe, Verfahren zum Erzeugen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol unter Verwendung dieser rekombinanter DNA zu erzeugen.
  • Bei der Suche bei einem einfachen und höchst ökonomischen Verfahren zum Erzeugen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol mit einer hohen optischen Reinheit haben sich die vorliegenden Erfinder auf ein Verfahren fokussiert zum Überexprimieren eines Enzyms in einem heterologen Mikroorganismus, wobei das Enzym 3,4-Dimethoxyphenylaceton stereoselektiv reduziert, um (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol zu erzeugen, und das anschließende Verwenden des resultierenden hoch aktiven, genetisch rekombinanten Bakteriums, um in effizienter Art und Weise (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol aus 3,4-Dimethoxyphenylaceton zu erzeugen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass Torulaspora delbrueckii eine hohe Reaktionsausbeute aufwies, sowie eine hohe Stereoselektivität. Sie führten anschließend Untersuchung mit Enzymen in diesem Bakterienstamm durch, welche involviert sind in der Reduktion von 3,4-Dimethoxyphenylaceton. Die Elektrophorese eines zellfreien Extraktes dieses Bakterienstammes zeigte, dass ein Enzym aufgereinigt werden konnte in ein einzelnes Elektrophorese-Band, wodurch einige der Basis-Eigenschaften des Enzyms aufgeklärt werden konnten. Als ein Ergebnis hat man gefunden, dass dieses Enzym eine neue Carbonyl-Reductase ist, welche verschiedene Carbonyle reduziert. Darüber hinaus reduzierte das vorliegende Enzym 3,4-Dimethoxyphenylaceton, um (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol mit einer hohen optischen Reinheit sowie in einer hohen Ausbeute zu erzeugen.
  • Des Weiteren haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine DNA isoliert, die das vorliegende Enzym kodiert und ein rekombinantes Bakterium hergestellt, welches dieses Enzym überexprimiert, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde. Das heißt, dass sich die vorliegende Erfindung auf Carbonyl-Reductasen bezieht, Polynukleotide, welche DNA umfasst, welche diese Enzyme kodiert, Verfahren zum Erzeugen dieser Enzyme sowie die Verwendung dieser Enzyme, wie unten dargestellt wird.
  • Im Stand der Technik ist wohlbekannt, dass das Enzym 'Phenylacetoaldehyd-Reductase' 3,4-Dimethoxyphenylaceton (Eur. J. Biochem., 269, 2394–2402 (2002)) reduziert. Dieses Enzym reduziert Ketone in einer NADH-abhängigen Art und Weise und umfasst die Aktivität des Dehydrierens von sekundären Alkoholen, ebenfalls in einer NADH-abhängigen Art und Weise. Folglich weist es Eigenschaften auf, die sich von den Carbonyl-Reductasen der vorliegenden Erfindung unterscheidet.
  • Darüber hinaus ist es auch im Stand der Technik wohlbekannt, dass das Enzym Keto-Reductase (Eur. J. Biochem., 267, 5493–5501 (2000)), hergestellt aus Zygosaccharomyces rouxii, 3,4-Methylendioxyphenylaceton reduziert, welches eine Struktur aufweist, die ähnlich ist zu Zygosaccharomyces rouxii 3,4-Dimethoxyphenylaceton. Jedoch gibt es keine Berichte von dessen Stereoselektivität oder Aktivität gegenüber 3,4-Dimethoxyphenylaceton. Darüber hinaus sind die Eigenschaften dieses Enzyms, wie z. B. das Molekulargewicht von 42 000 in SDS-PAGE, ein optimaler pH von 6,6 bis 6,8 sowie eine optimale Temperatur von 37 bis 39°C unterschiedlich im Vergleich zu denjenigen der Carbonyl-Reductasen der vorliegenden Erfindung.
  • Des Weiteren haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine SWISS-PROT-Homologie-Suche unter Verwendung eines BLAST-Programmes durchgeführt, wobei die Aminosäuresequenz, beschrieben in SEQ ID NO: 2, verwendet wurde. Sie stellten Proteine fest, die homolog zu den Carbonyl-Reductasen der vorliegenden Erfindung sind. Genauer gesagt, resultierte die Genom-Analyse von Saccharomyces cerevisiae in vier Arten von vorhergesagten ORFs, die bezeichnet sind mit YGL157w, YGL039w, YDR541c und YOL151w. Unter diesen waren die Funktionen der Proteine kodiert durch YGL157w, YGL039w und YDR541c nicht bekannt. Die Aktivität von YOL151w beim Reduzieren verschiedener Carbonyl-Verbindungen war gemessen worden in J. Am. Chem. Soc., 123(8), 1547–1555(2001), jedoch gab es keinerlei Angaben zu deren Aktivität gegenüber 3,4-Dimethoxyphenylaceton.
  • Folglich betrifft die vorliegende Erfindung neue Carbonyl-Reductasen, Polynukleotide kodieren diese Enzyme, Verfahren zum Herstellen dieser Enzyme, Verfahren zum Erzeugen eines optisch aktiven Alkohols unter Verwendung dieser Enzyme sowie Verwendungen davon, wie unten dargelegt wird. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit:
    • [1] ein Polynukleotid der beiden folgenden (a) oder (b) (a) ein Polynukleotid umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 (b) ein Polynukleotid, das ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst;
    • [2] ein Protein, das durch das Polynukleotid gemäß [1] kodiert wird;
    • [3] einen rekombinanten Vektor, welcher das Polynukleotid nach [1] umfasst;
    • [4] den rekombinanten Vektor von [3], der des weiteren ein Dehydrogenase-Gen zum Regenerieren eines Coenzyms umfasst;
    • [5] einen Transformanten, der transformiert ist mit dem Polynukleotid gemäß [1], oder den rekombinanten Vektor von [3] oder [4];
    • [6] ein Verfahren zum Herstellen eines optisch aktiven Alkohols, welches das Umsetzen des Proteins von [2], eines Mikroorganismus, der das Protein von [2] erzeugt, oder den Transformanten von [5] mit einem Keton umfasst;
    • [7] ein Verfahren zum Herstellen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol), welches das Umsetzen des Proteins nach [2], eines Mikroorganismus, der das Protein von [2] erzeugt, oder des Transformanten von [5] mit 3,4-Dimethoxyphenylaceton umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein SDS-PAGE-Muster. Zeile 1 zeigt einen Molekulargewicht-Marker und die Zeile 2 zeigt das Enzym, erhalten in Beispiel 1.
  • 2 ist ein Graph, der die pH-Abhängigkeit der 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierenden Aktivität des Enzyms zeigt, das in Referenzbeispiel 1 erhalten wird. Ein offener Kreis repräsentiert einen Britton- und Robinson-Puffer, ein Dreieck repräsentiert einen Essigsäure-Natriumacetat-Puffer und ein ausgefüllter Kreis repräsentiert einen Kaliumphosphat-Puffer.
  • 3 ist ein Graph, der die Temperaturabhängigkeit der 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierenden Aktivität des Enzyms zeigt, das im Referenzbeispiel 1 erhalten wird.
  • 4 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion des Plasmids (pSE-TDX) zeigt, in das ein Teil von Torulaspora delbrueckii-abgeleitetem TdCR1 eingebracht worden ist.
  • 5 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion des Plasmids (pUC-TDX) zeigt, in das ein Teil von Torulaspora delbrueckii-abgeleitetem TdCR1 eingebracht worden ist.
  • 6 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion des Plasmids (pSG-TDX) zeigt, in das ein Teil von Torulaspora delbrueckii-abgeleitetem TdCR1 eingebracht worden ist.
  • 7 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSE-TDR1) zeigt, welches das Volllängen TdCR1-Gen umfasst TdCR1 und exprimieren kann.
  • 8 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSG-TDR1) zeigt, welches Glucose-Dehydrogenase und TdCR1 coexprimieren kann.
  • 9 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSE-YGP7) zeigt, in das ein Saccharomyces cerevisiae-abgeleitetes YGL157w-Gen eingebracht wird. In der Plasmidkartierung repräsentiert P einen trc-Promotor, T (rrnB) repräsentiert einen rrnBT1T2-Terminator, amp repräsentiert β-Lactase-Gen, welches Ampicillin Resistenz verleiht, ori repräsentiert einen Ursprung der Replikation, rop repräsentiert ein ROP-Protein-Gen und laqlq repräsentiert einen Lactose-Unterdrücker.
  • 10 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSG-YGP7) zeigt, in welches ein Saccharomyces cerevisiae-abgeleitetes YGL157w-Gen und ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen eingebracht worden sind. In der Plasmidkartierung repräsentiert P einen trc-Promotor, T (rrnB) repräsentiert einen rrnBT1T2-Terminator, amp repräsentiert β-Lactase-Gen, welches Ampicillin Resistenz verleiht, ori repräsentiert einen Ursprung der Replikation, rop repräsentiert ein ROP-Protein-Gen und laqlq repräsentiert einen Lactose-Unterdrücker, und BsG1cDH repräsentiert ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen.
  • 11 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSE-YGD9) zeigt, in das ein Saccharomyces cerevisiae-abgeleitetes YGL039w-Gen eingebracht wird. In der Plasmidkartierung repräsentiert P einen trc-Promotor, T (rrnB) repräsentiert einen rrnBT1T2-Terminator, amp repräsentiert β-Lactase-Gen, welches Ampicillin Resistenz verleiht, ori repräsentiert einen Ursprung der Replikation, rop repräsentiert ein ROP-Protein-Gen und laqlq repräsentiert einen Lactose-Unterdrücker.
  • 12 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSG-YGD9) zeigt, in welches ein Saccharomyces cerevisiae-abgeleitetes YGL039w-Gen und ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen eingebracht worden sind. In der Plasmidkartierung repräsentiert P einen trc-Promotor, T (rrnB) repräsentiert einen rrnBT1T2-Terminator, amp repräsentiert β-Lactase-Gen, welches Ampicillin Resistenz verleiht, ori repräsentiert einen Ursprung der Replikation, rop repräsentiert ein ROP-Protein-Gen und laqlq repräsentiert einen Lactose-Unterdrücker, und BsG1cDH repräsentiert ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen.
  • 13 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSE-YDR1) zeigt, in das ein Saccharomyces cerevisiae-abgeleitetes YDR541c-Gen eingebracht wird. In der Plasmidkartierung repräsentiert P einen trc-Promotor, T (rrnB) repräsentiert einen rrnBT1T2-Terminator, amp repräsentiert β-Lactase-Gen, welches Ampicillin Resistenz verleiht, ori repräsentiert einen Ursprung der Replikation, rop repräsentiert ein ROP-Protein-Gen und laqlq repräsentiert einen Lactose-Unterdrücker.
  • 14 ist ein Diagramm, welches die Konstruktion eines Plasmides (pSG-YDR1) zeigt, in welches ein Saccharomyces cerevisiae-abgeleitetes YDR541c-Gen und ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen eingebracht worden sind. In der Plasmidkartierung repräsentiert P einen trc-Promotor, T (rrnB) repräsentiert einen rrnBT1T2-Terminator, amp repräsentiert β-Lactase-Gen, welches Ampicillin Resistenz verleiht, ori repräsentiert einen Ursprung der Replikation, rop repräsentiert ein ROP-Protein-Gen und laqlq repräsentiert einen Lactose-Unterdrücker, und BsG1cDH repräsentiert ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung kann NADPH als ein Coenzym einsetzen, zeigt keine Alkohol-dehydrierende Aktivität und reduziert 3,4-Dimethoxyphenylaceton durch Einsatz von NADPH als ein Coenzym, um so 90% ee oder mehr an (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol zu erzeugen.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Aktivität des reduzierenden 3,4-Dimethoxyphenylacetons beispielsweise wie folgt bestätigt werden:
    Ein Verfahren zum Messen der Aktivität des reduzierenden 3,4-Dimethoxyphenylacetons:
    Eine Reaktions-Lösung, die 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,5), 0,2 mM NADPH, 5 mM 3,4-Dimethoxyphenylaceton sowie ein Enzym enthält, wird bei 30°C zur Reaktion gebracht. Jede Abnahme in der Absorption bei 340 nm, die mit einer Abnahme in NADPH einhergeht, wird gemessen. 1U ist definiert als die Menge des Enzyms, welches 1 μmol an Abnahme an NADPH in einer Minute katalysiert.
  • Eine Carbonyl-Reductase, die kodiert wird durch das Polynukleotid von [1] wird gereinigt aus einer Kultur der Hefe Torulaspora delbrueckii. Beispiele von Torulaspora delbrueckii, welche eingesetzt werden können zum Erhalten einer Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung schließen IFO 0381 und JCM 5921 ein.
  • Torulaspora delbrueckii können kultiviert werden in einem Medium, das im Allgemeinen für Hefekultur eingesetzt wird, wie z. B. das YM-Medium. Der Mikroorganismus wird hinreichend kultiviert und die Zellen werden gesammelt. Um einen zellfreien Extrakt zu erhalten, werden diese Zellen dann in einem Puffer zerstört, der einen Protease-Inhibitor umfasst und ein reduzierendes Agens, wie z. B. 2-Mercaptoethanol sowie Phenylmethansulfonylfluorid. Das Enzym kann gereinigt werden aus dem zellfreien Extrakt durch geeignetes Kombinieren von Fraktionierung, welche die Löslichkeit des Proteins einsetzt (Ausfällen mit organischem Lösungsmittel und Aussalzen mit Ammoniumsulfat); Kationenaustausch-, Anionenaustausch-, Gel-Filtrations- oder hydrophobe Chromatografie; oder Affinitätschromatografie unter Einsatz eines Chelats, Pigments, eines Antikörpers, etc. Beispielsweise kann das Enzym aufgereinigt werden in ein einzelnes elektrophoretisches Band durch hydrophobe Chromatografie unter Einsatz von Phenyl-SepharoseTM, Anionenaustauscher-Chromatografie unter Verwendung von MonoQ, hydrophober Chromatografie unter Verwendung von Butyl-SepharoseTM, Adsorptions-Chromatografie unter Verwendung von Hydroxyapatit, etc.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynukleotid, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, oder ein Polynukleotid, welches ein Protein kodiert, das die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst. In dieser Erfindung bezeichnet der Begriff "Polynukleotid" ein Polynukleotid, das aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (beispielsweise die natürliche Umgebung, falls es natürlich auftritt) und folglich verändert wurde durch die "Menschenhand" gegenüber seinem natürlichen Zustand. Der Begriff deckt daher beispielsweise (a) ein DNA-Fragment eines natürlich auftretenden genomischen DNA-Moleküls ab, das frei ist von den kodierenden Sequenzen, welche natürlicherweise das Nukleotid flankieren (d. h. Sequenzen, welche an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind) in der genomischen DNA in dem Organismus, in welchem das DNA-Molekül natürlicherweise vorkommt; (b) eine Nukleinsäure, eingebracht in einen Vektor oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten in solch einer Art und Weise, dass das resultierende Molekül nicht identisch ist mit irgendeiner Art von natürlich auftretenden Vektoren oder genomischer DNA; (c) ein separates Molekül, wie z. B. einer cDNA, ein genomisches Fragment, ein Fragment, erzeugt durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder ein Restriktionsfragment; und (d) einer rekombinanten Nukleotidsequenz, welche ein Teil eines Hybrid-Gens ist, d. h. eines Gens, welches ein Fusions-Protein kodiert. Speziell ausgeschlossen aus dieser Definition sind Nukleinsäuren, die in zufälligen, nicht charakterisierten Mischungen von unterschiedlichen DNA-Molekülen, transfizierten Zellen oder Zell-Klonen vorliegen, beispielsweise wie sie in einer DNA-Bibliothek vorkommen, wie z. B. einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek. Die Polynukleotide, welche die Carbonyl-Reduktasen der vorliegenden Erfindung kodieren, umfassen die Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 1. Die Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst. Das Protein, welches diese Aminosäuresequenz umfasst, konstituiert einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
  • Ein Polynukleotid, welches ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfasst, kann isoliert werden, beispielsweise unter Verwendung der folgenden Prozedur:
    Die DNA der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden unter Verwendung von PCR zur Konzeption von PCR-Primern, die auf der Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 1 basieren, und unter Verwendung von chromosomaler DNA oder einer cDNA-Bibliothek eines Enzymerzeugenden Stammes als ein Templat.
  • Des Weiteren kann durch Verwenden eines erhaltenen DNA-Fragmentes als eine Sonde ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung erhalten werden durch Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek oder eine Bibliothek, erhalten durch Transformieren von E. coli mit einem Phagen oder einem Plasmid, in welches Restriktions-Enzym-Verdauungs-Produkte von chromosomaler DNA des Enzym-erzeugenden Stammes eingebracht wurden.
  • Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann auch erhalten werden durch Analysieren der Nukleotid-Sequenz des DNA-Fragmentes, das erhalten wird durch PCR unter Verwendung dieser Sequenz, um PCR-Primer zu konzipieren, welche die bekannte DNA nach au ßen ausdehnen, verdauen der chromosomalen DNA des Enzym-erzeugenden Stammes mit einem geeigneten Restriktions-Enzyms (geeignete Restriktions-Enzym) sowie anschließender Verwendung von selbst-ligierter zirkularer DNA als ein Template, um reverse PCR durchzuführen (Genetics 120, 621–623 (1988)). Alternativ kann das Rapid Amplification von cDNA Enden (RACE)-Verfahren ("Experimental manual for PCR" S. 25–33, HBJ Press) verwendet werden.
  • Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst nicht nur genomische DNA und cDNA, die kloniert wurden unter Verwendung der oben genannten Verfahren, sondern auch chemisch synthetisierte DNA.
  • Durch Inserzieren eines derart isolierten Polynukleotids, welches eine Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung kodiert, in einen bekannten Expressionsvektor kann ein Carbonyl-Reductase-Expressionvektor zur Verfügung gestellt werden. Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, der ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt einen Vektor bereit, der ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Beispiele des Vektors der vorliegenden Erfindung schließen ein pSE-TDR1, pSE-YDR1, pSE-YGP7 und pSE-YGD9, in welchen ein Gen, das eine Carbonyl-Reductase kodiert, eingebracht wird, in einem exprimierbaren Zustand in den E. coli-Expressionsvektor pSE420D. Darüber hinaus kann der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung ein Coenzym-regenerierendes Dehydrogenase-Gen, wie es unten beschrieben wird, umfassen.
  • Des Weiteren kann durch das Kultivieren eines Transformanten, der mit diesem Expressionsvektor transformiert worden ist, eine Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung aus dem Transformanten erhalten werden.
  • Ein Transformant, der transformiert wurde, um eine Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, kann jegliche Art von Organismus sein, solange er transformiert ist mit einem rekombinantem Vektor, der ein Polynukleotid umfasst, das ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, und er kann Carbonyl-Reductase-Aktivität exprimieren. Die vorliegende Erfindung stellt Transfomnanten zur Verfügung, die transformiert sind mit einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, oder einem Vektor der vorliegenden Erfindung.
  • Nicht limitierende Beispiele von Mikroorganismen, welche in der vorliegenden Erfindung transformiert werden können, sind diejenigen, für welche Wirts-Vektor-Systeme verfügbar sind und diese schließen die folgenden ein: Bakterien, wie z. B.:
    • • das Genus Escherichia
    • • das Genus Bacillus
    • • das Genus Pseudomonas
    • • das Genus Serratia
    • • das Genus Brevibacterium
    • • das Genus Corynebacterium
    • • das Genus Streptococcus
    • • das Genus Lactobacillus;
  • Actinomycetes, wie z. B.:
    • • das Genus Rhodococcus
    • • das Genus Streptomyces;
  • Hefen, wie z. B.:
    • • das Genus Saccharomyces
    • • das Genus Kluyveromyces
    • • das Genus Schizosaccharomyces
    • • das Genus Zygosaccharomyces
    • • das Genus Yarrowia
    • • das Genus Trichosporon
    • • das Genus Rhodosporidium
    • • das Genus Pichia
    • • das Genus Candida; und
  • Pilze, wie z. B.
    • • das Genus Neurospora
    • • das Genus Aspergillus
    • • das Genus Cephalosporium
    • • das Genus Trichoderma.
  • Prozeduren zum Herstellen eines Transformanten und das Konstruieren des rekombinanten Vektors, der geeignet ist für einen Wirt, können durchgeführt werden durch Einsetzen von Techniken, die im Allgemeinen in den Gebieten der Molekularbiologie, des Bioengineerings und des Genetic Engineerings eingesetzt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborstories (2001)). Um ein Gen, das eine Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung kodiert, die NADPH als einen Elektronen-Donor einsetzt, in einem Mikroorganismus zu exprimieren, ist es notwendig, die DNA in einen Plasmid-Vektor oder in einen Phagen-Vektor einzubringen, der stabil in diesem Mikroorganismus ist, und so die genetische Information zu transkribieren und zu translatieren.
  • Um dies zu erreichen, wird ein Promotor, eine Einheit zum Regulieren der Transkription und Translation, strangaufwärts zum 5'-Ende der DNA der vorliegenden Erfindung platziert und vorzugsweise ein Terminator strangabwärts zum 3'-Ende der DNA platziert. Der Promotor und der Terminator sollten funktional in dem Mikroorganismus sein, der als Wirt verwendet werden soll. Verfügbare Vektoren, Promotoren und Terminatoren für die oben genannten verschiedenen Mikroorganismen werden beschrieben im Detail in "Fundamental Course in Microbiology (8): Genetic Engineering", Kyoritsu Shuppan, specifically for yeasts, in "Adv. Biochem. Eng. 43, 75–102 (1990)" und "Yeast 8, 423–488 (1992)".
  • Beispielsweise schließen für das Genus Escherichia und insbesondere für Escherichia coli verfügbare Plasmide die pBR-Serie- und -pUC-Serie-Plasmide eine; verfügbare Promotoren schließen Promotoren ein, die abgeleitet sind von lac (abgeleitet von β-Galactosidase-Gen), trp (abgeleitet von dem Tryptophan operon), tac und trc (welche Chimeren sind von lac und trp), und PL und PR von λ-Phagen. Verfügbare Terminatoren werden abgeleitet von trpA, Phagen, rrnB-ribosomaler RNA, etc. Unter diesen kann der Vektor pSE420D (beschrieben in JP-A 2000-189170 ), welcher erzeugt wird durch Modifizieren eines Teils einer Multiklonierungs-Stelle des kommerziell verfügbaren pSE420 (Invitrogen), in geeigneter Art und Weise eingesetzt werden.
  • Für das Genus Bacillus sind verfügbare Vektoren die pUB110-Serien- und pC194-Serien-Plasmide und können integriert werden in ein Wirts-Chromosom. Verfügbare Promotoren und Terminatoren werden abgeleitet von apr (alkalische Protease), npr (neutrale Protease), amy (α-Amylase), etc.
  • Für das Genus Pseudomonas gibt es Wirts-Vektor-Systeme, entwickelt für Pseudomonas putida und Pseudomonas cepacia. Ein Vektor mit breitem Wirtsbereich, pKT240, (umfassend RSF1010-abgeleitete Gene, benötigt für die autonome Replikation) basierend auf einem TOL-Plasmid, das involviert ist in den Abbau von Toluol-Verbindungen, ist verfügbar. Ein Promotor und ein Terminator, die abgeleitet sind von dem Lipase-Gen ( JP-A Hei 5-284973 ) sind auch verfügbar.
  • Für das Genus Brevibacterium, und insbesondere für Brevibacterium lactofermentum, schließen verfügbare Plasmid-Vektoren pAJ43 (Gene 39, 281–286 (1985)) ein. Promotoren und Terminatoren, verwendet für Escherichia coli können eingesetzt werden für Brevibacterium ohne irgendeine Modifikation.
  • Für das Genus Corynebacterium, und insbesondere für Corynebacterium glutamicum, sind Plasmid-Vektoren, wie z. B. pCS11 ( JP-A Sho 57-183799 ) und pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)) verfügbar.
  • Für das Genus Streptococcus können Plasmid-Vektoren, wie z. B. pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)) und pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)) verwendet werden.
  • Für das Genus Lactobacillus können Plasmid-Vektoren, wie z. B. pAMβ1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979)), der entwickelt wurde für das Genus Streptococcus, eingesetzt werden. Promotoren, welche verwendet werden für Escherichia coli können auch eingesetzt werden.
  • Für das Genus Rhodococcus sind Plasmid-Vektoren, die isoliert wurden aus Rhodococcus rhodochrous, verfügbar (J. Gen. Microbiol. 138, 1003 (1992)).
  • Für das Genus Streptomyces können Plasmide konstruiert werden in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das beschrieben wird in "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual" (Hopwood et al., Cold Spring Harbor Laboratories (1985)). Insbesondere für Streptomyces lividans können plJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468–478, 1986), pKC1064 (Gene 103, 97–99 (1991)) und pUWL-KS (Gene 165, 149–150 (1995)) verwendet werden. Die gleichen Plasmide können auch eingesetzt werden für Streptomyces virginiae (Actinomycetol. 11, 46–53 (1997)).
  • Für das Genus Saccharomyces und insbesondere für Saccharomyces cerevisiae sind YRp-Serie-, YEp-Serie-, YCp-Serie- und YIp-Serie-Plasmide verfügbar. Darüber hinaus ermöglichen Integrations-Vektoren (siehe EP 537456 und Ähnliche), welche in ein Chromosom über homologe Rekombination integriert sind, mit Multikopie-ribosomalen Genen, das Einbringen eines Gens von Interesse in Multikopie und das eingebrachte Gen kann stabil in dem Mikroorganismus beibehalten werden. Folglich ist dieser Typ an Vektor hoch bedeutsam. Verfügbare Promotoren und Terminatoren werden abgeleitet von Genen, welche Alkohol-Dehydrogenase (ADH), Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), Säure-phosphatase (PHO), β-Galactosidase (GAL), Phosphoglycerat-Kinase (PGK), Enolase (ENO), etc. kodieren.
  • Für das Genus Kluyveromyces, insbesondere für Kluyveromyces lactis, sind verfügbare Plasmide diejenigen, wie z. B. 2 μm-Plasmide, die abgeleitet sind von Saccharomyces cerevisiae, pKD1-Serie-Plasmide (J. Bacteriol. 145, 382–390 (1981)), Plasmide abgeleitet von pGK11 und involviert in die Killer-Aktivität, KARS (Kluyveromyces-autonome Replikations-Sequenz)-Serie-Plasmide sowie Plasmide, die in der Lage sind, in ein Chromosom über homologe Rekombination integriert zu werden mit ribosomaler DNA (siehe, EP 537456 , etc.). Promotoren und Terminatoren, die abgeleitet sind von ADH, PGK usw., sind auch verfügbar.
  • Für das Genus Schizosaccharomyces ist es möglich, Plasmid-Vektoren einzusetzen, welche eine autonome Replikations-Sequenz (ARS) umfassen, abgeleitet von Schizosaccharomyces pombe sowie auxotroph-komplementierende auswählbare Marker, die abgeleitet sind von Saccharomyces cerevisiae (Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)). Promotoren, wie z. B. ADH-Promotor, der abgeleitet ist von Schizosaccharomyces pombe, können auch verwendet werden (EMBO J. 6, 729 (1987)). Insbesondere ist pAUR224 kommerziell verfügbar von TaKaRa Shuzo Co., Ltd.
  • Für das Genus Zygosaccharomyces sind Plasmid-Vektoren, die von denjenigen stammen, z. B. pSB3 (Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)), abgeleitet von Zygosaccharomyces rouxii verfügbar. Darüber hinaus ist es möglich, Promotoren einzusetzen, wie z. B. PHO5-Promotor, abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae sowie den GAP-Zr (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase)-Promotor (Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)), abgeleitet von Zygosaccharomyces rouxii.
  • Für das Genus Pichia wurde eine Wirts-Vektor-System entwickelt für Pichia angusta (früher bezeichnet als Hansenula polymorpha). Obwohl Pichia angusta-abgeleitete autonome Replikations-Sequenzen (HARS1 und HARS2) verfügbar sind als Vektoren, sind sie ziemlich unstabil und folglich ist die chromosomal Multikopie-Integration effektiv (Yeast 7, 431–443 (1991)). Darüber hinaus sind Methanol-induzierte Promotoren von Alkohol-Oxidase (AOX) und Formiat-Dehydrogenase (FDH) und dergleichen verfügbar. Des Weiteren wurden Wirts-Vektor-Systeme, welche von autonomen Replikations-Sequenzen (PARS1, PARS2), die von Pichia-abgeleitet sind, entwickelt (Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)). Ein höchst effizienter Promotor, wie z. B. der AOX-Promotor, der induzierbar ist durch Hoch-Zell-Dichtigkeits-Kultur und Methanol, kann auch eingesetzt werden (Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).
  • In dem Genus Candida wurden Wirts-Vektor-Systeme entwickelt für Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida utilis, etc. Ein ARS, der von Candida maltosa stammt, wurde kloniert (Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)) und ein Vektor, der diese Sequenz einsetzt, wurde entwickelt für Candida maltosa. Des Weiteren wurde ein Chromosom-Integrations-Vektor mit einem hoch effizienten Promotor entwickelt für Candida utilis ( JP-A Hei 08-173170 ).
  • Unter den Pilzen wurden Aspergillus niger und Aspergillus oryzae des Genus Aspergillus extensiv untersucht und folglich sind Plasmid-Vektoren und Chromosom-Integrations-Vektoren verfügbar, wie auch Promotoren, die abgeleitet sind von einem extrazellulären Protease-Gen und Amylase-Gen (Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).
  • In dem Genus Trichoderma wurden Wirts-Vektor-Systeme entwickelt für Trichoderma reesei und Promotoren, wie z. B. diejenigen, die abgeleitet sind von extrazellulären Cellulase-Genen, sind verfügbar (Biotechnology 7, 596–603 (1989)).
  • Verschiedene Wirts-Vektor-Systeme wurden auch entwickelt für Pflanzen und Tiere. Insbesondere schließen Systeme diejenigen von Insekten ein, wie z. B. der Seidenraupe (Nature 315, 592–594 (1985)) und Pflanzen, wie z. B. Raps, Mais und Kartoffel. Diese Systeme werden bevorzugt verwendet, um eine große Menge an fremden Proteinen zu exprimieren.
  • Die Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Carbonyl-Reductase zu produzieren, die in dieser Erfindung eingesetzt werden, umfassen alle Stämme, Mutanten und Varianten mit der Fähigkeit, Carbonyl-Reductase zu produzieren, wie auch Transformanten, welche durch Gene tic Engineering konstruiert werden und mit der Fähigkeit, das Enzym der vorliegenden Erfindung zu produzieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen eines optisch aktiven Alkohols, insbesondere zum Herstellen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol, durch Reduktion von Ketonen, unter Einsatz der oben genannten Carbonyl-Reductase. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Erzeugen einer Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung, welches den Schritt des Kultivierens des oben genannten Transformanten der vorliegenden Erfindung umfasst. Ein optisch aktiver Alkohol kann erzeugt werden unter Verwendung der gewünschten Enzym-Reaktion, durchgeführt durch Inkontaktbringen einer Reaktions-Lösung mit einem Enzym-Molekül, einem behandelten Enzym-Molekül, einer Kultur, welche ein Enzym-Molekül umfasst oder einem Transformanten, wie z. B. einem Mikroorganismus, der ein Enzym produziert. Die spezifische Art und Weise, durch welche ein Enzym in Kontakt gebracht wird mit einer Reaktions-Lösung ist nicht limitiert auf diese speziellen Beispiele. Beispiele eines Mikroorganismus, der in den oben genannten Verfahren verwendet wird, schließen vorzugsweise Torulaspora delbrueckii ein.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform eines Verfahrens zum Herstellen eines optisch aktiven Alkohols der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zum Herstellen eines optisch aktiven Alkohols, welches das Umsetzen eines Ketons mit einer Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung umfasst, mit einem Proteins der vorliegenden Erfindung, mit einem Mikroorganismus, welcher das Enzym oder das Protein erzeugt, mit einem Transformanten der vorliegenden Erfindung oder mit einem Carbonyl-reduzierenden Agens der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus ist ein Beispiel der Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol, welches das Umsetzen von 3,4-Dimethoxyphenylaceton mit einer Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung umfasst, mit einem Protein der vorliegenden Erfindung, mit einem Mikroorganismus, welcher das Enzym oder das Protein erzeugt, mit dem behandelten Mikroorganismus, mit einem Transformanten der vorliegenden Erfindung oder mit einem Carbonylreduzierenden Agens der vorliegenden Erfindung.
  • Als ein Keton in einem Verfahren zum Herstellen eines optisch aktiven Alkohols der vorliegenden Erfindung können 1-Acetoxy-2-propanon, Ethylacetoacetat, Methylacetoacetat, Ethyl 4-chloroacetoacetat, Methyl 4-chloroacetoacetat, 2-Chloro-1-(3'-chlorophenyl)ethanon, oder 3,4-Dimethoxyphenylaceton vorzugsweise eingesetzt werden und (S)-1-Acetoxy-2-propanol, Ethyl-(S)-3-hydroxybutanoat, Methyl-(S)-3-hydroxybutanoat, Ethyl-(R)-4-chloro-3-hydroxybutanoat, Methyl-(R)-4-chloro-3-hydroxybutanoat, (R)-2-Chloro-1-(3'-chlorophenyl)ethanol und (S)-1-(3,4-Dimetoxyphenyl)-2-propanol können hergestellt werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zum Herstellen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol, welches das Umsetzen von 3,4-Dimethoxyphenylaceton mit einer Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung umfasst, mit einem Protein, das die Carbonyl-reduzierende Aktivität umfasst, oder mit einem Mikroorganismus, welcher das Protein, das durch ein Polynukleotid der Erfindung kodiert wird, erzeugt.
  • Die NADPH-Regeneration unter Verwendung des NADP+ erzeugt aus NADPH in der oben genannten Reduktions-Reaktion kann durchgeführt werden unter Verwendung der NADP+-reduzierenden Fähigkeit der Mikroorganismen (Glycolyse-System, C1-Assimilations-Pfad von Methylotrophen, etc.). Die NADP+-reduzierende Fähigkeit kann verstärkt werden durch Zugabe von Glucose oder Ethanol zu einem Reaktions-System. Alternativ kann die reduzierende Fähigkeit auch verstärkt werden durch Zugabe eines Mikroorganismus zu dem Reaktions-System mit der Fähigkeit, NADPH aus NADP+ zu erzeugen, oder dieses behandelten Mikroorganismus oder eines Enzyms. Beispielsweise kann die NADPH-Regeneration durchgeführt werden durch Einsatz eines Mikroorganismus, der Glucose-Dehydrogenase umfasst, Alkohol-Dehydrogenase, Formiat-Dehydrogenase, Aminosäure-Dehydogenase oder einer Dehydrogenase von organischer Säure (wie z. B. Malat-Dehydrogenase), des behandelten Mikroorganismus oder eines teilweise aufgereinigten oder aufgereinigten Enzyms. Diese Komponenten, welche eine notwendige Reaktion für das Regenerieren der NADPH konstituieren, können durch Zugabe eines Reaktions-Systems zum Erzeugen eines optisch aktiven Alkohol der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden, durch Zugabe von immobilisierten Komponenten dazu oder durch Verwendung einer Membran, welche NADPH austauschen kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Erzeugen eines Proteins, welche die Carbonyl-reduzierende Aktivität der vorliegenden Erfindung umfassen, welche den Schritt des Kultivierens der Transformanten einschließen, der mit einem rekombinantem Vektor transformiert wurde, umfassend ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung. In einigen Fällen in den vorliegenden Verfahren kann, wenn eine lebende Zelle eines Mikroorganis mus, transformiert mit einem rekombinantem Vektor, umfassend ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, in einem Verfahren zum Erzeugen der oben genannten optischen Alkohols verwendet wird, ein zusätzliches Reaktions-System zum Regenerieren von NADPH nicht mehr notwendig sein. Genauer gesagt kann durch Verwenden eines Mikroorganismus mit einer hohen NADPH-regenerierenden Aktivität die Reduktions-Reaktion unter Verwendung eines Transformanten in effizienter Art und Weise durchgeführt werden, ohne die Zugabe eines NADPH-regenerierenden Enzyms. Darüber hinaus kann der Wirt sowohl mit einer DNA eingebracht werden, welche eine NADPH-abhängige Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung kodiert, als auch einem Gen, das einsetzbar ist beim Regenerieren von NADPH (ein Coenzym regenerierendes Dehydrogenase-Gen), z. B. das einer Glucose-Dehydrogenase, einer Alkohol-Dehydrogenase, einer Formiat-Dehydrogenase, einer Aminosäure-Dehydrogenase oder einer organischen Säure-Dehydrogenase (wie z. B. Malat-Dehydrogenase). Dies wird in einer effizienteren Expression des NADPH-regenerierenden Enzyms und der NADPH-abhängigen Carbonyl-Reductase resultieren sowie einer effizienteren Reduktions-Reaktion. Beim Einbringen von zwei oder mehreren dieser Gene in einen Wirt können, zur Vermeiden der Inkompatibilität, Verfahren wie die Folgenden verwendet werden: ein Verfahren zum Transformieren des Wirtes mit multiplen rekombinanten Vektoren, in welches Gene separat eingebracht worden sind, und wo die Vektoren unterschiedliche Replikationsursprünge aufweisen; ein Verfahren, in welches die zwei oder mehr Gene eingebracht werden in einen einzelnen Vektor; oder ein Verfahren zum Einbringen einer Vielzahl von oder eines der Gene in Chromosomen.
  • Wenn multiple Gene in einem einzelnen Vektor eingebracht werden, kann jedes Gen an eine Region ligiert werden, die in die Regulation der Expression involviert ist, wie z. B. einen Promotor oder Terminator. Multiple Gene können auch exprimiert werden als ein Operon, welches multiple Cistrons umfasst, wie z. B. das Lactose-Operon.
  • Als ein NADPH-regenerierendes Enzym können beispielsweise eine Glucose-Dehydrogenase, abgeleitet von Bacillus subtilis oder Thermoplasma acidophilum, verwendet werden. Genauer gesagt, schließen bevorzugt verwendete rekombinante Vektoren die Vektoren pSG-TDR1, pSG-YDR1, pSG-YGP7 und pSG-YGD9 ein, in welche ein Carbonyl-Reductase-Gen sowie ein Glucose-Dehydrogenase-Gen, abgeleitet von Bacillus subtilis, eingebracht worden sind.
  • Eine Reduktions-Reaktion unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung kann in Wasser durchgeführt werden, in einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z. B. Ethylacetat, Butylacetat, Toluol, Chloroform, n-Hexan, Methylisobutyl-Keton und Methyl-t-butylester; in ein Zweiphasen-System mit einem wässrigen Medium oder in ein Mischungssystem mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, Ethanol, Isopropyl-Alkohol, Acetonitril, Aceton und Dimethylsulfoxid. Die Reaktion in der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden durch Einsetzen eines immobilisierten Enzyms oder eines Membran-Reaktors.
  • Die Reaktion der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden in einem Temperaturbereich von 4°C bis 60°C, vorzugsweise bei 15°C bis 37°C; bei einem pH von 3 bis 11, vorzugsweise bei einem von pH 5 bis 9; und bei einer Substrat-Konzentration von 0,01% bis 50%, vorzugsweise von 0,1% bis 20%, mehr bevorzugt 0,1% bis 10%. Falls notwendig kann das Coenzym NADP+ oder NADPH hinzugefügt werden zum Reaktions-System in einer Menge von 0,001 mM bis 100 mM, mehr bevorzugt bei 0,01 mM bis 10 mM. Obwohl ein Substrat auf einmal zu Beginn der Reaktion zugeführt werden kann, ist es bevorzugt, es kontinuierlich oder diskontinuierlich hinzuzufügen, so dass die Substrat-Konzentration in der Reaktionslösung nicht zu hoch wird.
  • Bei der Regenerierung von NADPH wird beispielsweise Glucose (wenn Glucose-Dehydrogenase verwendet wird) oder Ethanol/Isopropanol (wenn eine Alkohol-Dehydrogenase verwendet wird) zum Reaktions-System hinzugegeben. Diese Verbindungen können in einem molaren Verhältnis hinzugefügt werden, relativ zu einem Substrat-Keton von 0,1- bis 20-fach, vorzugsweise in einem Überschuss von 1- bis 5-fach. Auf der anderen Seite kann ein NADPH-regenerierendes Enzym, wie z. B. Glucose-Dehydrogenase oder Alkohol-Dehydrogenase hinzugefügt werden in ungefähr 0,1- bis 100-facher Menge und vorzugsweise in 0,5- bis 20-facher Menge der Enzym-Aktivität im Vergleich mit der NADPH-abhängigen Carbonyl-Reductase der vorliegenden Erfindung.
  • Die Aufreinigung eines optisch aktiven Alkohols, erzeugt durch die Reduktion eines Ketons in der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden durch geeignete Kombination der Zentrifugation von Zellen und Proteinen, Abtrennen durch Membranbehandlung, Lösungsmittel-Extraktion, Destillation, etc.
  • Beispielsweise kann (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol erhalten werden als ein optisch aktiver Alkohol durch Zentrifugation einer Reaktions-Lösung, die Mikroorganismus-Zellen umfasst, um die Zellen zu entfernen, Extraktion mit Ethylacetat, Butylacetat, Toluol, Hexan, Benzol, Methylisobutyl-Keton, Methyl-t-butylether oder Butanol und anschließend Durchführen einer Vakuum-Konzentration. Die Reinheit des Reaktions-Produkts kann des Weiteren erhöht werden unter Verwendung einer Silicagel-Säulenchromatografie, etc.
  • Eine NADPH-abhängige Carbonyl-Reductase, bedeutsam zum Erzeugen eines optisch aktiven Alkohols, wurde zur Verfügung gestellt. Durch Einsetzen des vorliegenden Enzyms wurden Verfahren zur effizienten Erzeugung von optisch hochreinem (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol aus 3,4-Dimethoxyphenylaceton zur Verfügung gestellt.
  • Die Wörter "ein", "eine", "einer" und "die/der/das", wie hier verwendet, bedeuten zumindest ein(e/er), solange nichts anderes angegeben wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun genauer beschrieben unter Verwendung der unten aufgeführten Beispiele. Jedoch ist sie nicht so konzipiert, als dass sie darauf begrenzt wäre.
  • Referenz-Beispiel 1
  • Aufreinigung einer Carbonyl-Reductase
  • Zellen für die Enzym-Aufreinigung wurden hergestellt durch Kultivieren von Torulaspora delbrueckii JCM 5921-Stamm in 1,2 l an YM-Medium (Glucose 20 g/l, Hefe-Extrakt 3 g/l, Maltose-Extrakt 3 g/l, Pepton 5 g/l, pH 6,0), gefolgt von Zentrifugation. Die resultierenden nassen Zellen wurden suspendiert in einer Lösung, welche 50 mM Tris-HCl-Puffer enthielt (pH 8,5), 0,02% 2-Mercaptoethanol und 2 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), und homogenisiert mit einem Bead Beater (Biospec). Der Zellrückstand wurde anschließend durch Zentrifugation entfernt, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Protaminsulfat wurde zu dem zellfreien Extrakt hinzugefügt, der dann zentrifugiert wurde, um Nukleinsäuren zu entfernen und den Überstand zu erhalten. Ammoniumsulfat wurde dann zum Überstand auf 30%ige Sättigung hinzugefügt und das Ganze wurde zu Phenyl-SepharoseTM HP (2,6 cm × 10 cm) hinzugegeben, äquilibriert mit einem Standardpuffer (10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), 0,01% 2-Mercaptoethanol und 10% Glycerol), der 30% Ammoniumsulfat umfasste. Das vorliegende Enzym wurde dann eluiert unter Verwendung von Ammoniumsulfat über einem Konzentrations-Gradienten von 30% bis 0%. NADPH-abhängige 3,4-Dimethoxyphenylaceton- reduzierende Aktivität wurde erhalten in den Gradienten-eluierten Fraktionen und der Bereich des eluierten Maximums wurde gesammelt und anschließend durch Ultrafiltration aufkonzentriert.
  • Die konzentrierte Enzym-Lösung wurde dialysiert gegen eine Standardpuffer, zu MonoQ (0,5 cm × 5 cm) hinzugegeben, äquilibriert mit dem gleichen Puffer und einer Elution unterzogen mit Natriumchlorid über einer Gradienten-Konzentration von 0 M bis 0,5 M. Die eluierte aktive Fraktion wurde gesammelt und einer Ultrafiltration unterzogen, um die konzentrierte Enzym-Lösung zu erhalten.
  • Die konzentrierte Enzym-Lösung wurde dialysiert gegen 5 mM an Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0), umfassend 0,01% 2-Mercaptoethanol und 10% Glycerol, hinzugefügt zu einer Hydroxyapatit-Säule (0,5 cm × 10 cm), die äquilibriert worden war mit dem gleichen Puffer, und anschließend einer Gradienten-Elution unterzogen mit Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0) über 5 mM bis 350 mM. Die eluierte aktive Fraktion, welche die höchste spezifische Aktivität umfasste, wurde analysiert unter Verwendung von SDS-PAGE. Als ein Ergebnis wurde eine einzelne Bande, die nur aus dem vorliegenden Enzym bestand, erhalten (1).
  • Die spezifische Aktivität des aufgereinigten Enzyms betrug 196 mU/mg. Eine Zusammenfassung der Aufreinigung ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Schritt Protein (mg) Enzymaktivität (U) spezifische Aktivität (mU/mg)
    zellfreier Extrakt 15000 - -
    Nukleinsäure-Entfernung 6580 24,1 3,66
    Butyl-Toyopearl 377 7,00 18,6
    MonoQ 31,4 3,75 119
    Hydroxyapatit 0,245 0,048 196
  • Referenz-Beispiel 2
  • Messung des molekularen Gewichts der Carbonyl-Reductase
  • Das molekulare Gewicht einer Untereinheit des Enzyms, das in Beispiel 1 erhalten wurde, war ungefähr 38 000, wie durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Das molekulare Gewicht wurde auch separat gemessen unter Verwendung einer Superdex G200-Gel-Filtrations-Säule und fand sich erneut in der Größenordnung von 38 000. Daher nahm man an, dass das vorliegende Enzym ein Monomer sei.
  • Beispiel 3
  • Optimaler pH
  • Durch Veränderung des pH unter Verwendung von Kaliumphosphat-Puffer, Natriumacetatpuffer und Britton-Robinson-Puffer wurde die 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität des Enzyms, erhalten in Beispiel 1, untersucht. Die Aktivität bei jedem pH wurde exprimiert als eine relative Aktivität, wobei die maximale Aktivität als 100 betrachtet wurde (2). Der optimale pH (der 80% oder mehr an relativer Aktivität zeigt) war 5,5 bis 6,5.
  • Beispiel 4
  • Optimale Temperatur
  • Von den Standard-Reaktions-Bedingungen wurde nur die Temperatur verändert und die 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität des Enzyms, das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde anschließend gemessen. Die Aktivität bei einer jeden Temperatur wurde ausgedrückt als eine relative Aktivität, wobei die maximale Aktivität als 100 betrachtet wurde (3). Optimale Temperatur (mit 80% oder mehr an relativer Aktivität) war 50°C bis 55°C.
  • Beispiel 5
  • Substrat-Spezifität
  • Das Enzym, das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde umgesetzt mit verschiedenen Ketonen, Ketoestern usw. Die Aktivitäten der Reduktions-Reaktionen wurden ausgedrückt als relative Aktivitäten, wobei die Reduktion von 3,4-Dimethoxyphenylaceton als 100 betrachtet wurde (Tabelle 2) (Substrat-Spezifität von Carbonyl-Reductase). Die Aktivität des dehydrogenierenden 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanols wurde wie folgt gemessen: eine Reaktion wurde durchgeführt bei 30°C in einer Reaktions-Lösung, welche 50 mM Tris-HCl-Puffer umfasste (pH 8,5), 2,5 mM NADP+, 5 mM 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol und das Enzym. Eine Zunahme der Absorption bei 340 nm, die einhergeht mit der NADPH-Produktion, wurde gemessen. 1U wurde definiert als die Menge an Enzym, die die Produktion von 1 μmol NADPH pro Minute katalysierte. Zusätzlich wurde die Aktivität des reduzierenden NADH-abhängigen 3,4-Dimethoxyphenylacetons wie folgt gemessen: eine Reaktion wurde durchgeführt bei 30°C in einer Reaktions-Lösung, die 50 mM Kaliumphosphat-Puffer umfasste (pH 6,5), 0,2 mM NADH, 5 mM 3,4-Dimethoxyphenylaceton und das Enzym und die Abnahme in der Absorption bei 340 nm, die mit der Abnahme an NADH einhergeht, wurde gemessen. 1U wurde gemessen als die Menge an Enzym, welche eine Abnahme von 1 μmol NADH pro Minute katalysierte. Tabelle 2
    Substrat Konzentration (mM) Coenzym relative Aktivität (%)
    3,4-Dimethoxyphenylaceton 5 NADPH 100
    3,4-Dimethoxyphenylaceton 5 NADH 0,0
    (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol 5 NADP+ 0,0
    (R)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol 5 NADP+ 0,0
    Ethylacetoacetat 20 NADPH 3 170
    Methylacetoacetat 20 NADPH 3 670
    Ethyl-4-chloroacetoacetat 20 NADPH 6 780
    Methyl-4-chloroacetoacetat 20 NADPH 8 040
    2-Chloro-1-(3'-chlorophenyl)ethanon 2 NADPH 922
    2,3-Butandion 20 NADPH 1 480
    2,4-Pentandion 20 NADPH 422
    Acetophenon 20 NADPH 256
    1-Acetoxy-2-propanon 20 NADPH 24 700
    2-Acetoxycyclopentanon 20 NADPH 567
    4'-Methoxypropiophenon 20 NADPH 283
    Benzylaceton 20 NADPH 739
    Phenoxy-2-propanon 20 NADPH 939
    2-Acetoxy-3-butanon 20 NADPH 589
    Methyl-Pyruvat 20 NADPH 1320
    Camphorchinon 1 NADPH 644
    2,3-Pentandion 20 NADPH 2 590
    Methoxyaceton 20 NADPH 117
  • Beispiel 6
  • Synthese von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol unter Verwendung der Carbonyl-Reductase
  • Eine Reaktion wurde über Nacht bei 25 °C in 1 ml an Reaktions-Lösung durchgeführt, umfassend 200 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,5), 1 mM NADP+, 2U Glucose-Dehydrogenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 250 mM Glucose, 0,25U Carbonyl-Reductase und 50 mM 3,4-Dimethoxyphenylaceton. Die optische Reinheit des hergestellten (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanols wurde wie folgt gemessen: 1 ml an Ethylacetat wurde zu 0,5 ml der Reaktions-Lösung gegeben, um (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol zu extrahieren und das Extraktions-Lösungsmittel wurde entfernt. 0,5 ml einer auflösenden Lösung (n-Hexan:Isopropanol = 4:1) wurde anschließend hinzugegeben, um den Extrakt aufzulösen, der dann analysiert wurde durch Flüssigkeitschromatografie unter Verwendung einer optischen Auflösungs-Säule. CHIRALCEL OF (4,6 mm × 25 cm; Daicel Chemical Industries, Ltd.) wurde verwendet als die optische Auflösungs-Säule. Chromatografie wurde durchgeführt mit einer Wellenlänge von 220 nm, einer Flussrate von 1,0 ml/min und bei 40°C unter Verwendung einer Elutions-Lösung von n-Hexan:Isopropanol = 4:1. Das (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol, erzeugt durch die vorliegende Erfindung, wies eine Reinheit auf von 99% ee oder mehr.
  • Darüber hinaus wurde das (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol, das so erzeugt worden war, quantifiziert unter Verwendung von Gas-Chromatografie und eine Ausbeute, relativ zum rohen Ausgangsmaterial, 3,4-Dimethoxyphenylaceton, wurde erhalten. Genauer gesagt, wurde die Analyse durchgeführt über einer Säulen-Temperatur von 210°C unter Verwendung von Thermon 3000 (10%)-Chromosorb W(AW-DMCS, Mesh 60–80; 3,2 mm × 210 cm) mit einem Wasserstoff-Flammen-Ionisations-Detektor (FID). Die resultierende Reaktions-Ausbeute betrug 95%.
  • Referenz-Beispiel 7
  • Partielle Aminosäure-Sequenz der Carbonyl-Reductase
  • Die N-terminale Aminosäure-Sequenz des Enzyms, erhalten in Beispiel 1, wurde analysiert unter Verwendung eines Protein-Sequenzers. Die Aminosäure-Sequenz ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Darüber hinaus wurde ein Gel-Fragment, welches die Carbonyl-Reductase umfasste, aus einem SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten, zweimal gewaschen und einer In-Gel-Verdauung bei 35°C über Nacht unterzogen unter Verwendung einer Lysyl-Endopeptidase. Das verdaute Peptid wurde abgetrennt und durch Gradienten-Elution von Acetonitril in 0,1% Trifluoroessigsäure gesammelt, unter Verwendung von Revers-Phasen-HPLC (TSK-Gel ODS-80-Ts, 2,0 mm × 250 mm; Tosoh Corporation).
  • Das erhaltende Peptid-Maximum wurde als lep_41 bezeichnet und seine Aminosäure-Sequenz wurde analysiert unter Verwendung eines Protein-Sequenzers (Hewlett Packard G1005A Protein Sequence System). Die Aminosäure-Sequenz von lep_41 ist als SEQ ID NO: 4 dargestellt.
  • Referenz-Beispiel 8
  • Aufreinigung von chromosomaler DNA aus Torulaspora delbrueckii
  • Zellen wurden hergestellt durch Kultivieren von Torulaspora delbrueckii JCM 5921-Stamm auf YM-Medium. Die chromosomale DNA wurde aufgereinigt aus diesen Zellen unter Verwendung des Verfahrens, das beschrieben wird in Meth. Cell Biol. 22, 39–44 (1975).
  • Referenz-Beispiel 9
  • Klonieren der Kern-Region des Carbonyl-Reductase-Gens
  • Basierend auf den Aminosäure-Sequenzen des N-Terminus von lep_41 wurden Sense- und Antisense-Primer synthetisiert. Jede Nukleotid-Sequenz ist dargestellt in SEQ ID NO: 5 (TdCr-N1) bzw. 6 (TdCR-41).
  • Unter Verwendung von 50 μl einer Reaktions-Lösung umfassend 50 pmol von beiden Primern TdCR-N1 und TdCR-41, 10 nmol an dNTP, 50 ng an Torulaspora delbrueckii-abgeleiteter chromosomaler DNA, Ex-Taq-Puffer (TAKARA SHUZO CO., Ltd.) und 2U an Ex-Taq (TAKARA SHUZO CO., Ltd.) wurden 30 Zyklen an Denaturierung (94°C, 30 Sekunden), Annealen (51°C, 30 Sekunden) und Elongation (70°C, 20 Sekunden) durchgeführt unter Verwendung des GeneAmp® PCR-Systems 2400 (Applied Biosystems).
  • Ein Teil der PCR-Reaktions-Lösung wurde analysiert durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Als ein Ergebnis konnte ein Band, welches spezifisch erschien, bei ungefähr 330 bp nach gewiesen werden. Das resultierende DNA-Fragment wurde extrahiert unter Verwendung von Phenol/Chloroform, ausgefällt mit Ethanol und anschließend gesammelt und verdaut mit dem Restriktions-Enzym EcoRI. Die verdaute DNA wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen und das gewünschte Band wurde ausgeschnitten, um durch Sephaglas Band Prep-Kit (Amersham Biosciences) aufgereinigt zu werden.
  • Das resultierende DNA-Fragment wurde ligiert unter Verwendung von EcoRI-verdauter pUC18 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) und einem Takara Ligation-Kit und anschließend verwendet, um den Escherichia coli JM109-Stamm zu transformieren.
  • Die Transformanten wurden auf Platten von LB-Medium kultiviert (1% Bacto-tripton, 0,5% Bacto-Hefe-Extrakt und 1% Natriumchlorid; im Folgenden abgekürzt als LB-Medium), umfassend Ampicillin (50 μg/ml). Eine Vielzahl von weißen Kolonien wurde ausgewählt durch das Blau/Weiß-Auswahl-Verfahren, kultiviert in flüssigem LB-Medium, umfassend Ampicillin, und ein Plasmid wurde aufgereinigt durch FlexiPrep (Amersham Biosciences), um pTDR zu erhalten.
  • Unter Verwendung des aufgereinigten Plasmides wurde die Nukleotid-Sequenz der insertierten DNA analysiert. PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des fertigen Reaktions-Kits BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing FS (Applied Biosystems), und das PCR-Produkt wurde analysiert unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Die bestimmte Nukleotid-Sequenz der Kern-Region wird als SEQ ID NO: 7 dargestellt.
  • Beispiel 10
  • Analyse der Nukleotid-Sequenz an der Peripherie der Kern-Region des Carbonyl-Reductase-Gens
  • Torulaspora delbrueckii-abgeleitete chromosomale DNA wurde verdaut mit Restriktions-Enzym BamHI und jedes Fragment wurde zyklisiert bei 16°C über Nacht durch eine Selbst-Ligations-Reaktion unter Verwendung von T4-Ligase. Als Nächstes wurden unter Verwendung von 50 μl einer Reaktions-Lösung, die 100 pmol umfasst von jedem der Primer TdCR-59 (SEQ ID NO: 8) und TdCR-234 (SEQ ID NO: 9), wie auf 25 ng der zyklisierten DNA, Ex-Taq-Puffer (TAKARA SHUZO Co. Ltd.), und 2 U an Ex-Taq (TAKARA SHUZO Co. Ltd.), 30 Zyklen der Denaturierung (94°C, 30 Sekunden), Annealen (55°C, 30 Sekunden) und Elongation (72°C, sieben Minuten) durchgeführt unter Verwendung des GeneAmp® PCR-Systems 2400 (Applied Biosystems). Ein Teil der PCR-Reaktions-Lösung wurde analysiert durch Agarose-Gel-Elektrophorese und ein DNA-Fragment von ungefähr 2000 bp wurde nachgewiesen. Dieses DNA-Fragment wurde aufgereinigt unter Verwendung eines Sephaglas BandPrep-Kits (Amersham Biosciences), und eine Nukleotid-Sequenz wurde analysiert durch das Primer-Walking-Verfahren. Als ein Ergebnis wurde die ORF-Sequenz eines Carbonyl-Reductase-Gens bestimmt. Die DNA-Sequenz, die so bestimmt worden war, ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt und die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die ORF-Suche wurde durchgeführt unter Verwendung der Genetyx-win-Software (Genetix Corporation).
  • Referenz-Beispiel 11
  • Konstruktion von Plasmid pSE-TDX, umfassend einen Teil des Carbonyl-Reductase-Gens TdCR1
  • Die Primer Td-ATG1 (SEQ ID NO: 10) und Td-XbaR (SEQ ID NO: 11) wurden synthetisiert, um vom 5'-Terminus zu einer XbaI-Stelle des ORF des Carbonyl-Reductase-Gens zu klonieren.
  • Unter Verwendung von 50 μl einer Reaktions-Lösung, umfassend 50 pmol von jedem der Primer Td-ATG1 und Td-XbaR, wie auch 10 nmol von dNTP, 50 ng von einer chromosomalen DNA, abgeleitet von Torulaspora delbrueckii, Pfu-Turbo-DNA-Polymerase-Puffer (Stratagene) und 3,75 U an Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) wurden 30 Zyklen der Denaturierung (95°C, zwei Minuten 30 Sekunden), des Annealens (55°C, eine Minute), sowie der Elongation (72°C, eine Minute) durchgeführt unter Verwendung eines GeneAmp® PCR-Systems 2400 (Applied Biosystems). Das resultierende PCR-Produkt wurde als Td-PCR1 bezeichnet.
  • Das resultierende PCR-Produkt wurde gesammelt durch Extraktion mit Phenol-Chloroform und Ethanol-Fällung. Das Td-PCR1 wurde verdaut mit zwei Restriktions-Enzymen BspHI und XbaI und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Das gewünschte Band wurde ausgeschnitten und anschließend aufgereinigt durch Sephaglas BandPrep-Kit (Amersham Biosciences).
  • Ein Takara Ligations-Kit wurde verwendet, um das mit Restriktions-Enzym verdaute Td-PCR1 mit dem Vektor pSE420D ( JP-A 2000-189170 ) zu ligieren, der mit zwei Restriktions-Enzymen verdaut worden war, nämlich NcoI und XbaI. Escherichia coil JM109-Stamm wurde transformiert mit dem ligierten Plasmid. Die Transformanten wurden kultiviert auf LB-Medium, welches Ampicillin umfasste, und die Nukleotid-Sequenz des insertierten Fragmentes wurde analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pSE-TDX bezeichnet. Der Prozess des Konstruierens dieses Plasmids ist in 4 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 12
  • Konstruktion des Plasmids pUC-TDX, umfassend einen Teil des Carbonyl-Reductase-Gens TdCR1
  • Die Primer Td-XbaF (SEQ ID NO: 12) und Td-TAA1 (SEQ ID NO: 13) wurden synthetisiert, um vom 5'-Terminus zu einer XbaI-Stelle an dem 3-Terminaus des ORF des Carbonyl-Reductase-Gens zu klonieren.
  • Unter Verwendung von 50 μl einer Reaktions-Lösung, umfassend 50 pmol von jedem der Primer Td-XbaF und Td-TAA1, wie auch 10 nmol von dNTP, 50 ng von einer chromosomalen DNA, abgeleitet von Torulaspora delbrueckii, Pfu-Turbo-DNA-Polymerase-Puffer (Stratagene) und 3,75 U an Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene), wurden 30 Zyklen der Denaturierung (95°C, zwei Minuten 30 Sekunden), des Annealens (55°C, eine Minute), sowie der Elongation (72°C, eine Minute) durchgeführt unter Verwendung eines GeneAmp® PCR-Systems 2400 (Applied Biosystems). Das resultierende PCR-Produkt wurde als Td-PCR2 bezeichnet.
  • Das resultierende PCR-Produkt wurde gesammelt durch Extraktion mit Phenol-Chloroform und Ethanol-Fällung. Das Td-PCR2 wurde verdaut mit XbaI und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Das gewünschte Band wurde ausgeschnitten und anschließend aufgereinigt durch Sephaglas BandPrep-Kit (Amersham Biosciences).
  • Ein Takara Ligations-Kit wurde verwendet, um das mit Restriktions-Enzym verdaute Td-PCR2 mit dem Vektor pUC18 zu ligieren, der mit XbaI verdaut worden war. Escherichia coli JM109-Stamm wurde transformiert mit dem ligierten Plasmid. Die Transformanten wurden kultiviert auf LB-Medium, welches Ampicillin umfasste, und die Nukleotid-Sequenz des insertierten Fragmentes wurde analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pUC-TDX bezeichnet. Der Prozess des Konstruierens dieses Plasmids ist in 5 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 13
  • Konstruktion von Plasmid pSG-TDX, umfassend einen Teil des Carbonyl-Reductase-Gens TdCR1
  • Td-PCR1, das PCR-Produkt erhalten durch das Verfahren von Beispiel 11, wurde gesammelt durch Extraktion mit Phenol-Chloroform und Ethanol-Fällung. Die resultierende DNA wurde verdaut mit zwei Restriktions-Enzymen, BspHI und XbaI, und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen. Das beschriebene Band wurde ausgeschnitten und anschließend aufgereinigt unter Verwendung eines Sephaglas BandPrep-Kits (Amersham Biosciences).
  • Ein Takara Ligations-Kit wurde verwendet, um das mit Restriktions-Enzym verdaute Td-PCR1 mit dem Vektor pSE-BSG1 ( JP-A 2000-189170 ) zu ligieren, der ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen umfasst, und verdaut worden war mit den Restriktions-Enzymen NcoI und XbaI. Escherichia coil JM109-Stamm wurde transformiert mit dem ligierten Plasmid. Die Transformanten wurden kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin umfasste, und die Nukleotid-Sequenz des insertierten Fragments wurde analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pSG-TDX bezeichnet. Der Prozess des Konstruierens dieses Plasmids ist in 6 gezeigt.
  • Beispiel 14
  • Konstruktion des Plasmids pSE-TDR1, das das Carbonyl-Reductase-Gen TdCR1 exprimiert
  • Das Plasmid pUC-TDX, erhalten in Beispiel 12 wurde verdaut unter Verwendung des Restriktions-Enzyms XbaI, mit Ethanol ausgefällt und anschließend einer Agarose-Elektrophorese unterzogen. Eine Bande von ungefähr 0,8 kb, umfassend einen Teil des TdCR1-Gens, wurde ausgeschnitten. Diese Bande wurde aufgereinigt durch Sephaglas Band Prep (Amersham Biosciences) und gesammelt. Ein TaKaRa Ligations-Kit wurde verwendet, um das resultierende DNA-Fragment mit einem Plasmid pSE-TDX zu ligieren, das erhalten wurde durch Verdauen mit dem gleichen Restriktions-Enzym, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, Phenolextraktion, Phenol/Chloroform-Extraktion, Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung. Escherichia coli JM109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA und kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste. Ein Plasmid wurde aufgereinigt aus den resultierenden Transformanten unter Verwendung des Flexi Prep-Kits. Als ein Ergebnis wurde das Plasmid pSE-TDR1, welches das Volllängen-TdCR1-Gen umfasste und TdCR1 exprimieren kann, erhalten. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 7 gezeigt.
  • Beispiel 15
  • Konstruktion des Plasmids pSG-TDR1, welches das Carbonyl-Reductase-Gen TdCR1 coexprimieren kann und ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen
  • Das Plasmid pUC-TDX, erhalten in Beispiel 12 wurde verdaut unter Verwendung des Restriktions-Enzyms XbaI, mit Ethanol ausgefällt und anschließend einer Agarose-Elektrophorese unterzogen. Ein Band von ungefähr 0,8 kb, umfassend einen Teil des TdCR1-Gens, wurde ausgeschnitten. Dieses Band wurde aufgereinigt durch Sephaglas Band Prep (Amersham Biosciences) und gesammelt. Ein TaKaRa Ligations-Kit wurde verwendet, um das resultierende DNA-Fragment mit einem Plasmid pSG-TDX zu ligieren, das erhalten wurde durch Verdauen mit dem gleichen Restriktions-Enzym, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, Phenolextraktion, Phenol/Chloroform-Extraktion, Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung. Escherichia coli JM109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA und kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste. Ein Plasmid wurde aufgereinigt aus den resultierenden Transformanten unter Verwendung des Flexi Prep-Kits. Als ein Ergebnis wurde das Plasmid pSG-TDR1, welches das Volllängen-TdCR1-Gen umfasste und TdCR1 exprimieren kann, erhalten. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 8 gezeigt.
  • Beispiel 16
  • Bestätigung der Carbonyl-Reductase-Aktivität
  • Escherichia coli JM109-Stamm, transformiert mit dem Plasmid pSE-TDR1, das Carbonyl-Reductase exprimiert und dem Plasmid pSG-TDR1, das Carbonyl-Reductase und Bacillus subtilis-abgeleitete Glucose-Dehydrogenase coexprimiert, wurde kultiviert über Nacht bei 30°C in flüssigem LB-Medium, das Ampicillin enthielt. 0,1 mM IPTG wurden hinzugefügt und der Stamm wurde des Weiteren für vier Stunden kultiviert.
  • Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und anschließend in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,5) suspendiert, der 0,5 M NaCl, 0,02% 2-Mercaptoethanol, 2 mM PMSF und 10% Glycerin umfasste. Zellen wurden dann zerstört durch Schall und zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde verwendet als ein zellfreier Extrakt. Die 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität und die Glucose-dehydrierende Aktivität des zellfreien Extraktes wurde gemessen. Die Glucose-dehydrierende Aktivität wurde gemessen wie folgt: Messungen wurden durchgeführt bei 30°C in einer Reaktions-Lösung, die das Enzym umfasst und 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,5), 2,5 mM NAD+, 100 mM Glucose. 1U war definiert als die Menge an Enzym, die notwendig war, um die Produktion von 1 mol an NADH pro Minute unter den oben genannten Reaktions-Bedingungen zu katalysieren.
  • Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse des Messens der 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierenden Aktivität und der Glucose-Dehydrogenase-Aktivität unter Verwendung des zellfreien Extraktes. In allen Fällen wurde die 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität bestätigt. Tabelle 3
    Plasmid 3,4-Dimethoxypheylaceton-reduzierende Aktivität (mU/mg Protein) Glucose-Dehydrogenase-Aktivität (U/mg Protein)
    kein 0 0
    pSE-TDR1 61,6 0
    pSG-TDR1 57,0 4,07
  • Referenz-Beispiel 17
  • Aufreinigung von chromosomaler DNA aus Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae X2180-1B (Yeast Genetic Stock Center) wurde kultiviert auf YM-Medium, um Zellen herzustellen. Die Aufreinigung von chromosomaler DNA aus diesen Zellen wurde durchgeführt durch das Verfahren, das beschrieben wird in Meth. Cell Biol. 22, 39–44 (1975).
  • Referenz-Beispiel 18
  • Klonieren von Carbonyl-Reductase-Homolog YGL157w
  • PCR-Primer YGL1-ATG1 (SEQ ID NO: 14) und YGL1-TAA1 (SEQ ID NO: 15) wurden synthetisiert, basierend auf einer DNA-Sequenz (DDBJ Accession No. Z48618), die mit dem vorhergesagten Protein YGL157w (SWISS-PROT Accession No. P53111), registriert in DDBJ, korrespondiert.
  • Unter Verwendung von 50 μl der Reaktions-Lösung, die 25 pmol eines jeden der Primer umfasst, wie auch von 10 nmol an dNTP, 50 ng an Saccharomyces cerevisiae-abgeleiteter chromosomaler DNA, Pfu-DNA-Polymerase-Puffer (Stratagene), und 2 U an Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wurde eine PCR von 30 Zyklen der Denaturierung (95°C, 45 Sekunden), Annealen (55°C, 30 Sekunden) und Elongation (72°C, eine Minute 20 Sekunden) durchgeführt mit GeneAmp® PCR-System 2400 (Applied Biosystems). Als ein Ergebnis wurde ein spezifische Amplifikations-Produkt erhalten.
  • Ein TAKARA Ligations-Kit wurde verwendet, um das Amplifikations-Produkt, das mit Phenol behandelt worden war und dann doppelt verdaut worden war, mit den Restriktions-Enzymen BspHI und XbaI, mit dem Vektor pSE420D zu ligieren, welcher doppelt verdaut worden war mit den Restriktions-Enzymen NcoI und XbaI. Escherichia coli JM 109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA und kultiviert auf dem LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasst. FlexiPrep wurde verwendet, um ein Plasmid aus dem resultierenden Transformanten aufzureinigen.
  • Die Nukleotid-Sequenz der insertierten Plasmid-DNA wurde analysiert und SEQ ID NO: 19 zeigt die resultierende Sequenz. Diese Nukleotid-Sequenz war vollständig konsistent mit derjenigen, registriert in DDBJ. Das resultierende Plasmid wurde als pSE-YGP7 bezeichnet. Die Aminosäure-Sequenz, vorhergesagt von der Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 16 ist in SEQ ID NO: 17 gezeigt. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 9 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 19
  • Konstruktion von Plasmid pSG-YGP7, das Carbonyl-Reductase-Homolog YGL157w und das Bacillus subtilis-abgeleitete Glucose-Dehydrogenase-Gen coexprimiert
  • Das Plasmid pSE-BSG1 ( JPA 2000-374593 ), welches ein Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen umfasste, wurde doppelt verdaut mit zwei Restriktions-Enzymen, NheI und XbaI. Ein Takara Ligations-Kit wurde dann verwendet, um das Plasmid mit einem DNA-Fragment zu ligieren, das ein YGL157w-Gen umfasste, ausgeschnitten aus pSE-YGP7 unter Verwendung der gleichen Enzyme. Escherichia coli JM109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA, kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste und FlexiPrep wurde verwendet, um aus den resultierenden Transformanten das Plasmid pSG-YGP7 aufzureinigen, das in der Lage ist, Glucose-Dehydrogenase und YGL157w zu coexprimieren. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 10 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 20
  • Klonieren von Carbonyl-Reductase-Homolog YGL039w
  • PCR-Primer YGL2-ATG2 (SEQ ID NO: 18) und YGL2-TAA2 (SEQ ID NO: 19) wurden synthetisiert, basierend auf einer DNA-Sequenz (DDBJ Accession No. Z72561), die mit dem vorhergesagten Protein YGL039w (SWISS-PROT Accession No. P53183), registriert in DDBJ, korrespondiert.
  • Unter Verwendung von 50 μl der Reaktions-Lösung, die 25 pmol eines jeden der Primer umfasst, wie auch von 10 nmol an dNTP, 50 ng an Saccharomyces cerevisiae-abgeleiteter chromosomaler DNA, Pfu-DNA-Polymerase-Puffer (Stratagene), und 2 U an Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wurde eine PCR von 30 Zyklen der Denaturierung (50°C, 30 Sekunden), Annealen (72°C, 1 Minute 15 Sekunden) und Elongation (72°C, eine Minute 20 Sekunden) durchgeführt mit GeneAmp® PCR-System 2400 (Applied Biosystems). Als ein Ergebnis wurde ein spezifisches Amplifikations-Produkt erhalten.
  • Das Amplifikations-Produkt wurde behandelt mit Phenol, doppelt verdaut mit den Restriktions-Enzymen BspHI und NheI und ligiert unter Verwendung eines TAKARA Ligations-Kits mit dem Vektor pSE420D, der doppelt verdaut worden war mit den Restriktions-Enzymen NcoI und XbaI. Escherichia coli JM 109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA und kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste. FlexiPrep wurde verwendet, um ein Plasmid aus dem resultierenden Transformanten zu reinigen. Die Nukleotid-Sequenz der insertierten Plasmid-DNA wurde analysiert und SEQ ID NO: 20 zeigt die resultierende Sequenz. Diese Nukleotid-Sequenz war vollständig konsistent mit derjenigen, registriert in DDBJ. Das resultierende Plasmid wurde als pSE-YGP9 bezeichnet. Die Aminosäure-Sequenz, vorhergesagt von der Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 20 ist in SEQ ID NO: 21 gezeigt. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 11 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 21
  • Konstruktion eines Plasmids pSG-YGD9, das Carbonyl-Reductase-Homolog YGL039w und Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen coexprimieren kann
  • pSE-YGD9 wurde doppelt verdaut mit zwei Restriktions-Enzymen, EcoRI und HindIII. Ein Takara Ligations-Kit wurde anschließend verwendet, um das Produkt mit einem DNA-Fragment zu ligieren, welches ein Glucose-Dehydrogenase-Gen umfasste, welches unter Verwendung der gleichen Enzyme aus dem Plasmid pSE-BSG1 ( JP-A 2000-374593 ) ausgeschnitten worden war, welches das Bacillus subtilis-abgeleitete Glucose-Dehydrogenase-Gen umfasst.
  • Escherichia coli JM109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA, kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste und FlexiPrep wurde verwendet, um aus den resultierenden Transformanten das Plasmid pSG-YGP9 aufzureinigen, das in der Lage ist, Glucose-Dehydrogenase und YGL039w zu coexprimieren. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 12 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 22
  • Klonieren des Carbonyl-Reductase-Homologs YDR541c
  • PCR-Primer YGR-ATG1 (SEQ ID NO: 18) und YGR-TAA1 (SEQ ID NO: 23) wurden synthetisiert, basierend auf einer DNA-Sequenz (DDBJ Accession No. Z48239), die mit dem vorhergesagten Protein YDR541c (SWISS-PROT Accession No. U43834-5), registriert in DDBJ, korrespondiert.
  • Unter Verwendung von 50 μl der Reaktions-Lösung, die 25 pmol eines jeden der Primer umfasst, wie auch von 10 nmol an dNTP, 50 ng an Saccharomyces cerevisiae-abgeleiteter chromosomaler DNA, Pfu-DNA-Polymerase-Puffer (Stratagene), und 2 U an Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wurde eine PCR von 30 Zyklen der Denaturierung (95°C, 45 Sekunden), Annealen (52°C, 30 Sekunden) und Elongation (72°C, eine Minute 20 Sekunden) durchgeführt mit GeneAmp® PCR-System 2400 (Applied Biosystems). Als ein Ergebnis wurde ein spezifisches Amplifikations-Produkt erhalten.
  • Das Amplifikations-Produkt wurde behandelt mit Phenol, doppelt verdaut mit den Restriktions-Enzymen AflIII und XbaI und ligiert unter Verwendung eines TAKARA Ligations-Kits mit dem Vektor pSE420D, der doppelt verdaut worden war mit den Restriktions-Enzymen NcoI und XbaI. Escherichia coli JM 109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA und kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste. FlexiPrep wurde verwendet, um ein Plasmid aus dem resultierenden Transformanten zu reinigen. Die Nukleotid-Sequenz der insertierten Plasmid-DNA wurde analysiert und SEQ ID NO: 27 zeigt die resultierende Sequenz. Diese Nukleotid-Sequenz war vollständig konsistent mit derjenigen, registriert in DDBJ. Das resultierende Plasmid wurde als pSE-YDR1 bezeichnet. Die Aminosäure-Sequenz, vorhergesagt von der Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 24 ist in SEQ ID NO: 25 gezeigt. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 13 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 23
  • Konstruktion des Plasmids pSG-YGD7, das Carbonyl-Reductase-Homolog YDR541c und Bacillus subtilis-abgeleitetes Glucose-Dehydrogenase-Gen coexprimieren kann
  • pSE-YDR1 wurde doppelt verdaut mit zwei Restriktions-Enzymen, EcoRI und HindIII. Ein Takara Ligations-Kit wurde anschließend verwendet, um das Produkt mit einem DNA-Fragment zu ligieren, welches ein Glucose-Dehydrogenase-Gen umfasste, das unter Verwendung der gleichen Enzyme aus dem Plasmid pSE-BSG1 ( JP-A 2000-374593 ) ausgeschnitten worden war, welches das Bacillus subtilis-abgeleitete Glucose-Dehydrogenase-Gen umfasst.
  • Escherichia coli JM109-Stamm wurde transformiert mit der ligierten DNA, kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin (50 mg/l) umfasste, und FlexiPrep wurde verwendet, um aus den resultierenden Transformanten das Plasmid pSG-YDR1 aufzureinigen, das in der Lage ist, Glucose-Dehydrogenase und YDR541c zu coexprimieren. Der Prozess zum Konstruieren dieses Plasmids ist in 14 gezeigt.
  • Referenz-Beispiel 24
  • Bestätigung der Aktivität der Carbonyl-Reductase-Homologe YGL157w, YGL039w und YDR541c
  • Escherichia coli JM109+-Stämme, die pSE-YGP7, pSE-YGD9, pSE-YDR1, pSG-YGP7, pSG-YGD9 oder pSG-YDR1 umfassten, wurden kultiviert auf LB-Medium, das Ampicillin umfasste, induziert mit 0,1 mM IPTG für vier Stunden und anschließend zentrifugiert, um die Zellen einzusammeln.
  • Eine jede der Zell-Proben wurde suspendiert in einer Zell-Lyse-Lösung (50 mM KPB pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,02% 2-Mercaptoethanol, 2 mM PMSF, 10% Glycerol). Die Zellen wurden zerstört durch Schall und anschließend zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten, der wurde als zellfreier Extrakt verwendet.
  • 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität wurde gemessen unter Verwendung eines jeden der zellfreien Extrakte und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. YGL157w (pSE-YGP7 und pSG-YGP7), YGL039w (pSE-YGD9 und pSG-YGD9) und YDR541c (pSE-YDR1 und pSG-YDR1) wurden alle als die 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität aufweisend bestätigt. Tabelle 4
    Plasmid 3,4-Dimethoxyphenylaceton-reduzierende Aktivität (mU/mg Protein) Glucose-dehydrierende Aktivität (mU/mg Protein)
    kein 0,0 0,0
    pSE-YGP/ 39,0 0,0
    pSG-YGP7 6,85 2320
    pSE-YGD9 19,1 0,0
    pSG-YGD9 20,0 1340
    pSE-YDR1 21,0 0,0
    pSG-YDR1 30,0 30,0
  • Referenz-Beispiel 25
  • Synthese von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol durch Carbonyl-Reductase-Homologe YGL157w, YGL039w und YDR541c
  • Um eine rohe Enzym-Lösung für die Emzym-Reaktion herzustellen, wurde die rohe Enzym-Lösung, die in Beispiel 18 hergestellt wurde, zehnfach aufkonzentriert unter Verwendung einer UF-Membran. Diese Lösung wurde über Nacht umgesetzt bei 25°C in 1 ml einer Reaktions-Lösung, die 200 mM Kaliumphosphat-Puffer umfasste (pH 6,5), 1 mM NADP+, 2 U Glucose-Dehydrogenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 250 mM Glucose, 0,2 U Homolog-Enzym und 50 mM 3,4-Dimethoxyphenylaceton. Die optische Reinheit wurde gemessen und das erzeugte (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol wurde quantifiziert wie in Beispiel 6. Als ein Ergebnis erzeugte YGL157w (pSE-YGP7) 93,7% ee an (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol bei einer Ausbeute von 66%, YGL039w (pSE-YGD9) erzeugte 93,6% ee bei einer Ausbeute von 94% und YDR541c (pSE-YDR1) erzeugte 94,8% ee bei einer Ausbeute von 6%. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00380001
    Figure 00390001
    Figure 00400001
    Figure 00410001
    Figure 00420001
    Figure 00430001
    Figure 00440001
    Figure 00450001
    Figure 00460001
    Figure 00470001
    Figure 00480001
    Figure 00490001
    Figure 00500001
    Figure 00510001
    Figure 00520001
    Figure 00530001
    Figure 00540001
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Figure 00570001
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    Figure 00610001
    Figure 00620001
    Figure 00630001

Claims (7)

  1. Ein Polynukleotid der beiden folgenden (a) oder (b), (a) ein Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, (b) ein Polynukleotid, das ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
  2. Ein Protein, das durch das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
  3. Ein rekombinanter Vektor, welcher das Polynukleotid nach Anspruch 1 umfasst.
  4. Der rekombinante Vektor von Anspruch 3, der des weiteren ein Dehydrogenase-Gen zum Regenerieren eines Coenzyms umfasst.
  5. Ein Transformant, der mit dem Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder dem rekombinanten Vektor von Anspruch 3 oder 4 transformiert ist.
  6. Ein Verfahren zum Herstellen eines optisch aktiven Alkohols, welches das Umsetzen des Proteins von Anspruch 2, eines Mikroorganismus, der das Protein von Anspruch 2 erzeugt, oder des Transformanten von Anspruch 5 mit einem Keton umfasst.
  7. Ein Verfahren zum Herstellen von (S)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-propanol), welches das Umsetzen des Proteins nach Anspruch 2, eines Mikroorganismus, der das Protein von Anspruch 2 erzeugt, oder des Transformanten von Anspruch 5 mit 3,4-Dimethoxyphenylaceton umfasst.
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