CN113025506B - 一种生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种丝状真菌的基因工程菌的构建方法，通过基因工程方法使得所述丝状真菌过表达乙醇合成正调控基因，和/或下调了内源乙醇合成负调控基因获得基因工程菌株。所获得的基因工程菌株与其出发菌株相比，乙醇合成能力得到提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域。具体地，本发明涉及一种用于生产乙醇的重组工程菌株的构建方法及所获得的重组工程菌。本发明还涉及所述重组工程菌生产乙醇的方法。
背景技术
随着世界经济的快速发展，人类对能源的需求日益增加，目前使用的石油等化石能源一方面储量有限，并且在燃烧过程中会产生大量污染。能源和环境问题已经成为人类发展面临的一个重大挑战。交通运输行业是能源消耗的主要部门，并且也是温室气体排放的重要途径，所以迫切需要发展清洁的，可再生的替代燃料。其中燃料乙醇具有原料丰富、清洁可再生以及与现有燃料体系融和度好等特点，成为目前最主要的替代能源(Zabed,H.,Sahu,J.N.,Suely,A.,Boyce,A.N.and Faruq,G.(2017)Bioethanol production fromrenewable sources:Current perspectives and technological progress.Renewableand Sustainable Energy Reviews，71，475-501.)。在燃料乙醇的生产中，第一代燃料乙醇生产所使用的原料主要是以甘蔗和玉米为主，随着燃料乙醇的消耗量快速增长，第一代燃料乙醇“与人争粮，与粮争地”的弊端日益凸显。而以非粮木质纤维素为原料的第二代燃料乙醇能够很好地解决这一问题，并且符合我国能源经济可持续发展的战略方针。我国木质纤维素资源储量丰富，每年产生的农作物秸秆总产量约为9亿吨(田芳,李凡,袁敬伟,许克家,王康,王灿，叔谋，李义，佟毅，崔兆宁.纤维素乙醇产业现状及关键过程技术难点[J].当代化工，2019，48(09):2051-2056)，其中大部分通过焚烧或粗略还田的方式进行处理，不仅造成了资源的巨大浪费，还造成严重的环境污染。充分利用这一数量巨大的生物质资源生产燃料乙醇，将会为我国能源安全提供重要保障，同时有利于优化能源结构，改善生态环境并能促进农村地区经济发展。
目前在燃料乙醇的生产过程中主要使用的发酵微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Sarris，D.andPapanikolaou，S.(2016)Biotechnological production of ethanol:Biochemistry,processes and technologies.Engineering in Life Sciences,16,307-329)，它们在第一代的粮食乙醇生产过程中展现出优良的生产性能。然而在第二代燃料乙醇的生产中，由于缺乏纤维素酶分泌能力及戊糖代谢能力(尤其是木糖和阿拉伯糖)，酿酒酵母和运动发酵单胞菌已经不能够满足生产要求。木质纤维素的主要成分是木质素、纤维素和半纤维素。纤维素是D-葡萄糖以β-1,4糖苷键结合起来的链状高分子化合物；半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，包括五碳糖如木糖、阿拉伯糖和六碳糖如甘露糖和半乳糖等。木质纤维素的糖化产物主要为约70％的纤维二糖和葡萄糖以及约30％的木糖(Carroll A,Somerville C.Cellulosic biofuels.Annu Rev Plant Biol.2009；60:165-82)。为了提高木糖的发酵效率，科学家们已经做出了许多努力。但酿酒酵母和运动发酵单胞菌工程菌株利用木糖发酵生产乙醇的产率和产量仍然无法与葡萄糖发酵相比(Sharma NK,Behera S,Arora R,Kumar S,Sani RK.Xylose transport in yeast for lignocellulosic ethanolproduction:Current status.J Biosci Bioeng.2018；125(3):259-67)。此外，由于葡萄糖抑制效应的存在，天然的酿酒酵母不能在葡萄糖存在的情况下利用木糖，这也阻碍了纤维素水解产物中混合糖的有效利用。
真菌来源的纤维素酶可将纤维素水解，主要生成纤维二糖，而葡萄糖苷酶可将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。因此，利用生物质生产生物燃料，需要能够有效地利用纤维二糖和葡萄糖的微生物。由于葡萄糖抑制纤维素酶的活性和发酵过程中对其他糖类的利用，因此，微生物对纤维二糖的直接利用是一种更优的方法。纤维二糖降解为葡糖糖是在机体内发生的，因此可有效降低混合糖发酵过程中的碳代谢抑制效应。但是天然的酿酒酵母无法利用二糖发酵。只有引入外源的纤维二糖利用途径才能利用二糖，其主要包括来源于脉孢菌(Neurospora)的纤维二糖转运系统(Kim H,Lee WH,Galazka JM，Cate JH,JinYS.Analysis of cellodextrin transporters from Neurospora crassa inSaccharomyces cerevisiae for cellobiose fermentation.Appl MicrobiolBiotechnol.2014；98(3):1087-94)和水解系统或代之以海洋细菌Saccharophagusdegradans的纤维二糖磷酸化系统(Sadie CJ,Rose SH,den Haan R，van Zyl WH.Co-expression of a cellobiose phosphorylase and lactose permease enablesintracellular cellobiose utilisation by Saccharomyces cerevisiae.ApplMicrobiol Biotechnol.2011；90(4):1373-80)。尽管目前已有针对酿酒酵母的进一步改造，但其利用纤维二糖的能力仍受到很大的限制。
纤维素降解嗜热真菌是耐高温纤维素酶的优良生产者，天然具有分泌大量生物质降解酶类的能力，并能充分利用降解产生的纤维二糖、葡萄糖和木糖等多种糖类(Karnaouri A，Topakas E，Antonopoulou I，Christakopoulos P.Genomic insights intothe fungal lignocellulolytic system of Myceliophthora thermophila.FrontMicrobiol.2014；5:281)。同时这类微生物最适生长温度较高，可以节约发酵过程中的冷却水用量，降低生产成本，已被证实可以用来大规模工业发酵(Visser H，Joosten V，PuntPJ，Gusakov AV，Olson PT,Joosten R,Bartels J,Visser J.Development of a maturefungal technology and production platform for industrial enzymes based on aMyceliophthora thermophila isolate,previously known as Chrysosporiumlucknowense C1.Ind Biotechnol.2011；7:214-23)。但是野生型丝状真菌(包括嗜热毁丝霉)的乙醇产量均较低，不能直接用于乙醇的实际生产。因此对纤维素降解真菌进行遗传改造，实现生物质原料到乙醇的直接发酵，是目前第二代燃料乙醇生产中一个迫切需要克服的难题，同时也具有巨大的应用潜力
发明内容
目前乙醇的发酵生产主要是以玉米、甘蔗等粮食作物，以及木薯等非粮作物为原料，而以嗜热毁丝霉为代表的纤维素降解丝状真菌，可以直接利用木质纤维素生产乙醇，大大降低了预处理成本，简化了生产过程。但野生型丝状真菌(包括嗜热毁丝霉)的乙醇产量均较低，不能满足生产需求。并且丝状真菌的遗传操作复杂，效率低，周期长，也制约了通过遗传操作丝状真菌用于乙醇生产的进程。近年来，发明人先后建立了嗜热毁丝霉的遗传操作系统(Xu，J.，Li，J.，Lin,L.,Liu,Q.，Sun，W.，Huang，B.and Tian，C.(2015)Developmentof genetic tools for Myceliophthora thermophila.BMC Biotechnol,15,35)和基因编辑系统(Liu,Q.,Gao,R.,Li,J.,Lin,L.,Zhao,J.,Sun,W.and Tian,C.(2017)Developmentof a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthoraspecies and its application to hyper-cellulase production strainengineering.Biotechnol Biofuels，10，1)，大大加快了对嗜热毁丝霉的遗传改造进程。在上述基础上，发明人又对丝状真菌(尤其是嗜热毁丝霉)产乙醇的机理进行了系统的研究，并通过一系列的遗传改造，显著提高了嗜热毁丝霉生产乙醇的效率(包括以葡萄糖、纤维二糖和纤维素为碳源的条件)，为第二代燃料乙醇的生产提供新的策略。其中遗传改造的策略包括：过表达葡萄糖和纤维二糖转运蛋白，提高嗜热毁丝霉对纤维素降解产物的吸收速率；过表达乙醇合成途径中的关键基因，提高乙醇合成的效率；敲除主要的分支途径；提高细胞质NADH水平；敲除内源乙醇代谢的途径等。
本发明首先提供了一种丝状真菌重组工程菌的构建方法，其特征在于，通过基因工的程方法，使得所述丝状真菌中过表达乙醇合成途径关键基因，和/或下调了内源乙醇合成竞争途径基因的表达，使所述的基因工程菌株与出发菌株相比，乙醇合成能力得到提高。
优选的，所述丝状真菌为纤维素降解丝状真菌。具体地，所述丝状真菌选自脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、毁丝霉(Myceliophthora)、侧孢霉(Sporotrichum)、镰孢菌(Fusarium)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)和拟青霉(Paecilomyces)。
在更优选的方式中，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、异梭毁丝霉(Myceliophthora heterothallica)。
另一方面，所述乙醇合成正调控基因选自强化乙醇合成途径，提升糖转运能力，加快糖酵解速率、提高细胞质NADH水平的基因；所述乙醇合成负调控基因选自乙醇合成分支途径，能量代谢，细胞质还原力向线粒体穿梭、内源乙醇代谢途径中的基因。
在一些具体实施方式中，所述工程菌中细胞质还原力向线粒体穿梭被减少或阻断，和/或能量代谢途径被改造，和/或乙醇合成途径被加强，和/或糖分子转运被加强，和/或乙醇合成副产物途径被消弱，和/或糖酵解速率被加快。
在另一个方面中，所述过表达乙醇合成正调控基因是通过导入的外源性和/或内源性的乙醇合成正调控基因实现，其中所述乙醇合成正调控基因选自乙醇脱氢酶、葡萄糖转运蛋白、纤维二糖转运蛋白、或者丙酮酸脱羧酶中的一种，或者它们的多种组合。更具体的，是过表达外源性乙醇脱氢酶以提高产乙醇能力，或者过表达外源性葡萄糖转运蛋白以提高产乙醇能力，或者过表达外源性纤维二糖转运蛋白以提高产乙醇能力，过表达外源性丙酮酸脱羧酶以提高产乙醇能力。
优选的，所述导入是将携带外源性或内源性乙醇合成正调控基因的表达载体转入宿主细胞中，优选启动子为tef、gpdA、trpC、cbh1、glaA启动子。
更优选的，导入的外源性乙醇合成正调控基因来自酵母，优选来自酿酒酵母。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达乙醇脱氢酶编码基因Scadh1和/或丙酮酸脱羧酶基因pdc1和/或葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1和/或纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1/cdt-2。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达乙醇合成正调控基因选自外源性的乙醇脱氢酶，优选的乙醇脱氢酶为酿酒来源的乙醇脱氢酶Scadh1、乙醇脱氢酶Scadh3、乙醇脱氢酶Scadh5或乙醇脱氢酶Scadh6。
在另外的实施方式中，所述下调基因表达是通过基因敲除或小RNA干扰技术或更换启动子或基因突变使所述相关基因失活或表达量下降或活性降低，优选的，所述基因编辑是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法。
在一些具体实施方式中，所述内源乙醇合成负调控基因选自乙醇合成分支途径中的基因：ldh1，ldh2，mpd，细胞质还原力向线粒体穿梭途径的基因：mdh,gpd,nde1,nde2，电子传递链(呼吸链)中的基因：cox，乙醇代谢的基因：Mtadh，Mtaldh。
更具体选自乳酸脱氢酶、1-磷酸甘露醇脱氢酶、胞质苹果酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶、外NADH脱氢酶、乙醇脱氢酶(Mycth_55576)、乙醛脱氢酶中的一种，或者它们的多种组合。更具体地，使菌株中的内源乙醇合成负调控基因乳酸脱氢酶基因表达量下降或丧失，以提高产乙醇的能力；或者使内源1-磷酸甘露醇脱氢酶基因表达量下降或丧失，以提高产乙醇的能力，或者使内源胞质苹果酸脱氢酶基因表达量下降或丧失，以提高产乙醇的能力，或者使内源甘油-3-磷酸脱氢酶基因表达量下降或丧失，以提高产乙醇的能力，或者使其内源性乙醇脱氢酶(Mycth_55576)基因表达量下降或丧失，或者使内源乙醛脱氢酶中的一种或者多种组合基因表达量下降或丧失，或者使菌株中内源细胞色素C氧化酶表达量下降。
在一些具体实施方式中，所述内源乙醇合成负调控基因选自乳酸脱氢酶基因，和/或1-磷酸甘露醇脱氢酶。
在另一些具体实施方式中，所述内源乙醇合成负调控基因是细胞色素C氧化酶编码基因和/或外NADH脱氢酶基因nde。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶、和纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1/cdt-2，以及下调乳酸脱氢酶基因ldh-1和/或ldh-2的表达。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，并下调外NADH脱氢酶基因nde的表达，其中外NADH脱氢酶基因nde1和nde2两者之一或同时下调。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，和下调细胞色素C氧化酶基因的表达。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，并下调除细胞质苹果酸脱氢酶Mdh的表达，任选进一步下调甘油-3-磷酸脱氢酶基因gpd的表达。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，和丙酮酸脱羧酶基因pdc1，任选进一步过表达葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1，更进一步地下调乳酸脱氢酶基因和磷酸甘露醇脱氢酶)；或者更进一步地下调细胞质苹果酸脱氢酶Mdh，和/或下调除乙醇脱氢酶基因Mtadh和/或乙醛脱氢酶基因Mtaldh。
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，丙酮酸脱羧酶基因pdc1，任选进一步过表达葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1，更进一步地下调乳酸脱氢酶基因和1-磷酸甘露醇脱氢酶)
在一些具体实施方式中，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，和丙酮酸脱羧酶基因pdc1。
本发明还提供由如上述的构建方法所获得的基因工程菌。
在本发明实施方式中，其与其出发菌株相比，乙醇生产能力增强或提高了至少10％；较佳地至少20％，30％，40％，50％。
本发明进一步提供一种利用上述的构建方法所获得的产乙醇能力提高的重组菌在生产乙醇中的用途。
其中，其采用单糖或/和聚糖，或者含有单糖或/和聚糖的物质为底物。
优选的，所述单糖为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；所述聚糖包括纤维二糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、木寡糖、纤维寡糖、纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉、植物木质生物质或其组合。更优选的，所述的植物木质生物质选自农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物。进一步优选的，所述农作物秸秆选自玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯；所述林业废弃物选自枝叶，锯末；所述能源植物选自甜高粱，柳枝稷，芒草，芦苇或其组合。
在一些实施方式中，所述丝状真菌选自脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、毁丝霉(Myceliophthora)、侧孢霉(Sporotrichum)、镰孢菌(Fusarium)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)和拟青霉(Paecilomyces)。优选的，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(Myceliophthora heterothallica)。更优选的为嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)。
优选方式中，所述重组菌为嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，所述发酵温度40-60℃，较佳地，为45-52℃，更佳地，为48-50℃。
本发明还提供一种生产乙醇的方法，在含有单糖或/和聚糖的培养基质中，培养上述的构建方法所获得的基因工程菌，从培养物中收集乙醇。
优选的，所述单糖为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；所述聚糖包括纤维二糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、木寡糖、纤维寡糖、纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉、植物木质生物质或其组合。进一步地，所述的植物木质生物质选自农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物，更优选的，所述农作物秸秆选自玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯；所述林业废弃物选自枝叶，锯末；所述能源植物选自甜高粱，柳枝稷，芒草，芦苇或其组合。
在一些实施方式中，所述丝状真菌选自脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、毁丝霉(Myceliophthora)、侧孢霉(Sporotrichum)、镰孢菌(Fusarium)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)和拟青霉(Paecilomyces)。优选的，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(Myceliophthora heterothallica)。更优选的为嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)。优选的，所述丝状真菌为毁丝霉菌或木霉。更优选的，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(Myceliophthoraheterothallica)。最优选的所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)，同时更优选，所述发酵温度40-60℃，较佳地，为45-52℃，更佳地，为48-50℃。具体步骤包括将所述重组菌在底物中进行培养；收集培养液，提取乙醇。
本发明首次对丝状真菌尤其是毁丝霉属菌株进行基因改造，因而增强菌株的产乙醇能力，尤其是具备能够有效地利用聚糖或植物生物质这些普通菌株无法利用的发酵底物合成乙醇，将原本不用于生产乙醇的丝状真菌能够有效用于生产乙醇，尤其是采用嗜热毁丝霉菌，通过基因改造，可在普通菌株无法耐受的高温下高产率地合成出乙醇。利用嗜热毁丝霉能够实现生物质原料到乙醇的一步转化可以降低纤维素乙醇生产成本，本发明通过实验对上述效果进行验证，因而具有突出的应用潜力和广泛的现实应用前景。
附图说明
图1为野生型菌株，工程菌E1在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图2为工程菌E1，E2在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图3为工程菌E2，E3在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图4为野生型菌株，工程菌JY144，JY518在纤维二糖和纤维素条件下乙醇产量；
图5为工程菌E3，E4在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图6为工程菌E3，E5在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图7为工程菌E1，E7在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图8为工程菌E1，E6在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图9为工程菌E7，E8在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图10为工程菌E1，E10，E11，E12在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量；
图11为工程菌E5，E14，E15在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量。
在图中，Glucose代表葡萄糖，Cellobiose代表纤维二糖，Avicel代表纤维素，WT代表嗜热毁丝霉野生型菌株ATCC42464。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如Sambrook等人所著的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。
实施例1嗜热毁丝霉中过表达乙醇脱氢酶编码基因Scadh1
1.Scadh1过表达载体(pAN52-Scadh1)的构建
以pAN52-TB-Intron(Environ Microbiol.015.17(4):1444-62)为骨架构建表达载体，将eIF-5A基因(Mycth_2297659，Gene ID:11511639)启动子PeIF片段(序列如SEQ IDNO.1所示)，插入经BglII和SpeI酶切线性化载体pAN52-TB-Intron中，获得重组质粒pAN52-PeIF-TtrpC-neo。而后用引物eIF-ScADH1-F/R将来源于酿酒酵母S288c乙醇脱氢酶编码基因Scadh1(Gene ID:854068)片段进行扩增，利用NEB的Gibson Assembly试剂盒将其重组入经EcoRI和BamHI酶切后的线性化载体pAN52-PeIF-TtrpC-neo，得到组成型强启动子PeIF调控的乙醇脱氢酶编码基因Scadh1表达载体pAN52-PeIF-Scadh1。
PCR反应体系为：
Max Buffer 25μL，10mM dNTPs 1μL，上游/下游引物各1.5μL，模板1μL，
Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，水19μl。
PCR反应条件为：先95℃30s；然后98℃15s，58℃15s，72℃1min，34个循环；最后72℃5min，4℃10min。
本实施例中载体构建所用引物如下：
| SEQ ID NO. | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 30 | eIF-5A-F | tctgcagatctttaattaactcgagCCACATCATGTAAACAGAG |
| 31 | eIF-5A-R | ggatagacatCTTGTTGTTGTTGTTGTG |
| 36 | eIF-ScADH1-F | caacaacaagATGTCTATCCCAGAAACTC |
| 37 | eIF-ScADH1-R | gatttcagtaacgttaagtggatccTTATTTAGAAGTGTCAACAACG |
2、将表达载体(pAN52-Scadh1)导入嗜热毁丝霉
将嗜热毁丝霉ATCC 42464在MM斜面培养基[50×Vogel’s盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，组氨酸(50mg/mL)20mL，定容体积到1L，高压灭菌。50×Vogel’s盐(1L)配方为：柠檬酸三钠(1/2H2O)150g，无水KH2PO4 250g，无水NH4NO3 100g，MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 5g，微量元素液5mL，生物素(0.1mg/mL)2.5mL，定容体积到1L。微量元素液配方(100mL)：5gC6H8O·7H2O，5g ZnSO4·7H2O，1g Fe(NH4)2(SO4)·6H2O，0.25g CuSO4·5H2O，0.05g MnSO4·H2O，0.05g H3BO3，0.05g NaMoO4·2H2O，溶于水中，定容至100mL]上45℃培养10天后待用。
2.2嗜热毁丝霉原生质体转化
1)菌丝体准备
将成熟的嗜热毁丝霉孢子，用0.05％吐温80灭菌水收集，经擦镜纸过滤除去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的MM平板，37℃培养16h。
2)原生质体制备
将带有菌丝的玻璃纸放置于30mL裂解液(配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30mL溶液A，过滤除菌；溶液A配方为:1.036g磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90mL去离子水，氢氧化钾调pH到5.6，定量至100mL，高温灭菌)中，28℃裂解2h，每隔15min轻轻摇动。
而后经过擦镜纸过滤后，2000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入4mL溶液B(0.735g氯化钙，18.22g山梨醇，1mL Tris·HCl(1M，pH7.5)，溶于90mL去离子水，盐酸调pH到7.6，定量至100mL，高温灭菌)，2000rpm 4℃离心10min；弃上清，按200μL/5ug质粒加入一定体积溶液B。
3)原生质体转化
预冷的15ml离心管，依次加入50μL预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500μLTris·HCl(1M pH 7.5))，10μL用BglII线性化的质粒pAN52-Scadh1，200μL原生质体。放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素MM培养基中，置于平板中，45℃培养，2d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长
2.3嗜热毁丝霉转化子验证
1)基因组提取
采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体包括以下操作：
1)2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠及1mL的裂解液(lysis buffer，配方：0.2M Tris·HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％SDS(w/v))，挑取平板中生长的嗜热毁丝霉菌丝于DNA提取管中。
2)将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。
3)65℃水浴30分钟，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。
4)水浴结束后取出，每管加入80μL pH 7.5的1M Tris·HCl中和。
5)加入400μL的酚：氯仿(1:1)，13000rpm离心5分钟。
6)取300μl上清液于新的1.5mLEP管中，加入600μl 95％的乙醇(DNA)。
7)冰上孵育一小时，随后4℃、13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。
8)用75％的酒精(DNA级)400μL清洗，4℃、13000rpm离心，轻轻取出上清液。
9)将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。
10)加入50μL ddH2O溶解DNA，用NanoDrop测定DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。
2)PCR验证嗜热毁丝霉转化子
以提取的基因组DNA为模版，用引物eIF-5A-F及eIF-ScADH1-R对转化子进行基因PCR验证。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(110V电压，30分钟)，在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在引物eIF-5A-F和eIF-ScADH1-R引导下经PCR扩增获得了～2486bp的目的条带，该条带表明经BglII线性化的pAN52-PeIF-Scadh1整合到了野生型嗜热毁丝霉ATCC42464基因组中。
3、嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
将上述验证的转化子全部接种至250mL三角瓶中的100mL以葡萄糖为碳源培养基(培养基配方为：Glucose 75g，Yeast extract 10g，0.15g KH2PO4，0.15g K2HPO4，0.15gMgSO4·7H2O，0.1g CaCl2·2H2O，1mL Tace element，1mL 0.1mg/mL生物素溶液,定容体积到1L，高压蒸汽灭菌)中，纤维素(Avicel)为碳源培养基配方为：Avicel 75g，Yeastextract 10g，0.15g KH2PO4，0.15g K2HPO4，0.15g MgSO4·7H2O，0.1g CaCl2·2H2O，1mLTace element，1mL 0.1mg/mL生物素溶液，定容体积到1L，高压蒸汽灭菌。采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃条件下培养7天，摇床转速150rpm。接种量为2.5×105个/mL，45℃，150rpm培养，第7天取样测定乙醇含量。
1)样品处理：
取1mL发酵液于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，取上清液测定乙醇含量。
2)乙醇含量测定
处理后的样品用高效液相色谱测定乙醇含量，其中检测器为示差检测器，5mMH2SO4为流动相，流速为0.5mL/min。将获得的在嗜热毁丝霉野生型ATCC42464菌株中过表达pAN52-PeIF-Scadh1的菌株命名为E1菌株，结果显示Scadh1基因在嗜热毁丝霉中过表达时，能显著促进乙醇的生产。以葡萄糖为碳源发酵7天时，E1菌株的乙醇产量为4.60g/L(如图1所示)，相比野生型菌株(嗜热毁丝霉ATCC42464，3.17g/L)提高45.1％。在以纤维素(Avivel)为碳源发酵7天时，E1菌株的乙醇产量为87mg/L，显著高于野生型菌株(嗜热毁丝霉ATCC42464，30.5mg/L)，提高2.8倍。表明过表达乙醇脱氢酶Scadh1，可以显著提升嗜热毁丝霉在以葡萄糖和纤维素(Avicel)为碳源时的乙醇产量。
实施例2嗜热毁丝霉中过表达丙酮酸脱羧酶基因pdc1
1.pdc1过表达载体(pAN52-pdc1)的构建
以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C(taxid:559292)基因组DNA为模板，扩增出pdc1基因(Gene ID:850733)，以嗜热毁丝霉翻译延长因子编码阅读框(MYCTH_2298136)上游1.175kb片段(命名为Ptef启动子)为启动子(核酸序列如SEQ ID NO.2所示)，利用NEB的Gibson Assembly将上述两个片段重组入经XhoI和BamHI酶切后的线性化载体pAN52-TB-Intron中，得到pdc1基因的重组表达质粒pAN52-tef-pdc1。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例1中载体构建中所述方法相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
| SEQ ID NO. | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 72 | pdc1-Gib-Ptef-F | TACCGTCAAAATGTCTGAAATTACTTTGGG |
| 73 | pdc1-Gib-Ptef-R | GATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTATTGCTTAGCGTTGGTAG |
| 74 | Ptef-Gib-pdc1-F | TCTGCAGATCTTTAATTAACTCGAGCACCCGCCATGATTCCGTAG |
| 75 | Ptef-Gib-pdc1-R | TTTCAGACATTTTGACGGTATTTGTGTTCTGAAGAAC |
后续目标基因过表达载体导入嗜热毁丝霉的转化方法与验证方法与实施例1中所述相同。
2.嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
本次转化的出发菌株为E1菌株，转化获得的过表达丙酮酸脱羧酶基因pdc1的菌株，命名为E2菌株。E2菌株与E1菌株分别接种于75g/L葡萄糖以及75g/L纤维素(Avicel)培养基中(配方详见实施例1)。采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃光照培养7天，摇床转速150rpm。
样品离心取上清液，测定乙醇含量。结果如图2所示：在以葡萄糖为碳源时，E2菌株的乙醇产量为6.87g/L，较出发菌株E1的产量(4.60g/L)提高49.3％。在以纤维素(Avicel)为碳源发酵7天时，E1菌株的乙醇产量为87mg/L，E2菌株的乙醇产量为129mg/L，较E1提高48.3％。说明过表达丙酮酸脱羧酶基因pdc1，可以提升嗜热毁丝霉在葡萄糖和纤维素(Avicel)条件下的乙醇产量。
实施例3嗜热毁丝霉中过表达葡萄糖转运蛋白/己糖转运蛋白编码基因glt-1
1.葡萄糖转运蛋白基因glt-1表达载体构建
将在TrpC启动子调控下的草胺膦抗性基因(bar)片段PtrpC-bar以及TrpC终止子片段TtrpC，利用NEB的Gibson Assembly重组入经BglII酶切后的线性化载体pCAMBIA-0380中，获得在启动子TrpC调控下bar基因表达载体p0380-P-bar-T。
从粗糙脉孢霉基因组中扩增出葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1(NCU01633，GeneID:3872148)，以嗜热毁丝霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gpdA(Mycth_2311855)上游1372bp片段(如SEQ ID NO.6所示)作为启动子，以嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶编码基因cbh-1(Mycth_109566)下游片段TcbhI作为终止子(如SEQ ID NO.7所示)，以草胺膦抗性基因(bar)为筛选标记。将上述片段利用NEB的Gibson Assembly重组入经BglII酶切后的线性化载体pCAMBIA-0380中，从而获得glt-1过表达载体p0380-PgpdA-1633-bar。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例1中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
| SEQ ID NO. | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 47 | P-bar-F | AAGAGGAGTCCACCATGGTACTCGACAGAAGATGATATTG |
| 48 | P-bar-R | AACGTTAAGTTCAGATCTCGGTGACGGG |
| 49 | TtrpC-bar-F | CGAGATCTGAACTTAACGTTACTGAAATCATC |
| 50 | TtrpC-bar-R | GCTAGCGTTAACACTAGTCACCTCTAAACAAGTGTACC |
| 51 | TcbhI-F | AGCCATGGAGAGGTTTAGCACGAACCTCTCTGAAGGAG |
| 52 | TcbhI-R | GTATGATGGGTCAGTTCAG |
| 53 | TtrpC-bar-R | GCTAGCGTTAACACTAGTCACCTCTAAACAAGTGTACC |
| 54 | 1633-F | ATGGGTCTCTTCTCGAAA |
| 55 | 1633-R | CTAAACCTCTCCATGGCT |
| 56 | PgpdA-F | AAGAGGAGTCCACCATGGTACTTGCATCGTCCCAAAGC |
| 57 | PgpdA-R. | TTTCGAGAAGAGACCCATTTTGATTTCTGTGATGTGGG |
2.嗜热毁丝霉重组转化子发酵产乙醇分析
获得嗜热毁丝霉重组转化子
将构建的基因表达载体p0380-PgpdA-1633-bar整合至出发菌株嗜热毁丝霉E2菌株基因组(命名为E3菌株)，以终浓度为100μg/mL草胺膦为筛选抗生素，其方法见实施例1步骤2。利用引物PgpdA-F和1633-R，验证所得转化子，PCR体系及方法见实施例1步骤1。
将验证的转化子全部接种至250mL三角瓶中的100mL以葡萄糖为碳源培养基中(配方见实施例1步骤3)，接种量为2.5×105个/mL，45℃，150rpm培养。样品经实施例1步骤3.1所述方法进行处理后，测定发酵液中乙醇含量，方法同实施例1步骤3.2。结果如图3显示，在嗜热毁丝霉中过表达葡萄糖转运蛋白显著促进了葡萄糖条件下乙醇的生产，第7天时E3菌株乙醇产量达到10.74g/L，与对照菌种E2(6.87g/L)相比提高了56.3％。
以纤维素(Avicel)为碳源发酵7天时，E3菌株的乙醇产量为0.238g/L，显著高于出发菌株E2(0.129g/L)，提高84.5％。说明过表达葡萄糖转运蛋白/己糖转运蛋白基因glt-1，可以显著提升嗜热毁丝霉在葡萄糖和纤维素(Avicel)条件下的乙醇产量。
实施例4嗜热毁丝霉中过表达纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1/cdt-2
本实施例首先在嗜热毁丝霉野生型菌株ATCC42464中过表达乙醇脱氢酶基因Scadh1获得JY144菌株。然后采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术(Qian Liu,etal.Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungalMyceliophthora species and its application to hyper-cellulase productionstrain engineering.Biotechnol Biofuels 2017,10:1.)，将纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1和cdt-2分别定点整合至JY144菌株基因组乳酸脱氢酶基因ldh-1和ldh-2位点，获得的菌株命名为JY518，实现同时过表达目标基因并敲除代谢支路的效果，具体过程如下：
1.Scadh1过表达载体(pAN52-Scadh1)的构建
以pAN52-TB-Intron(Environ Microbiol.015.17(4):1444-62)为骨架构建表达载体，将tef基因启动子Ptef片段(SEQ ID NO.1)，插入经BglII和SpeI酶切线性化载体pAN52-TB-Intron中，获得重组质粒pAN52-MtTef-TtrpC-neo。而后用引物Tef-ScADH1-F/R将来源于酿酒酵母S288c乙醇脱氢酶编码基因Scadh1(Gene ID:854068)片段进行扩增，利用NEB的Gibson Assembly试剂盒将其重组入经EcoRI和BamHI酶切后的线性化载体pAN52-MtTef-TtrpC-neo，得到组成型强启动子Ptef调控的乙醇脱氢酶编码基因Scadh1表达载体pAN52-MtTef-Scadh1。嗜热毁丝霉的转化及鉴定方法同实施例1步骤2。
2.sgRNA表达框载体的构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因ldh-1(Mycth_38939，Gene ID:11506215)和ldh-2(Mycth_110317，Gene ID:11508231)的protospacer即靶标位点。采用融合PCR的方法将序列sgRNA启动子、protospacer及sgRNA连接在一起，采用基因重叠延伸(SOE)方法构建sgRNA表达框载体。
sgRNA表达框载体所需引物序列如表所示.
PCR反应体系为：5×phusion HF buffer 10μL，10mM dNTPs 1μL，上游/下游引物2.5μL，模板DNA 1μL，Phusion DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 32.5μL。
PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃10s，59℃30s，72℃1min，34个循环；最后72℃10min，4℃10min。
通过SOE-PCR的扩增形成sgRNA表达质粒U6p-ldh1-sgRNA和U6p-ldh2-sgRNA，其序列分别为SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示。
3.供体DNA载体构建
以嗜热毁丝霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因gpdA(Mycth_2311855)上游1372bp片段为cdt-1的启动子(SEQ ID No.6)，以嗜热毁丝霉基因组为模板，在引物的介导下，PCR扩增出粗糙脉孢菌纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1(NCU00801，GeneID:3879950)，以及ldh-1基因上/下游约900bp同源片段，而后利用NEB的Gibson Assembly将其重组入经SpeI和EcoRV酶切后的线性化载体pAN52-TB-Intron中，将得到的载体进行测序。得到在启动子PgpdA调控下的基因cdt-1表达的供体DNA片段donor-cdt1，其序列如SEQ ID No.16所示
丙酮酸脱羧酶编码阅读框pdc(Mycth_112121)上游730bp核酸片段Ppdc为cdt-2的启动子(如SEQ ID No.17所示)，草铵膦抗性基因Bar为筛选标记，以嗜热毁丝霉基因组为模板，在引物的介导下，PCR扩增出粗糙脉孢菌纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-2(NCU08114，GeneID:3880022)，以及ldh-2基因上/下游约1000bp同源片段,而后利用NEB的GibsonAssembly将其重组入经SpeI和EcoRV酶切后的线性化载体pAN52-TB-Intron中，将得到的载体进行测序。得到在启动子PgpdA调控下的cdt-1基因表达的供体DNA片段donor-cdt2，其序列如SEQ ID No.20所示。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与本实施例中(1)构建载体中所述方法相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
2.嗜热毁丝霉转化子利用纤维二糖生产乙醇能力的测定
首先将载体pAN52-MtTef-Scadh1转入野生型嗜热毁丝霉ATCC42464基因组中，将获得的过表达Scadh1基因的菌株命名为JY144菌株，随后以JY144菌株为出发菌株，将cdt-1及cdt-2表达载体、Cas9片段、U6p-ldh1-sgRNA、U6p-ldh2-sgRNA转化至JY144菌株中，以终浓度为100ug/mL草胺膦为筛选抗生素，其方法见实施例1步骤2。利用引物对38939-up-F/38939-down-R及110317-up-F/110317-down-R同时验证得到的转化子。
PCR反应体系为：10×Taq Buffer 2μL，10mM dNTP Mix 0.2μL，上游/下游引物各0.4μL DNA模板1μL，Taq DNA Polymerase 0.2μL，水15.8μL。
PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，58℃30s，72℃2min，32个循环；最后72℃7min，4℃10min.
将验证正确的转化子接种至以纤维二糖和纤维素(Avicel)为碳源的培养基中(配方见实施例1步骤3，只将葡萄糖替换为纤维二糖/纤维素)，接种量为2.5×105个/mL，45℃，150rpm培养。样品经实施例1步骤3.1所述方法进行处理后，测定发酵液中乙醇含量，方法同实施例1所述。
结果如图4所示，以纤维二糖为碳源条件下，JY144菌株乙醇产量为3.45g/L，高于野生型菌株产量(3.08g/L)。在JY144菌种基础上，过表达cdt-1和cdt-2，同时失活乳酸脱氢酶基因ldh-1和ldh-2，将所得菌株命名为JY518。在以纤维二糖为碳源时，JY518第7天乙醇产量为9.20g/L，相比出发菌株JY144的产量3.45g/L，提高1.67倍。
以纤维素(Avicel)为碳源发酵7天时，JY518菌株的乙醇产量为0.104g/L，高于出发菌株JY144(0.0914g/L)，提高13.8％，而嗜热毁丝霉野生型菌株(ATCC42464)的乙醇产量为0.0305g/L。实验结果表明过表达纤维二糖转运蛋白Cdt-1和Cdt-2，可以提高嗜热毁丝霉在纤维二糖(Cellobiose)和纤维素(Avicel)条件下的乙醇产量。
实施例5敲除乳酸脱氢酶基因ldh-2和1-磷酸甘露醇脱氢酶基因mpd
本实施例主要针对负调控基因乳酸脱氢酶Ldh-2(Mycth_110317，Gene ID:11508231)和1-磷酸甘露醇脱氢酶Mpd(Mycth_2310298，Gene ID:11513975)，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术(Biotechnol Biofuels 2017,10:1.)将目标基因失活，以敲除代谢支路，促进乙醇合成。
具体实施过程如下：
1.载体构建
(1)sgRNA表达框构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因ldh-2(Mycth_110317)和mpd(Mycth_2310298)的protospacer即靶标位点。采用融合PCR的方法将序列sgRNA启动子、protospacer及sgRNA连接在一起，采用基因重叠延伸(SOE)方法构建sgRNA表达框载体。
PCR反应体系和反应条件如实施例1所示。
通过SOE-PCR的扩增形成sgRNA表达质粒U6p-ldh2-sgRNA和U6p-mpd-sgRNA，其序列分别为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示。
(2)供体DNA载体构建
本发明中供体DNA片段分别由目标基因上/下游约600bp同源片段，草铵膦抗性基因表达框PtrpC-bar片段，通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶XbaI和EcoRV线性化的质粒PPk2BarGFP中，最终构建供体DNA片段donor-ldh2和donor-mpd，其核酸序列分别如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示。
Cas9表达框构建如本发明人已发表文章(Biotechnol Biofuels 2017,10:1.)所述，其核酸序列如SEQ ID No.29所示。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例1中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
2.嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
将Cas9表达框，sgRNA表达质粒U6p-ldh2-sgRNA(SEQ ID No.25)和U6p-mpd-sgRNA(SEQ ID No.26)以及供体DNA片段donor-ldh2(SEQ ID No.27)和donor-mpd(SEQ IDNo.28)以等比例混合后共转化进入嗜热毁丝霉E3菌株原生质体细胞后，Cas9蛋白在gRNA介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的ldh-2(MYCTH_110317，SEQ ID No.10)和mpd(Mycth_2310298，SEQ ID No.23)的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的，通过在平板中加入草铵膦筛选转化子。目标基因片段导入嗜热毁丝霉的转化方法与验证方法与实施例1中所述相同。
得到的同时敲除乳酸脱氢酶基因ldh-2和1-磷酸甘露醇脱氢酶基因mpd的转化子(命名为E4菌株)。E4菌株与E3菌株分别接种于75g/L葡萄糖以及75g/L纤维素(Avicel)培养基中(配方详见实施例1)。采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃条件下培养7天，摇床转速150rpm。
样品离心取上清液，测定乙醇含量。结果如图5所示：E4菌株的乙醇产量由E3的10.74g/L上升到13.70g/L，提高27.6％，说明敲除ldh-2和mpd基因有助于嗜热毁丝霉在葡萄糖条件下乙醇产量的提高。
以纤维素为碳源发酵7天时，E4菌株的乙醇产量为0.265g/L，高于出发菌株E3(0.238g/L)，提高11.3％。说明敲除乳酸脱氢酶基因和1-磷酸甘露醇脱氢酶基因，可以提升嗜热毁丝霉在纤维素上的乙醇产量。
实施例6敲除细胞质苹果酸脱氢酶Mdh
本实施例主要针对负调控基因细胞质苹果酸脱氢酶Mdh(Mycth_2315052，GeneID:11512768)，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术(Biotechnol Biofuels 2017，10:1.)将目标基因失活，减少细胞质NADH中的还原力向线粒体的穿梭，进而促进乙醇合成。
1.sgRNA表达框构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因mdh(Mycth_2315052)的protospacer即靶标位点。采用融合PCR的方法将序列sgRNA启动子、protospacer及sgRNA连接在一起，采用基因重叠延伸(SOE)方法构建sgRNA表达框载体。
PCR反应体系和反应条件如实施例1所示。
通过SOE-PCR的扩增形成sgRNA表达质粒U6p-mdh-sgRNA，其序列如SEQ ID No.32所示。
2.供体DNA载体构建
本发明中供体DNA片段分别由目标基因上/下游约700bp同源片段，草铵膦抗性基因表达框PtrpC-bar片段，通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶XbaI和EcoRV线性化的质粒PPk2BarGFP中，最终构建供体DNA片段donor-mdh，其核酸序列如SEQ IDNo.33所示。
Cas9表达框构建如本发明人已发表文章(Biotechnol Biofuels 2017,10:1.)所述，其核酸序列如SEQ ID No.29所示。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例1中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
| SEQ ID NO. | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 98 | 2315052doner-up-F | GGGTGGTGTGCATGGGGCCGTCT |
| 99 | 2315052doner-up-R | AAAGTGCTCCTTCAATATGCAGCAGGGTCAGCCGGGTCT |
| 100 | 2315052doner-Bar-F | CGGCTGACCCTGCTGCATATTGAAGGAGCACTTTTTGGGC |
| 101 | 2315052doner-Bar-R | GGTCATGCCGGGCTTTTAAGAAACTTTATTGCCAA |
| 102 | 2315052doner-Down-F | GGCAATAAAGTTTCTTAAAAGCCCGGCATGACCCGTGATGA |
| 103 | 2315052doner-Down-R | CGTACTGAAGCTCTTCCTCTATCCT |
| 104 | 2315052sgRNA-b | TTGGCGGGCAGGTAGCCGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAG |
| 105 | 2315052sgRNA-c | CTACCTGCCCGCCAACGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA |
| 106 | sgRNA-a | AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCG |
| 107 | sgRNA-d | AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| 108 | 2315052doner-up-F | GGGTGGTGTGCATGGGGCCGTCT |
| 109 | 2315052doner-Down-R | CGTACTGAAGCTCTTCCTCTATCCT |
3.嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
将Cas9表达框，sgRNA表达质粒U6p-mdh-sgRNA以及供体DNA片段donor-mdh，以等比例混合后共转化进入嗜热毁丝霉E3菌株和E1菌株原生质体细胞，Cas9在gRNA介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的mdh的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因的目的，通过在平板中加入草铵膦筛选转化子。目标基因片段导入嗜热毁丝霉的转化方法与验证方法与实施例1中所述相同，分别获得E5菌株(出发菌E3)和E7菌株(出发菌E1)。
将E5菌株及其出发菌株E3，E7菌株及其出发菌株E1分别接种于75g/L葡萄糖以及75g/L纤维素(Avicel)培养基中(配方详见实施例1)，采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃条件下培养7天，摇床转速150rpm。样品离心取上清液，测定乙醇含量。
结果如图6所示：在以葡萄糖为碳源时E5菌株的乙醇产量达到15.96g/L，相比出发菌株E3
(10.74g/L)提高48.6％。在以纤维素(Avicel)为碳源时，E5菌株的乙醇产量为2.568g/L，显著高于出发菌株E3(0.238g/L)，提高9.8倍。说明细胞质苹果酸脱氢酶Mdh的敲除，能够显著提升嗜热毁丝霉在葡萄糖和纤维素(Avicel)条件下的乙醇产量
同样，如图7所示：在以葡萄糖为碳源时E7菌株乙醇产量达到7.73g/L，与对照菌种E1(产量为4.60g/L)相比提高68.04％。在以纤维素(Avicel)为碳源时，E7菌株的乙醇产量为2.41g/L，显著高于出发菌株E1(0.087g/L)，提高26.7倍。说明细胞质苹果酸脱氢酶基因mdh的敲除，能够提高细胞质NADH含量，从而提高嗜热毁丝霉在葡萄糖和纤维素(Avicel)条件下乙醇的生产能力。
实施例7下调细胞色素C氧化酶编码基因的表达
本实施例主要应用CRISPR/dCas9技术，下调线粒体呼吸链关键基因细胞色素C氧化酶编码基因(Mycth_2312390，GeneID:11509370)的转录水平，进而促进嗜热毁丝霉乙醇的合成，具体如下：
1.表达载体构建
(1)dCas9蛋白编码序列的扩增
dCas9蛋白是把Cas9中两个关键结构域RuvC和HNH进行突变(D10A and H840A)，使其丧失切割DNA的活性。突变方法为：使用引物同时引入这两个突变位点(D10A andH840A)，以载体p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC为模板(Biotechnol Biofuels 2017，10:1)，分别用引物扩增出Cas9前/后两部分序列，采用融合PCR的方法将上述片段连接在一起，构成dCas9核酸片段，如SEQ ID No.38所示，蛋白质序列如SEQ ID No.39所示。
KRAB结构域为蛋白质—蛋白质相互作用区，可以与多种协同转录抑制因子结合，使KRAB型锌指蛋白作为转录因子和/或转录调控因子发挥依赖于DNA结合的转录抑制功能。本发明使用的KRAB结构域来源于人类锌指蛋白10(Homo sapiens zinc finger protein10)，密码子优化后人工合成，核酸和蛋白质序列分别见SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41。
采用融合PCR方式将dCas9与KRAB核酸片段连接构成dCas9KRAB片段，用PmeI和PacI酶切后连接入经同样酶双酶切的线性化载体p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC，获得dCas9KRAB重组表达质粒p0380-bar-Ptef1-dCas9KRAB-TtprC。
(2)sgRNA表达框的构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因MYCTH_2312390上游启动子区域的protospacer即靶标位点。采用融合PCR的方法将序列sgRNA启动子、protospacer及sgRNA连接在一起，采用基因重叠延伸(SOE)方法构建sgRNA表达框载体U6p-2312390-sgRNA，其核酸序列如SEQ ID No.42所示。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例3中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
2.嗜热毁丝霉的转化及转化子的鉴定
将p0380-bar-Ptef1-dCas9KRAB-TtprC载体经EcoRV线性化后和U6p-2312390-sgRNA等量转化出发菌株E1(构建和转化方法详见实施例1)。获得转化子后，利用引物dCas9-KRAB-F和KRAB-R(验证dCas9KRAB整合在基因组中)，以及2312390Sg-c和2312390Sg-d(验证U6p-2312390-sgRNA整合到基因组中)鉴定，用PCR验证得到的转化子，PCR体系及方法见实施例1。成功转入p0380-bar-Ptef1-dCas9KRAB-TtprC和2312390SgRNA的转化子命名为E6菌株。
3.嗜热毁丝霉转化子乙醇生产能力的测定
将菌株E6，出发菌株E1分别接种于75g/L葡萄糖以及75g/L纤维素(Avicel)的培养基(配方详见实施例1)，采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃条件培养7天，摇床转速150rpm。
样品离心取上清液，测定乙醇含量，结果如图8所示，在以葡萄糖为碳源时，转化子E6的乙醇产量达到5.29g/L，相比出发菌株E1(4.60g/L)提高15％。以纤维素(Avicel)为碳源发酵7天时，E6菌株的乙醇产量为0.094g/L，高于出发菌株E1(0.087/L)，提高8％，说明向下调控呼吸链强度，能够提升嗜热毁丝霉在葡萄糖和纤维素(Avicel)上的乙醇产量。
实施例8敲除甘油-3-磷酸脱氢酶基因gpd
为提高细胞质中的NADH水平，将嗜热毁丝霉乙醇合成菌株中的甘油-3-磷酸脱氢酶基因gpd(Mycth_2313529，GeneID:11508057)敲除，进一步提高转化子乙醇合成效率。
1.本实施例根据实施例6中所述方法构建sgRNA表达框U6p-gpd-sgRNA(如SEQ IDNo.34所示)及其供体DNA表达载体donor-gpd(如SEQ ID No.35所示)。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例1中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
| SEQ ID NO. | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 110 | 2313529doner-up-F | TGGGACGGCGAGAGCGACGGGT |
| 111 | 2313529doner-up-R | GCGTCGAGAAGGCAGAGTCTGTGGATCGTGC |
| 112 | 2313529doner-Down-F | AGACTCTGCCTTCTCGACGCCGTCAGGG |
| 113 | 2313529doner-Down-R | TAGCGCCAGTTGCGTGCCGAGGT |
| 114 | 2313529sgRNA-b | CGGGGATTGTGACATTCTCCGAGGAAAGAAAGAAAAGAAG |
| 115 | 2313529sgRNA-c | GGAGAATGTCACAATCCCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| 116 | sgRNA-a | AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCG |
| 117 | sgRNA-d | AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| 118 | KO2313529YZ-F | CGCTCTCATTCCCCCTCGCAG |
| 119 | KO2313529YZ-R | ATATACTCGCAAATCAGCTCGA |
2.嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
将Cas9表达框，sgRNA表达质粒U6p-gpd-sgRNA以及供体DNA片段donor-gpd以等比例混合后共转化进入嗜热毁丝霉E7菌株(构建过程详见实施例6)原生质体细胞后，Cas9在gRNA介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的gpd的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的。目标基因片段导入嗜热毁丝霉的转化方法与验证方法与实施例1中所述相同，获得在E7菌株中成功敲除gpd基因的转化子命名为E8菌株.
E8菌株及其出发菌株E7菌株，分别接种于75g/L纤维素(Avicel)培养基以及75g/L葡萄糖培养基(配方：碳源75g，酵母抽提物10g,0.15g KH2PO4,0.15g K2HPO4,0.15g MgSO4·7H2O，0.1g CaCl2·2H2O，1mL微量元素，1mL 0.1mg/mL生物素溶液,定容体积到1L，高压蒸汽灭菌)中。采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃条件下培养7天，摇床转速150rpm。
样品离心取上清液，测定乙醇含量，结果如图9所示：E8菌株第7天在以葡萄糖为碳源条件下，乙醇的产量达到13.84g/L，与对照菌种E7(产量为7.73g/L)相比提高79％。在纤维素(Avicel)条件下，E8菌株的乙醇产量得到了显著提高，达到5.91g/L，相比出发菌株E7(2.41g/L)提高145.2％。说明失活细胞质甘油-3-磷酸脱氢酶Gpd，能够显著提高纤维素(Avicel)和葡萄糖条件下嗜热毁丝霉的乙醇产量。
实施例9敲除外NADH脱氢酶基因nde
本实施例主要针对负调控基因外NADH脱氢酶基因nde(Mycth_2304268，Gene ID:11507602编码nde1，Mycth_2304512，Gene ID:11507705编码nde2)，采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术(Biotechnol Biofuels 2017,10:1.)将目标基因失活，减少细胞质NADH的还原力向线粒体的传递，进而促进乙醇合成。
1.sgRNA表达框构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因nde1(Mycth_2304268)和nde2(Mycth_2304512)的protospacer即靶标位点。采用融合PCR的方法将序列sgRNA启动子、protospacer及sgRNA连接在一起，采用基因重叠延伸(SOE)方法构建sgRNA表达框载体。
PCR反应体系和反应条件如实施例2所示。
通过SOE-PCR的扩增形成sgRNA表达质粒U6p-nde1-sgRNA，U6p-nde2-sgRNA，序列分别如SEQ ID No.144，SEQ ID No.146所示。
2.供体DNA的扩增
本发明中供体DNA片段分别由目标基因上/下游约700bp同源片段，草铵膦抗性基因表达框PtrpC-bar片段，通过融合PCR的方法获得全长的线性化供体DNA片段donor-nde1和donor-nde2，其核酸序列分别如SEQ ID No.145和SEQ ID No.147所示。
Cas9表达框构建如本发明人已发表文章(Biotechnol Biofuels 2017，10:1.)所述，其核酸序列如SEQ ID No.29所示。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例4中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
3.嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
将Cas9表达框，sgRNA表达质粒U6p-nde-sgRNA以及供体DNA片段donor-nde以等比例混合后共转化进入嗜热毁丝霉E1菌株原生质体细胞后，Cas9在gRNA介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上的nde的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的，通过在平板中加入草铵膦筛选转化子。目标基因片段导入嗜热毁丝霉的转化方法与验证方法与实施例1中所述相同,
本次转化的出发菌株为E1菌株，敲除外NADH脱氢基因nde1获得的菌株命名为E10菌株，敲除nde2获得的菌株命名为E11菌株，同时敲除nde1和nde2的菌株命名为E12菌株。E10，E11，E12菌株与E1菌株分别接种于75g/L葡萄糖培养基以及75g/L纤维素(Avicel)培养基(配方详见实施例1)中，培养7天后测定乙醇含量，结果如图10所示：在葡萄糖培养基中，E10，E11，E12菌株的乙醇产量分别为5.94g/L，6.02g/L，6.33g/L均高于出发菌株E1(4.60g/L)，分别较E1提高29.1％，30.9％和37.6％。在以纤维素(Avicel)为碳源条件下，结果如图10所示：E10，E11，E12菌株乙醇产量分别为1.82g/L，2.01g/L，2.17g/L均高于出发菌株E1(0.087g/L)，分别比E1提高了19.92倍，22.10倍，23.94倍。说明外NADH脱氢酶的敲除，能够提高嗜热毁丝霉细胞质中NADH的含量，进而菌株在提高葡萄糖和纤维素(Avicel)条件下乙醇的产量。
实施例10.敲除乙醇脱氢酶基因Mtadh和乙醛脱氢酶基因Mtaldh
在生物体内，乙醇合成途径的最后一步反应是由乙醇脱氢酶催化完成的，然而这一步反应是可逆反应，并且部分乙醇脱氢酶更倾向于催化乙醇的分解。此外，乙醇脱氢酶的底物——乙醛也会被内源的乙醛脱氢酶催化生成乙酰辅酶A。为了避免乙醇和乙醛的消耗，提升发酵液中乙醇积累，发明人通过分析乙醇胁迫条件下的转录组数据，寻找到了潜在的乙醇及乙醛消耗的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，并通过实验进行了验证。鉴定出起主要作用的基因是乙醇脱氢酶基因Mtadh(Mycth_55576，Gene ID:11511314)以及乙醛脱氢酶基因Mtaldh(Mycth_2140820，Gene ID:11506799)。因此，本实施例对这两个基因进行了敲除。
1.sgRNA表达框构建
通过软件sgRNACas9 tool设计目标基因mtadh(Mycth_55576)和mtaldh(Mycth_2140820)的protospacer即靶标位点。采用融合PCR的方法将序列sgRNA启动子、protospacer及sgRNA连接在一起，采用基因重叠延伸(SOE)方法构建sgRNA表达框载体。
PCR反应体系和反应条件如实施例4所示。
通过SOE-PCR的扩增形成sgRNA表达质粒U6p-mtadh-sgRNA，U6p-mtaldh-sgRNA，序列分别如SEQ ID No.4，SEQ ID No.5所示。
2.供体DNA的扩增
本发明中供体DNA片段分别由目标基因上/下游约700bp同源片段，潮霉素抗性基因表达框PtrpC-hygR片段，通过融合PCR的方法获得全长的线性化供体DNA片段donor-mtadh和donor-mtaldh，其核酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.10所示。
Cas9表达框构建如本发明人已发表文章(Biotechnol Biofuels 2017,10:1.)所述，其核酸序列如SEQ ID No.29所示。
本实施例中PCR反应体系及反应条件与实施例1中所述相同。
本实施例中载体构建所用引物如下：
3.嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
将Cas9表达框，sgRNA表达质粒U6p-mtadh-sgRNA，U6p-mtaldh-sgRNA以及供体DNA片段donor-mtadh，donor-mtaldh以等比例混合后共转化进入嗜热毁丝霉E5菌株原生质体细胞后，Cas9在gRNA介导下，通过靶标序列与宿主细胞基因组上目标基因DNA链配对来识别靶标位点进行切割，随后供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，从而达到编辑基因组的目的，通过在平板中加入潮霉素筛选转化子。目标基因片段导入嗜热毁丝霉的转化方法与验证方法与实施例1中所述相同。
本次转化的出发菌株为E5菌株(构建过程详见实施例6)，敲除乙醇脱氢酶基因mtadh(Mycth_55576)获得的菌株命名为E14菌株，敲除乙醛脱氢酶基因Mtaldh(Mycth_2140820)获得的菌株命名为E15菌株。E14，E15菌株与E5菌株分别接种于75g/L葡萄糖以及75g/L纤维素(Avicel)培养基中(配方详见实施例1)中，采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/mL，培养基体积为100mL/瓶，45℃条件下培养7天，摇床转速150rpm。
样品离心取上清液，测定乙醇含量，结果如图11所示：在以葡萄糖为碳源时，E14，E15菌株的乙醇产量分别为18.84g/L，17.93g/L均高于出发菌株E5(15.96g/L)，分别比E5提高了18.05％和12.34％。在以纤维素(Avicel)为碳源发酵7天时，E14，E15菌株的乙醇产量分别为3.12g/L，3.59g/L高于出发菌株E5(2.568g/L)，分别较E5提高21.5％和39.8％；说明内源乙醇脱氢酶基因Mtadh和乙醛脱氢酶基因Mtaldh的敲除，能够减少嗜热毁丝霉对乙醇的代谢消耗，进而提高菌株在葡萄糖和纤维素(Avicel)条件下乙醇的产量。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用
<160> 164
<170> PatentIn Version 3.1
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 1
ccacatcatg taaacagagg ctcagaagct cctgccacac tgggagggtt tcgaagtctg 60
acgactgcca atggacccca gccatcgcga gcacacagca gttcgcacgc tcccattggg 120
ttcctcatca cgcagtcgct ctccccgcca accagcgcca ggtccgggaa cagcggcgca 180
aatgcgtatt tgagggcgcc tcgctcgagc aacctgtgcc tgaccttctc ctcctccttc 240
tgcaccttgc atctcgtcgc gtccactcgc aggcaaccac acatcctcct cctctcccaa 300
aacccccccg ctttttcttt cccttgttgg aattcgattg aaaaagaaga cgggtccgtc 360
tagagaccgc cttctcacct ttctctcgac ttctttctag gaaaagaagc aagagtcatt 420
cttcttgtcc accttctggt tcacggaagg tcgaggagaa gattgcctct gcccccaaag 480
tcgccaacct ggactttgaa gcacgtgttc cggtcccttt cagtgtcttc ccgtcctcgt 540
acagggagtc cgagaccgcc acccaaaccc actcccacga agaggttgag atcaagctcc 600
cccagctcgc cggacgggaa ggtcaacact cttcattcca agcccaagca catcttcctc 660
ccagcggaga gggtcgcttc agagaagaag aggtccgcat cactcgtcaa gaggaacatc 720
accgccgtcc cggcatccgt gaagagttcg ttcaccgcga ggagcgtcac cggtaagttt 780
agtttttgtt ttgattcacc acccattgtc ttccccgcct ttttcttttt cttcccttgc 840
tctcttgccc ctgtctagtg tagggcattg ccaaggccat cttcacacac acacaccccc 900
ccccccaccc tcagctgggg gggggggggt ggcctgggtt gaccaaggga cggtgaagac 960
tactactact tgagccactc aaacccatgc atgacacagg gttttccttt ttcttttctc 1020
ttttccttta actaaccaac cactccaaca ttagccctca gtcaacctac tccgagtctc 1080
gcatcgagtt cgatactgag caccgcactc acaactccgt cattgacgtt gctgagagcg 1140
agtatcgtgc ccgtgtccag cccaactacc gcaaggaagc ttccgtagtc ggtaccaccg 1200
tcgacggatc ccgcttcagc cacagccgca aggccagcag caccacctcc acccacaccg 1260
acgagtacac cgtcgatccc cctagccacc gccccgtcta caagaaggag tcggttgaag 1320
tcgccggtac cactgttgac ccccctgctc ctcgttcgac ctaccacgag caggtgaaca 1380
ttgttgaaga gaccgttgac gctcaccgtt acgctcctca acacaacaac aacaacaag 1439
<210> 2
<211> 1216
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 2
catgtacctt gacgtcctcc gaggttcgac atcagggttc gtcataggga gtgaaacacc 60
cgccatgatt ccgtagccgc gcgcgaagat acgaagcaga tatttcacgg acatggcgga 120
gatacttgtt tcccgtacta aggtagtcat gtcggagaca tctgaacgac agagctggcc 180
aagagaaccg accagttgcc ccaggacgat ctagacaaaa aaaaagagag atgagtgggc 240
cacttttgcc acaacatcga cggccctgcg accgccccca ggcaaacaaa caaaccgccg 300
aacaataata cttttgtcat tttaggagga gcgttgtatg gataaaaaca acatctcgtt 360
gctgcagaat gtggacttca aacttgcaga aaatgggagg cggatttgca tgatcggagg 420
gtagttgact cacgccgcag gctgcaaatc cgtcctccat tattccatga acaacttcgt 480
aaggttgggc tgagcgccaa tgcctaacgg accgggggcc acagcgcaac gtcccactta 540
aaggccagcg tgacatgcca gttccatacc aagtagtggc accagaggcg gccaatgctc 600
agtaagggca gggagggagg ctcaaacgat tggcaaaaag aggggcttgc cagttcagtt 660
ccctgtgcga gcgcgagagg ggcagtttca aatctggagg ggtgtgttgc gctggtctga 720
agagaaagag aagactgtac ttaataattg ttcaaagagt ccatcatcgc gttgcggact 780
cctctagctg tatttagagc cctatcatta cttgtcgggt gcgaatcaaa ataccgggat 840
gcagccctct ggcgatttgc atgcggttgt ggaggaagtg aagcctgaat cgcggggctg 900
ggcggcaaag cacgacgtga aattcctggc gaaattcgag ggcttgcccc accgtggttg 960
aagtttttgt gctgcgtaac cccaccaacc cgccttgccc ctcccgcctg cccataaaaa 1020
cttcgacccc tcctcaaatc ttcttcgatt cttcctcttc acttccttcg tcggcatacc 1080
tgattcaagc aatcacctgc cactttcaag tgcgtatacc atcatcgata cactggttct 1140
tgacaagtac atcgtctcta actttccttt ttgcagtttt cattaagcgc aagtcgccag 1200
tttcgttctt cagaac 1216
<210> 3
<211> 348
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 3
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
340 345
<210> 4
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 4
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgatcat ccagagcgcc 480
ggcagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 5
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 5
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgagctc aagacgccca 480
tcacgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 6
<211> 1372
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 6
ccgtcgacac gtgtgtcatc cttccattgc aagcgatcac tcgcagggcg tgacgatgaa 60
cgagattttt gcccggaccg attcgcggat atagcggcag ccgaccagcc ctaccacact 120
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ttcaaatccg ggccaaaaca ggccaagact ggctggccaa aaaaaggagc gtagacggcc 540
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tcaaccattt ttattatcag ctcatgccac cacaacatga ctgttttctt tccttgctca 960
tcccacattt gacaaaaatc gtcgattaat ctctttccat acaggccgtc cgcgctctga 1020
taaccacata aaagtctctt cagtcaacag ctcaaagctc cctcatccct ccaggtaagc 1080
agccaaagag ctcccccacg gaccccgcac tgcctcatcc cgcctgtatc ggacctgcgc 1140
gacccagcag agaatcccaa acctttgctg cttgctgccc ggttccggac tgagctgcaa 1200
cccaagcctt taaaaagcta ttcccttctc ccacggtgtc aactctgtcc tatccctccg 1260
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caaaccaccc tgacagctcg ctcactcacc tccccacatc acagaaatca aa 1372
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<211> 359
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 7
acgaacctct ctgaaggagg ttctgagaca cgcgcgattc ttctgtatat agttttattt 60
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gcttcttttc agaccatgtg aaccatcttg atgccttgac ctcttcagtt ctcactttaa 180
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accgcctacc ttcttaccac agtacactac tcacacattg ctgaactgac ccatcatac 359
<210> 8
<211> 3311
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 8
tcaagtgtca tgatctcgcg tgtcatccac tttcatcagc gttgacctgg cccgcactcc 60
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cgacccacat tccaccgctt tccattgtca acaatgacgt cttgtccctg accttaagcg 360
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atttctgaag agagacgtct gtaacacgcg agcaccaaag actctcatca acacatcaca 480
acttctgaac ttgttccacg ttgtcatcct gtccacttcc ctctaatagt tcgcaccacg 540
ccagcaatta taggatacaa acacgcttac cacagtacat ccattcatcc aaacccagaa 600
gatgatattg aaggagcatt tttgggcttg gctggagcta gtggaggtca acacatcaat 660
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gactcttatt agcagacagg aacgaggaca ttattatcat ctgctgcttg gtgcacgata 840
acttgtgcgt ttgtcaagca aggtaagtga acgacccggt cataccttct taagttcgcc 900
cttcctccct ttatttcaga ttcaatctga cttacctatt ctaccgaagc atcgatatga 960
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tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1800
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ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1920
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gatctcgata agatacgttc atttgtccaa gcagcaaaga gtgccttcta gtgatttaat 2160
agctccatgt caacaagaat aaaacgcgtt ttcgggttta cctcttccag atacagctca 2220
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<211> 316
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 9
Met Ser Gly Asn Glu Lys Pro Thr Ser Arg Ile Ala Ile Val Gly Val
1 5 10 15
Gly Gln Val Gly Ala Ala Ala Ala Tyr Ala Leu Ile Leu Glu Ser Val
20 25 30
Ala Gly Glu Leu Leu Leu Val Asp Ile Lys Ala Asp Trp Arg Asp Gly
35 40 45
Gln Val Arg Asp Leu Ala Asp Val Ala Tyr Gly Ile Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Arg Val Arg Ala Ala Thr His Arg Glu Ala Gly Gln Cys Asp Ile Val
65 70 75 80
Val Ile Thr Ala Gly Ser Lys Trp Ser Ile Gly Glu Thr Asn Val Gln
85 90 95
His Met His Arg Asn Val Ser Val Met Arg Ser Val Met Arg Asp Met
100 105 110
Thr Pro Phe Arg Ser Asp Ala Ile Val Ile Val Val Ser Asn Pro Val
115 120 125
Asp Leu Leu Thr Ser Ile Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Pro Arg Phe
130 135 140
Gln Val Phe Gly Ser Gly Thr Phe Leu Asp Ser Val Arg Leu Arg Gly
145 150 155 160
Leu Val Ala Asp Lys Ala Gly Val Ser Ala Asp Ala Ile His Leu Ser
165 170 175
Val Val Gly Leu His Gly Asp Ser Gln Val Val Thr Trp Ser Thr Ala
180 185 190
Thr Val Asn Gly Val Pro Leu Asp Arg Phe Val Ala Pro Val Val Ser
195 200 205
Gly Val Glu Leu Met His Ala Asp Leu Glu Asp Glu Cys Lys Phe Arg
210 215 220
Ser Glu His Ile Ile Arg Ala Lys Gly Gly Thr Pro Phe Gly Ile Gly
225 230 235 240
Ser Val Val Ala Ser Leu Cys Ser Thr Val Leu Arg Asp Lys Gly Asp
245 250 255
Val Arg Pro Val Ser Tyr Tyr Gln Pro Asp Tyr Gly Cys Cys Phe Ser
260 265 270
Leu Pro Val Val Leu Gly Arg Lys Gly Ile Met Arg Thr Ile Ala Met
275 280 285
Pro Leu Asp Glu Arg Glu Lys Ala Thr Val Ser Arg Ser Ala Gln Arg
290 295 300
Leu Lys Glu Thr Ile Glu Arg Leu His Lys Ser Gln
305 310 315
<210> 10
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<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 10
gtgccgctat ccaagcatat tgcggggaag ccgggggtcg catccgcaaa tcagaggaag 60
aatctggcca tggggcgcgg acgagtggga ctcccccgca gcatcggagg tttggagaga 120
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cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca taacagcggt 1860
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cgcggcgtcc tgctgctaaa gctggccgat ctcgccgaga agaacctgga ccttctggcc 3180
gcggtcgagt cgctcgacaa cggcaagtcc atcaccatgg cccgcggcga cgtcgccgcc 3240
gttgtcgggt gcatccgcta ctacggcggc tgggccgaca agatcgaggg caggaccatc 3300
gacatcaacc cggacatgtt cagctacacg aggcgcgagc cggtatgcga ttcctttcac 3360
ctctctgctg tgctccccta ccctactccg agagtacaag ctaaccttgg actttttgtt 3420
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<213> 引物
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<213> Myceliophthora thermophila
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<213> Myceliophthora thermophila
<400> 13
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tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
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cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgctgct ccttgatagg 480
ttaggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 14
gtgccgctat ccaagcatat tgc 23
<210> 15
<211> 579
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 15
Met Ser Ser His Gly Ser His Asp Gly Ala Ser Thr Glu Lys His Leu
1 5 10 15
Ala Thr His Asp Ile Ala Pro Thr His Asp Ala Ile Lys Ile Val Pro
20 25 30
Lys Gly His Gly Gln Thr Ala Thr Lys Pro Gly Ala Gln Glu Lys Glu
35 40 45
Val Arg Asn Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ile Lys Glu Ser Asn Ile Lys
50 55 60
Pro Trp Ser Lys Glu Ser Ile His Leu Tyr Phe Ala Ile Phe Val Ala
65 70 75 80
Phe Cys Cys Ala Cys Ala Asn Gly Tyr Asp Gly Ser Leu Met Thr Gly
85 90 95
Ile Ile Ala Met Asp Lys Phe Gln Asn Gln Phe His Thr Gly Asp Thr
100 105 110
Gly Pro Lys Val Ser Val Ile Phe Ser Leu Tyr Thr Val Gly Ala Met
115 120 125
Val Gly Ala Pro Phe Ala Ala Ile Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Lys
130 135 140
Lys Gly Met Phe Ile Gly Gly Ile Phe Ile Ile Val Gly Ser Ile Ile
145 150 155 160
Val Ala Ser Ser Ser Lys Leu Ala Gln Phe Val Val Gly Arg Phe Val
165 170 175
Leu Gly Leu Gly Ile Ala Ile Met Thr Val Ala Ala Pro Ala Tyr Ser
180 185 190
Ile Glu Ile Ala Pro Pro His Trp Arg Gly Arg Cys Thr Gly Phe Tyr
195 200 205
Asn Cys Gly Trp Phe Gly Gly Ser Ile Pro Ala Ala Cys Ile Thr Tyr
210 215 220
Gly Cys Tyr Phe Ile Lys Ser Asn Trp Ser Trp Arg Ile Pro Leu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Ala Phe Thr Cys Leu Ile Val Met Ser Ser Val Phe Phe Leu
245 250 255
Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Phe Ala Asn Gly Arg Asp Ala Glu Ala
260 265 270
Val Ala Phe Leu Val Lys Tyr His Gly Asn Gly Asp Pro Asn Ser Lys
275 280 285
Leu Val Leu Leu Glu Thr Glu Glu Met Arg Asp Gly Ile Arg Thr Asp
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Ser Gly Arg Trp Arg Met Ala Gln Val Leu Met Ile Ser Ile Phe Gly
325 330 335
Gln Phe Ser Gly Asn Gly Leu Gly Tyr Phe Asn Thr Val Ile Phe Lys
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Asn Ile Gly Val Thr Ser Thr Ser Gln Gln Leu Ala Tyr Asn Ile Leu
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Asn Ser Val Ile Ser Ala Ile Gly Ala Leu Thr Ala Val Ser Met Thr
370 375 380
Asp Arg Met Pro Arg Arg Ala Val Leu Ile Ile Gly Thr Phe Met Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Asn Ser Gly Leu Ser Ala Thr Leu Asp Lys
405 410 415
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Gln Asp Ala Lys Asp Asn Ala Tyr Leu His Val Asp Ser Asn Tyr Ala
435 440 445
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450 455 460
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Thr Ile Arg Gly Lys Gly Leu Ala Leu Ser Gly Phe Ile Val Asn Ala
485 490 495
Met Gly Phe Ile Asn Gln Phe Ala Gly Pro Ile Ala Leu His Asn Ile
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Gln Leu Glu Trp Val Tyr Asp Gln Pro Asn Pro Val Lys Ala Ser Leu
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Lys Val Glu Lys Val Val Val Gln Ala Asp Gly His Val Ser Glu Ala
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Ile Val Ala
<210> 16
<211> 5188
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 16
caggatattg ataacacctt taattttcaa gacgcctaat taaaaagcca tcatccatga 60
gcggaaacga gaagccgacg tcgcggatcg cgatcgtggg ggtgggccag gtgggcgcgg 120
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tcaggggatg caaaaagggg ctcacgcatg agaataatta attaggcgag acgaacgtcc 420
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catcccacat ttgacaaaaa tcgtcgatta atctctttcc atacaggccg tccgcgctct 1800
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<213> Myceliophthora thermophila
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<212> DNA
<213> 引物
<400> 18
tcatcttctg tggttgtggt ggtggtgg 28
<210> 19
<211> 525
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 19
Met Gly Ile Phe Asn Lys Lys Pro Val Ala Gln Ala Val Asp Leu Asn
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Gln Ile Gln Glu Glu Ala Pro Gln Phe Glu Arg Val Asp Trp Lys Lys
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Asp Pro Gly Leu Arg Lys Leu Tyr Phe Tyr Ala Phe Ile Leu Cys Ile
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Ala Ser Ala Thr Thr Gly Tyr Asp Gly Met Phe Phe Asn Ser Val Gln
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Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Tyr Gln Ile Gly Ser Ile Gly Ser Ile
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Ile Ile Gly Cys Val Ile Met Ile Val Gly Ala Val Leu Gln Ala Thr
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Ala Lys Asn Leu Asp Thr Phe Met Gly Gly Arg Thr Met Leu Gly Phe
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Gly Asn Ser Leu Ala Gln Ile Ala Ser Pro Met Leu Leu Thr Glu Leu
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Ala His Pro Gln His Arg Ala Arg Leu Thr Thr Ile Tyr Asn Cys Leu
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Trp Asn Val Gly Ala Leu Val Val Ser Trp Leu Ala Phe Gly Thr Asn
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Tyr Ile Asn Asn Asp Trp Ser Trp Arg Ile Pro Ala Leu Leu Gln Ala
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Phe Pro Ser Ile Ile Gln Leu Leu Gly Ile Trp Trp Val Pro Glu Ser
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Pro Arg Phe Leu Ile Ala Lys Asp Lys His Asp Glu Ala Leu His Ile
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Leu Ala Lys Tyr His Ala Asn Gly Asp Pro Asn His Pro Thr Val Gln
245 250 255
Phe Glu Phe Arg Glu Ile Lys Glu Thr Ile Arg Leu Glu Met Glu Ser
260 265 270
Thr Lys Asn Ser Ser Tyr Leu Asp Phe Phe Lys Ser Arg Gly Asn Arg
275 280 285
Tyr Arg Leu Ala Ile Leu Leu Ser Leu Gly Phe Phe Ser Gln Trp Ser
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Gly Asn Ala Ile Ile Ser Asn Tyr Ser Ser Lys Leu Tyr Glu Thr Ala
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Gly Val Thr Asp Ser Thr Ala Lys Leu Gly Leu Ser Ala Gly Gln Thr
325 330 335
Gly Leu Ala Leu Ile Val Ser Val Thr Met Ala Leu Leu Val Asp Lys
340 345 350
Leu Gly Arg Arg Leu Ala Phe Leu Ala Ser Thr Gly Gly Met Cys Gly
355 360 365
Thr Phe Val Ile Trp Thr Leu Thr Ala Gly Leu Tyr Gly Glu His Arg
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Leu Lys Gly Ala Asp Lys Ala Met Ile Phe Phe Ile Trp Val Phe Gly
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Met Ser Val Gln Cys Ala Leu Thr Leu Asn Thr Tyr Ala Asn Pro Val
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Ala Phe Asp Tyr Phe Gly Pro Asp His Ser Trp Lys Leu Tyr Leu Ile
450 455 460
Tyr Thr Cys Trp Ile Ala Ala Glu Phe Val Phe Val Phe Phe Met Tyr
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Val Glu Thr Lys Gly Pro Thr Leu Glu Glu Leu Ala Lys Val Ile Asp
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Gly Asp Glu Ala Asp Val Ala His Ile Asp Ile His Gln Val Glu Lys
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<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
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ccttgacctc ttcagttctc actttaacgt agttcgcgtt tgtctgtatg tcccagttgc 3120
atgtagttga gataaatacc cctggaagtg ggtctgggcc tttgtgggac ggagccctct 3180
ttctgtggtc tggagagccc gctctctacc gcctaccttc ttaccacagt acactactca 3240
cacattgctg aactgaccca tcatactcga cagaagatga tattgaagaa gcactttttg 3300
ggcttggctg gagctagtgg aggtcaacaa tgaatgccta ttttggttta gtcgtccagg 3360
cggtgagcac aaaatttgtg tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc 3420
agccccactt gtagcagtag cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa 3480
cgaggacatt attatcatct gctgcttggt gcacgataac ttggtgcgtt tgtcaagcaa 3540
ggtaagtgaa cgacccggtc ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat 3600
tcaatctgac ttacctattc tacccaagca aagcttcgat taggaagtaa ccatgagccc 3660
agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac 3720
catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc 3780
gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga 3840
ggtggactgc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta 3900
cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc caccagcgga cgggactggg 3960
ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt 4020
cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc 4080
cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt caagcacggg aactggcatg acgtgggttt 4140
ctggcagctg gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat 4200
ctgaacttaa cgttactgaa atcatcaaac agcttgacga atctggatat aagatcgttg 4260
gtgtcgatgt cagctccgga gttgagacaa atggtgttca ggatctcgat aagatacgtt 4320
catttgtcca agcagcaaag agtgccttct agtgatttaa tagctccatg tcaacaagaa 4380
taaaacgcgt ttcgggttta cctcttccag atacagctca tctgcaatgc attaatgcat 4440
tggacctcgc aaccctagta cgcccttcag gctccggcga agcagaagaa tagcttagca 4500
gagtctattt tcattttcgg gagacgagat caagcagatc aacggtcgtc aagagaccta 4560
cgagactgag gaatccgctc ttggctccac gcgactatat atttgtctct aattgtactt 4620
tgacatgctc ctcttcttta ctctgatagc ttgactatga aaattccgtc accagcccct 4680
gggttcgcaa agataattgc actgtttctt ccttgaactc tcaagcctac aggacacaca 4740
ttcatcgtag gtataaacct cgaaaatcat tcctactaag atgggtatac aatagtaacc 4800
atgcatggtt gcctagtgaa tgctccgtaa cacccaatac gccggccgaa acttttttac 4860
aactctccta tgagtcgttt acccagaatg cacaggtaca cttgtttaga ggtattccgg 4920
gacgtagtgc cccgcatcgc acgccacgcg cccgacacca tcctcgtcgt ggccaccaac 4980
ccggtcgacg tgctcacgca cgcggcccac cacctctccg gcttcccact cgagagggtg 5040
atcgggtccg gcacggccat ggacaccacc aggttccggc acgagctggg caagcacttt 5100
ggggtcaacc cgcggaacgt gcacgccatg atcgtgggcg agcacggcga cagccagctg 5160
cccgtgtggt cgctcgccac catctgcggg atgcggctgc acgactactg cagggcggcc 5220
cgcatggagc acgacgaggc cgcactcgag gcctgcgcca agcggaccag ggaggccgcc 5280
tacgagatca tccggcgcaa gggcaagacc aactacggcg tcgcctcggt gctcgtcagc 5340
atcctgcagc ccatcgtcac cgacagcgac gccatcatga cggtctcgag ggtcggcacg 5400
tacgccggaa tccaggacgt ggccctcagc atgccctgca agctgaaccg gcatggcgcg 5460
taccaggacg tgcccctact cctcagcgag ttggag 5496
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 21
accacaacca cagaagatga tattgaagga g 31
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物
<400> 22
gtcttcttct gaaagaagga ttacctctaa ac 32
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物
<400> 23
tccttctttc agaagaagac gttcgaggtc 30
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 24
tccatgtgcg acgagagggc ggc 23
<210> 25
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 25
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgctgct ccttgatagg 480
ttaggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 26
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 26
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgacttg gttacctgct 480
ccgtgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 27
<211> 2197
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 27
agtttatgtg gaaaatggca tttgaaatga ggggtattcg gaatctaggg cgtttgctac 60
tgcgattaga tgacgtcagg tgtctgttct cgcgaaatac atataatctc ctcggttaga 120
tttgttcagg agaaagatga tggtgccaaa ctctacagtt taggcttctc taccgaggaa 180
agagaatgag aggtcggacc accagcgtgc taacaggacg agacttgagc caatttgtca 240
atagacaaga tagtctcgtg tgccaagcca acatcatcat ccgatctcag ctgagcccct 300
ccttctgaaa agagtataat tacagcagct tcagacgttg aggcatcact gttgctgccg 360
cacgtcagtc aaccacttaa tccgctctgt gtgaccggtg acggattcga tcattctacg 420
atccgctccg catcgccggt taaagggggt gacgagttat ttattacctt tacggattca 480
agatgcctca gccaaacgca gcagatgtca aggtcagtga agaggattgt ttcgaattac 540
tcagaaatga aacacctgct tacctaggta cacgttctca tgctccgccc aacggatagt 600
catattgaag gagcactttt tgggcttggc tggagctagt ggaggtcaac aatgaatgcc 660
tattttggtt tagtcgtcca ggcggtgagc acaaaatttg tgtcgtttga caagatggtt 720
catttaggca actggtcaga tcagccccac ttgtagcagt agcggcggcg ctcgaagtgt 780
gactcttatt agcagacagg aacgaggaca ttattatcat ctgctgcttg gtgcacgata 840
acttggtgcg tttgtcaagc aaggtaagtg aacgacccgg tcataccttc ttaagttcgc 900
ccttcctccc tttatttcag attcaatctg acttacctat tctacccaag caaagcttcg 960
attaggaagt aaccatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg 1020
cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact 1080
tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc 1140
gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc 1200
cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc 1260
gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg 1320
cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca 1380
tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg 1440
ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc 1500
cggtcctgcc cgtcaccgag atctgatccg tcgacctgca gatcgttcaa acatttggca 1560
ataaagtttc ttaagattga atcctgtact agtgatccgt cggcgactac gaggactgcg 1620
cccacgcggc ggcggtcatc atcacggcgg gcgtcaacca aaagcccggc cagacgcgcc 1680
tcgacctcgt caagaccaac tacgcgctat tccgggacgt agtgccccgc atcgcacgcc 1740
acgcgcccga caccatcctc gtcgtggcca ccaacccggt cgacgtgctc acgcacgcgg 1800
cccaccacct ctccggcttc ccactcgaga gggtgatcgg gtccggcacg gccatggaca 1860
ccaccaggtt ccggcacgag ctgggcaagc actttggggt caacccgcgg aacgtgcacg 1920
ccatgatcgt gggcgagcac ggcgacagcc agctgcccgt gtggtcgctc gccaccatct 1980
gcgggatgcg gctgcacgac tactgcaggg cggcccgcat ggagcacgac gaggccgcac 2040
tcgaggcctg cgccaagcgg accagggagg ccgcctacga gatcatccgg cgcaagggca 2100
agaccaacta cggcgtcgcc tcggtgctcg tcagcatcct gcagcccatc gtcaccgaca 2160
gcgacgccat catgacggtc tcgagggtcg gcacgta 2197
<210> 28
<211> 1200
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 28
cctgactgta taagagaaat ggcctcccct cggagtctga gcgcttcctt tcctttatct 60
gcagactttt cagtcatttc atcttcttta tcctaaggtt ttctgccaac tcgtattaag 120
gcccttgccg ttgttaagaa cacacgtcat catctcgtct tcgactgcct ttcctattgc 180
accgagattc tgagccgtcg atcatctatc tctctttcga cttccttctt caaccctcaa 240
cctactcaac acatcctacc ttccaaaatg gcgcaaagga atgcccccaa gaaggccgtc 300
cacttcggtg ctggaaacat cggtatgaat cctcttggga gattggcatc gacgaccgac 360
cttgactgac cgtgatgatt tccaggtcgt ggcttcgtcg cctgcttttt gcacaattca 420
ggctacgagg tcgtcttctc tgaggttaac gacgcaactg tatccaagct caactcccaa 480
aagagctatc gggtgattga agtcggcgcc gacgggacgt cggagtccat tatcaccaat 540
taccgcgcca tcaactcgag gacccacgag gccgaactgg ttcgggaaat tgccacggcg 600
ggagcttact ccggtcgctg tcattgcctg cgagaacgcc atcggggcca ccgatactct 660
tgctggtttc atcaagtcgc cagagaacac caatcctgac cggcttgccg actacgataa 720
gcgtgctcgg ttcgccaact ccgccatcga ccgcatcgtc cccgcacagg accccaacgc 780
cggtctcgac gttaggctcg agaagttcta cgagtgggtg gtagacagca ccccatttgc 840
cgaccatgcc ccccccgaca tcaagggtgt tcgctgggtg aacaacctgc agcccttcat 900
cgagcgcaag ctgtacacgg tcaacacggg ccacgccacg gccgcgtacc acggctacat 960
ccggcgtaag agcaccgtct acgacgcgct gcaagaccgc gagattcaag aagaggtcaa 1020
gaaggcgctg cagaacacgg ccgacctcat cacgcagaag cacggcatct cgcacgagga 1080
gcagcaggcc tacgtcgaga agattgtccg ccgtatcggc aatcctcacc tcgaggacgc 1140
cgtcgagcgc gtcggccgcg ccccgttgcg caagctcagc cgtaaggaac gcttcattgg 1200
<210> 29
<211> 6134
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5718)..(5718)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5926)..(5926)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6017)..(6017)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 29
tcctccgagg ttcgacatca gggttcgtca tagggagtga aacacccgcc atgattccgt 60
agccgcgcgc gaagatacga agcagatatt tcacggacat ggcggagata cttgtttccc 120
gtactaaggt agtcatgtcg gagacatctg aacgacagag ctggccaaga gaaccgacca 180
gttgccccag gacgatctag acaaaaaaaa agagagatga gtgggccact tttgccacaa 240
catcgacggc cctgcgaccg cccccaggca aacaaacaaa ccgccgaaca ataatacttt 300
tgtcatttta ggaggagcgt tgtatggata aaaacaacat ctcgttgctg cagaatgtgg 360
acttcaaact tgcagaaaat gggaggcgga tttgcatgat cggagggtag ttgactcacg 420
ccgcaggctg caaatccgtc ctccattatt ccatgaacaa cttcgtaagg ttgggctgag 480
cgccaatgcc taacggaccg ggggccacag cgcaacgtcc cacttaaagg ccagcgtgac 540
atgccagttc cataccaagt agtggcacca gaggcggcca atgctcagta agggcaggga 600
gggaggctca aacgattggc aaaaagaggg gcttgccagt tcagttccct gtgcgagcgc 660
gagaggggca gtttcaaatc tggaggggtg tgttgcgctg gtctgaagag aaagagaaga 720
ctgtacttaa taattgttca aagagtccat catcgcgttg cggactcctc tagctgtatt 780
tagagcccta tcattacttg tcgggtgcga atcaaaatac cgggatgcag ccctctggcg 840
atttgcatgc ggttgtggag gaagtgaagc ctgaatcgcg gggctgggcg gcaaagcacg 900
acgtgaaatt cctggcgaaa ttcgagggct tgccccaccg tggttgaagt ttttgtgctg 960
cgtaacccca ccaacccgcc ttgcccctcc cgcctgccca taaaaacttc gacccctcct 1020
caaatcttct tcgattcttc ctcttcactt ccttcgtcgg catacctgat tcaagcaatc 1080
acctgccact ttcaagtgcg tataccatca tcgatacact ggttcttgac aagtacatcg 1140
tctctaactt tcctttttgc agttttcatt aagcgcaagt cgccagtttc gttcttcaga 1200
aagcttatgg actacaagga ccatgatggc gattacaagg accacgacat cgattataag 1260
gatgatgatg acaagcctcc gaggaaacgt gccaaaacag aagatgagat ggataagaag 1320
tactccatcg gcctcgacat cggcaccaac tccgtcggct gggccgtcat caccgatgag 1380
tacaaggtcc cttccaagaa gttcaaggtc ctcggcaaca ccgatcgcca ttccatcaag 1440
aagaacctga tcggcgccct cctgttcgat tccggcgaaa ccgccgaggc cacccgcctt 1500
aaacgcaccg cccgtcgccg ctacacccgc cgcaagaacc gcatctgcta cctccaagaa 1560
atcttctcca acgagatggc caaggtcgat gatagcttct tccaccgcct cgaagagtcc 1620
ttcctggtcg aagaggataa gaagcacgag cgccatccta tcttcggcaa catcgtcgat 1680
gaggtcgcct accatgagaa gtaccctacc atctaccatc tccgcaagaa gctcgtcgat 1740
tccaccgata aggccgatct ccgcctcatc tacctcgccc tcgcccatat gatcaagttc 1800
cgcggccatt tcctcatcga gggcgatctc aaccctgata actccgatgt cgataagctg 1860
ttcatccagc tcgtccagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccctat caacgcctcc 1920
ggcgtcgatg ccaaggccat cctctccgct cgcctctcca agtctcgccg ccttgagaac 1980
cttatcgccc agctccctgg cgagaagaag aacggcctct tcggcaacct gatcgccctc 2040
tccctcggcc tcacccctaa cttcaagtcc aacttcgatc tcgccgagga tgccaagctc 2100
cagctctcca aggataccta cgatgatgat ctcgataacc tcctcgccca gatcggcgat 2160
cagtacgccg atctgttcct cgccgccaag aacctctccg atgccatcct cctctccgac 2220
atcctccgcg tcaacaccga gatcaccaag gcccctctgt ccgcctccat gatcaagcgc 2280
tacgatgagc atcatcagga cctcaccctg ctcaaggccc tcgtccgcca gcagctccct 2340
gagaagtaca aagagatttt cttcgatcag tccaagaacg gctacgccgg ctacatcgat 2400
ggcggcgctt cccaagaaga gttctacaag ttcatcaagc ctatccttga gaagatggat 2460
ggcaccgagg aactcctcgt caagctcaac cgcgaggacc tcctccgcaa gcagcgcacc 2520
ttcgataacg gctccatccc tcatcaaatc catctcggcg agctgcatgc catcttgcgc 2580
cgccaagagg atttctaccc attcctcaag gataaccgcg agaagatcga aaagattctc 2640
accttccgca tcccttacta cgtcggccct ctcgctcgcg gcaactcccg cttcgcctgg 2700
atgacccgca agtccgagga aaccatcacc ccttggaact tcgaggaagt cgtcgataag 2760
ggcgcctccg cccagtcctt catcgagcgc atgaccaact tcgataagaa cctccctaac 2820
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accaaggtca agtacgtcac cgagggtatg cgcaagcctg ccttcctgtc cggcgagcag 2940
aagaaggcca tcgtcgatct gctgttcaag accaaccgca aggtcaccgt caagcagctc 3000
aaagaggatt acttcaagaa aatcgagtgc ttcgattccg tcgagatcag cggcgtcgag 3060
gaccgcttca acgcctccct cggaacctac catgatctcc tcaagattat caaggataag 3120
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ctcttcgagg accgcgaaat gatcgaggaa cgcctcaaga cctacgccca tctcttcgat 3240
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tccgatggct tcgccaaccg caacttcatg cagctcatcc atgatgattc cctcaccttc 3420
aaagaggaca tccagaaggc ccaggtcagc ggccagggcg attccctcca tgagcatatc 3480
gccaacctcg ccggctcccc tgccatcaag aagggcatcc tccagaccgt caaggtcgtc 3540
gatgagctgg tcaaggtcat gggccgccat aagcctgaga acatcgtcat cgagatggcc 3600
cgcgagaacc agaccaccca gaagggccag aagaactccc gcgagcgcat gaagcgcatc 3660
gaggaaggca tcaaagagct gggcagccaa atcctcaaag agcatcctgt cgagaacacc 3720
cagctccaga acgagaagct ctacctctac tacctccaga acggccgcga tatgtacgtc 3780
gatcaagagc tggacatcaa ccgcctctcc gattacgatg tcgatcatat cgtccctcag 3840
tccttcctga aggatgattc catcgataac aaggtcctca cccgctccga taagaaccgc 3900
ggcaagtccg ataacgtccc ttccgaagag gtcgtcaaga agatgaagaa ctactggcgc 3960
cagctcctca acgccaagct catcacccag cgcaagttcg ataacctcac caaggccgag 4020
cgcggtggcc tctccgagct ggataaggcc ggcttcatca agcgccagct cgtcgaaacc 4080
cgccagatca ccaagcacgt cgcccaaatc ctcgattccc gcatgaacac caagtacgat 4140
gagaacgata agctcatccg cgaagtcaag gtcatcaccc tcaagtccaa gctcgtcagc 4200
gatttccgca aggatttcca gttctacaag gtccgcgaga tcaacaacta ccatcatgcc 4260
catgatgcct acctcaacgc cgtcgtcggc accgccctca tcaagaagta ccccaagctc 4320
gaatccgagt tcgtctacgg tgattacaag gtctacgatg tccgcaagat gatcgccaag 4380
tccgagcaag agatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctactccaa catcatgaat 4440
ttcttcaaga ccgaaatcac cctcgccaac ggcgaaatcc gcaagcgccc tctcatcgag 4500
actaacggcg agactggcga gatcgtctgg gataagggcc gcgatttcgc caccgtccgc 4560
aaggtcctct ccatgcctca ggtcaacatc gtcaagaaaa ccgaggtcca gaccggcggc 4620
ttctccaaag agtccatcct ccccaagcgc aactccgata agctgatcgc ccgcaagaag 4680
gattgggacc ctaagaagta cggcggcttc gattccccta ccgtcgccta ctccgtcctc 4740
gtcgtcgcca aggtcgagaa gggcaagtcc aagaagctca agtccgtcaa agagctgctc 4800
ggcatcacta ttatggaacg ctccagcttc gagaagaacc ctatcgattt ccttgaggcc 4860
aagggctaca aagaggtcaa gaaggacctc atcatcaagc tccccaagta ctccctgttc 4920
gagcttgaga acggccgcaa gcgcatgctc gcctccgccg gtgagcttca gaagggcaac 4980
gagctggccc tgccttccaa gtacgtcaac ttcctctacc tcgcctccca ttacgagaag 5040
ctcaagggct cccctgagga taacgagcag aagcagctgt tcgtcgagca gcataagcac 5100
tacctcgatg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agcgcgtcat cctcgccgat 5160
gccaacctcg ataaggtcct gtccgcctac aacaagcacc gcgataagcc tatccgcgag 5220
caggccgaga acatcatcca tctcttcacc ctcaccaacc tcggtgcccc tgccgccttc 5280
aagtacttcg ataccaccat cgatcgcaag cgctacacct ccaccaaaga ggtcctggac 5340
gccaccctca tccatcagtc catcaccggc ctctacgaaa cccgcatcga tctctcccag 5400
ctcggcggcg accctccgag gaaacgtgcc aaaacagaag atgagtgatg aggatccact 5460
taacgttact gaaatcatca aacagcttga cgaatctgga tataagatcg ttggtgtcga 5520
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ccaagcagca aagagtgcct tctagtgatt taatagctcc atgtcaacaa gaataaaacg 5640
cgttttcggg tttacctctt ccagatacag ctcatctgca atgcattaat gcattgactg 5700
caacctagta acgccttnca ggctccggcg aagagaagaa tagcttagca gagctatttt 5760
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aatccgctct tggctccacg cgactatata tttgtctcta attgtacttt gacatgctcc 5880
tcttctttac tctgatagct tgactatgaa aattccgtca ccagcncctg ggttcgcaaa 5940
gataattgca tgtttcttcc ttgaactctc aagcctacag gacacacatt catcgtaggt 6000
ataaacctcg aaatcanttc ctactaagat ggtatacaat agtaaccatg catggttgcc 6060
tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact tttttacaac tctcctatga 6120
gtcgtttacc caga 6134
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物
<400> 30
tctgcagatc tttaattaac tcgagccaca tcatgtaaac agag 44
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物
<400> 31
ggatagacat cttgttgttg ttgttgtg 28
<210> 32
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 32
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcggctac ctgcccgcca 480
acgagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 33
<211> 2373
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 33
gggtggtgtg catggggccg tctcggcggg gtgtgtgaac gcggggcaga actgagtgtt 60
cccgcggttc gacgggcctt caaagcaagc tgccccacga ccccgccaac tctctgagca 120
tgacttaggt acttaagcta ccaaagcttc gagtctgcaa catcgtgacc ttccaacttt 180
cccagcgact tacttgtttc aaccattgca tcactttcca ggtcagtgct ccagtctaat 240
attcgcactc tgcgaactcc aattgcattt ttacaatcga gagctgaccc tcagactgcg 300
agacgtcaac agttccccca cgatcctccg ctgcctccga tcctaactcc aactccaaac 360
aaaatggtca aagctggtaa gcacacgacg ccatcttctg ggcgatgtag gcatcaactg 420
gtctgacatt gttcctaaac agtcgttgct ggcgcctccg gcggtattgg acaggttcgt 480
atgccctcaa gctctctgga gccagcccgc tgacgccatc ggtaccccgc agccgctgtc 540
gctgctcctg aagctctctc cgctcgtcag cgagctcgca ctctacgatg ttgtcaacac 600
ccccggtgtt gcgaccgacc tgtcgcacat ttcatccaac gccgtaagtg gaaaagccgt 660
taaacccggc agcgttctca gacccggctg accctgctgc atattgaagg agcacttttt 720
gggcttggct ggagctagtg gaggtcaaca atgaatgcct attttggttt agtcgtccag 780
gcggtgagca caaaatttgt gtcgtttgac aagatggttc atttaggcaa ctggtcagat 840
cagccccact tgtagcagta gcggcggcgc tcgaagtgtg actcttatta gcagacagga 900
acgaggacat tattatcatc tgctgcttgg tgcacgataa cttggtgcgt ttgtcaagca 960
aggtaagtga acgacccggt cataccttct taagttcgcc cttcctccct ttatttcaga 1020
ttcaatctga cttacctatt ctacccaagc aaagcttcga ttaggaagta accatgagcc 1080
cagaacgacg cccggccgac atccgccgtg ccaccgaggc ggacatgccg gcggtctgca 1140
ccatcgtcaa ccactacatc gagacaagca cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac 1200
cgcaggagtg gacggacgac ctcgtccgtc tgcgggagcg ctatccctgg ctcgtcgccg 1260
aggtggacgg cgaggtcgcc ggcatcgcct acgcgggccc ctggaaggca cgcaacgcct 1320
acgactggac ggccgagtcg accgtgtacg tctccccccg ccaccagcgg acgggactgg 1380
gctccacgct ctacacccac ctgctgaagt ccctggaggc acagggcttc aagagcgtgg 1440
tcgctgtcat cgggctgccc aacgacccga gcgtgcgcat gcacgaggcg ctcggatatg 1500
ccccccgcgg catgctgcgg gcggccggct tcaagcacgg gaactggcat gacgtgggtt 1560
tctggcagct ggacttcagc ctgccggtac cgccccgtcc ggtcctgccc gtcaccgaga 1620
tctgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taaaagcccg 1680
gcatgacccg tgatgacctc ttcaacatca acgccggcat cgtgaagggc ctcattgagg 1740
tggccgccga ggtcgccccc aaggccttca tcctggttat ttccaacccc gtcaactcga 1800
ccgtccccat ctcggccgag gtgctcaagg ccaagggcgt cttcaacccc cagcgcctct 1860
tcggtgtcac caccctcgac attgtccgtg ccgagacctt cgttgccgag attgccggca 1920
agagcaaccc ccaggagttg actgtccccg tcgttggcgg tcactccggc gagaccattg 1980
ttccgctttt cagcaagatc gctccgtctg tcacgattcc ggacgacaag tacgacgctc 2040
ttgtcaaccg cgtccagttc ggtggtgatg aggttgtcaa ggccaaggac ggcgctggtt 2100
ctgccacact ttcgatggcg tatgctggtt acaggtaagc gccagacagt aaccaccctt 2160
cgacttctat ttttgctaac cgctatcaag gttcgccgag aagctcctca aggccgccgc 2220
gggcgtcaag ggcctcgttg aaccaagcta cgtctacctt cccggcatcc caggtggcaa 2280
ggagattgcc gagaagaccg gtgtcgagtt cttctccgtt cccatcgagc ttggcgtaag 2340
tcacaaagag gatagaggaa gagcttcagt acg 2373
<210> 34
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 34
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcggagaa tgtcacaatc 480
cccggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 35
<211> 1400
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 35
tgggacggcg agagcgacgg gttttggccg aggtgggcgg gttcgtcaac ggccttggcg 60
ctgaacgact gaaggcggtc aatgttttct gccgcccctt gcgtcatggc tcgcagaatg 120
ggccaacgga atttcgtacc aggaggaaaa tttccttgtt tggcggaaaa ccgccgggag 180
ggggtcgtct gatgaaccac gaggcgatgc acccagaagg ctgcacaggt agagcgtttt 240
tgcctacata gctgtgttca gttttcttga gtttgctgtg taagggtcca ggatggtacg 300
gggcgggctt ttgcggccgc ccctactgcc cacataccag agcagcggtg caattttgtc 360
ggcgttttcc tgcgacccat cgtccctccc cagcgtcaga caccggtcac cgcctgcctt 420
tttttctacg cccaacgtga cccatttcca ccacaggcct acccacttaa gaggctgcac 480
gttccgactg cccaagccca aaccttgtca gccaagtcgg ttcttcatat gccaagcgtc 540
tcaccgtccc aatctttctt cctgctctcg tccgaagtct ttgccggcaa tccgtggccg 600
ctctctcaaa cagacaaact cggctcccgc tctcattccc cctcgcagca tccgtctgtt 660
atcgcacaca gcaaaaatgg cacgatccac agactctgcc ttctcgacgc cgtcagggac 720
tcttccattc ttatcttcaa cctcccgcac gagttcatcg gcaacatttg caagcaaatc 780
aagggtcata tcctcccctt tgcccgggga atcagctgca tcaagggggt aacagtgacg 840
gaggacaagg tcgagctgat ttgcgagtat attggcgaga cgctgggtat ttactgcggc 900
gccctgagcg gggccaacat tgccaatgag atcgccaacg agctatggtg cgagacgacc 960
atcgcataca acgtaccacc gtgcgactcg cggggcgaga acggcgagag cggcgtcaat 1020
ggagagcact atcgtgacgc gcgcggtgca atcagcaaaa cgcagctcgc tcccgtacct 1080
caggagtacc cgccagtgga ccatgacgtg ctccacaagc tctttaaccg gccttatttt 1140
accgtctcca tggtgtcgga cgtggttggt gtctcgctcg ccggtgcgct caagaacatc 1200
gttgcgctcg cctgcggctt cattgaaggt cacggttgga acatgacggc taagacggcc 1260
gttatgcgcc gtggcatgct ggagacgatt cagttctgcc aagaattctt ccccgagacg 1320
gtcgacgaga tgacgttctg ggagagcgcc ggctggagcg acatgattgt gagctgcacc 1380
tcggcacgca actggcgcta 1400
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 36
caacaacaag atgtctatcc cagaaactc 29
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> 引物
<400> 37
gatttcagta acgttaagtg gatccttatt tagaagtgtc aacaacg 47
<210> 38
<211> 4227
<212> DNA
<213> 人工合成片段
<400> 38
aaggttgata agaagtactc catcggcctc gccatcggca ccaactccgt cggctgggcc 60
gtcatcaccg atgagtacaa ggtcccttcc aagaagttca aggtcctcgg caacaccgat 120
cgccattcca tcaagaagaa cctgatcggc gccctcctgt tcgattccgg cgaaaccgcc 180
gaggccaccc gccttaaacg caccgcccgt cgccgctaca cccgccgcaa gaaccgcatc 240
tgctacctcc aagaaatctt ctccaacgag atggccaagg tcgatgatag cttcttccac 300
cgcctcgaag agtccttcct ggtcgaagag gataagaagc acgagcgcca tcctatcttc 360
ggcaacatcg tcgatgaggt cgcctaccat gagaagtacc ctaccatcta ccatctccgc 420
aagaagctcg tcgattccac cgataaggcc gatctccgcc tcatctacct cgccctcgcc 480
catatgatca agttccgcgg ccatttcctc atcgagggcg atctcaaccc tgataactcc 540
gatgtcgata agctgttcat ccagctcgtc cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac 600
cctatcaacg cctccggcgt cgatgccaag gccatcctct ccgctcgcct ctccaagtct 660
cgccgccttg agaaccttat cgcccagctc cctggcgaga agaagaacgg cctcttcggc 720
aacctgatcg ccctctccct cggcctcacc cctaacttca agtccaactt cgatctcgcc 780
gaggatgcca agctccagct ctccaaggat acctacgatg atgatctcga taacctcctc 840
gcccagatcg gcgatcagta cgccgatctg ttcctcgccg ccaagaacct ctccgatgcc 900
atcctcctct ccgacatcct ccgcgtcaac accgagatca ccaaggcccc tctgtccgcc 960
tccatgatca agcgctacga tgagcatcat caggacctca ccctgctcaa ggccctcgtc 1020
cgccagcagc tccctgagaa gtacaaagag attttcttcg atcagtccaa gaacggctac 1080
gccggctaca tcgatggcgg cgcttcccaa gaagagttct acaagttcat caagcctatc 1140
cttgagaaga tggatggcac cgaggaactc ctcgtcaagc tcaaccgcga ggacctcctc 1200
cgcaagcagc gcaccttcga taacggctcc atccctcatc aaatccatct cggcgagctg 1260
catgccatct tgcgccgcca agaggatttc tacccattcc tcaaggataa ccgcgagaag 1320
atcgaaaaga ttctcacctt ccgcatccct tactacgtcg gccctctcgc tcgcggcaac 1380
tcccgcttcg cctggatgac ccgcaagtcc gaggaaacca tcaccccttg gaacttcgag 1440
gaagtcgtcg ataagggcgc ctccgcccag tccttcatcg agcgcatgac caacttcgat 1500
aagaacctcc ctaacgagaa ggtcctccct aagcactccc tgctctacga gtacttcacc 1560
gtctacaacg agctgaccaa ggtcaagtac gtcaccgagg gtatgcgcaa gcctgccttc 1620
ctgtccggcg agcagaagaa ggccatcgtc gatctgctgt tcaagaccaa ccgcaaggtc 1680
accgtcaagc agctcaaaga ggattacttc aagaaaatcg agtgcttcga ttccgtcgag 1740
atcagcggcg tcgaggaccg cttcaacgcc tccctcggaa cctaccatga tctcctcaag 1800
attatcaagg ataaggattt cctcgacaac gaggaaaacg aggacatcct tgaggacatc 1860
gtcctcaccc tcaccctctt cgaggaccgc gaaatgatcg aggaacgcct caagacctac 1920
gcccatctct tcgatgataa ggtcatgaag cagctcaagc gccgtcgcta caccggctgg 1980
ggtcgcctct cccgcaagct catcaacggc atccgcgata agcagtccgg caagactatc 2040
ctcgatttcc tcaagtccga tggcttcgcc aaccgcaact tcatgcagct catccatgat 2100
gattccctca ccttcaaaga ggacatccag aaggcccagg tcagcggcca gggcgattcc 2160
ctccatgagc atatcgccaa cctcgccggc tcccctgcca tcaagaaggg catcctccag 2220
accgtcaagg tcgtcgatga gctggtcaag gtcatgggcc gccataagcc tgagaacatc 2280
gtcatcgaga tggcccgcga gaaccagacc acccagaagg gccagaagaa ctcccgcgag 2340
cgcatgaagc gcatcgagga aggcatcaaa gagctgggca gccaaatcct caaagagcat 2400
cctgtcgaga acacccagct ccagaacgag aagctctacc tctactacct ccagaacggc 2460
cgcgatatgt acgtcgatca agagctggac atcaaccgcc tctccgatta cgatgtcgat 2520
gctatcgtcc ctcagtcctt cctgaaggat gattccatcg ataacaaggt cctcacccgc 2580
tccgataaga accgcggcaa gtccgataac gtcccttccg aagaggtcgt caagaagatg 2640
aagaactact ggcgccagct cctcaacgcc aagctcatca cccagcgcaa gttcgataac 2700
ctcaccaagg ccgagcgcgg tggcctctcc gagctggata aggccggctt catcaagcgc 2760
cagctcgtcg aaacccgcca gatcaccaag cacgtcgccc aaatcctcga ttcccgcatg 2820
aacaccaagt acgatgagaa cgataagctc atccgcgaag tcaaggtcat caccctcaag 2880
tccaagctcg tcagcgattt ccgcaaggat ttccagttct acaaggtccg cgagatcaac 2940
aactaccatc atgcccatga tgcctacctc aacgccgtcg tcggcaccgc cctcatcaag 3000
aagtacccca agctcgaatc cgagttcgtc tacggtgatt acaaggtcta cgatgtccgc 3060
aagatgatcg ccaagtccga gcaagagatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac 3120
tccaacatca tgaatttctt caagaccgaa atcaccctcg ccaacggcga aatccgcaag 3180
cgccctctca tcgagactaa cggcgagact ggcgagatcg tctgggataa gggccgcgat 3240
ttcgccaccg tccgcaaggt cctctccatg cctcaggtca acatcgtcaa gaaaaccgag 3300
gtccagaccg gcggcttctc caaagagtcc atcctcccca agcgcaactc cgataagctg 3360
atcgcccgca agaaggattg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgattc ccctaccgtc 3420
gcctactccg tcctcgtcgt cgccaaggtc gagaagggca agtccaagaa gctcaagtcc 3480
gtcaaagagc tgctcggcat cactattatg gaacgctcca gcttcgagaa gaaccctatc 3540
gatttccttg aggccaaggg ctacaaagag gtcaagaagg acctcatcat caagctcccc 3600
aagtactccc tgttcgagct tgagaacggc cgcaagcgca tgctcgcctc cgccggtgag 3660
cttcagaagg gcaacgagct ggccctgcct tccaagtacg tcaacttcct ctacctcgcc 3720
tcccattacg agaagctcaa gggctcccct gaggataacg agcagaagca gctgttcgtc 3780
gagcagcata agcactacct cgatgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagcgc 3840
gtcatcctcg ccgatgccaa cctcgataag gtcctgtccg cctacaacaa gcaccgcgat 3900
aagcctatcc gcgagcaggc cgagaacatc atccatctct tcaccctcac caacctcggt 3960
gcccctgccg ccttcaagta cttcgatacc accatcgatc gcaagcgcta cacctccacc 4020
aaagaggtcc tggacgccac cctcatccat cagtccatca ccggcctcta cgaaacccgc 4080
atcgatctct cccagctcgg cggcgaccct ccgaggaaac gtgccaaaac agaagatgag 4140
agcgctggag gaggtggaag cggaggagga ggaagcggag gaggaggtag cggacctaag 4200
aaaaagagga aggtggcggc cgcttaa 4227
<210> 39
<211> 1408
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 39
Met Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser
1 5 10 15
Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys
20 25 30
Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu
35 40 45
Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg
50 55 60
Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile
65 70 75 80
Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp
85 90 95
Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys
100 105 110
Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala
115 120 125
Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val
130 135 140
Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala
145 150 155 160
His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn
165 170 175
Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr
180 185 190
Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp
195 200 205
Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu
210 215 220
Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn
245 250 255
Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr
260 265 270
Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
275 280 285
Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu
325 330 335
Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe
340 345 350
Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala
355 360 365
Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met
370 375 380
Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu
385 390 395 400
Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His
405 410 415
Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro
420 425 430
Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg
435 440 445
Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala
450 455 460
Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu
465 470 475 480
Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met
485 490 495
Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His
500 505 510
Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val
515 520 525
Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu
530 535 540
Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val
545 550 555 560
Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe
565 570 575
Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu
580 585 590
Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu
595 600 605
Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu
610 615 620
Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr
625 630 635 640
Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg
645 650 655
Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg
660 665 670
Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly
675 680 685
Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr
690 695 700
Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser
705 710 715 720
Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys
725 730 735
Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met
740 745 750
Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn
755 760 765
Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg
770 775 780
Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His
785 790 795 800
Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr
805 810 815
Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn
820 825 830
Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu
835 840 845
Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn
850 855 860
Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met
865 870 875 880
Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg
885 890 895
Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu
900 905 910
Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile
915 920 925
Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr
930 935 940
Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys
945 950 955 960
Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val
965 970 975
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
980 985 990
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu
995 1000 1005
Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile
1010 1015 1020
Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe
1025 1030 1035
Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu
1040 1045 1050
Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly
1055 1060 1065
Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr
1070 1075 1080
Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys
1085 1090 1095
Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro
1100 1105 1110
Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp
1115 1120 1125
Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser
1130 1135 1140
Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu
1145 1150 1155
Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser
1160 1165 1170
Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr
1175 1180 1185
Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser
1190 1195 1200
Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala
1205 1210 1215
Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1220 1225 1230
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly
1235 1240 1245
Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His
1250 1255 1260
Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser
1265 1270 1275
Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser
1280 1285 1290
Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu
1295 1300 1305
Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala
1310 1315 1320
Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr
1325 1330 1335
Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile
1340 1345 1350
Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly
1355 1360 1365
Asp Pro Pro Arg Lys Arg Ala Lys Thr Glu Asp Glu Ser Ala Gly
1370 1375 1380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1385 1390 1395
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala
1400 1405
<210> 40
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 40
atggatgcta agtcactaac tgcctggtcc cggacactgg tgaccttcaa ggatgtattt 60
gtggacttca ccagggagga gtggaagctg ctggacactg ctcagcagat cgtgtacaga 120
aatgtgatgc tggagaacta taagaacctg gtttccttgg gttatcagct tactaagcca 180
gatgtgatcc tccggttgga gaagggagaa gagccctggc tggtggagag agaaattcac 240
caagagaccc atcctgattc agagactgca tga 273
<210> 41
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Met Asp Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr Phe
1 5 10 15
Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Gln Gln Ile Val Tyr Arg Asn Val Met Leu Glu Asn Tyr Lys
35 40 45
Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu
50 55 60
Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp Leu Val Glu Arg Glu Ile His
65 70 75 80
Gln Glu Thr His Pro Asp Ser Glu Thr Ala
85 90
<210> 42
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 42
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgggctc agcacaaagt 480
ctgggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 43
gcagatctca tgtaccttga cgtcctccga g 31
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物
<400> 44
aaacactagt tctgaagaac gaaactggcg act 33
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 45
tttaaacgat atcgaattcg agcatacaat caactatctc 40
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物
<400> 46
gatttcagta acgttaagtg ctttaaaatt tgtatacac 39
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 47
aagaggagtc caccatggta ctcgacagaa gatgatattg 40
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物
<400> 48
aacgttaagt tcagatctcg gtgacggg 28
<210> 49
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物
<400> 49
cgagatctga acttaacgtt actgaaatca tc 32
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 50
gctagcgtta acactagtca cctctaaaca agtgtacc 38
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 51
agccatggag aggtttagca cgaacctctc tgaaggag 38
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 52
gtatgatggg tcagttcag 19
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 53
gctagcgtta acactagtca cctctaaaca agtgtacc 38
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物
<400> 54
atgggtctct tctcgaaa 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物
<400> 55
ctaaacctct ccatggct 18
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 56
aagaggagtc caccatggta cttgcatcgt cccaaagc 38
<210> 57
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 57
tttcgagaag agacccattt tgatttctgt gatgtggg 38
<210> 58
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 58
tcacagaaat caaaactaga atgtcgtctc acggctc 37
<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 59
ttaagtggat ccgaattcga tatcctaagc aacgatagct tcggac 46
<210> 60
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 60
aagaggagtc caccatggta caggatattg ataacacc 38
<210> 61
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 61
cgatctctag aagtcctcgt cccgagccaa acacttgg 38
<210> 62
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 62
caggtacact tgtttagagg ccgctggaca ggttcgtg 38
<210> 63
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 63
gctagcgtta acactagtca gcccatctgt tgttaacc 38
<210> 64
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 64
acgaggactt ctagagatcg ttgcatcgtc ccaaagc 37
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 65
cctctaaaca agtgtacctg 20
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 66
tcaagtccag catagcgac 19
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 67
cctctaaaca agtgtacctg 20
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 68
aagaggagtc caccatggta cgtcaggtgt ctgttctc 38
<210> 69
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 69
gtcgctatgc tggacttgag tacgcagtcg tcacgcc 37
<210> 70
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 70
caggtacact tgtttagagg tattccggga cgtagtgc 38
<210> 71
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 71
gctagcgtta acactagtca ctccaactcg ctgaggag 38
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物
<400> 72
taccgtcaaa atgtctgaaa ttactttggg 30
<210> 73
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物
<400> 73
gatttcagta acgttaagtg gatccttatt gcttagcgtt ggtag 45
<210> 74
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物
<400> 74
tctgcagatc tttaattaac tcgagcaccc gccatgattc cgtag 45
<210> 75
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 75
tttcagacat tttgacggta tttgtgttct gaagaac 37
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 76
agtttatgtg gaaaatggca 20
<210> 77
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 77
ctcgtagtcg ccgacggact atccgttggg cggagcat 38
<210> 78
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物
<400> 78
ccaacggata gtccgtcggc gactacgagg actgcg 36
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 79
tacgtgccga ccctcgagac 20
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 80
tcctccgagg ttcgacatca gggtt 25
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 81
ctctaaacaa gtgtacctgt gcat 24
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 82
agtttatgtg gaaaatggca 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 83
tacgtgccga ccctcgagac 20
<210> 84
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 84
acggatagtc atattgaagg agcacttttt g 31
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 85
gtcgccgacg gatcactagt acaggattc 29
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 86
cggattcaag atgcctcagc ca 22
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<400> 87
gaccgggttg gtggccacga 20
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物
<400> 88
cctgactgta taagagaaat g 21
<210> 89
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 89
agcgaccgga gtaagctccc gccgtggcaa tttcccgaac 40
<210> 90
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 90
aaattgccac ggcgggagct tactccggtc gctgtca 37
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 91
ccaatgaagc gttccttacg gct 23
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 92
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 93
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 93
acggagcagg taaccaagtc gaggaaagaa agaaaagaag 40
<210> 94
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 94
gacttggtta cctgctccgt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 95
aaaaaaagca ccgactcggt gcc 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 96
tgactgaccg tgatgatttc cag 23
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 97
agcctaacgt cgagaccggc gt 22
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 98
gggtggtgtg catggggccg tct 23
<210> 99
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物
<400> 99
aaagtgctcc ttcaatatgc agcagggtca gccgggtct 39
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 100
cggctgaccc tgctgcatat tgaaggagca ctttttgggc 40
<210> 101
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物
<400> 101
ggtcatgccg ggcttttaag aaactttatt gccaa 35
<210> 102
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物
<400> 102
ggcaataaag tttcttaaaa gcccggcatg acccgtgatg a 41
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 103
cgtactgaag ctcttcctct atcct 25
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 104
gggtggtgtg catggggccg tct 23
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 105
cgtactgaag ctcttcctct atcct 25
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 106
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 107
aaaaaaagca ccgactcggt gcc 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 108
gggtggtgtg catggggccg tct 23
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 109
cgtactgaag ctcttcctct atcct 25
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 110
tgggacggcg agagcgacgg gt 22
<210> 111
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 111
gcgtcgagaa ggcagagtct gtggatcgtg c 31
<210> 112
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 112
gcgtcgagaa ggcagagtct gtggatcgtg c 31
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 113
tagcgccagt tgcgtgccga ggt 23
<210> 114
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 114
tgggacggcg agagcgacgg gt 22
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 115
tagcgccagt tgcgtgccga ggt 23
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 116
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 117
aaaaaaagca ccgactcggt gcc 23
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物
<400> 118
cgctctcatt ccccctcgca g 21
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 119
atatactcgc aaatcagctc ga 22
<210> 120
<211> 62
<212> DNA
<213> 引物
<400> 120
aagcttatgg accccaagaa gaaacgcaag gttgataaga agtactccat cggcctcgcc 60
at 62
<210> 121
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物
<400> 121
tgagggacga tagcatcgac atcgtaatcg ga 32
<210> 122
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物
<400> 122
cgatgtcgat gctatcgtcc ctcagtcctt cc 32
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 123
agcggccgcc accttcctct ttt 23
<210> 124
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物
<400> 124
gggtttaaac atggacccca agaagaaacg caa 33
<210> 125
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物
<400> 125
tagcatccat agcggccgcc accttcct 28
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 126
cggccgctat ggatgctaag tcactaact 29
<210> 127
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物
<400> 127
ccttaattaa tgcagtctct gaatcaggat gggt 34
<210> 128
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 128
ccggatctcg gatcactagt acaggattc 29
<210> 129
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 129
actagtgatc cgagatccgg ggtgacacc 29
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 130
cagtcgccca cggcccagat gt 22
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 131
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 132
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 132
cggcgctctg gatgatcgag gaaagaaaga aaagaag 37
<210> 133
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物
<400> 133
catccagagc gccggcagtt ttagagctag aaata 35
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 134
aaaaaaagca ccgactcggt gcc 23
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 135
tcaagtgtca tgatctcgcg tg 22
<210> 136
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物
<400> 136
tcatcttctg ggtttggatg aatggatg 28
<210> 137
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 137
catccaaacc cagaagatga tattgaagga g 31
<210> 138
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物
<400> 138
cgcaacttga gaaagaagga ttacctctaa ac 32
<210> 139
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物
<400> 139
tccttctttc tcaagttgcg gggcgcgt 28
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 140
aggactatta tcatcctggg gga 23
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 141
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 142
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物
<400> 142
gatgggcgtc ttgagctcga ggaaagaaag aaaagaag 38
<210> 143
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物
<400> 143
gctcaagacg cccatcacgt tttagagcta gaaatagca 39
<210> 144
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 144
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgattgg cttctatcag 480
ggctgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 145
<211> 2266
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 145
cgggctcagc cggaacttgc tacctctgta aactttcgac tgtggatttt ggcgctcgct 60
tctgttcgtg gacgccccat gacatcagtg aacaatttca taaaccccca ccatgttcag 120
acttttgtca aacctcttct gtcctttggt tctttcgttt attatttttt ttttccgtaa 180
aatgcatctt tggggacaca ggtagtttac acacagcctc gggttgaata tgtgaatgag 240
cctcgtgata tctatccagg agttggtagc ggaaagcagc gttgactgaa ccgggatatt 300
aagccgccga tatcaccttt atctgcctcg aagatgcccc tttacggtcc taacatgact 360
tggtgccgcc aacttgtagg ccggacaaac gctccaagac gatgctttag tatcgctaaa 420
agtaagtact ttcggcttcg aaccaagtgc gtccgtctcg ttaaccgatc ccaccagaca 480
atggcacaca caaggagcgg gtagtgatcc ttggctcagg ttgggcaggg tatggtttcg 540
ctcgcactct tgacccagcc aagtacgagc gcattatcat ctcgccacgc tcctactttg 600
tcttcacccc gttgctagcc atattgaagg agcacttttt gggcttggct ggagctagtg 660
gaggtcaaca atgaatgcct attttggttt agtcgtccag gcggtgagca caaaatttgt 720
gtcgtttgac aagatggttc atttaggcaa ctggtcagat cagccccact tgtagcagta 780
gcggcggcgc tcgaagtgtg actcttatta gcagacagga acgaggacat tattatcatc 840
tgctgcttgg tgcacgataa cttggtgcgt ttgtcaagca aggtaagtga acgacccggt 900
cataccttct taagttcgcc cttcctccct ttatttcaga ttcaatctga cttacctatt 960
ctacccaagc aaagcttcga ttaggaagta accatgagcc cagaacgacg cccggccgac 1020
atccgccgtg ccaccgaggc ggacatgccg gcggtctgca ccatcgtcaa ccactacatc 1080
gagacaagca cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac cgcaggagtg gacggacgac 1140
ctcgtccgtc tgcgggagcg ctatccctgg ctcgtcgccg aggtggacgg cgaggtcgcc 1200
ggcatcgcct acgcgggccc ctggaaggca cgcaacgcct acgactggac ggccgagtcg 1260
accgtgtacg tctccccccg ccaccagcgg acgggactgg gctccacgct ctacacccac 1320
ctgctgaagt ccctggaggc acagggcttc aagagcgtgg tcgctgtcat cgggctgccc 1380
aacgacccga gcgtgcgcat gcacgaggcg ctcggatatg ccccccgcgg catgctgcgg 1440
gcggccggct tcaagcacgg gaactggcat gacgtgggtt tctggcagct ggacttcagc 1500
ctgccggtac cgccccgtcc ggtcctgccc gtcaccgaga tctgatccgt cgacctgcag 1560
atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgtacta gtgatccggt 1620
catccccgct ccttctccct catcatcatc agaaaccggc gggccgggca aggcacccaa 1680
gggcgacctc atcgagatcc cttacgacaa gcttgtgatc gcttgcggcg cgtacagcca 1740
aacctttggc atcgagggag tccgcgaata tgcacacttc ctccgcgaca tcggcgacgc 1800
ccggcgcatc cgccttcgcg tcctctccct ctttgagcag tgcgcctatc cccgcgggtc 1860
cgaccacctc agcgacgacg acaagcgcca gctcctccac ttcgccatcg tgggcggcgg 1920
accgaccggc atcgaattcg ccgccgagct ccacgacctt atccgcgatg acctcgcccc 1980
catctacccc gagctcgccc cgctggtcag catcacggtc tacgacgtgg cccccaaggt 2040
tcttccaatg ttcgaccggg cgctcgcaaa gtacgccatg gacaccttct cacgacaaaa 2100
catcaaggtc aagaccgagc accatctcga gcgcctccgc ctggccgacg gggagctcgg 2160
ccgccgccgc ggagtcctca agatcaagat caaggagtac ggcgacgagg aagtcggcgc 2220
gggcctggtc gtctggagca caggcctcat gccaaacccc ttgatc 2266
<210> 146
<211> 567
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 146
aggatcggtg gagtgaagtt cggaatcgag gttcggcgat gggtcgtaag catggcgact 60
tcgaacttac ttgcactggc aagcgttgcc agaacggcga gaaaaagaag ggtaagcgat 120
attcgcgtca tgatggactg ttccttttgg aacagtagtt gttgtgggaa gactatgtca 180
cacttgccca cctgcaaggc cagggtcgtg gtcgaacgag accagcctcg gcgctgctgg 240
gagctcaaga tgggcacgtt tgattcgtta gacgtcaaca aggctggagt tcctagtgac 300
agccaaaggc acagccacat taagtggcgc tttatctgtc cactaaggtt caattgtggc 360
tttgagccgc gcagtgtgca gtcgtgcatt ggccacctag ctagcagtat ttaagatcct 420
cttctctccc gagatcttcc tcctcttctt ttctttcttt cctcgaccat cctccgccag 480
aagagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 540
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 567
<210> 147
<211> 2341
<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila
<400> 147
tcctcctccc tctctcaggc gccctccgcc gtgtcctacc tcgcgcgctc gtcaattgag 60
ccaatggcat ccacgtcgag agctctgagc aagctcgcgg tgccccaaac gggcgccgtt 120
atgcttcagc cgtcttcgtc cgcgcccaga ctgctcctcc agacatcgcg caggaccgta 180
ggcgcgaggc ccgtcttcgg cagctcacaa gggcccgctc tccggcagtt ccggcgcggc 240
gtcaccagcg acgccgcccc cgtcccgccg cccaagaagc ggcgattccg caagctgcgg 300
tgggcatggc ggttcacata cctctccgcc atcgccagca tcgcctacat cggctacggc 360
gtctaccagg acaggcaccc ggagccccag gtcgagcccg acccgtccaa gaagaccttg 420
gtgattctcg gtaagttttg gccccgtccc gtcatcccgt cacaccgcac tgttaaagaa 480
gcttgttccg cggttggggg gaatgtagaa agggaaaaaa aaaaagagag agagagagag 540
agagaaaata ttctccgggg ctaacaagca tgtgccgcag gaaccggctg gggctctgtc 600
tcgctgctca agcgcctcga cacggagaac tacaacgtca tcgtcatctc cccgcgcaac 660
tatattgaag gagcactttt tgggcttggc tggagctagt ggaggtcaac aatgaatgcc 720
tattttggtt tagtcgtcca ggcggtgagc acaaaatttg tgtcgtttga caagatggtt 780
catttaggca actggtcaga tcagccccac ttgtagcagt agcggcggcg ctcgaagtgt 840
gactcttatt agcagacagg aacgaggaca ttattatcat ctgctgcttg gtgcacgata 900
acttggtgcg tttgtcaagc aaggtaagtg aacgacccgg tcataccttc ttaagttcgc 960
ccttcctccc tttatttcag attcaatctg acttacctat tctacccaag caaagcttcg 1020
attaggaagt aaccatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg 1080
cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact 1140
tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc 1200
gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc 1260
cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc 1320
gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg 1380
cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca 1440
tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg 1500
ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc 1560
cggtcctgcc cgtcaccgag atctgatccg tcgacctgca gatcgttcaa acatttggca 1620
ataaagtttc ttaagattga atcctgtact agtgatccga gatccggggt gacaccaccg 1680
agaccgaggt gccgtacgac atgctggtgg tcggcgtggg cgccgagaac gccacgttcg 1740
gcatccccgg cgtgcgcgag cactcgtgct tcctcaagga gatcggcgac gcccaaaaga 1800
tccgcaagcg catcatggac tgcgtcgaga cggcggcgtt caaggaccag tcgcccgagg 1860
agatcgaccg gctcctgcac atggtggtcg tcgggggcgg cccgaccggc gtcgagttcg 1920
ccggcgagct gcaggacttc ttcgaggagg acatcaagaa gctggtgccc gagatcagcg 1980
accgcttccg ggtgacgctc atcgaggcgc tgcctaacgt gctgcccatg ttctccaagc 2040
agctgatcga gtacaccgag agcaccttca aggaggagaa gatcaacatc cacaccaaga 2100
ccgtggtcaa gaaggtgacg gacaagacgg tcgaggccga ggtgacgcgc ccggacggca 2160
agaaggagac ggtcgtcttc ccctacggcc tgctcgtctg ggccaccggt aacgccgtcc 2220
gccccgtcgt ccgggacctg atgtcgcgca tcccggccca ggccggctcg cgccgcggcc 2280
tcgccgtcaa cgagtacctc gtcgtccagg gcacgcgcga catctgggcc gtgggcgact 2340
g 2341
<210> 148
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 148
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 149
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 149
ctgatagaag ccaatcgagg aaagaaagaa aagaaga 37
<210> 150
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 150
gattggcttc tatcagggct gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 151
aaaaaaagca ccgactcggt gcc 23
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 152
cgggctcagc cggaacttgc tacc 24
<210> 153
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 153
ccttcaatat ggctagcaac ggggtgaag 29
<210> 154
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 154
gttgctagcc atattgaagg agcacttttt g 31
<210> 155
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 155
gggatgaccg gatcactagt acaggattc 29
<210> 156
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物
<400> 156
actagtgatc cggtcatccc cgctcctt 28
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物
<400> 157
gatcaagggg tttggcatga g 21
<210> 158
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 158
aggatcggtg gagtgaagtt cg 22
<210> 159
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<400> 159
tctggcggag gatggtcgag gaaagaaaga aaagaag 37
<210> 160
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物
<400> 160
accatcctcc gccagaagag ttttagagct agaaatagca 40
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 161
aaaaaaagca ccgactcggt gcc 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物
<400> 162
tcctcctccc tctctcaggc gcc 23
<210> 163
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 163
ccttcaatat agttgcgcgg ggagatgac 29
<210> 164
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物
<400> 164
ccgcgcaact atattgaagg agcacttttt g 31
Claims (29)
1.一种丝状真菌的基因工程菌的构建方法，其特征在于，通过基因工程方法使得所述丝状真菌过表达乙醇合成正调控基因，和/或下调表达内源乙醇合成负调控基因获得基因工程菌，且所述的基因工程菌与其出发菌株相比，乙醇合成能力得到提高；
所述乙醇合成正调控基因选自乙醇脱氢酶、纤维二糖转运蛋白、丙酮酸脱羧酶中的一种或多种，或与葡萄糖转运蛋白的组合；
所述负调控基因选自乳酸脱氢酶、1-磷酸甘露醇脱氢酶、胞质苹果酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶、外NADH脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶基因中的一种或多种；
所述丝状真菌是嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）或异梭毁丝霉(Myceliophthoraheterothallica)。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述过表达乙醇合成正调控基因是将携带外源性或内源性乙醇合成正调控基因的表达载体转入所述丝状真菌中。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，表达载体中的启动子为tef、gpdA、trpC、cbh1、glaA启动子。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述丝状真菌中过表达乙醇脱氢酶编码基因Scadh1、丙酮酸脱羧酶基因pdc1、葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1、纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1/cdt-2之一种，或者它们的组合。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述乙醇脱氢酶为酿酒酵母来源的乙醇脱氢酶Scadh1、乙醇脱氢酶Scadh3、乙醇脱氢酶Scadh5或乙醇脱氢酶Scadh6。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述下调基因表达是通过基因敲除或小RNA干扰技术或基因编辑或更换启动子或基因突变，使所述内源乙醇合成负调控基因失活或表达量下降或活性降低。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述基因编辑是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使菌株中的内源乙醇合成负调控基因选自乳酸脱氢酶、1-磷酸甘露醇脱氢酶、胞质苹果酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、外NADH脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶中的一种或者多种组合基因表达量下降或丧失，和/或使菌株中的内源乙醇合成负调控基因细胞色素C氧化酶表达量下降。
9.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶、纤维二糖转运蛋白编码基因cdt-1和/或cdt-2，以及下调乳酸脱氢酶基因ldh-1和/或ldh-2的表达。
10.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，并下调外NADH脱氢酶的表达，其中外NADH脱氢酶基因nde1和nde2两者之一或同时下调。
11.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，和下调细胞色素C氧化酶基因的表达。
12.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶，并下调/敲除细胞质苹果酸脱氢酶Mdh的表达。
13.如权利要求12所述的构建方法，其特征在于，进一步下调/敲除甘油-3-磷酸脱氢酶基因gpd的表达。
14.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述丝状真菌中过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶基因pdc1。
15.如权利要求13所述的构建方法，其特征在于，进一步过表达葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1。
16.如权利要求15所述的构建方法，其特征在于，更进一步地下调乳酸脱氢酶基因和1-磷酸甘露醇脱氢酶。
17.如权利要求16所述的构建方法，其特征在于，更进一步地下调细胞质苹果酸脱氢酶Mdh，和/或下调/敲除乙醇脱氢酶基因Mtadh，和/或下调/敲除乙醛脱氢酶基因Mtaldh。
18.如权利要求16所述的构建方法，其特征在于，进一步过表达葡萄糖转运蛋白编码基因glt-1，以及下调乳酸脱氢酶基因和1-磷酸甘露醇脱氢酶。
19.一种利用如权利要求1至18任一项所述的构建方法所获得的产乙醇能力提高的基因工程菌在生产乙醇中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，其采用单糖或/和聚糖，或者含有单糖或/和聚糖的物质为底物。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述单糖为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；所述聚糖选自纤维二糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、木寡糖、纤维寡糖、纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉、植物木质生物质或其组合。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的植物木质生物质选自农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物。
23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述农作物秸秆选自玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯；所述林业废弃物选自枝叶，锯末；所述能源植物选自甜高粱，柳枝稷，芒草，芦苇或其组合。
24.一种生产乙醇的方法，其特征在于，在含有单糖或/和聚糖的培养基质中，培养如权利要求1至18任一项所述的构建方法所获得的基因工程菌，从培养物中收集乙醇。
25.如权利要求24的生产乙醇的方法，其特征在于，所述单糖为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；所述聚糖选自纤维二糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、木寡糖、纤维寡糖、纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉、植物木质生物质或其组合。
26.如权利要求25的生产乙醇的方法，其特征在于，所述的植物木质生物质选自农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物。
27.如权利要求26的生产乙醇的方法，其特征在于，所述农作物秸秆选自玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯；所述林业废弃物选自枝叶，锯末；所述能源植物选自甜高粱，柳枝稷，芒草，芦苇或其组合。
28.如权利要求24至27任一项所述的生产乙醇的方法，其特征在于，所述培养中的发酵温度为40-60℃。
29.如权利要求28所述的生产乙醇的方法，其特征在于，所述发酵温度为45-52℃。
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