BR112019025777A2 - célula de levedura recombinante - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma célula de levedura recombinante que expressa funcionalmente uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos que codificam ribulose-1,5-fosfato carboxilase/oxigenase (EC4.1.1.39; Rubisco) e, opcionalmente, uma ou mais chaperonas moleculares para Rubisco, e uma ou mais fosforribuloquinase (EC2.7.1.19; PRK), em que um ou mais genes do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato são superexpressos e/ou em que a referida célula de levedura compreende uma deleção ou disrupção de um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULA DE LEVEDURA RECOMBINANTE".

[0001] A presente invenção refere-se a uma célula de levedura recombinante com a capacidade de produzir um produto de fermentação desejado, à expressão funcional de peptídeos heterólogos em uma célula de levedura e a um método para produzir um produto de fermentação em que a referida célula de levedura é usada. Antecedentes da invenção

[0002] Processos de fermentação microbiana são aplicados à produção industrial de uma faixa ampla e em rápida expansão de compostos químicos a partir de matérias-primas renováveis de carboidratos. Especialmente em processos de fermentação anaeróbica, o equilíbrio redox do par de cofatores NADH/NAD* pode causar restrições importantes no rendimento do produto. Esse desafio é exemplificado pela formação de glicerol como principal subproduto na produção industrial - por exemplo - de etanol combustível por Saccharomyces cerevisiae, uma consequência direta da necessidade de reoxidar o NADH formado em reações biossintéticas. Atualmente, a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae é, em volume, o maior processo de fermentação da biotecnologia industrial, mas vários outros compostos, incluindo outros álcoois, ácidos carboxílicos, isoprenoides, aminoácidos etc., também são produzidos atualmente em processos biotecnológicos industriais. Várias abordagens foram propostas para melhorar as propriedades fermentativas de organismos utilizados em biotecnologia industrial por modificação genética. Um grande desafio relacionado à estequiometria da produção baseada em levedura de etanol, mas também de outros compostos, é que quantidades substanciais de produtos secundários dependentes de NADH (em particular glicerol) são geralmente formadas como subprodutos, especialmente sob condições anaeróbicas e de oxigênio limitado ou em condições em que a respiração esteja, de outra forma, restrita ou ausente. Foi estimado que, em processos industriais típicos de etanol, até cerca de 4% em peso da matéria-prima açúcar é convertida em glicerol (Nissen et al. Yeast (Levedura) 16 (2000) 463- 474). Em condições ideais para o crescimento anaeróbico, a conversão em glicerol pode até ser maior, até cerca de 10%. A produção de glicerol em condições anaeróbicas está principalmente ligada ao metabolismo redox. Durante o crescimento anaeróbico de S. cerevisiae, a dissimilação do açúcar ocorre por fermentação alcoólica. Nesse processo, o NADH formado na reação glicolítica de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase é reoxidado pela conversão do acetaldeído, formado pela descarboxilação do piruvato, em etanol via álcool desidrogenase dependente de NAD*. A estequiometria fixa dessa via dissimilatória redox-neutra causa problemas quando uma redução líquida de NAD* a NADH ocorre em outras partes do metabolismo. Em condições anaeróbicas, a reoxidação do NADH em S. cerevisiae é estritamente dependente da redução de açúcar em glicerol.

[0003] A formação de glicerol é iniciada pela redução do intermediário glicolítico di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) em glicerol 3- fosfato (glicerol-3P), uma reação catalisada pela glicerol 3-fosfato desidrogenase dependente de NAD*. Subsequentemente, o glicerol 3- fosfato formado nesta reação é hidrolisado pela glicerol-3-fosfatase para produzir glicerol e fosfato inorgânico. Consequentemente, o glicerol é um subproduto importante durante a produção anaeróbica de etanol por S. cerevisiae, o que é indesejável, pois reduz a conversão geral de açúcar em etanol. Além disso, a presença de glicerol em efluentes de plantas de produção de etanol pode impor custos para o tratamento de águas residuais. O documento WO2014/129898 descreve uma célula recombinante com sequências de ácidos nucleicos heterólogos funcionais codificando ribulose-1,5-fosfato carboxilase/oxigenase (EC

4.1.1.39; aqui abreviada como "Rubisco"), e opcionalmente chaperonas moleculares para Rubisco e fosforribuloquinase (EC 2.7.1.19; aqui abreviada como "PRK"). O documento WO2015/107496 descreve uma célula recombinante com sequências de ácidos nucleicos heterólogos funcionais codificando unidades de ribulose-1,5-fosfato carboxilase/oxigenase Rbcl, RbcS e RcbX, chaperonas moleculares para Rubisco GroEL e GroES. Nos exemplos, PRK é expresso com um promotor induzível por tetraciclina TetO7; ver tabela 5. Deste modo, é necessário um auxiliar de processo para este promotor, isto é, as adições de um composto à propagação, o que aumenta o custo e a complexidade do processo. O referido composto é doxiciclina, um antibiótico, que não é preferido como aditivo no processo de fermentação do etanol. Embora o processo descrito no documento WO2014/129898 seja vantajoso, há uma necessidade contínua de melhoria, em particular produção melhorada de um composto orgânico útil, como etanol. Além disso, seria desejável fornecer um micro- organismo em que os produtos secundários dependentes de NADH sejam ainda mais reduzidos. Também é desejável um processo em que não sejam necessários aditivos, como antibióticos. Além disso, é desejável que as características de propagação da cepa sejam melhoradas. Estes estão entre os objetos da invenção. Legendas da Figura

[0004] Figure 1: Ensaio de osmotolerância de cepas engenheiradas. Células foram cultivadas em meio sintético (180g L' (1M) de glicose, pH inicial 6) e incubadas a 30ºC por 48h em condições anaeróbicas (10% CO>). A: IME324 (GPD1 GPD2); B: IMX1443 (GPD1 gpd2A pDAN1-prk cbbm não-ox PPP7, diploide); C: IMX1489 (GPD1 gpd2A pDAN1-prk cbbm não-ox PPP7, haploide. Sumário da invenção

[0005] Um ou mais dos objetivos mencionados acima são realizados de acordo com a presente invenção que fornece uma célula de levedura recombinante que expressa funcionalmente uma ou mais sequências heterólogas de ácido nucleico que codificam a ribulose-1,5- fosfato carboxilase/oxigenase (EC4.1.1.39; Rubisco) e, opcionalmente, uma ou mais chaperonas moleculares para Rubisco e uma ou mais fosforribuloquinases (EC2.7.1.19; PRK), em que um ou mais genes do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato estão superexpressos e/ou em que a referida célula de levedura compreende uma deleção ou disrtupção de um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD). Vantajosamente, essa célula de levedura recombinante possui melhores rendimentos de produto e/ou formação de produto secundário reduzida e/ou características de propagação melhoradas e/ou ausência de aditivos, como antibiótico, no processo de fermentação, de modo que o processo de fermentação convencional não precise ser alterado. Descrição detalhada da invenção

[0006] A invenção refere-se, assim, a uma célula de levedura recombinante que expressa funcionalmente uma ou mais sequências heterólogas de ácido nucleico que codificam ribulose-1,5-fosfato carboxilase/oxigenase (EC4.1.1.39; Rubisco) e, opcionalmente, uma ou mais chaperonas moleculares para Rubisco, e uma ou mais fosforribuloquinase (EC2.7.1.19; PRK), em que um ou mais genes do ramo não oxidativo da via de pentose fosfato estão superexpressos e/ou em que a referida célula de levedura compreende uma deleção ou disrupção de um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD).

[0007] O gene GPD pode ser um gene GPD1 e ou um gene GPD?2. Ambos os genes GPD1 e GPD2 podem ser excluídos ou interrompidos, embora seja preferido que GPD2, mas não GPD71, seja excluído ou interrompido. O gene GPD codifica uma enzima com pelo menos o número EC 1.1.1.8.

[0008] O documento WOZ2011 010923 descreve métodos para excluir ou interromper uma glicerol-3-fosfato desidrogenase.

[0009] Em uma modalidade, o um ou mais genes da via de pentose fosfato superexpressos codificam uma enzima selecionada da lista de uma transaldolase (EC 2.2.1.2), uma transcetolase (EC 2.2.1.1), uma ribose-5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6) e uma D-ribulose-5-fosfato 3- epimerase (EC 5.1.3.1).

[0010] Em outra modalidade, o um ou mais genes da via da pentose fosfato que são superexpressos são selecionados da lista de TAL1, TAL2, NOM1, TKL1, TKL2, RPE1 e RKI1.

[0011] Em uma modalidade, o PRK está sob controle de um promotor (aqui "o promotor de PRK") que tem uma razão de expressão de PRK anaeróbica/aeróbica de 2 ou mais e o Rubisco está sob um promotor constitutivo.

[0012] Em uma modalidade, o promotor de PRK é reprimido por ROX1. ROX1 é aqui repressor dependente de heme do(s) gene(s) hipóxico(s), que medeia repressão transcricional aeróbica de genes induzidos por hipóxia, como COX5b e CYC7; a função repressora é regulada através da diminuição da ocupação do promotor em resposta ao estresse oxidativo, e contém um domínio HMG que é responsável pela atividade de torção no DNA, envolvida na resistência ao estresse hiperosmótico. ROX1 é regulado por oxigênio.

[0013] Em uma modalidade, o promotor de PRK é reprimido por ROX1. Em uma modalidade, o promotor de PRK tem um ou mais motivos de ligação a ROX1.

[0014] Em uma modalidade, o promotor de PRK compreende em sua sequência um ou mais dos motivos NNNATTGTTNNN. Em uma modalidade, o promotor de PRK é o promotor nativo de um gene selecionado na lista que consiste em: FET4, ANB1, YHRO48W, DAN1, AAC3, TIR2, DIP5, HEM13, YNRO14W, YARO28W, FUN 57, COX5B, OYE2, SUR2, FRDS1, PIS1, LAC1I, YGRO35C, YALO28W, EUGA1,

HEM14, ISU2, ERG26, YMR252C e SML1; em particular FET4, ANB1, YHRO48W, DAN1, AAC3, TIR2, DIP5 e HEM13.

[0015] Em uma modalidade, o promotor de PRK compreende em sua sequência um ou mais dos motivos: TCGTTYAG e ou AAAAATTGTTGA.

[0016] Em uma modalidade, o promotor de PRK compreende em sua sequência um ou mais motivos de sequência: TOEGTTYAG e ou AAAAATTGTTG,

[0017] Em particular, esse promotor de PRK é promotor nativo de um gene DAN, TIR ou PAU. Em uma modalidade, o promotor de PRK é o promotor nativo de um gene selecionado na lista que consiste em: TIR2, DAN1, TIRA4, TIR3, PAU7, PAUS, YLLO64C, YGR294W, DAN3, YILI176C, YGL261C, YOL161C, PAU1, PAU6, DAN2 , YDR542W, YIRO41W, YKL224C, PAUS, YLLO25SW, YOR394W, YHLO46C, YMR325W, YALO68C, YPL282C, PAU2 e PAUA4, em particular o promotor de PRK é o promotor nativo de um gene selecionado na lista que consiste em: TIR2, DAN1, TIR4, TIR3, PAU7, PAUS, YLLO6AC, YGR294W, DAN3, YILI76C, YGL261C, YOL161C, PAU1, PAUG6, DAN2, YDR542W, YIRO41W, YKL224C, PAU3 e YLLO25W.

[0018] O promotor de PRK pode ter uma razão de expressão de PRK anaeróbica/aeróbica de 2 ou mais, preferivelmente de 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, ou mais ou 50 ou mais. Isso significa que a expressão de PRK pode ser pelo menos um fator 2 mais alto em condições anaeróbicas do que em condições aeróbicas.

[0019] "Expressão" refere-se à transcrição de um gene em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou RNA mensageiro (mMRNA) com tradução subsequente em uma proteína.

[0020] Em uma modalidade, a razão de expressão de PRK é determinada medindo a quantidade de proteína PRK de células cultivadas em condições aeróbicas e anaeróbicas. A quantidade de proteína PRK pode ser determinada por proteômica, como mostrado nos Exemplos.

[0021] Em outra modalidade, o nível ou taxa de expressão de PRK é determinada medindo a atividade de PRK de células cultivadas em condições aeróbicas e anaeróbicas, por exemplo em um extrato sem células. Métodos para medir a atividade de PRK são, por exemplo, descritos no Exemplo 1 do Pedido de Patente Europeia pendente EP16174382.8.

[0022] Em ainda outra modalidade, o nível ou taxa de expressão de PRK é determinad(o)(a) medindo o nível de transcrição (por exemplo, como quantidade de mMRNA) do gene de PRK de células cultivadas em condições aeróbicas e anaeróbicas. O especialista na técnica sabe como determinar níveis de tradução usando métodos comumente conhecidos na técnica, por exemplo. Q-PCR, PCR em tempo real, Northern Blot, RNA-seq.

[0023] Neste contexto, "promotor" é uma sequência de DNA que direciona a transcrição de um gene (estrutural), em particular um ou mais genes da fosforribuloquinase. O promotor permite maior expressão em condições anaeróbicas do que em condições aeróbicas.

[0024] Em uma modalidade, o promotor de PRK pode ser um oligonucleotídeo sintético. Pode ser um produto da síntese de oligonucleotídeos artificiais. A síntese de oligonucleotídeos artificiais é um método em biologia sintética usado para criar oligonucleotídeos artificiais, como genes, em laboratório. Serviços comerciais de síntese genética estão agora disponíveis em várias empresas em todo o mundo, algumas das quais construíram seu modelo de negócios em torno dessa tarefa. Abordagens atuais de síntese de genes são frequentemente baseadas em uma combinação de química orgânica e técnicas de biologia molecular e genes inteiros podem ser sintetizados "de novo",

sem a necessidade de precursor de modelo de DNA .

[0025] Em uma modalidade, o promotor está localizado na região 5'de um gene de PRK. Em uma modalidade, está localizado próximo ao local de início da transcrição de um gene de PRK.

[0026] A invenção refere-se ainda a um processo para preparar um composto orgânico, em particular um álcool, compreendendo a conversão de uma fonte de carbono, em particular um carboidrato ou outra fonte de carbono orgânico, usando uma célula de levedura, formando assim o composto orgânico, em que a célula de levedura é uma célula de levedura de acordo com a invenção.

[0027] O termo “um” ou “uma”, neste contexto, é definido como pelo menos um(a) a não ser que especificado de outra maneira.

[0028] Quando se referindo a um substantivo (por exemplo, um composto, um aditivo, etc.) no singular, o plural deve ser incluído. Assim, quando se refere a uma porção específica, por exemplo, "composto", isto significa "pelo menos um" dessa porção, por exemplo. "pelo menos um composto", a menos que especificado de outra forma. O termo 'ou', neste contexto, deve ser entendido como 'e/ou'.

[0029] Quando se referindo a um composto do qual existem vários isômeros (por exemplo, um enantiômero D e L), o composto em princípio inclui todos os enantiômeros, diastereômeros e isômeros cis/trans desse composto que podem ser utilizados no método particular da invenção; em particular quando se referindo a tal composto, é(são) incluído(s) o(s) isômero(s) natural(is).

[0030] O termo 'fermentação', 'fermentativo' e similares é usado aqui no sentido clássico, isto é, para indicar que um processo é ou foi realizado sob condições anaeróbicas. Condições anaeróbicas são aqui definidas como condições sem oxigênio ou nas quais essencialmente nenhum oxigênio é consumido pela célula de levedura, em particular por uma célula de levedura, e geralmente corresponde a um consumo de oxigênio inferior a 5 mmol/L.h (5 x 10º mol/L.h), em particular a um consumo de oxigênio inferior a 2,5 mmol/L.h (2,5 x 10º mol/L.h) ou inferior a 1 mmol/L.h (1 x 10º mol/L.h). Mais preferivelmente, é consumido O mmol/L/h (O x 10º mol/L.h) (ou seja, o consumo de oxigênio não é detectável). Isso geralmente corresponde a uma concentração de oxigênio dissolvido no caldo de cultura de menos de 5% de saturação do ar, em particular a uma concentração de oxigênio dissolvido de menos de 1% de saturação do ar ou menos de 0,2% de saturação do ar.

[0031] O termo "levedura" ou "célula de levedura" refere-se a um grupo filogeneticamente diverso de fungos unicelulares, a maioria dos quais estão na divisão de Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras de brotamento ("leveduras verdadeiras") são classificadas na ordem Saccharomycetales, com Saccharomyces cerevisiae como as espécies mais conhecidas.

[0032] O termo "(célula) recombinante" ou "micro-organismo recombinante", neste contexto, refere-se a uma cepa (célula) contendo ácido nucleico que é o resultado de uma ou mais modificações genéticas usando técnica(s) de DNA recombinante e/ou outra(s) técnica(s) mutagênica(s). Em particular, uma célula recombinante pode incluir ácido nucleico não presente em uma célula correspondente do tipo selvagem, tal ácido nucleico tendo sido introduzido nessa cepa (célula) usando técnicas de DNA recombinante (uma célula transgênica) ou, o ácido nucleico não presente no referido tipo selvagem sendo resultado de uma ou mais mutações - por exemplo, usando técnicas de DNA recombinante ou outra técnica de mutagênese, como irradiação por UV - em uma sequência de ácido nucleico presente no referido tipo selvagem (como um gene que codifica um polipeptídeo do tipo selvagem) ou em que a sequência de ácido nucleico de um gene foi modificada para atingir o produto polipeptídico (codificando-o) em direção a outro compartimento celular. Além disso, o termo "(célula) recombinante", em particular, se refere a uma cepa (célula) da qual sequências de DNA foram removidas usando técnicas de DNA recombinante.

[0033] O termo "célula (de levedura) transgênica", neste contexto, refere-se a uma cepa (célula) contendo ácido nucleico que não ocorre naturalmente nessa cepa (célula) e que foi introduzida nessa cepa (célula) usando técnicas de DNA recombinante, ou seja, uma célula recombinante.

[0034] O termo "mutado", usado aqui referindo-se a proteínas ou polipeptídeos significa que pelo menos um aminoácido na sequência de proteína ou polipeptídeo de tipo selvagem ou de ocorrência natural foi substituído por um aminoácido diferente, inserido ou excluído da sequência por mutagênese de ácidos nucleicos que codificam esses aminoácidos. Mutagênese é um método bem conhecido na arte e inclui, por exemplo, mutagênese sítio-dirigdida por meio de PCR ou por mutagênese mediada por oligonucleotídeo, como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonagem molecular — Um Manual de Laboratório), segunda edição, Vol. 1-3 (1989). O termo "mutado", conforme usado aqui em relação a genes, significa que pelo menos um nucleotídeo na sequência de ácido nucleico desse gene ou em uma sequência reguladora do mesmo foi substituído por um nucleotídeo diferente ou foi excluído da sequência por mutagênese, resultando na transcrição de uma sequência de proteínas com uma função qualitativamente ou quantitativamente alterada ou a inativação (knock out) desse gene.

[0035] O termo "gene", neste contexto, refere-se a uma sequência de ácido nucleico contendo um modelo para uma polimerase de ácido nucleico, em eucariotos, RNA polimerase Il. Os genes são transcritos em mRNAs que em seguida são traduzidos em proteína.

[0036] O termo "ácido nucleico", neste contexto, inclui referência a um polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, isto é, um polinucleotídeo, na forma de fita simples ou dupla, e a menos que limitado de outro modo, abrange análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais, na medida em que hibridizam a ácidos nucleicos de fita simples de maneira semelhante a nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos). Um polinucleotídeo pode ser de tamanho completo ou uma subsequência de um gene estrutural ou regulador nativo ou heterólogo. Salvo indicação em contrário, o termo inclui referência à sequência especificada, bem como à sequência complementar da mesma. Assim, DNAs ou RNAs com esqueletos modificados para estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos", como o termo pretende aqui. Além disso, DNAs ou RNAs contendo bases incomuns, como inosina, ou bases modificadas, como bases tritladas, para citar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos, como o termo é usado aqui. Será apreciado que uma grande variedade de modificações foi feita no DNA e RNA, modificações essas que servem a muitos propósitos úteis conhecidos pelos especialistas na técnica. O termo polinucleotídeo, tal como é aqui empregado, abrange essas formas de polinucleotídeos quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, entre outras coisas, células simples e complexas.

[0037] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. A natureza essencial desses análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporados a uma proteína, essa proteína é especificamente reativa a anticorpos —elicitados pela mesma proteínay mas consistindo inteiramente em aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" também são inclusivos quanto a modificações incluindo, mas não limitadas a, glicosilação, fixação lipídica, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[0038] Quando uma enzima é mencionada com referência a uma classe de enzimas (EC), a classe de enzimas é uma classe em que a enzima é classificada ou pode ser classificada, com base na Nomenclatura de Enzimas fornecida pelo Nomencliature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC- IUBMB) (Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular, nomenclatura essa que pode ser encontrada em http://www.chem.qmul.ac.uk/liubmb/enzyme/. Outras enzimas adequadas que (ainda) não foram classificadas em uma classe especificada, mas podem ser classificadas como tal, devem ser incluídas.

[0039] Se for feita referência a uma sequência de proteína ou de ácido nucleico, como um gene, por um número de acesso, esse número em particular será usado para se referir a uma sequência de proteína ou ácido nucleico (gene) com uma sequência que pode ser encontrada via www.ncbi.nIm.nih.gov/ (conforme disponível em 14 de junho de 2016), salvo indicação em contrário.

[0040] Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também, por referência ao código genético, descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. O termo "variantes conservativamente modificadas" aplica-se a ambas as sequências, de aminoácidos e de ácidos nucleicos. No que diz respeito a sequências particulares de ácido nucleico, variantes conservativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam variantes idênticas ou conservativamente modificadas das sequências de aminoácidos devido à degeneração do código genético. O termo "degeneração do código genético" refere-se ao fato de que um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em todas as posições em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas" e representam uma espécie de variação conservativamente modificada.

[0041] O termo "homólogo funcional" (ou abreviadamente "homólogo") de um polipeptídeo que possui uma sequência específica (por exemplo, SEQ ID NO: X), aqui utilizado, refere-se a um polipeptídeo contendo a referida sequência específica com a condição de que um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos, polipeptídeo esse que possui (qualitativamente) a mesma funcionalidade enzimática para conversão do substrato. Esta funcionalidade pode ser testada pelo uso de um sistema de ensaio compreendendo uma célula de levedura recombinante contendo um vetor de expressão para a expressão do homólogo em levedura, o referido vetor de expressão contendo uma sequência heteróloga de ácido nucleico operativamente ligada a um promotor funcional na levedura, e a referida sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo homólogo cuja atividade enzimática na célula de levedura deve ser testada, avaliando-se se se a referida conversão ocorre nas referidas células. Homólogos candidatos podem ser identificados usando análises de similaridade in silico. Um exemplo detalhado dessa análise é descrito no Exemplo 2 do documento

WOZ2009 013159. O perito na técnica será capaz de derivar a partir disso como homólogos candidatos adequados podem ser encontrados e, opcionalmente após otimização do códon (par), será capaz de testar a funcionalidade necessária desses homólogos candidatos usando um sistema de ensaio adequado, como descrito acima.

[0042] Um homólogo adequado representa um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos similar à de um polipeptídeo específico de mais de 50%, preferivelmente de 60% ou mais, em particular de pelo menos 70%, mais em particular de pelo menos 80%, pelo menos 90% , pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% e com a funcionalidade enzimática necessária. No que diz respeito às sequências de ácidos nucleicos, o termo homólogo funcional pretende incluir sequências de ácidos nucleicos que diferem de outra sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético e que codificam a mesma sequência polipeptídica.

[0043] Identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucleico (polinucleotídeo), conforme determinado pela comparação das sequências. Normalmente, identidades ou semelhanças das sequências são comparadas em todo o comprimento das sequências comparadas. Na arte, "identidade" também significa o grau de parentesco entre as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, conforme o caso, conforme determinado pela correspondência entre as cadeias de tais sequências.

[0044] Diz-se que sequências de aminoácidos ou nucleotídeos são homólogas quando exibem um certo nível de similaridade. Duas sequências sendo homólogas indicam uma origem evolutiva comum. Se duas sequências homólogas estão intimamente relacionadas ou mais distantes é indicado por "porcentagem de identidade" ou "porcentagem de similaridade", que é alta ou baixa, respectivamente.

Embora contestado, para indicar "porcentagem de identidade" ou "porcentagem de similaridade", "nível de homologia" ou "porcentagem de homologia" são frequentemente usados de forma intercambiável.

Uma comparação de sequências e determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático.

O perito estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a homologia entre duas sequências (Kruskal, JB (1983) An overview of sequence comparison In D.

Sankoff and J.

B.

Kruskal (Uma visão geral da comparação de sequencias em D.

Sankoff e J.

B.

Kruskal), (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison (Distorções no tempo, edições de cadeias e macromoléculas: a teoria e prática da comparação de sequências, pp. 1-44 Addison Wesley). O percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinado usando o algoritmo Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S.

B. e Wunsch, C.

D. (1970) J.

Mol.

Biol. 48, 443-453). O algoritmo alinha sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos.

O algoritmo Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE.

Para os fins desta invenção, foi utilizado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P.

Longden, |. e Bleasby, A.

Genetics 16, (6) pp276- 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para sequências de proteínas, o EBLOSUMG6? é usado para a matriz de substituição.

Para sequências de nucleotídeos, é utilizado EDNAFULL.

Outras matrizes podem ser especificadas.

Os parâmetros opcionais utilizados para o alinhamento das sequências de aminoácidos são uma penalidade de lacuna aberta de 10 e uma penalidade de extensão da lacuna de 0,5. O perito entenderá que todos esses parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a identidade percentual geral de duas sequências não é significativamente alterada ao se usar algoritmos diferentes. Definição de Homologia Global

[0045] A homologia ou identidade é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências completas ao longo da região alinhada total, incluindo quaisquer lacunas ou extensões. A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada da seguinte forma: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento, incluindo as lacunas. A identidade aqui definida pode ser obtida a partir do NEEDLE e é rotulada na saída do programa como “IDENTITY” ("IDENTIDADE"). Definição de identidade mais longa

[0046] A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada da seguinte forma: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade assim definida pode ser obtida do NEEDLE usando a opção NOBRIEF e é rotulada na saída do programa como “longest-identity” ("identidade mais longa").

[0047] Uma variante de uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos aqui divulgada pode também ser definida como uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos tendo uma ou várias substituições, inserções e/ou deleções em comparação com a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos especificamente aqui divulgada (por exemplo, na listagem de sequências).

[0048] Opcionalmente, ao determinar o grau de similaridade de aminoácidos, o especialista pode também levar em consideração as chamadas substituições de aminoácidos "conservadoras", como ficará claro para o especialista. Substituições conservadoras de aminoácidos referem-se à permutabilidade de resíduos com cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxílicas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metionina. Em uma modalidade, grupos conservadores de substituição de aminoácidos são: valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

[0049] Variantes substitucionais da sequência de aminoácidos aqui divulgadas são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências divulgadas foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. De preferência, a troca de aminoácidos é conservadora. Em uma modalidade, substituições conservadoras para cada um dos aminoácidos de ocorrência natural são as seguintes: Ala para Ser; Arg para Lys; Asn para Gln ou His; Asp para Glu; Cys para Ser ou Ala; GIh para Asn; Glu para Asp; Gly para Pro; His para Asn ou Gln; lle para Leu ou Val; Leu para Ile ou Val; Lys para Arg; GIh ou Glu; Met para Leu ou Ile; Phe para Met, Leu ou Tyr; Ser para Thr; Thr para Ser; Trp para Tyr; Tyr para Trp ou Phe; e Val para Ile ou Leu.

[0050] Sequências de nucleotídeos da invenção podem também ser definidas por sua capacidade de hibridizar com partes de sequências de nucleotídeos específicas aqui divulgadas, respectivamente, em condições de hibridação moderadas ou preferencialmente sob condições rigorosas. Condições de hibridização rigorosas são aqui definidas como condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50, 75 ou 100 nucleotídeos e mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize a uma temperatura de cerca de 65ºC em uma solução contendo cerca de 1 M de sal, preferiveimente 6 x SSC ou qualquer outra solução com uma força iônica comparável, com lavagem a 65ºC em uma solução contendo cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução com uma força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada de um dia para o outro, isto é, por pelo menos por 10 horas e de preferência a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Estas condições irão normalmente permitir a hibridização específica de sequências com cerca de 90% ou mais de identidade de sequência.

[0051] Condições moderadas são aqui definidas como condições que permitem que sequências de ácidos nucleicos de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridizem a uma temperatura de cerca de 45ºC em uma solução contendo cerca de 1 M de sal, de preferência 6 x SSC ou qualquer outra solução com uma força iônica comparável, e lavagem à temperatura ambiente em uma solução contendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução com força iônica comparável.

[0052] De preferência, a hibridização é realizada de um dia para o outro, isto é, pelo menos por 10 horas, e de preferência a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas de solução de lavagem. Estas condições irão normalmente permitir a hibridização específica de sequências com até 50% de identidade de sequência. O especialista na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização, para identificar especificamente sequências que variam em identidade entre 50% e 90%.

[0053] Neste contexto, "heterólogo", em referência a um ácido nucleico ou proteína, é um ácido nucleico ou proteína que se origina de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa na composição e ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual o gene estrutural foi derivado ou, se da mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados em relação à sua forma original. Uma proteína heteróloga pode se originar de uma espécie estranha ou, se pertencer à mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[0054] O termo "expressão heteróloga" refere-se à expressão de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula hospedeira. A expressão de proteínas heterólogas em sistemas de células hospedeiras eucarióticas, como leveduras, é bem conhecida dos especialistas na técnica. Um polinucleotídeo contendo uma sequência de ácido nucleico de um gene que codifica uma enzima com uma atividade específica pode ser expresso nesse sistema eucariótico Em algumas modalidades, células de levedura transformadas/transfectadas podem ser empregadas como sistemas de expressão para a expressão das enzimas. Expressão de proteínas heterólogas em leveduras é bem conhecida. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics (Métodos em Genética de leveduras), Cold Spring Harbor Laboratory (1982) é um trabalho bem reconhecido que descreve os vários métodos disponíveis para expressar proteínas em leveduras. Duas leveduras amplamente utilizadas são Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Vetores, cepas e protocolos para expressão em Saccharomyces e Pichia são conhecidos na arte e estão disponíveis em fornecedores comerciais (por exemplo, Invitrogen). Vetores adequados geralmente têm sequências de controle de expressão, como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool oxidase, e uma origem de replicação, sequências de terminação e similares, conforme desejado.

[0055] Neste contexto, "promotor" é uma sequência de DNA que direciona a transcrição de um gene (estrutural). Tipicamente, um promotor está localizado na região 5' de um gene, proximal ao sítio de início da transcrição de um gene (estrutural). Sequências de promotor podem ser constitutivas, induzíveis ou repressíveisó. Em uma modalidade, não há indutor (externo) necessário.

[0056] O termo "vetor", neste contexto, inclui referência a um vetor de expressão autossômico e a um vetor de integração usado para integração no cromossomo.

[0057] O termo "vetor de expressão" refere-se a uma molécula de DNA, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica um polipeptídeo de interesse sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) segmentos adicionais de ácido nucleico que proporcionam sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um intensificador, um sinal de poliadenilação e similares. Vetores de expressão são geralmente derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos. Em particular, um vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende na direção 5 'a 3' e operacionalmente ligadas: (a) uma região de transcrição e início de tradução reconhecida por levedura, (b) uma sequência de codificação para um polipeptídeo de interesse e (c)

uma região de terminação de transcrição e tradução reconhecida por levedura. "Plasmídeo" refere-se a DNA extracromossômico de replicação autônoma, que não é integrado a um genoma de micro- organismo e geralmente é de natureza circular.

[0058] Um "vetor de integração" refere-se a uma molécula de DNA, linear ou circular, que pode ser incorporada em um genoma de microrganismo e provê herança estável de um gene que codifica um polipeptídeo de interesse. O vetor de integração geralmente compreende um ou mais segmentos contendo uma sequência de genes que codifica um polipeptídeo de interesse sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) segmentos adicionais de ácido nucleico que proporcionam sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras e um ou mais segmentos que acionam a incorporação do gene de interesse no genoma da célula alvo, geralmente pelo processo de recombinação homóloga. Tipicamente, o vetor de integração será aquele que pode ser transferido para a célula alvo, mas que possui um replicon que não é funcional nesse organismo. A integração do segmento compreendendo o gene de interesse pode ser selecionada se um marcador apropriado for incluído nesse segmento.

[0059] Por "célula hospedeira" entende-se uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor.

[0060] "Transformação" e "transformar", neste contexto, refere-se à inserção de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, captação diretay transdução, f-mating ou eletroporação. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente, pode ser integrado ao genoma da célula hospedeira.

[0061] A célula de levedura recombinante é preferivelmente selecionada no grupo de Saccharomycetaceae, como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces beticus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces uvarum e Saccharomyces bayanus; Schizosaccharomyces, tais como Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus e Schizosaccharomyces cryophilus; Torulaspora como Torulaspora delbrueckii; Kluyveromyces como Kluyveromyces marxianus; Pichia como Pichia stipitis, Pichia pastoris ou pichia angusta, Zygosaccharomyces como Zygosaccharomyces bailii; Brettanomyces como Brettanomyces intermedius, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera Bruxellis e Dekkera anomala; Metschnikowia, Issatchenkia, como Issatchenkia orientalis, Kloeckera, como Kloeckera apiculataa Aureobasidium como Aureobasidium pullulans.

[0062] Em uma modalidade, a célula de levedura é selecionada no grupo de Saccharomycetaceae. Em particular, bons resultados foram alcançados com uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

[0063] O Rubisco pode, em princípio, ser selecionado dentre Rubiscos eucarióticos e procarióticos. O Rubisco é preferivelmente oriundo de um organismo não fototrófico. Em particular, o Rubisco pode ser de um micro-organismo quimiolitoautotrófico. Bons resultados foram alcançados com um Rubisco bacteriano.

[0064] De preferência, o Rubisco bacteriano origina-se de um Thiobacilus, em particular, Thiobacillus denitrificans, que é quimiolitoautotrófico. O Rubisco pode ser um Rubisco de subunidade única ou um Rubisco com mais de uma subunidade. Em particular, bons resultados foram alcançados com uma única subunidade Rubisco. Em particular, bons resultados foram alcançados com um Rubisco de forma

Il, mais em particular o cbbM. Um Rubisco adequado de acordo com a invenção é codificado pelo gene cbbM de Thiobacillus denitrificans. Uma alternativa a este Rubisco, é um homólogo funcional deste Rubisco, em particular o homólogo funcional compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com o do gene cbbM de Thiobacillus denitrificans. Polipeptídeos Rubisco naturais adequados são dados na Tabela 1, com identidade com o do gene cbbM de Thiobacillus denitrificans Tabela 1: Polipeptídeos Rubisco naturais adequados para expressão | Sderogdans fihamopicas EST roseta | FRisToRass nespolismas se vp oosaee nao

[0065] De acordo com a invenção, Rubisco é funcionalmente expresso no micro-organismo, pelo menos durante o uso em um processo industrial para preparação de um composto de interesse.

[0066] Para aumentar a probabilidade de que aqui a atividade enzimática seja expressa em níveis suficientes e em forma ativa nas células hospedeiras transformadas (recombinantes) da invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica essas enzimas, bem como a enzima Rubisco e outras enzimas da invenção (consulte abaixo), são preferivelmente adaptadas para otimizar seu uso de códons ao da célula hospedeira em questão. A adaptabilidade de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima ao uso de códons de uma célula hospedeira pode ser expressa como índice de adaptação de códons (CAI). O índice de adaptação de códons é aqui definido como uma medida da adaptabilidade relativa do uso de códons de um gene em relação ao uso de códons de genes altamente expressos em uma célula ou organismo hospedeiro específico. A adaptabilidade relativa (w) de cada códon é a razão entre o uso de cada códon e a do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice CAI é definido como a média geométrica desses valores relativos de adaptabilidade. Códons não sinônimos e códons de terminação (dependentes do código genético) são excluídos. Valores de CAI variam de O a 1, com valores mais altos indicando uma proporção maior dos códons mais abundantes (ver Sharp e Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; também ver: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res 31 (8): 2242-51). Uma sequência de nucleotídeos adaptada possui preferivelmente um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9. Em uma modalidade, as sequências que foram otimizadas quanto a códons para expressão na célula hospedeira fúngica em questão, como por exemplo células de S. cerevisiae.

[0067] De preferência, o RuUBisCO expresso funcionalmente tem uma atividade, definida pela taxa de incorporação de bicarbonato-"*C dependente de ribulose-1,5-bifosfato por extratos celulares, de pelo menos 1 nmol.min"'. (mg de proteína), em particular uma atividade de pelo menos 2 nmol.min'.mg de proteína), mais em particular uma atividade de pelo menos 4 nmol.min'.(mg de proteína). O limite superior para a atividade não é crítico. Na prática, a atividade pode ser de cerca de 200 nmol.min'!. (mg de proteína) ou menos, em particular nmol.min-1. (mg de proteína), mais em particular 15 nmol.min"!.(mg de proteína) ou menos, por exemplo cerca de 10 nmol.min.(mg de proteína) ou menos. As condições para um ensaio para determinar esta atividade de Rubisco são as encontradas nos Exemplos.

[0068] A sequência de ácido nucleico do RUBISCO pode ser de Thiobacillus denitrificans, ou ele pode codificar um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, ou é um homólogo funcional do mesmo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50% , pelo menos 60%, pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; preferivelmente com pelo menos 80%, pelo menos 85%, 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1, ou é um homólogo funcional que é derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0069] Uma fosforribuloquinase funcionalmente expressa (PRK, (EC 2.7.1.19)) de acordo com a invenção é capaz de catalisar a reação química:

[0070] ATP + D-ribulose 5-fosfato =ADP + D-ribulose 1,5-bifosfato (1)

[0071] Assim, os dois substratos desta enzima são ATP e D- ribulose 5-fosfato; seus dois produtos são ADP e D-ribulose1,5- bisfosfato.

[0072] A sequência de ácido nucleico de PRK pode ser de Spinacia oleracea, ou ela pode codificar um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2, ou é um homólogo funcional do mesmo, com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50% , pelo menos 60%, pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; preferivelmente com pelo menos 80%, pelo menos 85%, 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou é um homólogo funcional que é derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0073] O PRK pertence à família das transferases, especificamente aquelas que transferem grupos contendo fósforo (fosfotransferases)

com um grupo álcool como aceptor. O nome sistemático dessa classe de enzima é ATP: D-ribulose-5-fosfato 1-fosfotransferase. Outros nomes de uso comum incluem fosfopentoquinase, ribulose-5-fosfato quinase, fosfopentoquinase, fosforribuloquinase (fosforilação), 5- fosforribulose quinase, ribulose fosfato quinase, PKK, PRuK e PRK. Esta enzima participa da fixação do carbono. O PRK pode ser de um procariota ou um eucariota. Bons resultados foram alcançados com um PRK originário de um eucariota. Preferivelmente, o PRK eucariótico se origina de uma planta selecionada entre Caryophyllales, em particular de Amaranthaceae, mais em particular de Spinacia. Como uma alternativa ao PRK de Spinacia, pode estar presente um homólogo funcional de PRK de Spinacia, em particular um homólogo funcional compreendendo uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com o PRK de Spinacia. Os polipeptídeos PRK naturais adequados são dados na Tabela 2. Tabela 2: Polipeptídeos PRK naturais adequados para expressão com identidade com PRK de Spinacia ser Deo —

[0074] Em uma modalidade, o microrganismo recombinante compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais chaperonas moleculares procarióticas ou eucarióticas heterólogas, as quais - quando expressas - são capazes de interagir funcionalmente com uma enzima no microrganismo, em particular com pelo menos uma entre Rubisco e PRK.

[0075] Chaperoninas são proteínas que fornecem condições favoráveis para o dobramento correto de outras proteínas, impedindo, assim, a agregação. Proteínas recém-fabricadas geralmente devem se dobrar de uma cadeia linear de aminoácidos para uma forma tridimensional. As chaperoninas pertencem a uma grande classe de moléculas que auxiliam a dobragem de proteínas, chamadas chaperonas moleculares. A energia para dobrar proteínas é fornecida pelo trifosfato de adenosina (ATP). Um artigo de revisão sobre chaperonas que é útil aqui é escrito por Yébenes (2001); “Chaperonins: two rings for folding” (Chaperoninas: dois anéis para dobramento); Hugo Yébenes et al. Trends in Biochemical Sciences, Agosto de 2011, vol. 36, n.8.

[0076] Em uma modalidade, a chaperona ou chaperonas são de uma bactéria, mais preferivelmente de Escherichia, em particular E. coli; GroEL e GroEs de E. coli podem, em particular, ser codificadas em um micro-organismo de acordo com a invenção. Em uma modalidade, chaperonas são chaperonas de Saccharomyces, em particular Hsp10 e Hsp60 de Saccharomyces cerevisiae. Se as chaperonas forem naturalmente expressas em uma organela como uma mitocôndria (exemplos são Hsp60 e Hsp10 de Saccharomyces cerevisiae), pode-se conseguir a realocação para o citosol, por exemplo, modificando-se a sequência de sinal nativa das chaperoninas. Nos eucariotos, as proteínas Hsp60 e Hsp10 são estrutural e funcionalmente quase idênticas a GroEL e GroES, respectivamente. Assim, é contemplado que Hsp60 e Hsp10 de qualquer célula de levedura recombinante possam servir como chaperona para o Rubisco. Ver Zeilstra-Ryalls J, Fayet O, Georgopoulos C (1991). "The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins" (As chaperoninas GroE (Hsp60) universalmente conservadas". Annu Rev Microbiol. 45: 301-—25. doi: 101146 annurev.mi.45.100191.001505. PMID 1683763 e Horwich AL, Fenton WA, Chapman E, Farr GW (2007). "Two Families of Chaperonin:

Physiology and Mechanism" (Duas famílias de chaperoninas: fisiologia e mecanismo) Ann Rev Cell Dev Biol. 23: 11545. doi

10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555. PMID 17489689. Foram obtidos bons resultados com uma célula de levedura recombinante compreendendo as chaperonas heterólogas GroEL e GroES. Como uma alternativa a GroES, um homólogo funcional de GroES pode estar presente, em particular um homólogo funcional contendo uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com GroES. Chaperonas naturais adequadas, homólogas em polipeptídeo a GroES, são apresentadas na Tabela 3. Tabela 3: Chaperonas naturais homólogas a polipeptídeos GroES adequadas para expressão >gi[115388105|ref|lXP 001211558.1/:2-101 proteína de choque térmico de >gi[116196854]|ref|XP 001224239.1/:1-102 proteína hipotética conservada >gi[119175741|ref|XP. 001240050.1/:3-102 proteína hipotética >gil[119471607|ref|lXP 001258195.1/:12-111 chaperonina, putativa >gi[121699818|ref|XP 001268174.1/:8-106 chaperonina, putativa >gil[126274604]|ref|lXP 001387607.1/:2-102 proteína predita >gi[146417701|ref|XP 001484818.1/:5-106 proteína hipotética conservada >gi[154303611|ref|XP. 001552212.1/:1-102 proteína de choque térmico de >gil156049571|ref|XP. 001590752.1/:1-102 proteína hipotética

>gi[156840987|ref|XP 001643870.1/:1-103 proteína hipotética >gil169608295|ref|XP. 001797567.1/:1-101 proteína hipotética >gi[171688384|ref|XP 001909132.1/:1-102 proteína hipotética [Podospora >gi[189189366|ref|lXP 001931022.1/:71-168 chaperonina de 10 kDa >gi[19075598|ref|lNP 588098.1/:1-102 proteina de choque térmico >gi/212530240|ref|XP 002145277.1/:3-100 chaperonina, putativa >gi/212530242|ref|XP 002145278.1/:3-95 chaperonina, putativa >gi/213404320|ref|XP 002172932.1/:1-102 proteína de choque térmico >gi/225557301|gb|EEHOSS87.1/:381-478 fator de poliadenilação de pre- >gi/225684092|/gb|EEH22376.1/:3-100 proteina de choque térmico >gi/238490530|ref|XP 002376502 .1/:2-104 chaperonina, putativa >gil238878220|gb|EEQ41858.1/:1-106 proteína de choque térmico de10 >gi/240280207|gb|EER43711.1/:426-523 fator de poliadenilação de pre- >gi/241950445|ref|XP. 002417945.1/:1-103 —chaperonina de 10kDa, putativa; proteína de choque térmico mitocondrial de 10 kda (hsp10), putativa [Candida dubliniensis CD36]

>gi/242819222|ref|XP 002487273.1/:920-182 chaperonina, putativa

>gi/254566327|ref|XP 002490274.1/:1-102 proteína putativa de função >gi/254577241|ref|XP. 002494607.1/:1-103 ZYROOAO5434p >gi/255717999|ref|XP. 002555280.1/:1-103 KLTHOGO5588p [Lachancea >gi/255956581|ref|XP. 002569043.1/:2-101/ —Pc21920560 [Penicillium >gi/258572664|ref|XP 002545094.1/:16-108 chaperonina GroS >gi/261190594|ref|XP 002621706.1/:3-100 —chaperonina [Ajellomyces >gi/295664909|ref|XP 002793006.1/:3-100 proteína de choque térmico >gi/296412657|ref|XP 002836039.1/:76-177 proteína hipotética [Tuber >gil302307854|ref|lNP 984626.2/:2-102 AEL235Wp [Ashbya gossypii >gi/302894117|ref|lXP 003045939.1/:1-102 proteína predita [Nectria >gil303318351|ref|XP 003069175.1/:3-100 proteína de choque térmico de >gil3810795300|gb|EFQASO761.1/:1-102 chaperonina 10 kDa subunidade >gil315053085|ref|XP 003175916.1/:12-109 chaperonina GroS >gi[317032114|ref|lXP 001394060.2/:334-433 proteína de choque térmico >gil317032116|ref|lXP 001394059.2/:2-101 proteína de choque térmico >gil320583288|gb|EFWS97503.1/:6-106 chaperonina, proteína de choque

>gi/320591507 | gb|EFX03946.1/:1-102 proteina de choque térmico >gi/322700925|gb|EFY92677.1/:1-102 chaperonina [Metarhizium acridum >gi/l325096696|gb|EGC50006. 1/:409-506 fator de poliadenilação de pre- >gi/32647 1604/gb|EGD95613.1/:14-111 chaperonina subunidade 10 Kd >gi/327293056|ref|XP 003231225.1/:3-100 chaperonina [Trichophyton >gil3830942654|ref|XP 003306155.1/:37-136 proteína hipotética >gil3836268042|ref|XP. 003348786.1/:47-147 proteína hipotética >gi/l340519582|gb|EGR49820.1/|:1-109 proteína predita [Trichoderma reesei >gil3840960105|gb|EGS21286.1/:3-103 proteína de choque térmico de 10 kDa, putativa mitocondrial [Chaetomium thermophilum var. thermophilum DSM 1495] >gil342883802|gb|EGU84224.1/:1-102 proteína hipotética FOXB 05181 >gi/344302342|gb|EGW32647 .1/:2-102 proteína hipotética >gil845570750|gb|EGX53571.1/:1-102 proteína hipotética >gi/346321154|/gb|EGX90754.1/:1-102 chaperonina [Cordyceps militaris >gi/l346970393|/gb|EGY 13845.1/:1-102 protejna de choque térmico >gi/l354548296/Jemb|CCE45032.1/:1-106 proteína hipotética

>gil3858385052|gb|EHK22649.1/:1-102 proteína hipotética >gil358393422|/gb|EHK42823.1/:1-101 proteína hipotética >gi/361126733|/gb|EHK98722.1/:1-97 proteína de choque térmico de 10 >gi/363753862]|ref|lXP 003647147 .1/:2-102 proteína hipotética Ecym 5593 >gi/l365758401|gb|EHNO0244.1/:1-106 Hsp10p [Saccharomyces cerevisiae >gil365987664]|ref|XP 003670663.1/:1-103 proteína hipotética >gil3866995125|ref|XP. 003677326.1/:1-103 proteína hipotética >gil866999797|ref|XP. 003684634.1/:1-103 proteína hipotética >gil3867009030|ref|XP 003679016.1/:1-103 proteína hipotética >gil367023138|ref|lXP. 003660854.1/:1-104 proteína hipotética >gi/367046344]|ref|XP 003653552.1/:1-102 proteína hipotética >gil378726440|gb|EHY52899.1/:9-109 chaperonina GroES [Exophiala >gi/l380493977 Jemb|CCF33483.1/:1-102 chaperonina subunidade de 10 >gil885305728|gb|EIF49680. 1/:1-102 proteína de choque térmico de 10 kDa >gil389628546]|ref|XP 003711926.1/:1-102 proteina similar a hsp1O >gil396462608|ref|XP. 003835915.1/:1-101 similar a proteína de choque

>gil398392541|ref|XP 003849730.1/:1-102 proteína hipotética >gil400597723|/gb|EJP65453.1/:24-124 chaperonina subunidade de 10 kDa >gi[401623646|gb|EJS41738.1/:1-106 hsp10p [Saccharomyces arboricola >gil401842164|/gb|EJT44422.1/:1-92 — proteena — similar a HSP1O >gil402084027|gb|EJT79045.1/:1-102 proteína similar a hsp10 protein >gil403215209/Jemb|CCK69709.1/:1-104 proteína hipotética >gil406604629 /emb|CCH43969.1/:4-100 proteína hipotética BN7 3524 >gil406867021|gb|EKD20060.1|/:56-156 proteína hipotética MBM 02012 >gil407926227|gb|EKG19196.1/:74-174 proteina similar a GroES >gil408398157|gb|EKJ77291.1/:11-111 proteína hipotética FPSE 02566 >gil410082063|ref|XP 003958610.1/:1-103 proteína hipotética >gil425777664|/9b|EKV15823.1/:58-157 Chaperonina, putativa [Penicillium >gil440639680|gb|ELRO9599.1/:1-102. chaperonina GroES [Geomyces >gil444323906|ref|XP 004182593.1/:1-105 proteína hipotética >gil448083208|ref|XP 004195335.1/:2-101 PisoO 005888 [Milerozyma >gil448087837|ref|XP. 004196425.1/:2-102 PisoO 005888 [Millerozyma

>gil448534948|ref|XP 003870866.1/:1-106 proteina Hsp1i0 [Candida >gil449295977 | gb|EMC91998.1/:1-102 proteína hipotética >gil46123659|ref|XP 386383.1/:3-103 proteína hipotética FGO06207.1 >gi/50289455|ref|XP 447159.1/:1-103 proteína hipotética [Candida glabrata >gi/50308731|ref|lXP 454370.1/:1-103 proteína hipotética [Kluyveromyces >gi/50411066|ref|lXP 457014.1/:1-106 DEHA2ZB01122p [Debaryomyces >gil51013895| gb|AAT93241.1/:1-106 YOR020C [Saccharomyces >gi/l6324594|ref|NP. 014663.1/:1-106 Hsp10p [Saccharomyces cerevisiae >gil67523953|ref|XP. 660036.1/:2-101 proteína hipotética AN2432.2 >gi/70992219|ref|XP 750958.1/:12-106 chaperonina [Aspergillus fumigatus >gil85079266|ref|XP. 956315.1/:1-104 proteina hipotética NCUD4334

[0077] Como alternativa a GroEL, pode estar presente um homólogo funcional de GroEL, em particular um homólogo funcional contendo uma sequência que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com SEQUENCE of GroEL (SEQUÊNCIA de GroEL). Chaperonas naturais adequados homólogas em polipeptídeos a GroEL são apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Chaperonas naturais homólogas a polipeptídeos GroEL adequadas para expressão

>gi[115443330|ref|XP 001218472.1) proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Aspergillus terreus NIH2624] >gi[114188341|gb|EAU3SO041.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Aspergillus terreus NIH2624] >gi[119480793|ref|XP 001260425.1) proteína mitocondrial antigênica HSP60, putativa [Neosartorya fischeri NRRL 181] >gil119408579|/gb|EAW18528.1| proteína mitocondrial antigênica HSP6O0, putativa [Neosartorya fischeri NRRL 181] >gi[126138730|ref|lXP 001385888.1| proteína hipotética PICST 90190 [Scheffersomyces stipitis CBS 6054] >gil126093166|gb|ABN67859.1| proteína de choque térmico tipo groEL mitocondrial [Scheffersomyces stipitis CBS 6054] >gi[145246630|ref|XP 001395564.1| proteína de choque térmico 60 [Aspergillus niger CBS 513.88] >gi[134080285 Jemb|CAK46207.1| produto proteico sem nome [Aspergillus niger] >gil850636909|gb|EHA25267.1| proteína hipotética ASPNIDRAFT 54001 [Aspergillus niger ATCC 1015] >gi[146413148|ref|lXP 001482545.1| proteina de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260] >gi[154277022]|ref|lXP 001539356.1) proteina de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Ajellomyces capsulatus NAm1] >gi[150414429|gb|EDNO09794.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Ajellomyces capsulatus NAM1] >gi[154303540|ref|XP 001552177.1| proteina de choque térmico 60 [Botryotinia fuckeliana BO5.10] >gi/347840915/emb|CCD55487.1| similar a proteína de choque térmico 60 [Botryotinia fuckeliana] >gi[156063938|ref|XP 001597891.1) proteina de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Sclerotinia sclerotiorum 1980] >gi[154697421|gb|EDN97159.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Sclerotinia sclerotiorum 1980 UF-70] >gil156844469|ref|lXP 001645297.1| proteína hipotética Kpol 1037p35 [Vanderwaltozyma polyspora DSM 70294] >gi[156115957|gb|EDO17439.1| proteína hipotética Kpol 1037p35 [Vanderwaltozyma polyspora DSM 70294] >gi[16416029/emb|CAB91379.2| provável proteína de choque térmico hsp60 [Neurospora crassa] >gil350289516|gb|EGZ70741.1| proteína de choque térmico putativa hsp60 [Neurospora tetrasperma FGSC 2509] >gi[169626377|ref|XP 001806589.1) proteína hipotética SNOG 16475 [Phaeosphaeria nodorum SN15] >gil111055053|gb|EAT76173.1| proteína hipotética SNOG 16475 [Phaeosphaeria nodorum SN15]

>gi[169783766|ref|lXP 001826345.1) proteina de choque térmico 60 [Aspergillus oryzae RIB40] >gi/238493601|ref|XP 002378037.1| proteína mitocondrial antigênica HSP60, putativa [Aspergillus flavus NRRL3357] >gi/[83775089|dbj|BAE65212.1| produto proteico sem nome [Aspergillus oryzae RIB40] >gil220696531|gb|EED52873.1| proteina mitocondrial antigênica HSPG6O, putativa [Aspergillus flavus NRRL3357] >gi/391869413|gb|EIT78611.1] chaperonina, Cpn60/Hsp60p [Aspergillus oryzae 3.042] >gi[189190432|ref|XP 001931555.1) proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Pyrenophora triticic-repentis Pt-1C-BFP] >gi[187973161|/gb|EDU40660.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP] >gi[190348913|/gb|EDK41467.2| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260] >gi/225554633|/gb|EEHO2929.1| proteína similar a hsp60 [Ajellomyces capsulatus G186AR] >gil238880068|gb|EEQ43706.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Candida albicans WO-1] >gi/239613490|gb|EEQ90477.1| chaperonina GroL [Ajellomyces dermatitidis ER-3] >gi/240276977|gb|EER40487.1| proteína similar a hsp60 [Ajellomyces capsulatus H143] >gi/241958890|ref|XP 002422164.1| proteína de choque térmico 60, precursor — mitocondrial, — putativa — [Candida — dubliniensis —CD36] >gi/223645509/emb|CAX40168.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial, putativa [Candida dubliniensis CD36] >gi/254572906|ref|XP 002493562.1| chaperonina tetradecamérica mitocondrial [Komagataella pastoris GS115] >gi/238033361 /emb|CAY71383.1| chaperonina tetradecamérica mitocondrial [Komagataella pastoris GS115] >gi/254579947 |ref|lXP. 002495959.1) ZYROOCO7106p [Zygosaccharomyces rouxii] >gi/238938850 /emb|CAR27026.1| ZYROOCO07106p [Zygosaccharomyces rouxii] >gi/255712781|ref|lXP 002552673.1| KLTHOC10428p [Lachancea thermotolerans] >gi/238934052/emb|CAR22235.1| KLTHOC10428p [Lachancea thermotolerans CBS 6340] >gi/255721795|ref|XP 002545832.1)| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Candida tropicalis MYA-3404] >gi/240136321|gb|EER3S5874.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Candida tropicalis MY A-3404] >gi/255941288|ref|XP. 002561413.1| Pc16911070 [Penicillium chrysogenum Wisconsin —54-1255] >gil211586036/emb|CAP93777.1] Pci6g11070 [Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255]

>gi/259148241 /emb|CAY81488.1) Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae EC1118] >gi/260950325|ref|XP 002619459.1) proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Clavispora lusitaniae ATCC 42720] >gi/238847031|gb|EEQ36495.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Clavispora lusitaniae ATCC 42720] >gi/261194577|ref|XP 002623693.1)] chaperonina Grol [Ajellomyces dermatitidis SLH14081] >gi/239588231|gb|EEQ70874.1| chaperonina Grol [Ajellomyces — dermatitidis SLH14081] >gil327355067 | gb|EGE83924.1| chaperonina GroL [Ajellomyces dermatitidis ATCC 18188] >gi/296422271|ref|lXP 002840685.1| proteína hipotética [Tuber melanosporum Mel28] >gi/295636906|emb|CAZ84876.1| produto proteico

Pp 9 Pp Pp sem nome [Tuber melanosporum] >gi/296809035|ref|XP 002844856.1| proteína de choque térmico 60 [Arthroderma otae CBS 113480] >gi/238844339|gb|EEQ34001.1| proteína de choque térmico 60 [Arthroderma otae CBS 113480] >gil802308696|ref|NP. 985702.2| AFR155Wp [Ashbya gossypii ATCC 10895] >gi/299790751|gb|AASS3526.2] AFR155Wp [Ashbya gossypii ATCC 10895] >gi[374108933|gb|AEY97839.1] FAFR155Wp [Ashbya gossypii FDAG1] >gi/302412525|ref|lXP. 003004095.1| proteína de choque térmico [Verticillium albo-atrum VaMs.102] >gi/261356671 | gb|EEY 19099.1| proteína de choque térmico [Verticillium albo-atrum VaMs.102] >gil802505585|ref|XP 003014499.1) proteína hipotética ARB 07061 [Arthroderma benhamiae CBS 112371] >gil291178320|gb|EFE3S4110.1| proteína hipotética ARB 07061 [Arthroderma benhamiae CBS 112371] >gil302656385|ref|lXP 003019946.1) proteina hipotética TRV 05992 [Trichophyton verrucosum HKI 0517] >gil291183723|/gb|EFE39322.1| proteína hipotética TRV 05992 [Trichophyton verrucosum HKI 0517] >gi/l302915513|ref|XP 003051567 .1| proteína predita [Nectria haematococca mMpVI 77-13-4] >gil256732506|gb|EEU45854.1| proteína predita [Nectria haematococca mpV! 77-13-4] >gil3810794550|gb|EFQ3S0011.1| chaperonina GroL [Glomerella graminicola M1.001] >gil315048491|ref|XP 003173620.1] chaperonina Grol [Arthroderma gypseum CBS 118893] >gil311341587|gb|EFROO790.1| chaperonina Grol [Arthroderma gypseum CBS 118893] >gi/320580028|gb|EFW94251.1| chaperonina tetradecamérica mitocondrial [Ogataea parapolymorpha DL-1] >gil3820586014|gb|EFW98693.1| precursor mitocondrial de proteína de choque térmico [Grosmannia clavigera kw1407] >gil322692465|gb|EFY84374.1| precursor de proteína de choque térmico 60 (Antigen HIS-62) [Metarhizium acridum CQMa 102] >gil322705285|gb|EFY96872.1| Proteína de choque térmico 60 (Antigen HIS- 62) [Metarhizium anisopliae ARSEF 23]

>gil823303806|gb|EGAS7589.1)/ Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae FostersB] >gil323307999|gb|EGA61254.1)/ Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae FostersO] >gil323332364|/gb|EGA73773.1] Hsp6O0Op [Saccharomyces cerevisiae AWRI796] >gi/l326468648|/gb|EGD92657.1) proteenra de choque térmico 60 [Trichophyton/ tonsurans CBS 112818] >gil326479866|/gb|EGE03876.1| chaperonina GroL [Trichophyton equinum CBS 127.97] >gil330915493|ref|XP. 003297052.1) proteina hipotética PTT 07333 [Pyrenophora teres f. teres 0-1] >gil311330479|gb|EFQ94847.1| proteína hipotética PTT 07333 [Pyrenophora teres f. teres 0-1] >gil336271815|ref|lXP 003350665.1) proteína hipotética SMAC 02337 [Sordaria macrospora k-helll >gil880094827 emb|CCC07329.1| produto proteico sem nome [Sordaria macrospora k-hell] >gil336468236|/gb|EGO56399.1| proteína hipotética NEUTE1IDRAFT 122948 [Neurospora tetrasperma FGSC 2508] >gi/340522598|gb|EGR52831.1| proteína similar a precursor mitocondrial hsp60 [Trichoderma reesei QM6a] >gi/341038907 | gb|EGS23899.1| proteína similar a proteína de choque térmico mitocondrial 60[Chaetomium thermophilum var. thermophilum DSM 1495] >gi/342886297 | gb|EGU86166.1| proteína hipotética FOXB 03302 [Fusarium oxysporum Fo5176] >gil344230084|gb|EGV61969.1| chaperonina GroL [Candida tenuis ATCC 10573] >gil344303739|gb|EGW33988.1| proteína hipotética SPAPADRAFT 59397 [Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907] >gil3845560428|gb|EGX43553.1| proteína hipotética AOL s002159289 [Arthrobotrys oligospora ATCC 24927] >gi/l346323592|gb|EGX93190.1| proteína de choque térmico 60 (Antigen HIS- 62) [Cordyceps militaris CMO1] >gi/346975286|gb|EGY 18738.1| proteína de choque térmico [Verticillium dahliae VdLs.17] >gil854545932 /emb|CCE42661.1| proteína hipotética CPAR2 203040 [Candida parapsilosis] >gil358369894|/dbj| GAA8S6507.1| proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial [Aspergillus kawachii IFO 4308] >gil858386867 | gb|EHK24462.1| proteína hipotética TRIVIDRAFT 79041 [Trichoderma virens Gv29-8] >gil858399658|gb|EHK48995.1| proteína hipotética TRIATDRAFT 297734 [Trichoderma atroviride IMI 206040]

>gi/363750488|ref|lXP 003645461.1) proteina hipotética Ecym 3140 [Eremothecium cymbalariae DBVPGH7215] >gil856889095|gb|AET38644.1| Proteína hipotética Ecym 3140 [Eremothecium cymbalariae DBVPGAH7215] >gi/l365759369|/gb|EHNO1160.1) Hsp6O0p [Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces kudriavzevii VIN7] >gil365764091|gb|EHNOS6S16.1) Hsp6Op [Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces kudriavzevii VIN7] >gil865985626|ref|XP. 003669645.1| proteína hipotética NDAI 0DO00880 [Naumovozyma dairenensis CBS 421] >gil343768414/Jemb|CCD24402.1) proteína hipotética NDAI 0D00880 [Naumovozyma dairenensis CBS 421] >gil866995970|ref|XP. 003677748.1| proteína hipotética NCAS 0H00890 [Naumovozyma castellii CBS 4309] >gil342303618 Jemb|CCC71399.1) proteína hipotética NCAS 0H00890 [Naumovozyma castellii CBS 4309] >gil867005154|ref|XP 003687309.1| proteína hipotética TPHA 0J00520 [Tetrapisispora phaffii CBS 4417] >gil357525613/Jemb|CCE64875.1| proteína hipotética TPHA 0J00520 [Tetrapisispora phaffii CBS 4417] >gil3867017005|ref|lXP 003683001.1| proteína hipotética TDEL 0G04230 [Torulaspora — delbrueckii]l — >gil3859750664/Jemb|CCE93790.1| proteína hipotética TDEL 0G04230 [Torulaspora delbrueckii] >gil867035486|ref|XP. 003667025.1| proteína hipotética MYCTH 2097570 [Myceliophthora thermophila ATCC 42464] >gil847014298|gb|AEO61780.1| proteína hipotética MYCTH 2097570 [Myceliophthora thermophila ATCC 42464] >gil867055018|ref|XP. 003657887.1|] proteína hipotética THITE 127923 [Thielavia terrestris NRRL 8126] >gil347005153|gb|AEO71551.1| proteína hipotética THITE 127923 [Thielavia terrestris NRRL 8126] >gil378728414|gb|EHY54873.1| proteína de choque térmico 60 [Exophiala dermatitidis NIH/UT8656] >gil880494593 /emb|CCF33032.1)| proteina de choque térmico 60 [Colletotrichum higginsianum] >gil885305893|gb|EIF49836.1| proteína de choque térmico 60 [Dekkera bruxellensis AWRI1499] >gil389638386|ref|lXP 003716826.1)] proteina de choque térmico 60 [Magnaporthe oryzae 70-15] >gil351642645|/gb|EHASOS507.1| proteína de choque térmico 60 [Magnaporthe oryzae 70-15] >gil440474658|/gb|ELQ43388.1)] proteina de choque térmico &6O [Magnaporthe oryzae Y34] >gil440480475|/gb|ELQ61135.1| proteína de choque térmico 60 [Magnaporthe oryzae P131] >gi/393243142|gb|EJD50658.1| chaperonina GroL [Auricularia delicata TFB- 10046 SS5]

>gil3896494741|ref|XP 003844378.1| similar a proteína de choque térmico 60 [Leptosphaeria maculans JN3] >gil312220958Jemb|CBY00899.1| similar a proteína de choque térmico 60 [Leptosphaeria maculans JN3] >gil3898393428|ref|XP. 003850173.1| chaperona ATPase HSP60 [Zymoseptoria tritici IPO323] >gil339470051|gb|EGP85149.1| proteína hipotética MYCGRDRAFT 75170 [Zymoseptoria tritici IPO323] >gil401624479|gb|EJS42535.1| hsp60p [Saccharomyces arboricola H-6] >gi[401842294|gb|EJT44530.1| Proteína similar a hsp60 [Saccharomyces kudriavzevii IFO 1802] >gil402076594|gb|EJT72017.1)] protemra de choque térmico 60 [Gaeumannomyces graminis var. tritici R3-111a-1] >gil403213867 emb|CCK68369.1| proteína hipotética KNAG 0A07160 [Kazachstania naganishii CBS 8797] >gil406606041 /emb|CCH42514.1) Proteína de choque térmico 60, mitocondrial [Wickerhamomyces ciferrii] >gil406863285|/gb|EKD16333.1| proteína de choque térmico 60 [Marssonina brunnea f. sp. 'multigermtubi' MB m1] >gi/407922985|/gb|EKG16075.1)] Chaperonina Cpn60 [Macrophomina phaseolina MS6] >gil408399723|/gb|EKJ78816.1| proteína hipotética FPSE 00959 [Fusarium pseudograminearum CS3096] >gil410083028|ref|XP. 003959092.1| proteína hipotética KAFR 0101760 [Kazachstania africana CBS 2517] >gil372465682/Jemb|CCF59957.1| proteína hipotética KAFR 0101760 [Kazachstania africana CBS 2517] >gil444315528|ref|XP. 004178421.1| proteína hipotética TBLA 0BOO580 [Tetrapisispora blattae CBS 6284] >gil387511461 Jemb|CCH58902.1| proteína hipotética TBLA 0BOO0580 [Tetrapisispora blattae CBS 6284] >gil448090588|ref|XP. 004197110.1) Piso0 004347 [Milerozyma farinosa CBS 7064] >gi|448095015|ref|XP. 004198141.1| Piso0 004347 [Millerozyma farinosa CBS 7064] >gil359378532Jemb|CCE84791.1)] PisoO 004347 [Millercozyma farinosa CBS 7064] >gil359379563/emb|CCE83760.1| PisoO 004347 [Millerozyma farinosa CBS 7064] >gil448526196|ref|lXP 003869293.1| proteína de choque térmico Hsp60 [Candida orthopsilosis Co 90-125) >gil3880353646 Jemb|CCG23157.1| proteína de choque térmico Hsp60 [Candida orthopsilosis] >gil46123737|ref|lXP 386422.1)] HS60 AJECA Proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial (Antigen HIS-62) [Gibberella zeae PH-1] >gi/50292099|ref|XP 448482.1| proteína hipotética [Candida glabrata CBS 138] >gi[49527 794 /emb|CAG61443.1| produto proteico sem nome [Candida glabrata] >gi/50310975|ref|XP 455510.1| proteína hipotética [Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140] >gil49644646 /emb|CAG98218.1| KLLAOFO9449p [Kluyveromyces lactis]

>gi/50422027|ref|XP 459575.1) DEHAZEO5808p [Debaryomyces hansenii CBS767] >gil49655243Jemb|CAG87802.1| DEHAZEO5808p [Debaryomyces hansenii CBS767] >gil50555023|ref|XP 504920.11 YALIOFO2805p [Yarrowia lipolytica] >gil49650790/Jemb|CAG77725.1)/ YALIOFOZ2805p [Yarrowia lipolytica CLIB122] >gi/l6323288|ref|NP 013360.1)| Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae S288c] >gi[123579|sp|P19882.1|HSP6GO YEAST RecName: Full=Proteina de choque térmico 60, mitocondrial; AltName: Full=CPNG60; AltName: Full=P66; AltName: Full=componente fator estimulador | 66 kDa; Flags: Precursor >gi[171720|/gb|AAA3S4690.1| proteína de choque térmico 60 (HSP60) [Saccharomyces cerevisiae] >gil577181|/gb|AAB67380.1| Hsp60p: Proteína de choque térmico 60 [Saccharomyces cerevisiae] >gi[151941093|gb|EDN59473.1| chaperonina [Saccharomyces cerevisiae YJM789] >gil190405319|gb|EDVO8586.1| chaperonina [Saccharomyces cerevisiae RM11-1a] >gi/207342889|gb|EDZ70518.1| proteína similar a YLR259Cp [Saccharomyces cerevisiae AWRI1N631] >gi/25627 1752|gb|EEVO6789.1) Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae JAY 291] >gi/285813676|tpg|DAAO9S572.1| TPA: chaperona ATPase HSP60 [Saccharomyces cerevisiae S288c] >gi[323353818|/gb|EGA85673.1| Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae VL3] >gil349579966|dbj| GAA25127.1| K7 Hsp60p [Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 7] >gi/392297765|gb|EIWO8S864.1) “Hsp6O0p [Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D] >gi/226279|prf||1504305A fator de montagem mitocondrial >gil68485963|ref|XP 713100.1| proteína de choque térmico 60 [Candida albicans SC5314] >gil68486010|ref|XP 713077.1| proteína de choque térmico 60 [Candida albicans SC5314] >gil6016258|sp|O74261.1|HSP6O CANAL RecName: Full=Proteína de choque térmico 60, mitocondrial; AltName: Full= chaperonina 60 kDa; AltName: Full=Proteína Cpn60; Flags: Precursor >gil8552009|gb|AAC34885.1| proteína de choque térmico 60 [Candida albicans] >gil46434552|gb|EAK93958.1| proteína de choque térmico 60 [Candida albicans SC5314] >gil46434577|gb|EAK93982.1| proteína de choque térmico 60 [Candida albicans SC5314] >gil71001164|ref|lXP 755263.1) proteína mitocondrial antigênica HSP60 [Aspergillus fumigatus Af293] >gil66852901/gb|EAL93225.1| proteína mitocondrial antigênica HSP60, putativa [Aspergillus fumigatus Af293] >gi[159129345|gb|EDP54459.1| proteína mitocondrial antigênica HSPG6O0, putativa [Aspergillus fumigatus A1163] >gi/90970323|gb|ABE0O2805.1| proteína de choque térmico 60 [Rhizophagus intraradices]

[0078] Em uma modalidade, uma chaperona de 10 kDa da Tabela 3 é combinada com uma chaperona de 60kDa correspondente da Tabela 3 do mesmo gênero ou espécie de organismo para expressão no hospedeiro. Por exemplo chaperonina de 10 kDa :> gi | 189189366 | ref | XP 001931022.1 |: 71-168 [Pyrenophora tritici-repentis] expressa junto com a proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial correspondente > gi | 189190432 | ref | XP 001931555.1 | [Pyrenophora triticicrepentis Pt-1C-BFP]. Todas as outras combinações da Tabela 3 e 4 feitas de maneira semelhante com a mesma fonte de organismo também estão disponíveis para o perito para expressão. Além disso, pode-se combinar uma chaperona da Tabela 3 de um organismo com uma chaperona da Tabela 4 de outro organismo, ou combinar GroES com uma chaperona da Tabela 3 ou combinar GroEL com uma chaperona da Tabela 4.

[0079] A sequência de ácido nucleico que codifica uma chaperona molecular pode codificar uma chaperona com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 e/ou 4, ou é um homólogo funcional do mesmo tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 e/ou 4; preferivelmente pelo menos 80%, pelo menos 85%, 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 e/ou 4, ou é um homólogo funcional derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e/ou 4.

[0080] Como se segue do exposto acima, a invenção refere-se ainda a um método para preparar um composto orgânico compreendendo a conversão de uma fonte de carbono, usando um micro-organismo, formando assim o composto orgânico. O método pode ser realizado em condições aeróbicas, com oxigênio limitado ou anaeróbicas.

[0081] A invenção permite, em particular, uma redução na formação de um produto secundário dependente de NADH, especialmente glicerol, em até 100%, até 99% ou até 90%, em comparação com a referida produção em uma cepa de referência correspondente. À formação de produto secundário dependente de NADH é preferivelmente reduzida em mais de 10% em comparação com a cepa de referência correspondente, em particular em pelo menos 20%, mais em particular em pelo menos 50%. Produção de produtos secundários dependente de NADH é preferivelmente reduzida em 10-100%, em particular em 20-95%, mais em particular em 50-90%.

[0082] Em uma modalidade, é fornecido um processo de fermentação, em que é usado Rubisco, ou outra enzima capaz de catalisar a formação de um composto orgânico a partir de CO, (e outro substrato) ou outra enzima que catalisa a função do CO2 como um aceptor de elétrons, e dióxido de carbono presente na mistura gasosa acima do caldo de fermentação e/ou dissolvido no caldo de fermentação. Em uma modalidade específica, o dióxido de carbono ou parte dele é formado in situ pelo micro-organismo.

[0083] Se desejado, o método compreende ainda a etapa de adicionar CO, externo ao sistema de reação, geralmente por aeração com CO, ou uma mistura de gases contendo CO», por exemplo uma mistura de CO» / nitrogênio. A adição de CO, externo, em particular, é usada para (aumentar ou) manter o CO> dentro de uma faixa de concentração desejada, se não for formado, ou for formado CO2 insuficiente in situ.

[0084] Como fonte de carbono, em princípio qualquer fonte de carbono que o microrganismo possa usar como substrato pode ser usada. Em particular, pode ser utilizada uma fonte de carbono orgânico, selecionada no grupo de carboidratos e lipídios (incluindo ácidos graxos) — Carboidratos — adequados incluem —monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos hidrolisados (por exemplo, amidos hidrolisados, —hidrolisados lignocelulósicos).. Embora um ácido carboxílico possa estar presente, não é necessário incluir um ácido carboxílico, como ácido acético, como fonte de carbono.

[0085] A levedura da invenção é adequada para a produção de um álcool, notadamente etanol. No entanto, é contemplado que a percepção de que o CO, pode ser usado como um aceptor de elétrons em microrganismos que naturalmente não permitem isso, traz um benefício industrial para outros processos biotecnológicos para produção de moléculas orgânicas, em particular moléculas orgânicas de um peso molecular relativamente baixo, particularmente moléculas orgânicas com um peso molecular abaixo de 1000 g/mol. Os itens a seguir são aqui mencionados como modalidades do uso de dióxido de carbono como um aceptor de elétrons de acordo com a invenção.

[0086] Em relação à produção de etanol, são encontrados detalhes acima, ao se descrever a célula de levedura contendo PRK e Rubisco e nos exemplos. O etanol ou outro álcool é produzido, de preferência, em um processo fermentativo.

[0087] Para a produção de vários ácidos orgânicos (carboxilatos), por exemplo, ácido cítrico, um processo aeróbico é útil. Para a produção de ácido cítrico, por exemplo, Aspergillus niger, Yarrowia lipolytica ou outro organismo produtor de citrato conhecido, podem ser utilizados.

[0088] Um exemplo de um ácido orgânico que é, de preferência, produzido anaerobicamente é o ácido lático. Várias cepas bacterianas produtoras de ácido lático e cepas de leveduras que foram projetadas (engineered) para produção de lactato são geralmente conhecidas na técnica. Outras modalidades da invenção são agora descritas em maiores detalhes.

[0089] Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso da célula de levedura recombinante, descrita aqui em fermentação na indústria de biocombustíveis. Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante pode conter uma ou duas ou mais cópias de uma ou mais xilose isomerases e/ou uma ou duas ou mais cópias de um ou mais genes de xilose redutase e xilitol! desidrogenase, permitindo que a célula de levedura recombinante converta xilose . Em uma modalidade da mesma, estes genes podem ser integrados no genoma da célula de levedura recombinante. Em outra modalidade, a célula de levedura recombinante compreende os genes araA, araB e araD. É então capaz de fermentar arabinose. Em uma modalidade da invenção, a célula de levedura recombinante compreende o gene xy/A, o gene XYL1 e o gene XYL2 e / ou o gene XKS1, para permitir que a célula de levedura recombinante fermente xilose; realize a deleção do gene da aldose redutase (GRE3) e/ou superexpressão de GAL2 e/ou deleção de GAL8O0. De acordo com uma modalidade, os seguintes genes podem ser introduzidos na célula de levedura recombinante por introdução em uma célula hospedeira:

1. um conjunto constituído pelos genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1, opcionalmente sob controle de forte promotor constitutivo;

2. um conjunto constituído por um gene xyl/A sob controle de forte promotor constitutivo;

3. um conjunto compreendendo um gene XKS1 sob controle de forte promotor constitutivo,

4. um conjunto constituído pelos genes araA, araB e araD sob controle de um forte promotor constitutivo;

5. deleção de um gene de aldose redutase.

[0090] As células acima podem ser construídas utilizando técnicas de expressão recombinante conhecidas. A modificação do cofator pode ser afetada antes, simultaneamente ou após qualquer uma das modificações 1) a 5). A célula de levedura recombinante de acordo com a invenção pode ser submetida a engenharia evolutiva para melhorar suas propriedades. Processos de engenharia evolutiva são processos conhecidos. A engenharia evolutiva é um processo em que fenótipos industrialmente relevantes de um micro-organismo, neste caso a célula de levedura recombinante, podem ser acoplados à taxa de crescimento específica e/ou à afinidade por um nutriente, por um processo de seleção natural de configuração racional. A Engenharia Evolutiva é, por exemplo, descrita em detalhes em Kuijper, M, et al., FEMS, Eucaryotic Cell Research (Pesquisa de Célula Eucariótico) 5 (2005) 925-934, WOZ2008/041840 e WOZ2009/112472. Após a engenharia evolutiva, a célula de levedura recombinante fermentadora de pentose resultante é isolada. O isolamento pode ser executado de qualquer maneira conhecida, por exemplo, por separação de células de um caldo de células de levedura recombinante usado na engenharia evolutiva, por exemplo, colhendo uma amostra de células ou por filtração ou centrifugação.

[0091] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante é livre de marcadores. Neste contexto, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica uma característica ou um fenótipo que permite a seleção ou a triagem de uma célula hospedeira que contém o marcador. Sem marcadores significa que os marcadores estão essencialmente ausentes na célula de levedura recombinante. Ser livre de marcadores é particularmente vantajoso quando marcadores de antibióticos foram utilizados na construção da célula de levedura recombinante e são removidos posteriormente. A remoção de marcadores pode ser realizada utilizando qualquer técnica adequada da técnica anterior, por exemplo, recombinação intramolecular.

[0092] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante industrial é construída com base em uma célula hospedeira tolerante a inibidor, em que a construção é conduzida como descrito a seguir. Células hospedeiras tolerantes a inibidor podem ser selecionadas por seleção de cepas para crescimento em materiais contendo inibidores, como ilustrado em Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), vol.

136-140, 847-858, em que foi selecionada uma cepa ATCC 26602 de S. cerevisiae tolerante a inibidor.

[0093] A célula de levedura recombinante pode ainda compreender as atividades enzimáticas necessárias para a conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado, como etanol, butanol (por exemplo, n-butanol, 2-butanol e isobutanol), ácido lático, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico B-lactâmico ou uma cefalosporina.

[0094] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante é derivada de uma célula de levedura recombinante industrial. Uma célula industrial e uma célula de levedura recombinante industrial podem ser definidas como se segue. As condições ambientais de células (células de levedura recombinantes) em processos industrias são significativamente diferentes das em laboratório. Células de leveduras recombinantes industrias devem ser capazes de ter um bom desempenho em várias condições ambientais que podem variar durante o processo. Essas variações incluem trocas de fontes de nutrientes, pH, concentração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio, etc., que juntas têm potencial impacto no crescimento celular e na produção de etanol de Saccharomyces cerevisiae. Em condições industriais adversas, as cepas tolerantes ao ambiente devem permitir um crescimento e produção robustos. As linhagens de células de levedura recombinantes industriais são geralmente mais robustas em relação a essas alterações nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplicações em que são usadas, como na indústria de panificação, indústria de cerveja, fabricação de vinho e indústria de etanol de biocombustível... Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante industrial é construída com base em uma célula hospedeira industrial, em que a construção é conduzida como descrito a seguir. Exemplos de células de levedura industrial (S. cerevisiae) são Ethanol Red&O (Fermentis) FermiolO (DSM) e ThermosaccO (Lallemand).

[0095] As células de levedura recombinantes de acordo com a invenção são preferivelmente tolerantes a inibidores, ou seja, elas podem suportar inibidores comuns no nível que normalmente possuem com condições comuns de pré-tratamento e hidrólise, de modo que as células de levedura recombinantes podem encontrar ampla aplicação, ou seja, têm alta aplicabilidade para diferentes matérias-primas, diferentes métodos de pré-tratamento e diferentes condições de hidrólise. Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante é tolerante a inibidores. Tolerância a inibidor é a resistência a compostos inibidores. A presença e o nível de compostos inibitórios na lignocelulose podem variar amplamente com a variação da matéria- prima, método de pré-tratamento, processo de hidrólise. Exemplos de categorias de inibidores são ácidos carboxílicos, furanos e/ou compostos fenólicos. Exemplos de ácidos carboxílicos são ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico. Exemplos de furanos são furfural e hidroximetilfurfural. Exemplos de compostos fenólicos são vanilina, ácido siríngico, ácido ferúlico e ácido cumárico. As quantidades típicas de inibidores são para ácidos carboxílicos: algumas gramas por litro, até gramas por litro ou mais, dependendo da matéria-prima, do pré- tratamento e das condições de hidrólise. Para furanos: algumas centenas de miligramas por litro até alguns gramas por litro, dependendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise. Para fenólicos: algumas dezenas de miligramas por litro, até um grama por litro, dependendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise.

[0096] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante é uma célula que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente, fermentação alcoólica anaeróbica. Uma célula de levedura recombinante tem preferivelmente uma alta tolerância a etanol, uma alta tolerância a pH baixo (isto é, capaz de crescer a um pH menor que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2,5) e a orgânicos e/ou uma alta tolerância a temperaturas elevadas.

[0097] A invenção também se refere a um processo para fermentação de um substrato para produzir um produto de fermentação com uma célula de levedura recombinante, conforme descrito aqui, na indústria de biocombustíveis, em que o rendimento de glicerol é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20% ou pelo menos 30% inferior ao de um processo com a célula de levedura recombinante de tipo selvagem correspondente. Em uma modalidade de tal processo, o rendimento de etanol não é aumentado ou diminuído, comparado com o de um processo com a célula de levedura recombinante de tipo selvagem correspondente.

[0098] Qualquer uma das características ou atividades acima de uma célula de levedura recombinante pode estar naturalmente presente na célula ou pode ser introduzida ou modificada por modificação genética.

EXPRESSÃO RECOMBINANTE

[0099] A célula de levedura recombinante é uma célula recombinante. Isto é, uma célula de levedura recombinante compreende, ou é transformada com ou é geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente na célula em questão. Técnicas para a expressão recombinante de enzimas em uma célula, bem como para modificações genéticas adicionais de uma célula de levedura recombinante são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Tipicamente, essas técnicas envolvem a transformação de uma célula com constructo de ácido nucleico contendo a sequência relevante. Esses métodos são, por exemplo, conhecidos de manuais padrão, como Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Clonagem molecular: um manual de laboratório (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press ou F. Ausubel et al. , eds., "Current protocols in molecular biology" (Protocolos atuais em biologia molecular), Green Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). Métodos para transformação e modificação genética de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, de EP-A-0635574, WOS98 / 46772, WO 99 / 60102, WOO00 / 37671, WO90 / 14423, EP-A- 0481008, EP-A-O0635574 e US6 265 186.

PRODUÇÃO DE BIOPRODUTOS

[00100] — Aolongo dos anos, foram feitas sugestões para a introdução de vários organismos para a produção de bioetano!l a partir de açúcares de culturas. Na prática, no entanto, todos os principais processos de produção de bioetanol continuaram a usar as células de levedura recombinantes do gênero Saccharomyces como produtoras de etanol. Isto se deve às muitas características atraentes das espécies de Saccharomyces para processos industriais, i. e alta tolerância a ácido, etanol e osmotolerância, capacidade de crescimento anaeróbico e, é claro, sua alta capacidade fermentativa alcoólica. Em uma modalidade, espécies de células de levedura recombinantes como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Uma célula de levedura recombinante pode ser uma célula adequada para a produção de etanol. Uma célula de levedura recombinante pode, no entanto, ser adequada para a produção de produtos de fermentação diferentes de etanol. Esses produtos de fermentação não etanólicos incluem, em princípio, qualquer produto químico bruto ou fino que seja produzido por um micro-organismo eucariótico, como uma célula de levedura recombinante ou um fungo filamentoso.

[00101] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante para produção de produtos de fermentação não etanólicos é uma célula hospedeira que contém uma modificação genética que resulta em menor atividade da álcool desidrogenase.

LIGNOCELULOSE

[00102] A lignocelulose, que pode ser considerada como uma potencial matéria-prima renovável, geralmente inclui os polissacarídeos celulose (glucanos) e hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, alguma hemiceluloses podem estar presentes como glucomananos, por exemplo, em matérias-primas derivadas da madeira. A hidrólise enzimática desses polissacarídeos em açúcares solúveis, incluindo monômeros e multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucurônico e outras hexoses e pentoses, ocorre sob a ação de diferentes enzimas atuando em conjunto. Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas, como arabinanos, podem representar uma proporção considerável da massa seca de paredes celulares típicas de tecidos vegetais não lenhosos (cerca de um quarto a metade da massa seca pode ser pectina). PRÉ-TRATAMENTO

[00103] Antes do tratamento enzimático, o material lignocelulósico pode ser pré-tratado. O pré-tratamento pode compreender a exposição do material lignocelulósico a um ácido, uma base, um solvente, calor, um peróxido, ozônio, retalhamento mecânico, trituração, moagem ou despressurização rápida, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos mesmos. Este pré-tratamento químico é frequentemente combinado com pré-tratamento térmico, por exemplo, entre 150-220ºC por 1 a 30 minutos.

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

[00104] O material pré-tratado é geralmente sujeito a hidrólise enzimática para liberar açúcares que podem ser fermentados de acordo com a invenção. Isto pode ser executado com métodos convencionais, por exemplo, por contato com celulases, por exemplo celobio- hidrolase(s), endoglucanase(s), beta-glucosidase(s) e opcionalmente outras enzimas. A conversão com as celulases pode ser executada à temperatura ambiente ou a temperaturas mais altas, em um tempo de reação para liberar quantidades suficientes de açúcar(es). O resultado da hidrólise enzimática é um produto de hidrólise compreendendo açúcares C5/C6, designado neste documento como a composição de açúcar.

A COMPOSIÇÃO DE AÇÚCAR

[00105] A composição de açúcar usada de acordo com a invenção compreende glicose e uma ou mais pentoses, por exemplo, arabinose e/ou xilose. Qualquer composição de açúcar que atenda estes critérios pode ser utilizada na invenção. Açúcares opcionais na composição de açúcar são galactose e manose. Em uma modalidade, a composição de açúcar é um hidrolisado de um ou mais materiais lignocelulósicos. Lignocelulose, aqui, inclui hemicelulose e partes de hemicelulose de biomassa. Lignocelulose inclui frações lignocelulósicas de biomassa. Materiais lignocelulósicos adequados podem ser encontrados na lista a seguir: aparas de pomar, chaparral, resíduos de moinho, resíduos de madeira urbana, resíduos municipais, resíduos de cortes de árvores, desbaste de florestas, culturas florestais de curta rotação, resíduos industriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linho, cascas de soja, cascas de arroz, palha de arroz, ração de glúten de milho, cascas de aveia, cana- de-açúcar, palha de milho, talos de milho, espigas de milho, casca de milho, gramínea “switchgrass” (Panicum virgatum), miscanto, sorgo doce, caules de canola , caules de soja, “prarie grass” (Bromus willdenowii), “gamagrass” (Tripsacum dactyloides), “foxtail” (gramíneas dos gêneros Alopecurus, Hordeum, e Setaria); polpa de beterraba sacarina, polpa de frutas cítricas, cascas de sementes, resíduos celulósicos de animais, aparas de relva, algodão, algas marinhas, árvores, madeira macia, madeira dura, choupo (poplar), pinho, arbustos, gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, cascas de milho, espigas de milho, grãos de milho, fibras de grãos, produtos e subprodutos da moagem úmida ou seca de grãos, resíduos sólidos urbanos, restos de papel, resíduos de quintal, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, restos de papel, polpa de celulose, resíduos de fábricas de papel, galhos, arbustos, canas, milho, cascas de milho, cultura energética, floresta, uma fruta, uma flor, um grão, uma grama, uma colheita herbácea, uma folha, casca, uma agulha, um tronco, um raiz, uma muda, um arbusto, Panicum virgatum (switch grass), uma árvore, um vegetal, casca de fruta, uma videira, polpa de beterraba sacarina, subprodutos da moagem de trigo (wheat middlings), cascas de aveia, madeira dura ou macia, resíduos orgânicos gerados a partir de um processo agrícola, resíduos de madeira florestal ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

[00106] A conversão de glicose, xilose, arabinose e galactose em produto de fermentação é de grande importância econômica. Manose está presente em alguns materiais lignocelulósicos, geralmente em quantidades inferiores às dos açúcares mencionados anteriormente. Vantajosamente, portanto, também a manose é convertida pela célula de levedura recombinante. Espera-se que as células de levedura recombinantes da presente invenção possam ser manipuladas ainda mais para alcançar outras características desejáveis, ou ainda maiores rendimentos globais de etanol. A seleção de células de levedura recombinantes “melhoradas passando as células de levedura recombinantes em meio contendo hidrolisado resultou em uma célula de levedura recombinante melhorada com maiores taxas de fermentação. Usando os ensinamentos da presente invenção, pode-se facilmente preparar essas cepas melhoradas. Por material contendo pentose, entende-se qualquer meio contendo pentose, seja líquido ou sólido. Materiais contendo pentose adequados incluem hidrolisados de polissacarídeos ou biomassa lignocelulósica, como cascas de milho, madeira, papel, subprodutos agrícolas e similares.

[00107] Por um "hidrolisado" como utilizado neste documento, entende-se um polissacarídeo que foi despolimerizado através da adição de água para formar açúcares mono e oligossacarídeos. Hidrolisados podem ser produzidos por hidrólise enzimática ou ácida do material contendo polissacarídeos.

[00108] De preferência, a célula de levedura recombinante é capaz de crescer em condições semelhantes às encontradas em fontes industriais de pentose. O método da presente invenção seria mais econômico se o material contendo pentose pudesse ser inoculado com a variante de célula de levedura recombinante sem manipulação excessiva. A título de exemplo, a indústria de celulose gera grandes quantidades de resíduos celulósicos. Sacarificação da celulose por hidrólise ácida produz hexoses e pentoses que podem ser usadas em reações de fermentação. No entanto, o licor de hidrolisado ou sulfito contém altas concentrações de sulfito e inibidores fenólicos naturalmente presentes na madeira que inibem ou impedem o crescimento da maioria dos organismos. Os exemplos abaixo descrevem a fermentação de pentose em hidrolisados ácidos (ou licor residual de sulfito) de madeiras duras e madeiras macias pelas células de levedura recombinantes da presente invenção. É razoavelmente esperado que cepas de células de levedura recombinantes capazes de crescer em licor residual de sulfito possam crescer em virtualmente qualquer outro hidrolisado de biomassa.

PROPAGAÇÃO

[00109] Ainvenção refere-se ainda a um processo para propagação aeróbica da célula de levedura recombinante, em particular propagação aeróbica da cepa de célula de levedura recombinante. Propagação é aqui qualquer processo de crescimento de células de levedura recombinantes que leva ao aumento de uma população inicial de células de levedura recombinantes. O principal objetivo da propagação é aumentar uma população de células de levedura recombinantes usando as capacidades de reprodução natural das células de levedura recombinantes como organismos vivos. Pode haver outras razões para a propagação; por exemplo, no caso do uso de célula de levedura recombinante seca, a propagação é usada para reidratar e condicionar a célula de levedura recombinante, antes de ser cultivada. Célula de levedura recombinante fresca, seja célula de levedura recombinante seca ativa ou bolo úmido, pode ser adicionada para iniciar a propagação diretamente.

[00110] As condições de propagação são críticas para produção ideal de células de levedura recombinantes e fermentação subsequente, como, por exemplo, fermentação de hidrolisado lignocelulósico em etanol. Elas incluem fonte de carbono, aeração, temperatura e adições de nutrientes adequados. O tamanho do tanque para propagação normalmente fica entre 2% e 5% do tamanho do fermentador (de hidrolisado lignocelulósico em etanol). Na propagação, a célula de levedura recombinante precisa de uma fonte de carbono. À fonte de carbono pode aqui incluir glicerol, etanol, acetato e / ou açúcares (açúcares C6 e C5). Outras fontes de carbono também podem ser usadas. A fonte de carbono é necessária para biossíntese da parede celular e produção de proteína e energia. Propagação é um processo aeróbico; portanto, o tanque de propagação deve ser adequadamente aerado para manter um certo nível de oxigênio dissolvido. Aeração adequada é normalmente obtida por indutores de ar instalados na tubulação que entra no tanque de propagação que puxa o ar para a mistura de propagação à medida que o tanque enche e durante a recirculação. A capacidade da mistura de propagação reter oxigênio dissolvido é uma função da quantidade de ar adicionada e da consistência da mistura, e é por isso que água é frequentemente adicionada em uma proporção entre 50:50 e 90:10 de mosto para água.

[00111] Misturas de propagação "espessas" (proporção 80:20 mosto-água e superior) geralmente exigem a adição de ar comprimido para compensar a capacidade reduzida de reter o oxigênio dissolvido. A quantidade de oxigênio dissolvido na mistura de propagação também é uma função do tamanho de bolha, de modo que algumas usinas de etanol adicionam ar através de aspersores que produzem bolhas menores em comparação aos indutores de ar. Juntamente com glicose baixa, aeração adequada é importante para promover respiração aeróbica, que difere do ambiente comparativamente anaeróbico da fermentação. Um sinal de aeração inadequada ou altas concentrações de glicose é o aumento da produção de etanol no tanque de propagação. Geralmente durante a propagação, a célula de levedura recombinante requer uma temperatura confortável para crescimento e metabolismo, por exemplo, a temperatura no reator de propagação está entre 25-40 º C. Geralmente, temperaturas mais baixas resultam em metabolismo mais lento e reprodução reduzida, enquanto temperaturas mais altas podem causar produção de compostos de estresse e redução da reprodução. Em uma modalidade, os tanques de propagação são internos e protegidos contra o rigor de altas temperaturas no verão ou baixas temperaturas no inverno, de modo que manter temperaturas ótimas entre 30-35 graus C normalmente não é um problema. Propagação adicional pode ser realizada à medida que a propagação de célula de levedura recombinante é normalmente realizada.

FERMENTAÇÃO

[00112] A invenção provê um processo para a fermentação de uma célula de levedura recombinante de acordo com a invenção, por exemplo, etanol, que é vantajoso na indústria de biocombustíveis.

[00113] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante de acordo com a invenção pode ser uma célula de levedura recombinante fermentadora de pentose e glicose, incluindo mas não se limitando a células que são capazes de consumo simultâneo anaeróbico de pentose e glicose. Em uma modalidade do processo, o material contendo “pentose compreende um hidrolisado de material lignocelulósico. O hidrolisado pode ser um hidrolisado enzimático de material lignocelulósico.

[00114] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbica ou anaeróbica. Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, mais preferivelmente O mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável) e em que moléculas orgânicas servem tanto como doadoras quanto como aceptoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, NADH produzido na glicólise e formação de biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver esse problema, muitos microrganismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de elétrons e hidrogênio, regenerando assim o NAD+.

[00115] Assim, em uma modalidade, em um processo de fermentação anaeróbica piruvato é usado como aceptor de elétrons (e hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico Peo23, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido e etileno.

[00116] O processo de fermentação é, de preferência, executado a uma temperatura ideal para a célula. Assim, para a maioria das células de levedura recombinantes, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura inferior a cerca de 50ºC, inferior a cerca de 42ºC ou inferior a cerca de 38ºC. Para células de levedura recombinantes ou células hospedeiras fúngicas filamentosas, o processo de fermentação é preferivelmente realizado a uma temperatura inferior a cerca de 35, cerca de 33, cerca de 30 ou cerca de 28ºC e a uma temperatura superior a cerca de 20, cerca de 22 ou cerca de 25ºC.

[00117] —Orendimento de etanol com xilose e/ou glicose no processo é, de preferência, pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95 ou cerca de 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como uma porcentagem do rendimento máximo teórico.

[00118] A invenção também fornece um processo para a produção de um produto de fermentação. O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser executado em condições aeróbicas e anaeróbicas. Em uma modalidade, o processo é realizado em condições microaerofílicas ou limitadas de oxigênio. Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, e em que moléculas orgânicas servem tanto como doadoras quanto como aceptoras de elétrons. Um processo de fermentação com oxigênio limitado é um processo no qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada, bem como pelas propriedades reais de mistura / transferência de massa do equipamento de fermentação utilizado.

[00119] Preferivelmente, em um processo sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos cerca de 5,5, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 6, como pelo menos 7 mmol/L/h. Um processo da invenção pode compreender a recuperação do produto de fermentação. Em uma modalidade do processo, a célula fermenta tanto a xilose quanto a glicose, preferivelmente simultaneamente, caso em que é usada, de preferência uma célula insensível à repressão da glicose, para impedir o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação compreenderá ainda o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula. Composições de meios de fermentação para crescimento de micro- organismos, tais como células de levedura recombinantes, são bem conhecidas na arte. Os processos de fermentação podem ser realizados em batelada, batelada alimentada ou modo contínuo. Um processo separado de hidrólise e fermentação (separate hydrolysis and fermentation - SHF) ou um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (simultaneous saccharification and fermentation -SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para uma produtividade ideal. Esses processos são descritos a seguir em maiores detalhes.

MODO SSF

[00120] Para o modo Simultâneo de Sacarificação e Fermentação (SSF), o tempo de reação para a etapa de liquefação/hidrólise ou pré- sacarificação depende do tempo para atingir um rendimento desejado, isto é, o rendimento de conversão de celulose em glicose. Esse rendimento é preferivelmente o mais alto possível, de preferência 60%

ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 96 % ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, mesmo 99,5% ou mais ou 99,9% ou mais. De acordo com a invenção, são realizadas concentrações muito altas de açúcar no modo SHF e concentrações muito altas de produto (por exemplo, etanol) no modo SSF. Na operação SHF, a concentração de glicose é de 25 g/L ou mais, 30 g/l ou mais, 35 g/| ou mais, 40 g/| ou mais, 45 g/| ou mais, 50 g/| ou mais, 55 g/| ou mais, 60 g/l ou mais, 65 g/l ou mais, 70 g/l ou mais, 75 g/l ou mais, 80 g/| ou mais, 85 g/l ou mais, 90 g/l ou mais, 95 g/| ou mais, 100 g/| ou mais, 120g/| ou mais ou podem, por exemplo, ser 25 g9/1-250 g/l, 30 g/1-200 g/l, 40 g/1-200 g/l, 50 9g/1-200 9/1, 60 g/1-200 9/1, 70 g/1-200 9/1, 80 g/1-200g/1, 90 g/1-200 g/l.

CONCENTRAÇÃO DO PRODUTO NO MODO SSF

[00121] Na operação de SSF, a concentração de produto (g/L) depende da quantidade de glicose produzida, mas isso não é visível, pois açúcares são convertidos em produto no SSF, e as concentrações de produto podem estar relacionadas à concentração subjacente de glicose por multiplicação pelo rendimento máximo teórico (Yps max em g de produto por grama de glicose). O rendimento máximo teórico (Yps max em gramas de produto por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado dos livros didáticos de bioquímica. Para etanol, 1 mol de glicose (180 g) produz de acordo com via de fermentação normal da glicólise, na célula de levedura recombinante, 2 moles de etanol (= 2x46 = 92 g etanol). O rendimento máximo teórico de etanol com glicose é, portanto, 92/180 = 0,511 g etanol/g de glicose). Para n-butanol (MW 74 g/mol) ou isobutanol, o rendimento máximo teórico é de 1 mol de butanol por mol de glicose. Então Yps max para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g (iso-) butanol/g de glicose. Para ácido lático, o rendimento de fermentação para fermentação homoláctica é de 2 moles de ácido lático (PM = 90 g / mol) por mol de glicose. De acordo com esta estequiometria, o Yos max = 1 g de ácido lático/de glicose. Cálculos semelhantes podem ser feitos para fermentações C5/C6, nas quais, além da glicose, também estão incluídas pentoses, por exemplo, xilose e/ou arabinose. Para outros produtos de fermentação, um cálculo semelhante pode ser feito.

MODO SSF

[00122] “Naoperação SSF a concentração de produto é 25g * Yps g/L ou mais, 30 * Yps g/L ou mais, 35g * Yps /L ou mais, 40 * Yps g/L ou mais, 45 * Yps g/L ou mais, 50 * Yps g/L ou mais, 55 * Yps g/L ou mais, 60 * Yps g/L ou mais, 65 * Yps g/L ou mais, 70 * Yps g/L ou mais ,75* Yps g/L ou mais, 80 * Yps g/L ou mais, 85 * Yps g/L ou mais, 90 * Yps g/L ou mais, 95 * Yps g/L ou mais, 100 * Yps g/L ou mais, 110 * Yps g/L ou mais, 120g/L * Yps ou mais ou pode ser, por exemplo, 25 * Yps g/L- 250 * Yps g/L, 30 * Yps 9g/L-200 * Yps g/L, 40 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 50 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 60 * Yps 9/L-200 * Yps g/L, 70 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 80 * Yps 9g/L-200 * Yps g/L, 90 * Yps g/L , 80 * Yps 9g/L-200 * Yps g/L. Assim, a invenção provê um método para preparação de um produto de fermentação, o método compreendendo: a) degradar lignocelulose usando um método descrito neste documento; e b) fermentar o material resultante, para preparar, assim, um produto de fermentação.

PRODUTO DE FERMENTAÇÃO

[00123] O produto de fermentação da invenção pode ser qualquer produto útil. Em uma modalidade, é um produto selecionado no grupo que consiste em etanol, n-butanol, 2-butanol, isobutanol, ácido lático, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico , ácido itacônico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, um aminoácido, como lisina, metionina, triptofano, treonina e ácido aspártico, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico B-lactâmico e uma cefalosporina, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos para ração animal, produtos químicos especiais, matérias-primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, incluindo biocombustíveis e biogás ou polímeros orgânicos e uma enzima industrial, como protease, celulase, amilase, glucanase, lactase, lipase, liase, oxidorredutases, transferase ou xilanase.

RECUPERAÇÃO DO PRODUTO DE FERMENTAÇÃO

[00124] Para a recuperação do produto de fermentação, são utilizadas tecnologias existentes. Para diferentes produtos de fermentação, diferentes processos de recuperação são adequados. Métodos existentes de recuperação de etanol a partir de misturas aquosas geralmente usam técnicas de fracionamento e adsorção. Por exemplo, uma cerveja ainda pode ser usada para processar um produto fermentado, que contém etanol em uma mistura aquosa, para produzir uma mistura enriquecida contendo etanol que é então submetida a fracionamento (por exemplo, destilação fracionada ou outras técnicas similares). Em seguida, as frações que contêm as maiores concentrações de etanol podem ser passadas através de um adsorvedor para remover a maior parte, se não toda, a água restante do etanol. Em uma modalidade além da recuperação do produto de fermentação, a levedura pode ser reciclada. Os seguintes exemplos não limitativos pretendem ser meramente ilustrativos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. SUPEREXPRESSÃO DE GENES PPP E DELEÇÃO DO GENE GPD?2.

[00125] O GPD?2 foi excluído pela transformação da cepa IMX774 de Saccharomyces cerevisiae (cuja cepa é divulgada no documento WO2017/216136) usando uma abordagem descrita no Pedido de Patente Europeia pendente EP16194660.3 e no Pedido PCT pendente

PCT/EP2017/076148 com fragmentos de DNA resultando em uma exclusão da sequência de codificação de GPD2 mediante recombinação — homóloga em IMX774. |Isto foi conseguido cotransformando o plasmídeo de expressão de RNA guia com a sequência de direcionamento de GPD2, revogando assim a sequência de codificação de gpd2. A cepa resultante foi denominada IMX949.

[00126] Genes do ramo não oxidativo da via das pentoses-fosfato (TAL1, NOM1, TKL1, TKL2, RPE1, RKI1) foram superexpressos por transformação na cepa IMX774 de Saccharomyces cerevisiae (cuja cepa é divulgada no documento WO2017 / 216136), utilizando uma abordagem descrita no Pedido de Patente Europeia pendente EP16194660.3 e no pedido PCT pendente PCT / EP2017 / 076148, com cassetes de expressão dos genes acima mencionados sob controle de promotores constitutivos.

[00127] Os cassetes de expressão foram integrados no lócus GPD2 cotransformando o plasmídeo de expressão de RNA guia com a sequência de direcionamento de GPD2, revogando assim a sequência de codificação de gpd2. A cepa resultante foi denominada IMX1443. À cepa IMX1443 foi comparada com IME324 e IMX/774 em uma experiência de fermentação em batelada como descrito em WO?2017/216136. A cepa IME3S24 é divulgada no documento WO?2017/216136.

[00128] Os resultados estão listados nas Tabelas 5 e 6. TABELA 5. RESULTADOS USANDO CEPA DE LEVEDURA COM GENES PPP E DELEÇÃO DE GENE GPD2 DANT1p-prk, | pDANT1-prk, | prk, groES, groEL groES, groES, groEL | gpd2::RPE1, groEL TKL1, TAL1, TAL2, RKI1, NQM1

0,20 + 0,03 | 0,22+0,01 0,30 +0,03 0,01 0,058 + | 0,038 + 0,001 po + 0,001 gg) 0,001 0,005 (9x 97) 0,000 0,007 1) 0,004 0,001 Proporção glicerol| 12,262 + 7,272 + 4,314 + 0,245 [1,557 + 0,003 produzido/biomassa 0,122 0,115 Epa) o fi TABELA 6. TAXAS DE CRESCIMENTO ESPECÍFICAS (WM), RENDIMENTOS (Y) DE BIOMASSA, ETANOL E GLICEROL EM

GLICOSE E RELAÇÕES ESTEQUIOMÉTRICAS ENTRE A PRODUÇÃO DE GLICEROL E A FORMAÇÃO DE BIOMASSA EM

CULTURAS EM BATELADA ANAERÓBIA EM BIORREATORES ANAERÓBICOS DE CEPAS DE S. CEREVISIAE IME369 E IMX1489.

CULTURAS FORAM CULTIVADAS EM MEIO SINTÉTICO CONTENDO 20 G L'º DE GLICOSE (PH 5) TAXAS DE

CRESCIMENTO E ESTEQUIOMETRIAS ESPECÍFICAS FORAM

CALCULADAS A PARTIR DE PONTOS DE AMOSTRA DURANTE A FASE DE CRESCIMENTO MÉDIO-EXPONENCIAL. VALORES REPRESENTAM MÉDIAS + DESVIOS MÉDIOS DE MEDIÇÕES EM CULTURAS DUPLICADAS INDEPENDENTES. * (P <0,02) E * (P <0,01) INDICAM SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA DE DIFERENÇAS ENTRE O IME324 (TABELA 5) E CEPAS IME369 E IMX1489 NOS TESTES T DE STUDENT. BALANÇOS DE GRAU DE REDUÇÃO

CONSTRUÍDOS DURANTE A FASE DE CRESCIMENTO

EXPONENCIAL RENDEU RECUPERAÇÕES DE ELÉTRONS ENTRE 96% E 100%.

SS AA Genótipo relevante GPD1 GPD2 GPD1 gpd24 PDAN1-prk cbbm não ox PPP1 | Y biomassa/glicose (g g”) | 0,091 + 0,009 Y glicerol/glicose (gg) |0,107+0,004 0,014 + 0,000 ** Glicerol 12,189 + 1,080 1,669 + 0,082 ** produzido/biomassa (mmol (g biomassa)) TABELA 7: BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS T. denitrificans Rubisco grande subunidade CbbM S. oleracea phosphoribulokinase (prk) E. coli groES E. coli groEL

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Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula de levedura recombinante, caracterizada pelo fato de que expressa funcionalmente uma ou mais sequências heterólogas de ácido nucleico que codifcam a ribulose-1,5-fosfato carboxilase/oxigenase (EC4.1.1.39; Rubisco) e, opcionalmente, uma ou mais chaperonas moleculares para Rubisco e compreendendo adicionalmente uma ou mais fosforribuloquinases (EC2.7.1.19; PRK), em que um ou mais genes do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato estão superexpressos.

2. Célula de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter adicionalmente uma deleção ou disrupção de um gene da glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD).

3. Célula de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato que um ou mais genes do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato estão superexpressos e em que a referida célula de levedura contém uma deleção ou disrupção de um gene da glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD).

4. Célula de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato que o gene GPD codifica uma enzima tendo pelo menos número EC 1.1.1.8.

5. Célula de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato que o GDP é GPD1 elou GPD?2, preferivelmente GPD2.

6. Célula de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato que o um ou mais genes da via pentose fosfato que é superexpresso codifica uma enzima selecionada na lista de uma transaldolase (EC 2.2.1.2) uma transcetolase (EC 2.2.1.1), uma ribose-5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6) e uma D-ribulose-5-fosfato 3-epimerase (EC 5.1.3.1).

7. Célula de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato que o um ou mais genes da via pentose fosfato é selecionado na lista de TAL1, TAL2, NQM1, TKL1, TKL2, RPE1 e RKI1.

8. Célula de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato que a fosforribuloquinase está sob controle de um promotor (o “promotor de PRK") que tem uma razão de expressão de PRkKanaeróbica/aeróbica de 2 ou mais.

9. Célula de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato que a célula de levedura é selecionada no grupo de Saccharomycetaceae.

10. Processo para preparar um composto orgânico, em particular um álcool, caracterizado pelo fato de que compreende converter uma fonte de carbono, em particular um carboidrato ou outra fonte orgânica de carbono, usando uma célula de levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a9, formando, assim, o composto orgânico.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato que a fonte de carbono é um hidrolisado de amido.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato que a fonte de carbono é um hidrolisado de fibra de milho.

13. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato que a fonte de carbono é um hidrolisado de palhas de milho.