CN104789638A - 酵母中生产乙酰-CoA的酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酵母中生产乙酰-CoA的酶和鉴定具有在酵母细胞中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽的方法，其包括a)提供突变的包含至少一种(PDH)旁路基因缺失的酵母细胞，所述基因选自编码丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶和乙酰-CoA合成酶的基因；b)用包含下述异源核苷酸序列的表达载体转化突变的酵母细胞，所述异源核苷酸序列编码具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的潜在酶活性的候选多肽；c)针对在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长的能力测试重组突变的酵母细胞，和d)当观察到细胞生长时将候选多肽鉴定为具有在酵母细胞中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽。

Description

酵母中生产乙酰-CoA的酶
本申请是申请号为200880100320.7的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2008/059119的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明属于使用异源表达体系在酵母中生产代谢产物的领域。具体地，本发明涉及对下述酵母菌株的代谢改造，所述酵母菌株能够生产需要胞质乙酰-CoA作为前体的代谢产物，例如生产丁醇的酵母菌株。本发明涉及鉴定异源酶的实验体系，所述异源酶在酵母胞质中表达时能够将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA。
背景技术
乙酰-辅酶A(CoA)是大量代谢通路的必需中间产物，并且是许多工业相关化合物合成中的关键前体，所述化合物例如为脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、氨基酸、脂质、蜡酯、(多)糖多羟基链烷酸酯、他汀、聚酮化合物和乙酸酯(例如乙酸乙酯和乙酸异戊酯)。具体地，乙酰-CoA也是工业上重要的大量使用的化学品1-丁醇的前体。
与细菌例如E.coli相比，酵母细胞提供了生产上述乙酰-CoA衍生产物的非常合适的替代方式，原因是因为基于酵母的过程可以在低pH下运行，所以酵母对噬菌体或其它感染不易感。因此，使用酵母不需要无菌的过程，从而降低了感兴趣的产物的成本价格。
当天然(野生型)酵母不能够生产感兴趣的乙酰-CoA衍生产物时，使用代谢工程改造能够提供表达能够支持这类过程的异源基因的酵母细胞。在这类情况下，异源基因产物通常被靶向酵母的胞质区室。因为乙酰-CoA-衍生产物的生物合成会完全或部分地在胞质溶胶中进行，所以在胞质区室中供应足量的前体乙酰-CoA是至关重要的。在Saccharomycescerevisiae中，乙酰-CoA的生物合成发生于两个分开的区室中。在线粒体中，通过丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)催化的丙酮酸氧化脱羧作用合成乙酰-CoA，该合成具有以下的总反应化学计量：
丙酮酸(Pyr)+CoA+NAD+＝乙酰-CoA+CO2+NADH+H+
在胞质溶胶中，通过丙酮酸脱氢酶(PDH)旁路合成乙酰-CoA，该旁路涉及酶丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)，其具有以下的总体反应化学计量：
Pyr+CoA+ATP+NAD(P)+＝乙酰-CoA+CO2+NAD(P)H+AMP+PPi+H+。
酵母S.cerevisiae的丙酮酸-脱氢酶-负性(Pdc-)突变体不具有功能性PDH旁路，并且由于不能为生长提供(足量的)胞质乙酰-CoA而不能在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长(Flikweert et al.,(1996)Yeast12:247-57)。因此，PDH旁路对在胞质区室中提供乙酰-CoA而言是必需的。然而，从以下的总体反应化学计量中可以看出，对能量平衡而言酵母中的PDH旁路不是最适的：通过PDH-旁路合成每摩尔乙酰-CoA需要2摩尔ATP，因为乙酰-CoA合成酶反应ATP被水解为AMP。相反，经由PDH的线粒体通路不需要ATP。PDH旁路的额外ATP需求可能是从胞质乙酰-CoA前体合成感兴趣的产物的一个问题，因为为了产生ATP需要通过例如氧化磷酸化和/或底物磷酸化(例如糖酵解)将更多的碳源转化，从而降低基于碳的产物总体产率。
将酵母代谢工程改造为生产1-丁醇时，可以在酵母细胞的胞质溶胶中表达异源生物合成基因(WO 2007/041269)。通常，1摩尔葡萄糖通过糖酵解产生2摩尔乙酰-CoA，这是1摩尔丁醇的前体；因此，如果不考虑细胞生长和维持，则每摩尔葡萄糖最多能够合成1摩尔丁醇。然而，与丁醇生物合成组合使用PDH旁路时，由于能量不平衡而不能达到该最大理论产率：其中在糖酵解中每摩尔转化的葡萄糖产生2摩尔ATP，PDH旁路中形成2摩尔乙酰-CoA需要总计4摩尔(2乘以2摩尔)ATP，所述2摩尔乙酰-CoA被转化为1摩尔丁醇。因此，如果使用PDH旁路从1摩尔葡萄糖中合成1摩尔1-丁醇，则存在ATP的净短缺。
因此，需要鉴定出其中不需要PDH旁路的可能替代性代谢途径，用于在酵母中生产胞质乙酰-CoA，用于生产乙酰-CoA衍生产物，尤其是丁醇。
丁醇是重要的工业化学品，并且适合用作替代性的引擎燃料，其具有优于乙醇的改进的特性。丁醇还可用作多种化学和纺织过程的溶剂，用于塑料的有机合成中，用作化学中间产物，和在涂层和食品和调味剂工业中用作溶剂。丁醇可以产自生物质(生物丁醇)以及化石燃料(石油丁醇)。
可以通过本领域已知的多种可用方法完成丁醇异构体之一的化学合成(见例如Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,6th edition,2003,Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)。这些工艺的缺点是它们基于石油化学品衍生物的使用，所述石油化学品衍生物通常是昂贵的并且对环境不友好。
可以使用细菌Clostridium acetobutylicum或其它Clostridium物种进行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)过程，通过发酵实现丁醇的生物合成。然而，ABE过程的一个重要缺点在于，其产生丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。另外，细菌的使用需要无菌的工艺条件，并通常使该过程对噬菌体感染易感。因此，酵母细胞提供了上文所述的非常合适的替代方式。
发明内容
本发明人目前鉴定了在酵母中提高胞质乙酰-CoA生产的替代性代谢途径，所述途径能够克服PDH旁路的问题。
一种可能的途径包括通过使用乙酰基化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)(见图2，反应A，ACDH)将乙醛直接转化为乙酰-CoA而不消耗ATP。另一途径包括通过酶或多酶复合物，例如通过使用丙酮酸:NADP氧化还原酶(E.C.1.2.1.51)(见图2，反应C，PNO)，将丙酮酸直接转化为乙酰-CoA而不消耗ATP。在这两种可能的途径中，每摩尔葡萄糖形成1摩尔丁醇会导致形成2摩尔ATP。还有另一种途径包括通过替代性酶或酶组合，例如通过使用乙酸:CoA连接酶(ADP-形成，E.C.6.2.1.13)，或通过使用ATP:乙酸磷酸转移酶(E.C.2.7.2.1)与乙酰-CoA:Pi乙酰基转移酶(E.C.2.3.1.8)组合，将乙酸转化为乙酰-CoA，形成每个乙酰-CoA消耗1个ATP。在该途径中，每摩尔葡萄糖形成1摩尔丁醇是ATP-平衡的，即不会形成ATP。本发明人目前发现，PDH旁路的这一替代方式可以在酵母的胞质溶胶中导致乙酰-CoA合成，并且这样的乙酰-CoA可以在生物合成中用于产生更高量的想要的发酵产物，例如丁醇。
在第一方面，本发明提供了鉴定下述异源多肽的方法，所述多肽具有在酵母细胞(的胞质溶胶)中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性，所述方法包括：
-提供突变的酵母细胞，其中所述突变包括至少一种(PDH)旁路基因的失活，所述基因选自编码丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因；
-用包含至少一种异源核苷酸序列的表达载体转化所述突变的酵母细胞，所述异源核苷酸序列与在酵母中有功能的启动子可操作地连接，并且所述异源核苷酸序列编码至少一种具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的潜在酶活性的候选多肽；
-针对在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长的能力，测试所述重组突变的酵母细胞，和
-当观察到所述细胞的生长时，将所述候选多肽鉴定为具有在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽。
在所述方法的一个优选的实施方案中，酵母细胞是Saccharomycescerevisiae细胞，针对在Saccharomyces cerevisiae中的表达，对所述异源核苷酸序列进行了密码子(对)优化。
在另一个优选的实施方案中，所述突变包括乙酰-CoA合成酶同种型2(acs2)基因的失活。
在另一个优选的实施方案中，所述具有将乙醛转化为乙酰-CoA的酶活性的至少一种候选多肽是(推定的)乙酰基化乙醛脱氢酶。
或者，所述在酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的至少一种异源多肽可以由两种或更多酶组成，所述两种或更多酶一起发挥作用，达到想要的从丙酮酸、乙醛或乙酸到乙酰-CoA的转化。
在另一方面，本发明提供了用于在酵母细胞基因组中整合异源核苷酸序列并随后从中表达异源多肽的整合载体，所述异源核苷酸序列编码具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的多肽。
在另一方面，本发明提供了在酵母中表达异源多肽的表达载体，所述表达载体包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列与在酵母中有功能的启动子可操作地连接并且编码下述多肽，所述多肽在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性。
在所述载体的一个优选的实施方案中，通过上文所述的根据本发明的方法，鉴定具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的多肽。
在另一个优选的实施方案中，所述多肽选自SEQ ID NO:19、22、25、28和52及其功能性同源物。
在另一个优选的实施方案中，所述表达载体用于在Saccharomycescerevisiae中的表达，其中针对在Saccharomyces cerevisiae中的表达，对所述异源核苷酸序列进行了密码子(对)优化。
在另一个优选的实施方案中，所述异源核苷酸序列选自SEQ ID NO:20、23、26和29。
在另一方面中，本发明提供了包含如上所述本发明的表达载体的重组酵母细胞。
在一个优选的实施方案中，重组酵母细胞还包含至少一个(PDH)旁路基因的失活，所述基因选自编码丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因。
优选地，根据本发明的酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的基因的失活。
在另一个优选的实施方案中，重组酵母细胞还包含下述基因(核苷酸序列)的失活，所述基因编码能够催化乙醛转化为乙醇的酶，所述基因优选是编码醇脱氢酶的基因。
在本文中使用时，可以通过编码酶的基因或核苷酸序列(的部分)的突变、缺失或断裂，实现编码酶的基因(核苷酸序列)的失活。
优选地，根据本发明的酵母细胞显示在含有葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长。
在本发明酵母细胞的另一个优选的实施方案中，所述酵母细胞还包含一个或多个引入的基因，所述基因编码从胞质乙酰-CoA形成1-丁醇的重组通路。从乙酰-CoA到1-丁醇的合适的重组通路是本领域已知的。这类通路例如从WO 2007/041269中已知。优选地，所述一个或多个引入的基因编码生产乙酰乙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、丁烯酰基-CoA、丁酰基-CoA、丁醛和/或1-丁醇的酶。所述酶可以是：
-乙酰-CoA乙酰基转移酶(E.C.2.3.1.9[Enzyme Nomenclature 1992,Academic Press,San Diego]；尽管具有更宽泛的底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也同样有作用)，所述酶将2摩尔乙酰-Coa转化为乙酰乙酰基-CoA；
-NADH-依赖性或NADPH-依赖性3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(E.C.1.1.1.35或E.C.1.1.1.30，分别为E.C.1.1.1.157或E.C.1.1.1.36)，所述酶将乙酰乙酰基-CoA转化为3-羟基丁酰基-CoA；
-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(也称作巴豆酸酶；E.C.4.2.1.17或E.C.4.2.1.55)，其将3-羟基丁酰基-CoA转化为丁烯酰基-CoA；
-NADH-依赖性或NADPH-依赖性丁酰基-CoA脱氢酶(E.C.1.3.1.44，分别为E.C.1.3.1.38或E.C.1.3.99.2)，所述酶将丁烯酰基-CoA转化为丁酰基-CoA；
-单功能的NADH-依赖性或NADPH-依赖性醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10或1.2.1.57)，所述酶将丁酰基-CoA转化为丁醛，和
-NADH-依赖性或NADPH-依赖性丁醇脱氢酶(E.C.1.1.1.-)，所述酶将丁醛转化为1-丁醇，或
-双功能NADH-依赖性或NADPH-依赖性醛/醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1./1.2.1.10)，所述酶将丁酰基-CoA通过丁醛转化为1-丁醇。
在本发明的另一个优选实施方案中，酵母细胞是Saccharomycescerevisiae。
在另一方面，本发明提供了生产丁醇的方法，包括步骤：用根据本发明的酵母细胞发酵合适的碳底物，和回收所述发酵期间生产的丁醇。
附图说明
图1是PDH旁路的图示，其展示了丙酮酸脱羧酶(PDC；E.C.4.1.1.1)、乙醛脱氢酶(ALD；E.C.1.2.1.3、E.C.1.2.1.4和E.C.1.2.1.5)和乙酰-CoA合成酶(ACS；E.C.6.2.1.1)。
图2展示了Saccharomyces cerevisiae中丁醇生产的图示代谢途径。反应1-6是引入酵母中的来自Clostridium acetobutylicum的丁醇生物合成步骤。A、B和C表示胞质溶胶中乙酰-CoA生物合成的替代性反应。B表示丙酮酸脱氢酶旁路的部分(pdc、ald和acs)，这是酵母中胞质乙酰-CoA的天然来源。Glc，葡萄糖；EtOH，乙醇；Pyr，丙酮酸；AA，乙醛；ACT，乙酸；AcCoA，乙酰-CoA；AACoA，乙酰乙酰基-CoA；BuCoA，丁酰基-CoA；Bual，丁醛；BuOH，丁醇；NAD(P)(H)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(还原形式)；ATP，三磷酸腺苷；AMP，单磷酸腺苷；TCA循环，三羧酸循环；PDH，丙酮酸脱氢酶；pdc，丙酮酸脱羧酶；adh，醇脱氢酶；acdh，乙酰基化乙醛脱氢酶；ald，乙醛脱氢酶；acs，乙酰-CoA合成酶；pno，丙酮酸:NADP氧化还原酶。反应1-6表示的酶转化指出了来自Clostridium acetobutylicum的异源丁醇通路：thlB(或ThL)，编码乙酰-CoA乙酰基转移酶或硫解酶[E.C.2.3.1.9](SEQ ID NO:30)；hbd，3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶[E.C.1.1.1.157](SEQ ID NO:31)；crt，3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶[E.C.4.2.1.55](SEQ ID NO:32)；ter，转-烯酰基CoA还原酶；bcd，丁酰基-CoA脱氢酶[E.C.1.3.99.2](SEQ ID NO:33)；etfαβ，异二聚体电子传递黄素蛋白(etfα和etfβ，分别为SEQ ID NO:38和SEQID NO:39)；adhE/adhE1，醛/醇脱氢酶E和E1[E.C.1.1.1.1/1.2.1.10](分别为SEQ ID NO:34和35)；bdhA/bdhB，NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶A和B[E.C.:1.1.1.-](分别为SEQ ID NO:36和37)。
图3显示了质粒YEplac112PtdhTadh的图谱。该质粒的序列在SEQ IDNO:40中提供。
图4显示了以实施例2中所述1到4型蛋白质的氨基酸序列为基础的相似性树形图的例子，并且显示了分支。
具体实施方式
发明详述
定义
术语“丁醇”指正丁醇，或1-丁醇。
术语“酵母”指在种系发生上不同的一类单细胞真菌，其中大部分属于子囊菌亚门(Ascomycota)和担子菌亚门(Basidiomycota)。出芽酵母(“真酵母”)被归类于酵母菌目(Saccharomycetales)，其中Saccharomycescerevisiae是最公知的物种。
在本文中使用时，术语“重组酵母”被定义为含有核苷酸序列和/或蛋白质的细胞，或者用酵母中天然不存在的核苷酸序列转化或遗传修饰的细胞，或者其含有内源核酸序列(或蛋白质)的额外的一个或多个拷贝，或者其含有内源核酸序列的突变、缺失或断裂。
在本文中关于蛋白质或多肽使用时，术语“突变的”表示野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列中的至少一种氨基酸通过编码这些氨基酸的核酸的诱变而被不同的氨基酸替代，或者从序列中缺失。诱变是本领域公知的方法，并且包括例如借助于PCR或通过寡核苷酸介导的诱变进行的定点诱变，如Sambrook et al.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2nd ed.,Vol.1-3(1989)中所述。在本文中提到基因使用时，术语“突变的”表示基因或其调节序列的核苷酸序列中至少一个核苷酸被不同的核苷酸代替，或者通过诱变从序列中缺失，导致非功能性蛋白质序列的转录或者基因的敲除。
在本文中使用时，术语“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。
术语丙酮酸脱氢酶(PDH)旁路指酵母的胞质溶胶中从丙酮酸到乙酰-CoA的酶促级联放大，其由以下酶组成：将丙酮酸转化为乙醛的丙酮酸脱羧酶(PDC；E.C.4.1.1.1)；将乙醛转化为乙酸的乙醛脱氢酶(ALD；E.C.1.2.1.3、E.C.1.2.1.4和E.C.1.2.1.5)；和将乙酸转化为乙酰-CoA的乙酰-CoA合成酶(ACS；E.C.6.2.1.1)。
在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特定的序列及其互补序列。因此，主链为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA是该术语在本文中所指的“多核苷酸”。另外，包含稀有碱基(例如肌苷)或经修饰的碱基(例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是本文所用的术语多核苷酸。应当理解，已对DNA和RNA进行了大量不同的修饰，所述修饰发挥了本领域技术人员已知的许多有用目的。在本文中使用时，术语多核苷酸包括这些经化学、酶促或代谢修饰的多核苷酸形式，以及病毒和细胞的特征性DNA和RNA化学形式，所述细胞尤其包括简单细胞和复杂细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物的关键特征是，当掺入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。
序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在所比较的序列的全长上比较序列同一性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸虚礼之间的序列相关性程度，其根据情况通过这类序列的字符串之间的匹配测定。
对测定同一性的优选方法加以设计，以在所测试的序列之间得到最大匹配。测定同一性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。测定两条序列之间同一性和相似性的优选的计算机程序包括BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，公众可从NCBI和其它来源获得(BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)。使用BLASTP进行氨基酸序列比较的优选的参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。
本文中编码多肽的每条核酸序列还通过遗传密码子描述了核酸的每种可能的沉默变异。术语“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸两种序列。涉及具体的核酸序列时，经保守修饰的变体表示下述核酸，所述核酸由于遗传密码子的简并性而编码相同的氨基酸序列或其经保守修饰的变体。术语“遗传密码子的简并性”是指大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定了丙氨酸的每个位置上，可以将密码子改变为所述任何相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其代表一类经保守修饰的变异。
“表达”是指基因转录成为结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)并随后翻译成为蛋白质。
在本文中关于核酸或蛋白质使用时，“异源的”是下述核酸或蛋白质，其来自于外源物种，或者如果来自于相同物种时，通过有意的人工干预在组成和/或基因组基因座上与其天然形式相比被大幅修饰。例如，与异源结构基因可操作地连接的启动子来自与结构基因所来源的物种不同的物种，或者如果来自于相同物种时，启动子或异源结构基因之一或二者与其原始形式相比被大幅修饰。异源蛋白质可来自于外来物种，或者如果来自相同物种时，通过有意的人工干预与其原始形式相比被大幅修饰。
在本文中使用时，“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。典型地，启动子位于基因的5'-区，接近(结构)基因的转录起点。启动子序列可以是组成型、诱导型或阻抑型的。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应答诱导剂而提高。
在本文中使用时，术语“载体”包括常染色体表达载体，和用于整合进染色体中的整合载体。
术语“表达载体”是指线性或环形的DNA分子，其包含编码感兴趣的多肽的区段，所述区段位于支持其转录的额外的核酸区段的控制下(即与之可操作地连接)。这类额外的区段可包括启动子和终止子序列，并可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记物、增强子、多聚腺苷酸化信号等等。表达载体一般来自于质粒或病毒DNA，或者可含有二者的元件。具体地，表达载体包含以5'到3'方向包含并且可操作地连接的核苷酸序列：(a)酵母识别的转录和翻译起始区，(b)感兴趣的多肽的编码序列，和(c)酵母识别的转录和翻译终止区。“质粒”是指自主复制的染色体外DNA，其不被整合进微生物的基因组中，并且通常天然是环状的。
“整合载体”是指线性或环状的DNA分子，其能够被掺入微生物的基因组中，并且提供编码感兴趣的多肽的基因的稳定遗传。整合载体一般包含一个或多个区段(segments)，所述区段包括编码感兴趣的多肽的基因序列，所述基因序列位于支持其转录的额外的核酸区段的控制下(与之可操作地连接)。这类额外的区段可包括启动子和终止子序列，和驱动感兴趣的基因掺入靶细胞基因组中的一个或多个区段，所述掺入通常通过同源重组过程实现。典型地，整合载体会是能够被转移进靶细胞的载体，但是其具有在所述生物中无功能的复制子。当区段中包含适当的标记物时，可以选择包含感兴趣的基因的区段的整合。
在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指一种并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。与另一控制序列和/或与编码序列“可操作地连接”的控制序列以下述方式放置，所述方式使得在与控制序列相容的条件下达成编码序列的转录和/或表达。一般地，可操作地连接表示相连的核酸序列是邻接的，并且在需要接合两个蛋白质编码区时是邻接的，并处于相同的读码框中。
“宿主细胞”表示含有载体并支持载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如E.coli，或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是放线菌目(Actinomycetales)的细胞，更优选地是酵母细胞，最优选地是Saccharomyces cerevicsiae细胞。
在本文中使用时，转化("Transformation"和"transforming")表示将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而无论采用什么插入方法，例如直接吸收、转导、f-交配或电穿孔。外源多核苷酸可作为不整合的载体例如质粒被维持，或者可以被整合进宿主细胞基因组中。
术语“寡核苷酸”是指通过含磷键(例如磷酸二酯、烷基和芳基磷酸酯、硫代磷酸酯、phosphotliester)或无磷键(例如肽、氨基磺酸盐和其它)接合的核苷酸单体的短序列(通常为6到100个核苷酸)。寡核苷酸可含有经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸具有经修饰的碱基(例如5-甲基胞嘧啶)和经修饰的糖基(例如2'-O-甲基核糖基、2'-O-甲氧乙基核糖基、2'-氟核糖基、2'-氨基核糖基等等)。寡核苷酸可以是天然存在的或者合成的双链和单链DNA和双链和单链RNA分子，其具有环状、分支或线性的形状，并任选地包含能够形成稳定的二级结构的结构域(例如茎-环和环-茎-环结构)。
在本文中使用时，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚体形式，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括双链和单链的DNA和RNA。
在本文中使用时，术语“重组多核苷酸”是指基因组、cDNA、半合成或合成起源的多核苷酸，所述多核苷酸由于其起源或操作而：(1)与其天然结合的多核苷酸的全部或部分不结合；或(2)与除了其天然连接的多核苷酸之外的其它多核苷酸连接；或(3)天然不存在。
在本文中使用时，术语“最小培养基”是指化学上确定的下述培养基，其仅包含所培养的细胞存活和增殖所需的营养素。典型地，最小培养基不含有支持所培养的细胞种群存活和增殖不必需的生物学提取物，例如生长因子、血清、垂体提取物或其它物质。例如，最小培养基一般含有以下作为必需物质：至少一种碳源，例如葡萄糖；至少一种氮源，例如铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素；无机盐，例如磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和硫酸镁；和其它营养素，例如生物素和维生素。
优选的实施方案的描述
本发明的一种方法提供了鉴定能够在酵母细胞的胞质溶胶中生产乙酰-CoA的异源酶的方法。异源酶能够使用丙酮酸、乙醛或乙酸作为底物生产乙酰-CoA，优选地在单一的转化步骤中进行。优选地，异源酶从乙醛生产乙酰-CoA。能够催化所述反应的一种酶是乙酰基化乙醛脱氢酶(acdh；E.C.1.2.1.10)，也称作乙醛:NAD+氧化还原酶(CoA-乙酰基化)。乙醛通过乙酰基化乙醛脱氢酶成为乙酰-CoA的转化是可逆的，并且当乙醛在胞质溶胶中累积时朝乙酰-CoA的方向进行。这样的累积可以例如通过醇脱氢酶(adh；E.C.1.1.1.1)的缺失来实现。
异源酶也可以从丙酮酸生产乙酰-CoA。能够催化所述反应的一种酶是丙酮酸:NADP氧化还原酶(pno；E.C.1.2.1.51)。该反应在化学计量上与线粒体丙酮酸脱氢酶相同，不同之处在于：与使用NADH的PDH相比，pno使用NADPH作为辅因子。与acdh相比，pno酶体系的一个重要缺点是pno是氧敏感的，并且其为大的多体酶，因此其成功的遗传掺入(5-6kb基因)比acdh的遗传掺入难得多。为此，在本发明的实施方案中优选使用acdh。
能够显示想要的测试多肽酶活性的测试细胞的一个重要特性是，所述细胞由于引入的多肽而是原营养型的。这表示细胞的营养需求不超过相应的野生型菌株，并且其会在最小培养基上增殖(与营养缺陷型相反)。事实上，测试多肽所支持的乙酰-CoA的生产会取消所述至少一个PDH旁路基因缺失的影响，所述缺失由丙酮酸脱羧酶(pdc；E.C.4.1.1.1)、乙醛脱氢酶(ald；E.C.1.2.1.3、E.C.1.2.1.4或E.C.1.2.1.5)或乙酰-CoA合成酶(acs；E.C.6.2.1.1)的缺失引起。这样的补足实验是本领域公知的。在本发明的方面中，使用所述实验鉴定能够在酵母细胞中维持胞质乙酰-CoA生产的异源酶的合适来源。
补足实验以提供替代性途径以克服缺失的PDH旁路酶活性为基础。用于在酵母中达成基因缺失的方法是本领域公知的，并且可以例如通过寡核苷酸介导的诱变来实现。使用带有loxP-kanMX-loxP基因断裂盒的质粒pUG6可以获得良好的结果(Güldener et al.[1996]Nucleic Acids Res.24(13):2519-24；GenPept登录号P30114)。因此，技术人员会能够提供下述酵母菌株，所述菌株缺失了乙醛脱氢酶和/或乙酰-CoA合成酶，从而阻断其中的PDH旁路。
Saccharomyces cerevisiae包含两种乙酰-CoA合成酶同种型：Acs1p和Acs2p。二者均为用于组蛋白乙酰化的乙酰-CoA核来源。胞质乙酰-CoA的生产也是脂质生产所需要的。Acs活性是必需的，因为acs1acs2双无效突变体是不能存活的。在乙醇作为唯一碳源时，acs1无效突变体能够生长。在本发明方面中使用的突变的酵母细胞优选地具有acs2基因失活。
带有acs2基因失活的Saccharomyces cerevisiae突变体不能在葡萄糖作为唯一碳源时生长，因为ACS1被阻抑并且蛋白质被有效降解。用基于质粒的acs基因补足这样的Δacs2突变体会重建细胞在葡萄糖作为单一碳源时生长的能力。另外，通过表达下述基因补足了这样的突变体的生长，所述基因支持用于生产足量胞质乙酰-CoA的替代性途径。因此，用下述质粒转化Δacs2突变体会重建突变体在葡萄糖作为唯一碳源时生长的能力，从所述质粒能够表达功能性(异源)acdh或pno。应当理解，除了去除ACS2基因座以外，也可以去除ACS1基因座，尽管相信这在一些情况下可以防止回复体的产生(ACS1基因座中的突变导致Δacs2表型的回复)，但是发现这不是必需的。双重突变体(acs1/acs2Δ菌株)应当完全依赖于引入的用于生产胞质乙酰-CoA的acdh或pno基因。
本发明的补足实验的一个重要优点是其可以作为平板筛选实验进行，其中成功的补足作为菌落生长被观察到。这比需要分析想要的代谢产物生产的实验快得多。
为了对突变加以补足，用合适的表达载体转化ald和/或acs基因失活的酵母细胞，所述表达载体包含异源测试多肽的核苷酸序列。
酵母表达载体可广泛得自多种供应商。迄今为止，通过外来同源物对酵母突变的功能性补足已经成为Saccharomyces cerevisiae改造中的标准实践。用于异源基因的合适表达载体可基于人工的诱导型启动子，例如GAL启动子，但是优选地基于组成型启动子，例如TDH3启动子。合适的体系在下文实施例中举例。在某些生产体系中，可优选诱导型启动子的使用，因为这会允许在时间上分开用于生物质生产(启动子未被诱导)和发酵产物生产(启动子被诱导)的阶段。在另一高度优选的实施方案中，在某些生产体系中，载体是用于将异源基因稳定整合进酵母生产菌株基因组中的整合载体。
为了实现在酵母中的最优表达，可以通过使用多种合成基因设计软件包之任一来优化异源基因的密码子(对)选择，所述软件包例如WO2008/000632中所述用于密码子选择优化或密码子对选择优化的来自Geneart AG(Regensburg，德国)的密码子选择的这一适应确保(例如细菌起源的)异源基因被酵母转录和翻译机制有效地加工。密码子对选择的优化会导致酵母细胞中增强的蛋白质表达。
经优化的序列可以例如被克隆进高拷贝酵母表达质粒中，与在酵母中有功能的(优选地组成型)启动子可操作地连接。使用质粒YEplac112(2μTRP1)获得了良好的结果(Gietz&Sugino[1988]Gene 74(2):527-34)。
可以在芯片上鉴定编码下述候选多肽的异源基因，所述候选多肽具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的潜在酶活性。被描述为具有将乙醛转化为乙酰-CoA的能力的合适酶是乙酰基化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)。来自多种微生物起源的超过200种这些酶的核苷酸和氨基酸序列描述于多种数据库中(例如KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)数据库)。
本发明的发明人选择了若干种乙酰基化乙醛脱氢酶，并在本发明的基于Δacs2突变体的实验体系中测试了这些酶。当密码子对选择被优化时，其中许多(尽管不是全部)在S.cerevisiae中有功能。
这些蛋白质的功能性同源物也可以用于本发明的方面中。在本文中使用时，术语“功能性同源物”是指包含SEQ ID NO:19、22、25的氨基酸序列或SEQ ID NOs:28和52的乙醛脱氢酶部分的蛋白质，其中一个或多个氨基酸被替代、缺失、添加和/或插入，并且所述蛋白质具有相同的用于底物转化的酶功能，例如乙酰基化乙醛脱氢酶同源物能够将乙醛转化为乙酰-CoA。该功能可以通过使用下述实验体系测试，并使用所述实验体系如本文所述进行鉴定在酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽的方法，所述实验体系包含重组的酵母细胞，所述重组的酵母细胞包含用于在酵母中表达同源物的表达载体，所述表达载体包含与在酵母中有功能的启动子可操作地连接的异源核苷酸，并且所述异源核苷酸序列编码在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰CoA的酶活性的同源多肽。可以通过使用芯片上的相似性分析鉴定候选同源物。这类分析的一个详细的例子描述于下文实施例2中。技术人员应当能够从其中获知如何寻找合适的同源物，并且任选地在密码子(对)优化后，应当能够如上所述使用本发明的实验体系测试这类候选同源物的所需要的功能。合适的同源物代表了下述蛋白质，所述蛋白质与乙酰基化乙醛脱氢酶具有多于50％，优选地多于60％，更优选地多于70％、80％、90％或更多氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NOs:19、22、25或SEQ ID NOs:28和52的乙醛脱氢酶部分具有这样的氨基酸序列同一性，并具有将乙醛转化为乙酰-CoA所需的酶功能。类似地，与上文针对乙酰基化乙醛脱氢酶所述的相似，也可以使用被描述为直接将丙酮酸转化为乙酰-CoA的酶及其功能性同源物，以及被描述为将乙酸转化为乙酰-CoA的酶及其功能性同源物。
本发明的方法还包括下述步骤：测试突变的和用测试蛋白质转化的酵母细胞在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长的能力。如前文所述，这可以在培养皿(平板)中的固体(琼脂)培养基上合适地进行，其中生长可以作为菌落的生长被观察到，但是液体培养基也同样合适，并且可以通过浊度检测生长。也可以使用用于测定突变的和用测试蛋白质转化的酵母细胞在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长的其它方法。
当突变的和用测试蛋白质转化的酵母细胞能够在含葡萄糖的最小培养基上生长时，候选多肽被成功地鉴定为在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽。生长可以合适地被观察为固体生长培养基，尤其是含葡萄糖的最小培养基上的菌落形成。
根据本发明，用于在酵母中表达异源多肽的表达载体可以是适用于转化酵母的任何表达载体。在本领域中可以获得能够适当地被用于在酵母中表达异源核苷酸序列的无数例子。一种在本发明的方面中非常合适的载体是质粒。一种高度优选的质粒是YEplac112PtdhTadh(SEQ ID NO:40)。
通常，编码下述多肽的异源核苷酸序列会被置于在酵母中有功能的启动子的控制下，所述多肽在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰COA的酶活性。优选地，启动子是组成型启动子。质粒YEplac112PtdhTadh上的启动子是TDH3启动子。
插入本发明的表达载体中的异源核苷酸序列可以是任何pno、acdh或在酵母的胞质溶胶中能够将丙酮酸、乙醛或乙酸(分别)转化为乙酰-CoA的其它酶。优选的核苷酸序列是本文中鉴定的核苷酸序列，即编码以下的核苷酸序列：
-来自E.coli HS的乙醇胺利用蛋白质(SEQ ID NO:18)；
-来自L.innocua的与乙醇胺利用蛋白质EutE相似的假定蛋白质Lin1129(SEQ ID NO:21)，
-来自Clostridium kluyveri DSM 555的乙醛脱氢酶EDK33116(具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列)；和
-编码Staphylococcus aureus subsp.aureus N315中双功能乙醛/醇脱氢酶的S.aureus的adhE同源物(具有SEQ ID NO:27的核苷酸序列)，或其乙醛脱氢酶功能性部分。
-编码双功能醛/醇脱氢酶的Piromyces sp.E2的adhE同源物(核苷酸序列SEQ ID NO:51)或其乙醛脱氢酶部分。
这些核苷酸序列的功能性同源物或它们所编码的多肽也是合适的。该术语表示与编码上述acdh酶的核苷酸序列具有多于80％、90％或95％序列同一性的核酸序列，或者与上述acdh酶的氨基酸序列具有多于50％，优选地多于60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性，条件是同源序列编码的多肽显示功能性酶acdh活性。
如上文所述，可以通过本领域公知的密码子对选择优化，针对在Saccharomyces cerevisiae中的表达来优化这些核苷酸序列。SEQ IDNO:18、21、24和27的经密码子对优化的序列分别在SEQ ID NO:20、23、26和29中提供。
本发明的表达载体可以被用于转化酵母细胞。转化方法包括电穿孔、玻璃珠和生物弹转化，其均为本领域公知的，并且例如描述于Sambrook etal.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2nd ed.,Vol.1-3(1989)中。
根据本发明的酵母细胞包含编码下述多肽的异源核苷酸序列，所述多肽在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性。优选地，本发明的酵母细胞包含异源acdh或pno。这样的酵母细胞的优点是其能够通过不需要PDH旁路的代谢途径生产乙酰-CoA。这在厌氧条件下在能量方面更加有利，并且可以形成其中乙酰-CoA为中间产物的在厌氧条件下使用酵母细胞的任何生物学合成过程的基础。除了包含异源acdh或pno以外，本发明的酵母细胞可包含多种基因缺失或基因补充，这取决于酵母的预期用途。
优选地，根据本发明的酵母细胞包含编码下述酶的核苷酸序列(基因)的失活从而例如优化酵母细胞中的乙醛累积，所述酶能够催化乙醛转化成为乙醇，优选地为醇脱氢酶。
如果在根据本发明的筛选异源酶的方法中使用，则酵母细胞包含至少一个(PDH)旁路基因的缺失，所述基因选自编码以下酶的基因：丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)，优选地为乙酰-CoA合成酶，最优选地为acs2。
如果在生产发酵产物的方法中使用，则酵母细胞可任选地包含支持从乙酰-CoA到所述丁醇的代谢通路的大量(异源)基因补充。这样的通路可仅由异源基因产物组成，或者可利用异源和同源基因产物的混合物。在发酵产物是丁醇的情况下，可以利用包含下述基因的酵母，所述基因编码例如Clostridium acetobutylicum的丁醇通路的酶，如本文和图2中所述。在根据本发明的酵母细胞包含编码丁醇生产酶的基因的情况下，酵母优选地包含编码丁酰基-CoA脱氢酶的核苷酸序列，和至少一种编码异源电子传递黄素蛋白(ETF)的核苷酸序列。发现除了丁醇通路的基因以外包含ETF的酵母细胞产生更大量的乙醇。
根据本发明的真核细胞中的异源电子传递黄素蛋白可以是单种蛋白质，或者ETF可包含两个或更多亚基，例如α亚基和β亚基。优选地，ETF包含ETFα(SEQ ID NO:38)和ETFβ(SEQ ID NO:39)。电子传递黄素蛋白可来自于任何合适的起源。优选地，ETF来自于与丁酰基-CoA脱氢酶相同的起源。优选地，ETF来自于原核生物起源，优选地来自于Clostridium sp.，优选地来于Clostridium acetobutylicum或Clostridiumbeijerinckii。
生产根据本发明的发酵产物的方法，所述方法优选地包括在厌氧条件下在合适的碳和能量来源上培养酵母。合适的碳和能量来源是C5和C6糖(单糖)例如葡萄糖，和多糖例如淀粉。其它原料例如甘蔗、玉米、小麦、大麦、甜菜、油菜籽和向日葵也是合适的。在一些情况下，原料可以通过酶处理被预消化。最优选地，碳源是木质纤维素，其主要由纤维素、半纤维素、果胶和木质素组成。木质纤维素存在于例如植物的茎、叶、荚(hull)、外壳(husk)和穗轴(cob)中。通过特异的酶处理水解这些多聚体，释放了中性糖的混合物，所述中性糖包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。可以使用木质纤维素材料生产丁醇，所述木质纤维素材料例如木材、草本材料、农业残余物、玉米纤维、废纸、纸浆和纸粉碎残余物(paper mill residue)。水解酶例如是用于水解纤维素的β-连接的葡聚糖(这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡萄糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)；β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖；用于水解半纤维素的、内切作用和外切作用的半纤维素酶和纤维二糖酶，和水解木质素糖苷键的乙酰脂酶和酯酶。用于水解木质纤维素的这些方法和其它方法是本领域公知的。
本文公开的实施方案的变更和修饰是可能的，并且在学习本专利文件后，本领域常规技术人员应当理解所述实施方案的实践替代方式和多种元素的等同物。可以对本文公开的实施方案进行这些和其它变更和修饰，而不偏离本发明的范围和思想。
本发明接着将通过以下的非限制性实施例阐述。
实施例
以下的实施例阐述了Saccharomyces cerevisiae菌株的提供，所述菌株适用于本发明的测定法和方法，例如适用于鉴定在S.cerevisiae中能够形成胞质乙酰-CoA的异源酶的方法。这类方法在途径/酶的鉴定中有用，所述酶/途径允许在缺氧条件下在S.cerevisiae中胞质提供乙酰-CoA。
为了增强我们的丁醇生产菌株中胞质乙酰-CoA的形成，我们建立了鉴定在S.cerevisiae中形成胞质乙酰-CoA的异源酶的选择方法。测试体系基于在葡萄糖上胞质乙酰-CoA生物合成不足的Δacs2酵母突变体，这类菌株不能在葡萄糖作为唯一碳源时生长，除非补充胞质乙酰-CoA。在这类菌株中的补足研究能够揭示哪些异源酶适用于Saccharomyces cerevisiae的丁醇生产菌株。
因为不浪费ATP，所以乙酰基化乙醛脱氢酶被鉴定为优于同源PDH旁路的胞质乙酰-CoA供应。基于序列同源性鉴定的十二种推定的乙酰基化乙醛脱氢酶被合成，并针对Δacs2酵母的补足进行检验。
E.coli、L.innocua和C.kluyveri的eutE同源物和S.aureus的adhE同源物的密码子对经优化的基因能够补充acs2酵母突变体(7个中的4个)，导致acs2ΔS.cerevisiae宿主的生长。目的是通过表达藉此鉴定的一种或多种基因，在酵母中促进丁醇生物合成。
为了测试胞质乙酰-CoA供应的这些异源途径是否能够在S.cerevisiae中作用，以带有acs2基因缺失的Saccharomyces cerevisiae突变体为基础开发了筛选体系。这些细胞不能在葡萄糖作为唯一碳源时生长，除非用基于质粒的acs基因补充或者用产生足量胞质乙酰-CoA的任何其它基因补充Δacs2突变体。因此，如果要用导致acdh或pno活性表达的质粒转化，则这样的突变体应当能够再次在葡萄糖作为单一碳源时生长。补足研究在平板上进行。进行以下的实验建立和评价测试体系。
实施例1Δacs2菌株的构建
首先用以下寡核苷酸对质粒pUG6(Güldener et al.,1996，上文)进行PCR，产生S.cerevisiae acs2缺失的菌株(acs2Δ菌株)：
5’acs2::Kanlox                  5’-tacacaaacagaatacaggaaagtaaatcaatacaataataaaacagctgaagcttcgtacgc-3’
3’acs2::Kanlox                  5’-tctcattacgaaatttttctcatttaagttatttctttttttgaggcataggccactagtggatctg-3’。
使用得到的1.4kb片段转化S.cerevisiae CEN.PK113-3C(MATA trp1-289)，所述片段含有赋予G418抗性的KanMX标记物。转化后将菌株涂布于含200mg/ml遗传霉素(G418)的YPD(10g l-1酵母提取物(BD Difco)、20g l-1蛋白胨(BD Difco)、10g l-1葡萄糖)上。在抗性转化体中，使用以下寡核苷酸通过PCR验证正确的整合：
5’ACS2:                  5'-
gatattcggtagccgattcc-3'
3’ACS2:                  5'-
ccgtaaccttctcgtaatgc-3'
ACS2内部：                  5'-
cggattcgtcatcagcttca-3'
KanA:                  5'-
cgcacgtcaagactgtcaag-3'
KanB:                  5'-
tcgtatgtgaatgctggtcg-3'
通过测试在含1％葡萄糖(YPD)或1％乙醇+1％甘油(YPEG)作为碳源的YP上的生长来验证表型。
挑取一个转化体并命名为RWB060(MATA trp1-289acs2::Kanlox)，所述转化体具有正确的PCR条带，并且在含葡萄糖的YP上不生长但是在含乙醇和甘油作为碳源的YP上生长。
实施例2在芯片上针对乙醛成为乙酰-CoA的正确转化鉴定推定的乙酰基 化乙醛脱氢酶
描述用于将乙醛转化为乙酰-CoA的酶是所谓的乙酰基化乙醛脱氢酶(ACDH)(E.C.1.2.1.10)，其催化以下反应：
乙醛(AA)+NAD++CoA<＝>乙酰-CoA+NADH+H+
文献中描述了具有该活性的四种蛋白质：
1)双功能蛋白质，其催化乙酰-CoA成为乙醛的可逆转化，以及随后的乙醛成为乙醇的可逆转化。这类蛋白质的一个例子是E.coli中的AdhE蛋白质(GenBank No:NP_415757)。AdhE似乎是基因融合的进化产物。AdhE蛋白质的NH2-末端区域与乙醛:NAD+氧化还原酶高度同源，而COOH-末端与Fe2+-依赖性的乙醇:NAD+氧化还原酶家族同源(Membrillo-Hernández et al.,(2000)J.Biol.Chem.275:33869-33875)。E.coli AdhE受到金属催化的氧化，因此其是对氧敏感的(Tamarit et al.(1998)J.Biol.Chem.273:3027-32)。
2)蛋白质，其在严格厌氧或兼性厌氧的微生物中催化乙酰-CoA成为乙醛的可逆转化，但是不具有醇脱氢酶活性。这类蛋白质的一个例子已在Clostridium kluyveri中报道(Smith et al.(1980)Arch.Biochem.Biophys.203:663-675)。在Clostridium kluyveri DSM 555基因组中已注释了一种乙酰基化乙醛脱氢酶(GenBank No:EDK33116)。在Lactobacillus plantarum基因组中鉴定了同源蛋白质AcdH(GenBank No:NP_784141)。这类蛋白质的另一个例子是Clostridium beijerinckii NRRL B593中的ald基因产物(Toth et al.(1999)Appl.Environ.Microbiol.65:4973–4980,GenBank No:AAD31841)。
3)涉及乙醇胺分解代谢的蛋白质。乙醇胺可以被许多肠道细菌作为碳源和氮源二者利用(Stojiljkovic et al.(1995)J.Bacteriol.177:1357-1366)。乙醇胺首先被乙醇胺氨裂合酶转化为氨和乙醛，随后乙醛被乙酰基化乙醛脱氢酶转化为乙酰-CoA。这类乙酰基化乙醛脱氢酶的一个例子是Salmonellatyphimurium中的EutE蛋白质(Stojiljkovic et al.(1995)J.Bacteriol.177:1357-1366,GenBank No:AAL21357)。E.coli也能够利用乙醇胺(Scarlett etal.(1976)J.Gen.Microbiol.95:173–176)，并且具有与S.typhimurium中的EutE蛋白质同源的EutE蛋白质(GenBank No:AAG57564)。
4)蛋白质，其为涉及4-羟基-2-酮戊酸盐/酯(4-hydroxy-2-ketovalerate)代谢的双功能醛缩酶-脱氢酶复合物的部分。这类双功能酶催化儿茶酚的间位切割通路的最后两个步骤，所述儿茶酚是许多微生物物种中苯酚、甲苯、萘、联苯和其它芳香族化合物的降解中的中间产物(Powlowski andShingler(1994)Biodegradation 5,219–236)。4-羟基-2-酮戊酸盐/酯首先通过4-羟基-2-酮戊酸盐/酯醛缩酶被转化为丙酮酸和乙醛，随后乙醛被乙酰基化乙醛脱氢酶转化为乙酰-CoA。这类乙酰基化乙醛脱氢酶的一个例子是Pseudomonas sp CF600中的DmpF蛋白质(GenBank No:CAA43226)(Shingler et al.(1992)J.Bacteriol.174:711-24)。E.coli具有与Pseudomonassp.CF600中的DmpF蛋白质同源的MphF蛋白质(Ferrández et al.(1997)J.Bacteriol.179:2573–2581,GenBank No:NP_414885)。
为了鉴定乙酰基化乙醛脱氢酶的蛋白质家族成员，使用默认参数，在针对GenBank非冗余蛋白质数据库的BLASTp搜索中，作为查询序列运行E.coli双功能AdhE蛋白质(GenBank No:NP_415757)、L.plantarum AcdH蛋白质(乙酰基化)(GenBank No:NP_784141)、E.coli EutE蛋白质(GenBank No:AAG57564)和E.coli MhpF蛋白质(GenBank No:NP_414885)的氨基酸序列。提取E-值小于或等于1e-20的氨基酸序列。去除冗余序列，比对剩余的序列，并使用6.5.2版Genedata Physolopher蛋白质分析仪软件建立相似性树形图。相似性树形图提供了生物序列相似性的信息。该树形图通过每个残基位置上氨基酸序列的成对比较创建，与ClustalW算法无关。在每个位置上，相似性被分级并加和，得到每个序列对的总体评分。以这些成对评分为基础，进行了分级聚类，所述分级聚类将序列排列在树形图中。注意，C.beijerinckii的ald基因产物(GenBank no:AAD31841)与来自E.coli和S.typhimurium的EutE蛋白质聚类在一起。从该相似性树形图中可以定义四个主要的分支，每个分支含有被用作BLASTp搜索的查询序列的一条氨基酸序列。图4显示这类相似性树形图的一个例子，其含有该实施例中提到的所有序列。
从每个分支中至少选择一条氨基酸序列用于S.cerevisiaeΔacs2的补足测试中。优选地，所选择的氨基酸序列具有其作为乙酰基化乙醛脱氢酶的生物化学功能的实验证据。这类证据可存在于公共数据库中，例如BRENDA、UniProt和NCBI Entrez数据库中。
实施例3表达质粒的构建和补足测试
为了测试乙酰基化乙醛脱氢酶(ACDH)是否能够补足S.cerevisiae中ACS2的缺失，从如上所述的多种数据库中选择编码(推定的)ACDH的若干基因。
为了在酵母中达到最优表达，通过密码子对优化使所有基因的密码子选择适应。这些序列由Geneart AG(Regensburg，德国)合成。
将经优化的序列克隆进高拷贝酵母表达质粒YEplac112PtdhTadh(SEQ ID NO:40；以YEplac112为基础(2μTRP1)(Gietz&Sugino[1988]Gene 74(2):527-34)中，允许TDH3启动子引起的组成型表达。
通过将来自p426GPD(Mumberg et al.[1995]Gene.156(1):119-22)的KpnI-SacI片段克隆进用KpnI-SacI切割的YEplac112中，制造YEplac112PtdhTadh，所述KpnI-SacI片段含有TDH3启动子和CYC1终止子。用KpnI和SphI切割得到的质粒并将末端填平，然后连接得到YEplac112TDH。为了获得YEplac112PtdhTadh，用PstI-HindIII切割YEplac112TDH并与含有ADH1终止子(Tadh)的345bp PstI-HindIII PCR片段连接，由此代替CYC1终止子并改变启动子和终止子之间的多聚接头。使用以下的寡核苷酸产生Tadh PCR片段：
MCS-5’Tadh:                  5'-
aaggtacctctagactagtcccgggctgcagtcgactcgagcgaatttcttatgatttatgatt-3'
Tadh1-Hind:                  5'-
aggaagcttaggcctgtgtggaagaacgattacaacagg-3'
根据制造商的说明书，用VentR DNA聚合酶完成PCR。
用SpeI-PstI切割含有ACDH基因的合成构建体，并连接进用相同酶消化的YEplac112PtdhTadh中，得到pBOL058到pBOL068和pBOL082。最终质粒的名称和它们所含有的基因在表1中给出。
表1：针对Δacs2S.cerevisiae菌株的补足所测试的推定的乙酰基化乙醛脱氢酶的概况。导致补足的基因用黑体给出。提供了野生型基因的DNA序列、由其表达的蛋白质和经密码子对优化的DNA序列的SEQ IDNOs。
表1
生物 名称 组* 大小(kb) SEQ ID NO：DNA/PRT/OPT
Escherichia coli adhE 1 2.6
Entamoeba histolytica adh2 1 2.6 48/50/49
Staphylococcus aureus adhE 1 2.6 27/28/29
Piromyces sp.E2 adhE 1 2.6 51/52
Clostridium kluyveri EDK33116 2 1.5 24/25/26
Lactobacillus plantarum acdH 2 1.4
Escherichia coli EutE 3 1.4 18/19/20
Listeria innocua Lin1129 3 1.4 21/22/23
Pseudomonas putida YP 001268189 4 1.0
*组表示具有实施例2中定义的ACDH活性的蛋白质组。第1组：与双功能E.coli AdhE相似(AdhE-型蛋白质)；第2组：与Lactobacillusplantarum AcdH具有相似性的蛋白质(AcdH-型蛋白质)；第3组：与E.coli EutE相似(EutE-型蛋白质)；第4组：与E.coli MhpF相似(MhpF-型蛋白质)。
所有的质粒都被用于转化Δacs2酵母菌株RWB060。使用空载体YEplac112作为阴性对照。将转化体涂布在含1％葡萄糖(MYD)或1％乙醇+1％甘油(MYEG)作为单一碳源的矿物培养基(Verduyn et al.[1992]Yeast 8(1992),pp.501–517)上。
尽管对所有构建体而言，可以在含乙醇/甘油的最小培养基上选择若干转化体，但是在含葡萄糖的平板上则不是这样。
表2：Δacs2S.cerevisiae菌株RWB06中推定的乙酰基化乙醛脱氢酶补足实验的结果。导致补足的基因以黑体给出。MYEG和MYD列指出MYEG(乙醇/甘油)和MYG(葡萄糖)平板上的转化体数量。
生物 基因(GenPept登录号) 质粒 MYEG MYD
无 YEplac112 75 0
Escherichia coli adhE pBOL059 6 0
Entamoeba histolytica adh2 pBOL061 54 0
Staphylococcus aureus adhE pBOL064 36 39
Piromyces sp.E2 adhE pBOL039 32 3
Clostridium kluyveri EDK33116 pBOL065 21 8
Lactobacillus plantarum acdH pBOL058 6 0
Escherichia coli EutE pBOL066 24 18
Listeria innocua Lin1129 pBOL067 28 8
Pseudomonas putida YP 001268189 pBOL068 32 0
在含葡萄糖的平板上，仅可针对质粒pBOL064、pBOL065、pBOL066和pBOL067而非空载体选择转化体。菌落大小也存在清楚的差异，这取决于使用的质粒。尽管构建体pBOL066(E.coli eutE)产生最大的菌落，但是pBOL067(L.innocua lin1129)的菌落显示稍小，pBOL065(C.kluyveriedk3116)显示最小的菌落。质粒pBOL064(S.aureus adhE)和质粒pBOL139(Piromyces sp.E2,adhE)在较晚的日期进行实验，所以不能直接比较。含有pBOL64的菌落似乎与包含pBOL066的菌落类似，包含pBOL139的菌落似乎与包含pBOL065的菌落类似。
为了确保这些结果不来自于自发回复型，针对一些质粒重复转化实验，得到了相同的结果。另外，对所有质粒而言，从MYEG平板上随机选择四个转化体，并在MYD和MYEG平板上重新划线。
在所有实验中，从来没有用空载体(YEplac112)在葡萄糖上观察到生长，同时只有pBOL065、pBOL066和pBOL067重复地给出了在葡萄糖上的良好生长。在初始的强阳性结果之后，没有用这种方式再测试质粒pBOL064。
根据这些结果得出结论：
-编码来自E.coli HS的乙醇胺利用蛋白质EutE的E.coli(SEQ IDNO:20)；
-编码来自L.innocua的与乙醇胺利用蛋白质EutE相似的假定蛋白质的L.innocua(SEQ ID NO:23)，和
-编码Clostridium kluyveri DSM 555中乙酰基化乙醛脱氢酶的C.kluyveri(SEQ ID NO:26)
的eutE同源物的经密码子对优化的基因；和
-编码Staphylococcus aureus subsp.aureus N315中双功能乙醛/醇脱氢酶的S.aureus(SEQ ID NO:29)
的adhE同源物的经密码子对优化的基因；和
-编码双功能醛/醇脱氢酶的Piromyces sp.E2(SEQ ID NO:51)
的adhE同源物的未经密码子对优化的基因，
能够补足acs2酵母突变体。这些基因编码下述酶活性，所述酶活性允许在酵母中从乙醛形成胞质乙酰-CoA。
结论
胞质乙酰-CoA的供应被认为是酵母中丁醇生产的瓶颈。为了鉴定编码在S.cerevisiae中形成胞质乙酰-CoA的酶的异源基因，进行了基于Δacs2酵母突变体的测试体系。
由于在葡萄糖上胞质乙酰-CoA生物合成中的缺陷，acs2Δ菌株不能够在葡萄糖作为唯一碳源时生长。
在acs2Δ酵母中表达被鉴定为从乙醛供应胞质乙酰-CoA的候选者的9种推定的乙酰基化乙醛脱氢酶。这9个基因中总计5个在使用葡萄糖作为单一碳源时补足了acs2Δ菌株的生长。因此显示了Δacs2菌株作为针对乙酰-CoA胞质供应的可行途径的预选择工具的用途。
迄今为止鉴定的5种乙酰基化乙醛脱氢酶中的4种：E.coli、L.innocua和C.kluyveri的eutE同源物，和S.aureus的adhE同源物和Piromyces sp.E2被成功地整合进S.cerevisiae的丁醇生产菌株中。如下文实施例中所述研究了对丁醇生产的影响。
该测试体系还被用于分析丙酮酸:NADP氧化还原酶是否能够在酵母中被成功地过表达。由于氧敏感性，该测试必须厌氧进行。
下文的实施例4-6描述了针对丁醇生产的改进，测试来自实施例3的5种选定的ACDH基因中的4种。
实施例4构建生产丁醇的酵母菌株并敲除ADH1和ADH2基因
表3中列出了涉及从乙酰-CoA生物合成丁醇的六个Clostridiumacetobutylicum基因。所述基因如WO2008/000632中所述针对S.cerevisiae进行了密码子对优化，并由表3中所列的酵母启动子和终止子表达。
在Geneart设计并合成两种酵母整合载体(pBOL34[SEQ ID NO:41]和pBOL36[SEQ ID NO:42])，每种含有来自Clostridium acetobutylicum的涉及丁醇生物合成的六个经密码子对优化的基因中的3个。
基因ThiL、Hbd和Crt由含有AmdS选择标记物的pBOL34表达。最终的三个基因Bcd、BdhB和AdhE由带有AmdS选择标记物的称作pBOL36的整合载体表达。
表3：用于在S.cerevisiae中生产丁醇的基因，包含启动子(1000bp)和终止子(500bp)。
基因 活性 启动子 终止子
ThiL 乙酰CoA c-乙酰基转移酶[E.C.2.3.1.9] ADH1 TDH1
Hbd 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶[E.C.1.1.1.157] ENO1 PMA1
Crt 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶[E.C.4.2.1.55] TDH1 ADH1
Bcd 丁酰基-CoA脱氢酶[E.C.1.3.99.2] PDC1 TDH1
BdhB NADH-依赖性丁醇脱氢酶[E.C.1.1.1.-] ENO1 PMA1
adhE 醇/乙醛CoA脱氢酶[E.C.:1.1.1.1/1.2.1.10] TDH1 ADH2
为了整合进ADH2基因座中，通过BsaBI消化将pBOL36线性化。用线性化的片段转化S.cerevisiae CEN.PK113-5D(MATa MAL2-8c SUC2ura3-52)，并在含YCB(Difco)和5mM乙酰胺作为氮源的平板上培养。
通过将转化体在2ml管中YEPD中于30℃培养6小时，通过重组去除AmdS标记物。随后将细胞涂布在1.8％琼脂培养基上，所述培养基含有YCB(Difco)和40mM氟乙酰胺和30mM磷酸盐缓冲液pH 6.8，其仅支持丢失AmdS标记物的细胞生长。通过PCR验证正确的整合和重组。使用以下的引物验证上游片段的正确整合：
P1:5’-GAATTGAAGGATATCTACATCAAG-3’和
P2:5’-CCCATCTACGGAACCCTGATCAAGC-3’。
用以下的引物验证下游片段的正确整合：
P3:5’-GATGGTGTCACCATTACCAGGTCTAG-3’和
P4:5’-
GTTCTCTGGTCAAGTTGAAGTCCATTTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGCGTG-3’。
得到的菌株被命名为BLT021。
通过PsiI消化线性化pBOL34，并整合进BLT021的ADH1基因座中。在含有YCB(Difco)和5mM乙酰胺的平板上培养转化体。为了去除AmdS选择标记物，将菌落接种于YEPD中并在2ml管中于30℃培养6小时。将细胞涂布在YCB(Difco)和40mM氟乙酰胺和0.1％硫酸铵上。
通过PCR验证正确的整合和重组。使用以下的引物组验证上游片段的正确整合：
P5:5’-GAACAATAGAGCGACCATGACCTTG-3’和
P6:5’-GACATCAGCGTCACCAGCCTTGATG-3’。
使用以下的引物组验证下游片段的正确整合：
P7:5’-GATTGAAGGTTTCAAGAACAGGTGATG-3’和
P8:5’-GGCGATCAGAGTTGAAAAAAAAATG-3’。
得到的菌株被命名为BLT057。
实施例5在BLT057中引入ETFα和ETFβ
如WO2008/000632中所述针对S.cerevisiae对表4中所列的ETF基因和Acdh基因进行了密码子对优化，并从如表4中所列的酵母启动子和终止子来进行表达。
表4：用于在S.cerevisiae中表达密码子对经优化的ETF基因和Acdh基因的启动子和终止子
启动子 终止子
Etfα(CpO) tef1 tdh2
Etfα(CpO) tdh2 tef1
Acdh64(AdhE S.aureus) tdh3 adh
Acdh65(Clostridium) tdh3 adh
Acdh66(EutE E.Coli) tdh3 adh
Acdh67(Lin 1129Ec) tdh3 Adh
整合载体由Geneart AG合成，所述整合载体仅表达ETFα和ETFβ(pBOL113,[SEQ ID NO:43])，或表达与Acdh64(pBOL115,[SEQ IDNO:44])、Acdh65(pBOL116,[SEQ ID NO:45])、Acdh66(pBOL118,[SEQID NO:46])或Acdh67(pBOL120,[SEQ ID NO:47])组合的ETFα和ETFβ。
用StuI线性化载体pBOL113、pBOL115、pBOL116、pBOL118和pBOL120，并整合进菌株BLT057的ura3-52基因座中。
在含有/不含有氨基酸+2％半乳糖的YNB(Difco)中培养转化体，以选择尿嘧啶原养型菌株。基因组中整合了pBOL113/115/116/118/120的来自菌株BLT057的菌株被分别命名为菌株：BLT071、BLT072、BLT073、BLT074和BLT075。
实施例6通过表达阳性Acdh基因而改进的的丁醇生产
在Verduyn培养基(Verduyn et al.(1992)Yeast 8:501-517)中培养实施例5中制备的菌株BLT071到BLT075，所述培养基中硫酸铵被2g/l尿素代替，并且还含有4wt.％半乳糖。在旋转摇动器中180rpm下，将细胞在含有50ml培养基的100ml摇瓶中于30℃培养72小时。
测定培养物上清液中的丁醇浓度。在装有火焰电离检测器和自动注射体系的HS-GC上分析样品。柱J&W DB-1长度30m，id 0.53mm，df 5μm。使用以下条件：使用氦作为载气，流速5ml/分钟。将柱温度设定为110℃。将注射器设定为140℃并在300℃下进行检测。使用Chromeleon软件获得数据。在顶空采样器中将样品于60℃加热20分钟。1ml顶空挥发物被自动地注射在柱上。
多种菌株的1-丁醇生产如下：
BLT057:120mg/l
BLT071:450mg/l
BLT072:500mg/l
BLT073:600mg/l
BLT074:670mg/l
BLT075:700mg/l
结果显示引入通过实施例3的补足实验鉴定的电子传递黄素蛋白(ETFα和ETFβ)和/或引入乙酰基化乙醛脱氢酶提供了丁醇生产水平。

Claims (20)

1.鉴定下述异源多肽的方法，所述异源多肽在酵母细胞(的胞质溶胶)中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性，所述方法包括：
-提供突变的酵母细胞，其中所述突变包括至少一种(PDH)旁路基因的失活，所述基因选自编码丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因；
-用下述表达载体转化所述突变的酵母细胞，所述表达载体包含与酵母中有功能的启动子可操作地连接的至少一种异源核苷酸序列，并且所述异源核苷酸序列编码具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的潜在酶活性的候选多肽；
-针对在含葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上生长的能力，测试所述重组突变的酵母细胞，和
-当观察到所述细胞的生长时，将所述候选多肽鉴定为具有在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述酵母细胞是Saccharomycescerevisiae的细胞，并且其中，针对在Saccharomyces cerevisiae中表达，对所述异源核苷酸序列进行了密码子对优化。
3.根据权利要求2的方法，其中所述突变包括乙酰-CoA合成酶同种型2(acs2)的基因的失活。
4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述具有将乙醛转化为乙酰-CoA的酶活性的候选多肽是(推定的)乙酰基化乙醛脱氢酶(acdh)。
5.用于在酵母中表达异源多肽的载体，所述载体包含与在酵母中有功能的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，并且所述异源核苷酸序列编码具有在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的多肽。
6.根据权利要求5的载体，其中通过根据权利要求1-4中任一项的方法鉴定具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的所述多肽。
7.根据权利要求5或6的载体，其中所述多肽与选自SEQ ID NO:19、22、25、28和52的氨基酸序列具有多于50％，优选地多于60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。
8.用于在Saccharomyces cerevisiae中表达的、根据权利要求5到7中任一项的载体，其中针对在Saccharomyces cerevisiae中的表达，对所述异源核苷酸序列进行了密码子对优化。
9.根据权利要求8的表达载体，其中所述异源核苷酸序列选自SEQID NO:20、23、26、29和51。
10.包含权利要求5-9中任一项所述的载体的重组酵母细胞。
11.包含下述异源核苷酸序列的重组酵母细胞，所述异源核苷酸序列编码具有在所述酵母细胞(的胞质溶胶)中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的多肽。
12.根据权利要求10或11的酵母细胞，其还包含至少一种(PDH)旁路基因的失活，所述基因选自编码酶丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因。
13.根据权利要求10到12中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的基因的失活。
14.根据权利要求10到13中任一项的酵母细胞，其中所述细胞显示出在含有葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基上的生长。
15.根据权利要求10到14中任一项的酵母细胞，其还包含编码催化乙醛向乙醇的转化的酶的基因的失活，优选地为醇脱氢酶。
16.根据权利要求10到15中任一项的酵母细胞，其还包含一种或多种引入的基因，所述基因编码用于从乙酰-CoA形成1-丁醇的重组通路。
17.根据权利要求16的酵母细胞，其中所述一种或多种引入的基因编码生产乙酰乙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、丁烯酰基-CoA、丁酰基-CoA、丁醛和/或1-丁醇的酶。
18.根据权利要求10到17中任一项的酵母细胞，其中所述酵母是Saccharomyces cerevisiae。
19.生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：用根据权利要求10到16中任一项的酵母细胞发酵合适的碳底物，和回收所述发酵期间生产的发酵产物。
20.根据权利要求19的方法，其中所述发酵产物是丁醇。
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