BR112021001577A2 - produção de álcool aumentada a partir de levedura que produz uma quantidade aumentada de proteína crz1 ativa - Google Patents

Abstract

PRODUÇÃO DE ÁLCOOL AUMENTADA A PARTIR DE LEVEDURA QUE PRODUZ UMA QUANTIDADE AUMENTADA DE PROTEÍNA CRZI ATIVA. A presente invenção refere-se a composições e métodos que se referem à levedura modificada que, adicionalmente à CRZI nativa endógena, produz um ativador transcricional de CRZI modificado envolvido na trajetória de resposta a estresse de calcineurina. Tal leve-dura é bem adequada para uso na produção de álcool combustível para aumentar o rendimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODU-

ÇÃO DE ÁLCOOL AUMENTADA A PARTIR DE LEVEDURA QUE PRODUZ UMA QUANTIDADE AUMENTADA DE PROTEÍNA CRZ1 ATIVA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Pa- tente Provisório nº U.S. 62/703.952, depositado em 27 de julho de 2018, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] As presentes composições e métodos referem-se à levedura modificada que produz uma quantidade aumentada de um ativador transcricional de CRZ1 variante ativo envolvido na trajetória de resposta a estresse de calcineurina. Tal levedura é bem adequada para uso na produção de álcool combustível para aumentar o rendimento.

ANTECEDENTES

[0003] Muitos países produzem álcool combustível a partir de subs- tratos fermentáveis, tais como amido de milho, cana-de-açúcar, mandi- oca e melaço. De acordo com a Associação de Combustível Renovável (Washington DC, Estados Unidos), a produção de etanol combustível de 2015 foi próxima de 15 bilhões de galões (56,78 bilhões de litros) nos Estados Unidos, apenas.

[0004] Butanol é um produto químico de uso industrial importante e componente de combustível imprevisto com uma variedade de aplica- ções incluindo o uso como um aditivo para combustível renovável, um produto químico de matéria-prima na indústria de plásticos e um extra- tante de grau alimentício na indústria de alimentos e sabor. Consequen- temente, há uma alta demanda por álcoois, tais como butanol e isobu- tanol, assim como por métodos de produção eficientes e ecológicos.

[0005] Em vista da grande quantidade de álcool produzida no mundo, até mesmo um pequeno aumento na eficiência de um orga- nismo fermentador pode resultar em um grande aumento na quantidade de álcool disponível. Consequentemente, existe a necessidade de orga- nismos que sejam mais eficientes na produção de álcool.

SUMÁRIO

[0006] São descritos composições e métodos relacionados à leve- dura modificada que produz um ativador transcricional de CRZ1 variante em relação à levedura progenitora, de outro modo, idêntica. Os aspec- tos e modalidades das composições e métodos são descritos nos pará- grafos a seguir, independentemente enumerados.

[0007] 1. Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modi- ficadas derivadas de células de levedura progenitoras, sendo que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células produzam uma quantidade maior de polipeptídeos CRZ1 ativos em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem durante a fermentação uma quantidade maior de álcool em comparação com a quantidade de álcool produzida pelas cé- lulas progenitoras sob condições idênticas de fermentação.

[0008] 2. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 1, os polipeptídeos CRZ1 ativos exibem fosforilação reduzida em comparação com polipeptídeos CRZ1 nativos sob condições de fer- mentação idênticas.

[0009] 3. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 1 ou 2, os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número redu- zido de resíduos de aminoácido com a capacidade para fosforilação em comparação com os resíduos de aminoácido em polipeptídeos CRZ1 nativos.

[0010] 4. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 3, os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resíduos de serina com a capacidade para fosforilação em compara- ção com os resíduos de aminoácido em polipeptídeos CRZ1 nativos.

[0011] 5. Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 4, a quantidade de aumento na expres- são dos polipeptídeos mutantes CRZ1 modificados é pelo menos cerca de 500%, pelo menos 1.000%, pelo menos 1.500% ou até mesmo pelo menos 2.000%, em comparação com o nível de expressão dos polipep- tídeos CRZ1 nativos nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0012] 6. Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, as células compreendem, ainda, um ou mais genes da trajetória de fosfocetolase.

[0013] 7. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 6, os genes da trajetória de fosfocetolase são selecionados den- tre o grupo que consiste em fosfocetolase, fosfotransacetilase e acetil desidrogenase acetilante.

[0014] 8. Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, as células compreen- dem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.

[0015] 9. Em algumas modalidades, as células modificadas dos pa- rágrafos 1 a 8, compreendem, ainda, uma alteração nas trajetórias de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

[0016] 10. Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de álcool.

[0017] 11. Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 10, as células são de um Saccha- romyces Spp.

[0018] 12. Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 11, o álcool é etanol.

[0019] 13. Em outro aspecto, é fornecido um método para aumentar a produção de álcool a partir de células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato que compreende: introduzir em células de le- vedura progenitoras uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos CRZ1 ativos em comparação com a quantidade produ- zida nas células progenitoras.

[0020] 14. Em algumas modalidades do método do parágrafo 13, os polipeptídeos CRZ1 ativos exibem fosforilação reduzida em compara- ção com polipeptídeos CRZ1 nativos sob condições de fermentação idênticas.

[0021] 15. Em algumas modalidades do método do parágrafo 13 ou 14, os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resí- duos de aminoácido com a capacidade para fosforilação em compara- ção com os resíduos de aminoácido em polipeptídeos CRZ1 nativos.

[0022] 16. Em algumas modalidades do método do parágrafo 15, os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resíduos de serina com a capacidade para fosforilação em comparação com os re- síduos de aminoácido em polipeptídeos CRZ1 nativos.

[0023] 17. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 13 a 16, a alteração genética resulta na levedura variante de qualquer um dos parágrafos 1 a 11 ou variantes da mesma.

[0024] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes com- posições e métodos serão evidentes a partir da descrição, incluindo os Desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] As Figuras 1A a 1C são um alinhamento Clustal W que com- para o gene CRZ1 nativo (SEQ ID NO: 3; parte inferior) ao gene variante CRZ1 geneticamente modificado (SEQ ID NO: 4; parte superior) con- tendo uma mutação silenciosa na posição de nucleotídeo 39 resultando na deleção de um sítio de restrição Spel e contendo, ainda, alterações de nucleotídeo resultando em resíduos de alanina nas posições 68, 69, 77 e 78 substituindo os resíduos de serina. As diferenças nas sequên- cias são mostradas em nedgrito.

[0026] A Figura 2 é um alinhamento Clustal W que compara o poli- peptídeo CRZ1 nativo (SEQ ID NO: 1) ao polipeptídeo variante CRZ1 geneticamente modificado (SEQ ID NO: 2). As substituições de serina para alanina nas posições 68, 69, 77 e 78 são mostradas em negrito.

DESCRIÇÃO DETALHADA |. VISÃO GERAL

[0027] As presentes composições e métodos referem-se à levedura modificada que produz um ativador transcricional de CRZ1 variante en- volvido na trajetória de resposta a estresse de calcineurina. O gene CRZ1 nativo em Saccharomyces cerevisiae é constitutivamente trans- crito, traduzido e enovelado em uma proteína (Crz1p), um membro da família de dedo de zinco de fatores de transcrição. Crz1p contém uma região rica em serina (SRR) que, sob condições sem estresse, é fosfo- rilada. Sob condições ambientais não estressantes, a Crz1p fosforilada está localizada no citoplasma. Quando as células são submetidas aos estresses ambientais, tais como uma falta de nutrientes, estresse tér- mico, químico ou osmótico e similares, a Crz1p é desfosforilada por complexo de calcineurina induzido, e a trajetória de resposta a estresse de calcineurina é ativada. A Crz1p desfosforilada é translocada para o núcleo em que a mesma afeta genes que atuam na resposta a estresse celular. Dessa maneira, a Crz1p desfosforilada é considerada a forma ativa da molécula.

[0028] Embora no núcleo, o estado da fosforilação de Crz1p muda rapidamente com quinases que refosforilam os resíduos de serina na SRR causando a exportação rápida da Crz1p do núcleo. Cineticamente, a exportação é favorecida em relação à importação, e a existência de

Crz1p no estado desfosforilado é transitória.

[0029] Embora se saiba que a presença de álcool induz a trajetória de resposta a estresse de calcineurina, era desconhecido até o mo- mento que a expressão de uma proteína CRZ1 modificada adicional- mente à CRZ1 endógena nativa resultaria em tolerância a álcool aumen- tada. Essa observação sugere que a trajetória de resposta a estresse de calcineurina em levedura não é naturalmente otimizada para o es- tresse da produção de álcool, até mesmo em levedura comercial seleci- onada especificamente para esse propósito. Vários aspectos e modali- dades da presente composição e métodos são descritos em detalhes no presente documento. Il. DEFINIÇÕES

[0030] Antes de descrever as células modificadas e métodos de uso em detalhes, os termos a seguir são definidos por questões de clareza. Os termos não definidos devem ser acordados com seus significados comuns conforme usados na técnica relevante.

[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "álcool" refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.

[0032] Conforme usado no presente documento, "células de leve- dura", "cepas de levedura" ou simplesmente "levedura" referem-se a or- ganismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exem- plificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccharomycetales. Os exemplos específicos de levedura são Saccharomyces spp., inclu- indo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0033] Conforme usado no presente documento, o sintagma "célu- las de levedura variantes", "células de levedura modificadas" ou sintag- mas similares (consultar o disposto acima) referem-se à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocor- rência natural.

[0034] Conforme usado no presente documento, os termos "poli- peptídeo" e "proteína" (e suas respectivas formas plurais) são usados de forma intercambiável para se referir a polímeros de qualquer compri- mento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-ter- minal. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender ami- noácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modifi- cado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de liga- ção de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um amino- ácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0035] Conforme usado no presente documento, as proteínas fun- cional e/ou estruturalmente similares são consideradas "proteínas rela- cionadas". Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de dife- rentes gêneros e/ou espécies, ou até mesmo diferentes classes de or- ganismos (por exemplo, bactérias e fungos). As proteínas relacionadas também englobam homólogos determinados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por função ou reatividade cruzada imunológica.

[0036] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína homóloga" ou "homólogo" refere-se a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutiva- mente. Assim, pretende-se que o termo abranja a enzima (enzimas) igual, similar ou correspondente (isto é, em termos de estrutura e fun- ção) obtida a partir de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaterná- ria, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica si- milar (ou respostas imunológicas similares) à de uma proteína de refe- rência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneti- camente modificadas para produzir enzimas com a atividade desejada (ou atividades desejadas).

[0037] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consul- tar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Ne- edleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Gene- tics (Genetics Computer Group, Madison, WI); e Devereux et a/. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).

[0038] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múl- tiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas com o uso de alinhamentos progressivos por pareamento. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J.

Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5: 151 a 153). Os parâmetros de PILEUP úteis incluem um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento da lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderados. Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et a/. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST particu- larmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo, Al- tschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros "W","T" e "X" determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O pro- grama BLAST usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUMG6?2 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N-4 e uma comparação entre ambas as fitas.

[0039] Conforme usado no presente documento, os sintagmas "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipica- mente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma se- quência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de iden- tidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em compara- ção com a sequência de referência (isto é, do tipo selvagem). O percen- tual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo

CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et a/. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Os parâmetros padrão para o al- goritmo CLUSTAL W são: Penalidade de abertura de lacuna: 10,0 Penalidade de extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: Série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de atraso de sequências divergentes: 40 Distância de separação de lacuna: 8 Peso de transições de DNA: 0,50 Lista de resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Uso de matriz negativa: DESATIVADO Alternância de penalidades de resíduo específico: ATIVADO Alternância de penalidades hidrofílicas: ATIVADO Alternância penalidade por separação de lacuna final DESATIVADO

[0040] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substan- cialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoá- cido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um poli- peptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substitui- ção conservadora. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[0041] Conforme usado no presente documento, o termo "gene" é sinônimo do termo "alelo" em referência a um ácido nucleico que codi- fica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegeta- tivas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado.

[0042] Conforme usado no presente documento, "expressar um po- lipeptídeo" e termos similares referem-se ao processo celular de produ- zir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomos) da célula.

[0043] Conforme usado no presente documento, "superexpressar um polipeptídeo", "aumentar a expressão de um polipeptídeo" e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação ge- nética especificada.

[0044] Conforme usado no presente documento, um "cassete de ex- pressão" refere-se a um fragmento de DNA que inclui um promotor, uma sequência de codificação de aminoácido, um terminador e outra se- quência de ácidos nucleicos necessários para permitir que o polipeptí- deo codificado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expres- são podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endó- genos (isto é, existentes em uma célula).

[0045] Conforme usado no presente documento, os termos "tipo sel- vagem" e "nativo" são usados de forma intercambiável e se referem a cepas ou proteínas de genes encontradas na natureza.

[0046] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de interesse" refere-se a um polipeptídeo que se deseja que seja ex- presso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, um fator, um cofator, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável ou simi- lares e pode ser expressa em altos níveis. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno modificado ou um gene heterólogo (isto é, "gene de interesse") em relação à cepa progenitora. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0047] Conforme usado no presente documento, o termo "nativo" é sinônimo de tipo selvagem e não geneticamente modificado.

[0048] Conforme usado no presente documento, os termos "mani- pulação genética" e "alteração genética" são usados de forma intercam- biável e se referem à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substitui- ção, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0049] Conforme usado no presente documento, um "polipeptí- deo/proteína ativa" possui uma atividade definida.

[0050] Conforme usado no presente documento, "geneticamente modificado", particularmente em relação a um gene CRZ1, mRNA trans- crito ou proteína CRZ1 modificada ativa, refere-se a uma versão do gene, mRNA ou proteína que foi geneticamente manipulada por inter- venção humana.

[0051] Conforme usado no presente documento, "fermentação ae- róbia" refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0052] Conforme usado no presente documento, "fermentação ana- eróbica" refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0053] Conforme usado no presente documento, os artigos singula- res "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências ci- tadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de refe- rência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a não ser que especificado de outro modo: ºC graus Centígrados AA a-amilase pb pares de bases DNA ácido desoxirribonucleico DP grau de polimerização ds ou DS sólidos secos EtoH etanol g ou gm grama gl gramas por litro GA glicoamilase GAU/g de ds unidades de glicoamilase por grama de sólidos secos H2O0 água HPLC cromatografia líquida de alto desempenho hr ou h hora kg quilograma M molar mg miligrama mL ou ml mililitro ml/min mililitro por minuto mM milimolar N normal nm nanômetro PCR reação em cadeia de polimerase ppm partes por milhão RNA ácido ribonucleico

A relacionado a uma deleção vg micrograma uL e ul microlitro UM micromolar Il. CÉLULAS DE LEVEDURA MODIFICADAS QUE TÊM EXPRES- SÃO DE CRZ1 MODIFICADA

[0054] Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modifi- cadas, em que as células modificadas têm uma alteração genética que resulta na produção de polipeptídeos CRZ1 modificados que são, adici- onalmente aos polipeptídeos CRZ1 endógenos nativos, comparados a células progenitoras, de outro modo, idênticas. A sequência de aminoá- cidos do polipeptídeo CRZ1 de S. cerevisiae S288c ativo exemplificado (isto é, número de acesso ao EMBL NP 014371) é mostrada abaixo como a SEQ ID NO: 1. Os resíduos de serina do tipo selvagem menci- onados no texto anexo são sublinhados:

MSFSNGNMASYMTSSNGEEQS INNKNDIDDNSAYRRNNFRNSSNSGSHT FOLSDLDLDVDMRMDAA NSSEKISKNLSSGIPDSFDSNVNSLLSPSSGSYSADLNYQSLYKPDL POQQOLO000LO00000000

QQQEÇAKATPTLKVEQSDTFQWDDIL TPADNQHRPSLTNQFLSPRSNYDGTTRSSGIDSNYSDTES NYHTPYLYPQODLVSSPAMSHLTANNDDFDDLLSVASMNSNYLLPVNSHGYKHISNLDELDDLLSLT YSDNNLLSASNNSDFNNSNNGIINTADTONSTIAINKSKVGTNQKMLLTIPTSSTPSPSTHAAPVT PIISIQEFNEGHFPVKNEDDGTLOLKVRDNESYSATNNNNLLRPDDNDYNNEALSDIDRSFEDIIN GRKLKLKKSRRRSSQTSNNSFTSRRSSRSRSISPDEKAKS I SANREKLLEMADLLPSSENDNNRER YDNDSKTSYNTINSSNFNEDNNNNNLLTSKPKIESGIVNIKNELDDTSKDLGILLDIDSLGQFEQK VGFKNDDNHENNDNGT FSVKKNDNLEKLDSVTNNRKNPANFACDVCGKKFTRPYNLKSHLRTHTNE RPFICSICGKAFARQHDRKRHEDLHTGKKRYVCGGKLKDGKPWGCGKKFARSDALGRHFKTESGRR CITPLYEEARQEKSGQES

[0055] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo CRZ1 de S. ce- revisiae S288c geneticamente modificado exemplificado é mostrada abaixo como a SEQ ID NO: 2. As substituições de alanina mencionadas no texto anexo são sublinhadas:

MSFSNGNMASYMTSSNGEEQS INNKNDIDDNSAYRRNNFRNSSNSGSHT FOLSDLDLDVDMRMDAA NAAEKISKNLAAGIPDSFDSNVNSLLSPSSGSYSADLNYQSLYKPDLPOQOLOCOOLOCEOoEEEo

EEEEÇEOKETPTLKVEQSDTFOWDDI L TPADNQHRPSLTNQFLSPRSNYDGTTRSSGIDSNYSDTES NYHTPYLYPODLVSSPAMSHLTANNDDFDDLLSVASMNSNYLLPVNSHGYKHISNLDELDDLLSLT YSDNNLLSASNNSDEFNNSNNGI INTADTONSTIAINKSKVGTNQKMLLTIPTSSTPSPSTHAAPVT PIISIQEFNEGHFPVKNEDDGTLOLKVRDNESYSATNNNNLLRPDDNDYNNEALSDIDRSFEDIIN GRKLKLKKSRRRSSQTSNNSFTSRRSSRSRSISPDEKAKS I SANREKLLEMADLL PSSENDNNRER YDNDSKTSYNTINSSNFNEDNNNNNLLTSKPKIESGIVNIKNELDDTSKDLGILLDIDSLGQFEQK VGFKNDDNHENNDNGT FSVKKNDNLEKLDSVTNNRKNPANFACDVCGKKFTRPYNLKSHLRTHTNE RPFICSICGKAFARQHDRKRHEDLHTGKKRYVCGGKLKDGKPWGCGKKFARSDALGRHFKTESGRR CITPLYEEARQEKSGQES

[0056] O gene geneticamente modificado inclui uma mutação silen- ciosa na posição de nucleotídeo 39 resultando na deleção de um sítio de restrição Spel e inclui, ainda, alterações de nucleotídeo resultando nos resíduos de serina nas posições 68, 69, 77 e 78 substituindo os resíduos de alanina. As modificações de nucleotídeo são mostradas no alinhamento Clustal W da Figura 1. As diferenças entre os polipeptídeos nativos e geneticamente modificados são mostradas no alinhamento Clustal W da Figura 2. Sem ater-se a uma teoria, acredita-se que a subs- tituição de resíduos de serina por alanina remove os sítios de fosforila- ção, imitando, assim, a desfosforilação do polipeptídeo CRZ1 nativo, re- sultando na localização nuclear e resposta a estresse melhorada. Outro resíduo com a capacidade para ser fosforilado, particularmente aqueles na SRR, pode também ser presumivelmente substituído em vez ou adi- cionalmente àqueles exemplificados, com efeito similar.

[0057] Em algumas modalidades, os polipeptídeos CRZ1 genetica- mente modificados são expressos em combinação com, e adicional- mente a, polipeptídeos CRZ1 nativos. Em algumas modalidades, os po- lipeptídeos CRZ1 geneticamente modificados são expressos no lugar de, isto é, na ausência de, polipeptídeos CRZ1 nativos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CRZ1 modificado é expresso em excesso em relação aos polipeptídeos nativos. Em algumas modalidades, o au- mento na expressão dos polipeptídeos mutantes CRZ1 é pelo menos pelo menos 500%, pelo menos 1.000%, pelo menos 1.500% ou até mesmo pelo menos 2.000% ou mais, em comparação com o nível de expressão dos polipeptídeos nativos nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0058] Em algumas modalidades, o aumento na produção de álcool pelas células modificadas é um aumento de pelo menos 0,3%, pelo me- nos, 0,5%, pelo menos 0,6%, pelo menos 0,7%, pelo menos 0,8%, pelo menos 0,9%, pelo menos 1,0%, pelo menos 1,1%, pelo menos 1,2%, pelo menos 1,3%, pelo menos 1,4%, pelo menos 1,5%, pelo menos 1,6%, pelo menos 1,7%, pelo menos 1,8%, pelo menos 1,9%, pelo me- nos 2,0% ou mais, em comparação com a quantidade de álcool produ- zido por células progenitoras cultivadas sob as mesmas condições.

[0059] De preferência, a produção de CRZ1 é atingida por manipu- lação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas para sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. Entre- tanto, a mutagênese química não é excluída como um método para pro- duzir células de levedura modificadas. A produção de CRZ1 modificado pode também ser alcançada por evolução clássica com o uso de técni- cas de triagem projetadas.

[0060] Em algumas modalidades, a célula progenitora que já está modificada para incluir um gene de interesse, tal como um gene que codifica um marcador selecionável, enzima processadora de carboidra- tos ou outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, um gene de inte- resse é subsequentemente introduzido nas células modificadas. IV. COMBINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CRZ1 MODIFICADO COM

GENES DE UMA TRAJETÓRIA DE PKL EXÓGENA

[0061] A expressão de CRZ1 modificado pode ser combinada com a expressão de genes na trajetória de PKL para aumentar a produção de etanol. As células de levedura geneticamente modificadas que têm uma trajetória de PKL heteróloga foram descritas anteriormente no do- cumento nº WO2015148272 (Miasnikov et al/.). Essas células expres- sam fosfocetolase (PKL), fosfotransacetilase (PTA) e acetil desidroge- nase acetilante (AADH) heterólogas, opcionalmente com outras enzi- mas, para canalizar o fluxo de carbono na direção oposta à trajetória de glicerol e em direção à síntese de actil-CoA, que, então, é convertida em etanol. Tais células modificadas têm capacidade de produção de etanol aumentada em um processo de fermentação em comparação com células de levedura progenitoras, de outro modo, idênticas. V. COMBINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CRZ1 MODIFICADO COM OU- TRAS MUTAÇÕES QUE AFETAM A PRODUÇÃO DE ÁLCOOL E/OU

REDUÇÃO DE GLICEROL

[0062] Em algumas modalidades, além de expressarem polipeptí- deos CRZ1 modificados, as presentes células de levedura modificadas incluem modificações adicionais que afetam a produção de etanol.

[0063] As células modificadas podem incluir, ainda, as mutações que resultam em atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol na- tiva e/ou trajetória de glicerol de reutilização, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redu- ção ou eliminação da atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase (GPP) dependente de NAD endó- geno, por exemplo, por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPD1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as patentes nº U.S. 9.175.270 (Elke et a/.), 8.795.998 (Pronk et a/.) e 8.956.851 (Ar- gyros et al.). Métodos para melhorar a trajetória de glicerol de reutiliza- ção pela superexpressão de glicerol desidrogenase (GCY1) e di-hidroxi acetona quinase (DAK1) para converter glicerol em fosfato de di-hidroxi acetona (Zhang et a/. (2013) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40: 1.153 a

1.160).

[0064] A levedura modificada pode apresentar adicionalmente ativi- dade aumentada de acetil-CoA sintase (também chamada de acetil-CoA ligase) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido por hidró- lise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cul- tura da levedura por qualquer outra razão) e converter o mesmo em Ac- CoA. Isso evita o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendi- mento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heterólogo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão de um gene endógeno da acetil- CoA sintase e similares. Uma acetil-CoA sintase particularmente útil para introdução em células pode ser obtida a partir de Methanosaeta concilii (número de acesso ao UniProt/TTEMBL: WP 013718460). Ho- mólogos dessas enzimas, incluindo enzimas que têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e até mesmo pelo menos 99% de identidade de se- quência de aminoácidos com a acetil-CoA sintase de Methanosaeta concilii supracitada, também são úteis nas presentes composições e métodos.

[0065] Em algumas modalidades, as células modificadas podem in- cluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com ativi- dade de acetaldeído desidrogenase acetilante dependente de NAD* e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formato liase. A in- trodução de tais genes em combinação com a atenuação da trajetória de glicerol é descrita, por exemplo, na Patente nº U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). Em algumas modalidades das presentes composições e méto- dos, a levedura carece expressamente de um gene heterólogo (ou ge- nes heterólogos) que codifica uma acetaldeído desidrogenase aceti- lante, uma piruvato-formato liase ou ambas.

[0066] Em algumas modalidades, as células de levedura modifica- das presentes podem superexpressar adicionalmente um polipeptídeo semelhante a transportador de açúcar (STL1) (consultar, por exemplo, Ferreira et al. (2005) Mol Biol Cell 16:2.068 a 2.076; Duskova et al. (2015) Mol Microbiol 97:541 a 559 e o documento nº WO 2015023989 A1) para aumentar a produção de etanol e reduzir o acetato.

[0067] Em algumas modalidades, as células de levedura modifica- das presentes podem superexpressar adicionalmente uma proteína de ligação a poliadenilato, por exemplo, PAB1, para aumentar a produção de álcool e reduzir a produção de acetato.

[0068] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma traje- tória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolac- tato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidroxi-isovalerato; (c) 2,3-di-hidroxi-iso- valerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a traje- tória biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codi- ficam polipeptídeos que têm atividade de acetolactato sintase, ceto- ácido redutoisomerase, di-hidroxi-ácido desidratase, cetoisovalerato de- carboxilase e álcool desidrogenase.

[0069] Em algumas modalidades, as células de levedura modifica- das que compreendem uma trajetória biossintética de butanol compre- endem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato descarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mu- tação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato descarboxilase. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxi- lase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C. VI. COMBINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CRZ1 MODIFICADO COM

OUTRAS MUTAÇÕES BENÉFICAS

[0070] Em algumas modalidades, além da expressão de polipeptí- deos CRZ1 modificados, opcionalmente em combinação com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool, as pre- sentes células de levedura modificadas incluem, ainda, qualquer nú- mero de genes de interesse adicionais que codificam proteínas de inte- resse. Genes de interesse adicionais podem ser introduzidos antes, du- rante ou após manipulações genéticas que resultam na produção au- mentada de polipeptídeos CRZ1 modificados.

[0071] As proteínas de interesse incluem marcadores selecioná- veis, enzimas processadoras de carboidratos e outros polipeptídeos co- mercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transaldolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma B-glucanase, uma fosfatase, uma pro- tease, uma a-amilase, uma B-amilase, uma glicoamilase, uma pulula- nase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transfe- rase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e mo- dificadas de outra forma.

VII. USO DA LEVEDURA MODIFICADA PARA PRODUÇÃO DE ÁL- COOL AUMENTADA

[0072] As presentes composições e os métodos incluem métodos para aumentar a produção de álcool e/ou reduzir a produção de glicerol em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um pro- cesso específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição "imprevista" para leve- dura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool. Embora seja principalmente destinada à produção de álcool combustí- vel, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja. VIII. CÉLULAS DE LEVEDURA ADEQUADAS PARA MODIFICAÇÃO

[0073] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccha- romyces Spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, La- chancea e Schizosaccharomyces spp. Inúmeras cepas de levedura es- tão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais como alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e similares. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir en- zimas heterólogas, como glicoamilase ou a-amilase. IX. SUBSTRATOS E PRODUTOS

[0074] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboi- drato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-de-açúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecâ- nicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0075] Os produtos de fermentação de álcool incluem o composto orgânico que tem um grupo funcional hidroxila (-OH) ligado a um átomo de carbono. Álcoois exemplificativos incluem, porém sem limitação, me- tanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-pentanol, isopentanol e álcoois superiores. Os álcoois combustíveis mais comumente produzidos são etanol e butanol.

[0076] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas de levedura e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, mas não a limitar, as composições e os métodos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. MATERIAIS E MÉTODOS

PREPARAÇÃO DE LIQUEFEITO

[0077] O liquefeito (pasta fluida de milho moído) foi preparado adi- cionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g de ds de FERMGENTY 2,5X (protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g de ds de glicoamilase de Tri- choderma variante (TrGA) e 1,46 de SSCU/g de ds de a-amilase de As- pergillus, ajustado a um pH de 4,8.

ENSAIOS DE ANKOM

[0078] 300 ul da cultura de levedura concentrada durante a noite foram adicionados a cada um dentre os inúmeros recipientes ANKOM preenchidos com 30 g de liquefeito preparado para uma OD final de 0,3.

Os recipientes foram, então, incubados a 32ºC com agitação (150 RPM) por 55 horas.

ANÁLISE DE HPLC

[0079] As amostras dos experimentos de frasco de soro e AnKkom foram coletadas em tubos Eppendorf por centrifugação por 12 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram filtrados com filtros de PTFE 0,2 UM e, então, usados para análise de HPLC (Agilent Technologies série 1200) com as seguintes condições: colunas Bio-Rad Aminex HPX-

87H, temperatura de funcionamento de 55ºC. Fluxo isocrático a 0,6 ml/min de H2SO, 0,01 N, volume de injeção de 2,5 ul. Padrões de cali- bração foram usados para quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. As amostras dos experimentos de vasos de agitação foram co- letadas em tubos Eppendorf por centrifugação por 15 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram diluídos por um fator de 11 com o uso de H2SO4s 5 mM e incubados por 5 min a 95ºC. Após o resfriamento, as amostras foram filtradas com filtros de 0,2 uM Corning FiltrEX CLS3505 e, então, usadas para análise por HPLC. 10 ul foram injetados em uma HPLC Agilent série 1200 equipada com um detector de índice de refra- ção. A coluna de separação usada foi uma coluna Phenomenex Rezex- RFQ Fast Acid H+ (8%). A fase móvel foi H2SO4 5 mM, e a taxa de fluxo foi 1,0 ml/min a 85ºC. A Mistura Padrão de Calibração de HPLC da Bion Analytical foi usada para a quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. Exceto se especificado de outro modo, todos os valores são expressos em g/L.

EXEMPLO 2. GERAÇÃO DE UM GENE CRZ1 "ATIVO" MODIFICADO

[0080] A sequência de codificação de CRZ1 de S. cerevisiae S288c foi sintetizada em uma forma geneticamente modificada alterando-se um nucleotídeo de timina com um nucleotídeo de adenina na posição 39 resultando em uma mutação silenciosa que deleta um sítio de restri- ção Spel e alterando-se nucleotídeos de timina por nucleotídeos de gua- nina nas posições 202, 205, 229 e 232 resultando em resíduos de ala- nina substituindo resíduos de serina na SRR. O gene CRZ1 modificado foi nomeado CRZ1.1.2. O alinhamento de sequência de ácidos nuclei- cos nativos e o alinhamento de sequência de polipeptídeos mostrando a diferença entre os dois genes são ilustrados nas Figuras 1 e 2, res- pectivamente. O gene geneticamente modificado é representado pela SEQ ID NO: 4, mostrada abaixo com as mutações sublinhadas:

ATGTCATTCAGCAACGGAAATATGGCTTCCTACATGACAAGTAGTAATGGAGAGGAGCAAAGTATA AACAACAAAAACGATATAGACGATAACAGCGCTTACAGACGTAATAATTTCAGGAATAGTAGCAAT TCAGGATCACATACGTTCCAATTATCGGACTTGGACTTAGATGTGGATATGAGGATGGATGCTGCC AATGCAGCGGAGAAAATATCAAAGAACCTTGCCGCTGGCATCCCGGACTCATTTGATTCTAACGTG AACAGCTTGCTGTCTCCGTCAAGCGGTTCTTATTCTGCAGATTTGAATTACCAAAGTCTATACAAA CCAGATCTTCCACAGCAACAGTTACAACAGCAACAGTTACAACAGCAACAGCAACAGCAACAGCAA CAACAACAGCAACAGCAGAAGCAAMACACCAACTTTAAAAGTCGAACAATCTGATACATTTCAGTGG GACGATATCTTAACACCTGCTGATAATCAACATCGGCCATCCCTCACAAACCAGTTTTTATCTCCA AGATCTAATTACGATGGTACCACTAGGAGCTCGGGCATTGACTCCAATTATAGCGATACAGAATCA AACTATCATACGCCTTATTTGTATCCACAGGACTTAGTTTCTTCACCTGCGATGTCTCACTTAACC GCGAATAACGATGATTTTGACGATCTTTTGAGCGTCGCATCTATGAACTCAAATTATTTACTGCCC GTAAATTCACATGGTTATAAACATATTTCAMACCTTGATGAGTTGGATGACTTGCTATCTTTAACA TATTCAGACAATAACCTTTTATCAGCATCAAACAACAGTGATTTCAACAACAGTAATAACGGAATT ATTAATACCGCTGACACTCAAAACAGTACCATTGCCATTAATAAAAGTAAAGTCGGTACTAACCAA AAGATGTTATTGACTATTCCAACTTCTTCCACACCTTCTCCTICCACTCATGCTGCCCCGGETAACA CCCATCATTTCTATACAGGAATTCAATGAGGGACACTTCCCAGTTAAAAACGAAGATGACGGAACG TTACAACTAAAAGTTCGGGATAACGAAAGTTATAGCGCTACTAACAATAACAATCTACTTCGTCCA GATGATAATGATTACAACAACGAAGCTCTCAGTGATATTGACCGCTCCTTCGAAGATATCATTAAC GGTCGAAAATTGAAACTTAAAAAATCAAGAAGAAGATCTTCTCAAACTTCCAATAATAGTTTCACT AGCAGGAGATCCTCGAGATCAAGAAGCATATCTCCCGATGAAAAAGCTAAATCTATAAGTGCAAAT AGGGAAAAGTTATTGGAGATGGCAGATCTTTTACCATCCAGTGAAAATGACAATAATCGGGAGCGC TATGACAATGATAGCAAAACTAGCTATAACACCATTAACAGTAGCAATTTTAATGAGGATAATAAT AATAACAATTTGTTAACAAGTAAACCAAAAATTGAATCGGGCATTGTCAATATTAAAAATGAACTA GATGACACTAGCAAAGATCTTGGCATACTTCTAGACATAGATAGCTTGGGCCAATTTGAGCAGAAA GTTGGTTTCAAAAATGATGATAATCACGAAAATAACGATAATGGCACATTTTCTGTTAAGAAAAAT GACAATCTAGAAAAACTAGACAGTGTAACAAATAATAGGAAAAATCCTGCGAATTTTGCTTGTGAT GTATGTGGTAAGAAGTTTACAAGACCTTATAACTTAAAGTCACACTTAAGAACGCATACAAATGAA AGGCCATTTATTTGTTCTATTTGTGGTAAGGCGTTTGCACGTCAACATGATAGAAAGAGACACGAA GATTTGCATACAGGTAAGAAAAGGTATGTATGCGGTGGTAAGCTGAAGGACGGTAAACCCTGGGGT TGTGGCAAAMAGTTTGCAAGAAGTGATGCTCTTGGTAGGCATTTTAMAACTGAAAGTGGTAGAAGA

TGCATCACTCCCTTGTACGAAGAAGCCAGACAGGAGAAATCGGGACAAGAGAGTTAA EXEMPLO 2. GERAÇÃO DE CASSETES DE EXPRESSÃO DE CRZ1

MODIFICADO

[0081] O gene CRZ1 de S. cerevisiae S288c nativo foi amplificado por PCR a partir de uma preparação de DNA genômico com iniciador a montante contendo um sítio 5'-Spel e uma única troca de nucleotídeo para deletar o sítio Spel interno de CRZ1 conforme anteriormente des- crito e iniciador a jusante contendo um sítio 3'-Notl. O produto de ampli- ficação juntamente com o plasmídeo pJT801 foi digerido com Spel e Notl. Após a incubação do produto de PCR digerido com o plasmídeo pJT801 digerido na presença de DNA ligase, um GO! anteriormente clo- nado foi substituído pelo CRZ1 com Spel deletada interno, para ser de- nominado CRZ1.1. O novo construto de plasmídeo, pJT852 contém o promotor DAL80::CRZ1.1::cassete de terminador FBA1.

[0082] As modificações supracitadas (isto é, substituições de serina por alanina) na SRR de CRZ1 foram introduzidas no novo plasmídeo pela síntese de DNA de fita dupla gBlock. A sequência modificada foi sintetizada com os sítios Spel e Pstl a montante e a jusante, respectiva- mente, e usada para substituir o fragmento Spel e Pstl do plasmídeo pJT852 para construir o plasmídeo pJT860 contendo o promotor DAL80::CRZ1.1.2::cassete de expressão de terminador FBA1, a ser de- nominado CRZ1.2. EXEMPLO 3. GERAÇÃO DA LEVEDURA QUE EXPRESSA CRZ1 MO-

DIFICADO

[0083] O plasmídeo pJT860 do Exemplo 2 foi usado como o modelo para amplificação por PCR do cassete de expressão de CRZ1.1.2 com o uso de iniciadores de flanqueamento apropriados que têm homologia ao locus AAP1 de S. cerevisiae. O fragmento de DNA amplificado foi usado como DNA doador para integração mediada por CRISPR no lo- cus AAP1 em três cepas progenitoras: (i) FG é FERMAX'Y Gold Label (Martrex Inc., Minnesota, EUA; abreviado no presente documento, "FG"), (ii) FG-PKL é uma levedura FG geneticamente modificada que tem uma trajetória de fosfocetolase (PKL) heteróloga que envolve a ex- pressão de fosfocetolase (PKL), fosfotransacetilase (PTA) e acetil desi- drogenase acetilante (AADH), conforme descrito no documento º WOZ2015148272 (Miasnikov et a/. ), e (iii) FG-PKL-GA é a cepa de FG-

PKL geneticamente modificada, ainda, para expressar uma glicoamilase exógena (GA). A GA exógena expressa por todas as leveduras foi a mesma variante da glicoamilase de Trichoderma. A integração dos cas- setes de expressão foi confirmada por PCR. EXEMPLO 4. EFEITO DA EXPRESSÃO DE CRZ1 MODIFICADO NA

PRODUÇÃO DE ETANOL

[0084] Dois clones de cada cepa que expressa o CRZ1.1.2 inte- grado foram triados quanto à produção de etanol, em relação a cepas de controle que expressam apenas CRZ1 nativo, pelo crescimento ana- eróbico conduzido em frascos Ankom em meio de crescimento de lique- feito de milho. A produção de etanol foi analisada no final de uma fer- mentação de 55 horas. Observe que os pares de dados a seguir repre- sentam experimentos independentemente controlados e não deve ser comparados uns aos outros. TABELA 2. PRODUÇÃO DE ETANOL POR VARIANTES aumento) eo eee as e fora frases — Ta foras frases na rã — Tras fo

[0085] Uma produção de etanol aumentada em até mais do que 1,0% foi observada com CRZ1 modificada.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, caracterizadas pelo fato de que compreendem uma alteração genética que faz com que as células produzam uma quantidade maior de polipeptídeos CRZ1 ativos em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem, durante a fermentação, uma quantidade maior de álcool em comparação com a quantidade de álcool produzida pelas células progenitoras sob condi- ções idênticas de fermentação.

2. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que os polipeptídeos CRZ1 ativos exibem fosforilação reduzida em comparação com polipeptídeos CRZ1 nativos sob condições de fermentação idênticas.

3. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas pelo fato de que os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resíduos de aminoácido com a capacidade para fosforilação em comparação com os resíduos de aminoácido em poli- peptídeos CRZ1 nativos.

4. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo fato de que os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resíduos de serina com a capacidade para fos- forilação em comparação com os resíduos de aminoácido em polipeptí- deos CRZ1 nativos.

5. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na expressão dos polipeptídeos mutantes CRZ1 modificados é pelo menos cerca de 500%, pelo menos 1.000%, pelo menos 1.500% ou até mesmo pelo menos 2.000%, em comparação com o nível de ex- pressão dos polipeptídeos CRZ1 nativos nas células progenitoras culti- vadas sob condições equivalentes.

6. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, um ou mais genes da trajetória de fosfocetolase.

7. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de que os genes da trajetória de fosfocetolase são selecionados dentre o grupo que consiste em fosfocetolase, fosfo- transacetilase e acetil desidrogenase acetilante.

8. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de car- boidratos.

9. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma alteração nas trajetórias de glicerol e/ou na trajetória de ace- til-CoA.

10. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de álcool.

11. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadas pelo fato de que são de um Sac- charomyces Spp.

12. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizadas pelo fato de que o álcool é etanol.

13. Método para aumentar a produção de álcool a partir de células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato, carac- terizado pelo fato de que compreende: introduzir em células de levedura progenitoras uma alteração genética que aumenta a produção de poli- peptídeos CRZ1 ativos em comparação com a quantidade produzida nas células progenitoras.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que os polipeptídeos CRZ1 ativos exibem fosforilação reduzida em comparação com polipeptídeos CRZ1 nativos sob condi- ções de fermentação idênticas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, ca- racterizado pelo fato de que os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resíduos de aminoácido com a capacidade para fosforilação em comparação com os resíduos de aminoácido em poli- peptídeos CRZ1 nativos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que os polipeptídeos CRZ1 ativos incluem um número reduzido de resíduos de serina com a capacidade para fosforilação em comparação com os resíduos de aminoácido em polipeptídeos CRZ1 nativos.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a alteração genética resulta na levedura variante, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, ou variantes da mesma.