BR112021013257A2 - Levedura híbrida com produção de etanol aumentada - Google Patents

Abstract

levedura híbrida com produção de etanol aumentada. a presente invenção refere-se a composições e métodos relacionados a levedura híbrida que produz uma quantidade aumentada de etanol a partir de substratos contendo amido em comparação com sua levedura progenitora. tal levedura é bem adequada para uso em produção de álcool combustível para aumentar o rendimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LEVEDURA HÍBRIDA COM PRODUÇÃO DE ETANOL AUMENTADA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório No U.S. 62/789873, depositado em 8 de janeiro de 2019, e que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] As presentes composições e métodos referem-se a leveduras híbridas que produzem uma quantidade aumentada de etanol a partir de substratos contendo amido em comparação com sua levedura parental. Tal levedura é bem adequada para uso em produção de álcool combustível para aumentar o rendimento.

ANTECEDENTES

[0003] A produção de etanol à base de levedura de primeira geração converte açúcares em etanol de combustível. A produção de etanol combustível anual por levedura é cerca de 90 bilhões de litros mundialmente (Gombert, A.K. e van Maris. A.J. (2015) Curr. Opin. Biotechnol. 33:81-86). É estimado que cerca de 70% do custo de produção de etanol é da matéria-prima. Visto que o volume da produção de etanol é tão grande, até mesmo pequenas melhorias de rendimento têm impacto econômico massivo na indústria.

[0004] Leveduras modificadas geneticamente que produzem mais etanol do que seus pais do tipo selvagem, e até mesmo leveduras desenvolvidas artificialmente, estão disponíveis comercialmente. No entanto, todas as formas de modificação genética envolvem concessões e a modificação genética metabólica da levedura não é exceção. A levedura modificada geneticamente normalmente tem propriedades indesejáveis, como uma taxa de crescimento lenta,

robustez reduzida, incapacidade de crescer na presença de sólidos dissolvidos (DS) e produção aumentada de subprodutos indesejáveis.

[0005] Existe a necessidade de leveduras que produzam mais álcool, cresçam rapidamente na presença de alto DS e cresçam em temperaturas elevadas.

SUMÁRIO

[0006] São descritas composições e métodos relacionados a células de levedura híbrida que produzem uma quantidade aumentada de etanol a partir de substratos que contêm amido em comparação com sua levedura parental. Os aspectos e as modalidades das células de levedura modificadas e os métodos são descritos nos seguintes parágrafos independentemente numerados.

1. Em um aspecto, uma cepa de levedura é fornecida, isto é, a cepa de Saccharomyces cerevisiae DGY1 (depositada sob o número de acesso V18/015412 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália); ou um derivado da mesma, que tem as características definidoras da cepa de levedura de S. cerevisiae DGY1.

2. Em algumas modalidades, a cepa de levedura do parágrafo 1 que compreende adicionalmente uma alteração genética que faz com que as células da cepa produzam uma quantidade diminuída de polipeptídeo Dls1 funcional.

3. Em algumas modalidades da cepa de levedura do parágrafo 1 ou 2, as células da cepa compreendem um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato.

4. Em algumas modalidades da cepa de levedura do parágrafo 3, o gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato codifica uma glicoamilase.

5. Em algumas modalidades da cepa de levedura de qualquer um dos parágrafos 1 a 4, as células da cepa compreendem uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

6. Em algumas modalidades da cepa de levedura de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, as células da cepa compreendem uma trajetória alternativa para produzir etanol.

7. Em outro aspecto, um para produzir etanol a partir de um material que contêm amido caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar o material que contém amido para obter glicose; e (b) fermentar a glicose para produzir etanol com o uso de um organismo de fermentação; em que o organismo de fermentação é a cepa de Saccharomyces cerevisiae DGY1 (depositada sob o número de acesso V18/015412 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália); ou um derivado da mesma, que tem as características definidoras da cepa S. cerevisiae DGY1.

8. Em algumas modalidades do processo do parágrafo 7, a cepa de levedura produz uma quantidade aumentada de álcool em comparação com as cepas progenitoras sob condições de fermentação equivalentes.

9. Em algumas modalidades do processo do parágrafo 7 ou 8, as células da cepa de levedura compreendem, ainda, uma alteração genética que faz com que as células da cepa produzam uma quantidade diminuída de polipeptídeo Dls1 funcional.

10. Em algumas modalidades do processo de qualquer um dos parágrafos 7-9, as células da cepa de levedura compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato.

11. Em algumas modalidades do processo do parágrafo 10, o gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato codifica uma glicoamilase.

12. Em algumas modalidades do processo de qualquer um dos parágrafos 7 a 11, as células da cepa compreendem uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

13. Em algumas modalidades do processo de qualquer um dos parágrafos 7 a 12, as células da cepa compreendem uma trajetória alternativa para produzir etanol.

[0007] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes composições e métodos ficarão evidentes a partir da descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão Geral

[0008] As presentes composições e métodos se referem a células de levedura híbrida que produzem uma quantidade aumentada de etanol a partir de substratos contendo amido em comparação com suas células parentais nas mesmas condições de fermentação. Aspecto e modalidades da composição e métodos são descritos em detalhes, abaixo. II. Definições

[0009] Antes de descrever as células de levedura modificadas e métodos de uso em detalhes, os seguintes termos são definidos para maior clareza. Os termos não definidos devem ter concordância com seus significados comuns, conforme usado na técnica relevante.

[0010] Conforme usado no presente documento, "álcool" refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.

[0011] Conforme usado no presente documento, os termos "células de levedura", "cepas de levedura" ou simplesmente "levedura" se referem a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccharomycetales. Os exemplos particulares de levedura são Saccharomyces spp., incluindo, porém, sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool de combustível, assim como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0012] Conforme usado no presente documento, a frase "células de levedura variantes", "células de levedura modificadas" ou frases similares (consultar o disposto acima) se referem à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.

[0013] Conforme usado no presente documento, a frase "substancialmente isento de uma atividade" ou frases similares significam que uma atividade especificada é indetectável em uma mistura por adição ou está presente em uma quantidade que não interferiria com o propósito pretendido da mistura por adição.

[0014] Conforme usado no presente documento, os termos "polipeptídeo" e "proteína" (e suas respectivas formas plurais) são usados intercambiavelmente para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento e todas as sequências são apresentadas de uma direção N- terminal para C-terminal. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica.

[0015] Conforme usado no presente documento, proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas "proteínas relacionadas". Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de diferentes gêneros e/ou espécies, ou mesmo diferentes classes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos). As proteínas relacionadas também abrangem homólogos determinados pela análise de sequência primária, determinados pela análise de estrutura primária, secundária ou terciária ou determinados pela reatividade imunológica cruzada.

[0016] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína homóloga" ou "homólogo" se refere a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Desse modo, pretende-se que o termo abranja a enzima (ou enzimas) igual, similar ou correspondente (isto é, em termos de estrutura e função) obtida a partir de organismos diferentes. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tem uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica similar (ou respostas imunológicas similares) como uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com atividade desejável (ou atividades desejáveis).

[0017] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e

Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; programas tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI); e Devereux et al. (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-95).

[0018] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas com o uso de alinhamentos progressivos por pareamento. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Os parâmetros de PILEUP úteis incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento da lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderados. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5873 a 5887). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU- BLAST-2 (consultar, por exemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Os parâmetros "W," "T" e "X" determinam a sensibilidade e a velocidade escalar do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M′5, N′-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0019] Conforme usado no presente documento, as expressões "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos, significam tipicamente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade, ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade, ou mais, em comparação com a sequência de referência (isto é, de tipo selvagem). A porcentagem de identidade de sequência é calculada com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673 a 4680. Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0 Penalidade de extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: Série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de sequências divergentes de atraso: 40 Distância de separação de lacuna: 8 Peso de transições de DNA: 0,50 Listar resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Usar matriz negativa: DESLIGADO Alternar penalidades específicas para resíduos: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade de separação de lacuna final DESLIGADO

[0020] Outra indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de modo cruzado com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoácido são imunologicamente reativos de modo cruzado. Desse modo, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservadora. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[0021] Conforme usado no presente documento, o termo "gene" é sinônimo do termo "alelo" em referência a um ácido nucleico que codifica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegetativas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado.

[0022] Conforme usado no presente documento, "expressar um polipeptídeo" e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomas) da célula.

[0023] Conforme usado no presente documento, "superexpressar um polipeptídeo", "aumentar a expressão de um polipeptídeo" e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação genética especificada.

[0024] Conforme usado no presente documento, um "cassete de expressão" refere-se a um ácido nucleico que inclui uma sequência de codificação de aminoácido, promotores, terminadores e outra sequência de ácidos nucleicos necessários para permitir que o polipeptídeo codificado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expressão podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endógenos (isto é, existentes em uma célula).

[0025] Conforme usado no presente documento, os termos "tipo selvagem" e "nativo" são usados intercambiavelmente e se referem a proteínas ou cepas de genes encontradas na natureza.

[0026] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de interesse" se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja expresso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável ou semelhantes e pode ser expressa em altos níveis. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno modificado ou um gene heterólogo (isto é, "gene de interesse") em relação à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0027] Conforme usado no presente documento, "deleção de um gene" refere-se a sia remoção do genoma de uma célula hospedeira. Quando um gene inclui elementos de controle (por exemplo, elementos intensificadores) que não estão localizados imediatamente adjacentes à sequência de codificação de um gene, a deleção de um gene se refere à deleção da sequência de codificação e, opcionalmente, elementos intensificadores adjacentes, incluindo, mas sem limitação, por exemplo, sequências promotoras e/ou terminadoras, mas não requer a deleção de elementos de controle não adjacentes.

[0028] Conforme usado no presente documento, "ruptura de um gene" se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou química, isto é, mutação, que impeça substancialmente que uma célula produza um produto gênico funcional, por exemplo, uma proteína, em uma célula hospedeira. Métodos exemplificativos de ruptura incluem deleção completa ou parcial de qualquer porção de um gene, incluindo uma sequência de codificação de polipeptídeos, um promotor, um intensificador ou um outro elemento regulador, ou mutagênese do mesmo, em que a mutagênese abrange substituições, inserções, deleções, inversões e combinações e variações das mesmas, sendo que qualquer uma das mutações impede substancialmente a produção de um produto gênico funcional. Um gene também pode ser rompido com o uso de RNAi, antissenso ou qualquer outro método que anule a expressão de genes. Um gene pode ser rompido por deleção ou manipulação genética de elementos de controle não adjacentes.

[0029] Conforme usado no presente documento, os termos "manipulação genética" e "alteração genética" são usados intercambiavelmente e se referem à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, mas sem limitação, uma substituição, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0030] Conforme usado no presente documento, um "polipeptídeo/proteína funcional" é uma proteína que possui uma atividade, tal como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade tensoativa ou semelhantes, e que não foi mutagenizada, truncada ou, de outra forma, modificada para anular ou reduzir essa atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser termoestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.

[0031] Conforme usado no presente documento, um "gene funcional" é um gene que tem capacidade para ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes funcionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para serem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.

[0032] Conforme usado no presente documento, células de levedura foram "modificadas para impedir a produção de uma proteína especificada" se tiverem sido alteradas genética ou quimicamente para impedir a produção de uma proteína/polipeptídeo funcional que exibe uma atividade característica da proteína do tipo selvagem. Tais modificações incluem, porém, sem limitação, deleção ou ruptura do gene que codifica a proteína (conforme descrito no presente documento), modificação do gene de modo que o polipeptídeo codificado careça da atividade supracitada, modificação do gene de modo a afetar a estabilidade ou o processamento pós-translacional e combinações das mesmas.

[0033] Conforme usado no presente documento, o termo "parálogo" refere-se a genes homólogos que são o resultado de um evento de duplicação.

[0034] Conforme usado no presente documento, "atenuação de uma trajetória" ou "atenuação do fluxo através de uma trajetória", isto é, uma trajetória bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma trajetória metabólica. A atenuação de uma trajetória pode ser alcançada por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, mas sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituição de alelos do tipo selvagem desses genes por formas mutantes que codificam enzimas com atividade catalítica reduzida ou maiores valores Km, modificação dos promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificação genética das enzimas ou do mRNA que codifica essas enzimas para uma estabilidade diminuída, mau direcionamento de enzimas para compartimentos celulares onde têm menor probabilidade de interagirem com o substrato e intermediários, o uso de RNA de interferência e semelhantes.

[0035] Conforme usado no presente documento, "fermentação aeróbia" se refere ao crescimento na presença de oxigênio.

[0036] Conforme usado no presente documento, "fermentação anaeróbica" se refere ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0037] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências mencionadas no presente documento estão incorporadas ao mesmo a título de referência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a menos que especificado de outro modo: C graus centígrados AA α-amilase bp pares de bases DNA ácido desoxirribonucleico DP grau de polimerização ds ou DS sólidos secos EtOH etanol g ou gm grama g/l gramas por litro GA glicoamilase GAU/g ds unidades de glicoamilase por grama de sólidos secos H2O água HPLC cromatografia líquida de alta eficiência hr ou h hora kg quilograma M molar mg miligrama mL ou ml mililitro ml/min mililitros por minuto mM milimolar N normal nm nanômetro PCR reação em cadeia de polimerase ppm partes por milhão RNA ácido ribonucleico Δ relacionado a uma deleção μg micrograma μL e µl microlitro μM micromolar III. Levedura híbrida que produz aumento de etanol a partir de um substrato de amido

[0038] São descritas leveduras híbridas que produzem uma quantidade maior de etanol a partir de substratos contendo amido. Foram descritas várias leveduras geneticamente modificadas que produzem uma quantidade maior de etanol em comparação com a levedura original. O aumento da produção de etanol é frequentemente alcançado pela introdução de trajetórias metabólicas heterólogas que canalizam o carbono para a produção de etanol. Infelizmente, essa levedura frequentemente produz quantidades aumentadas de subprodutos tóxicos, como acetato, formato, álcoois tipo fúsel e semelhantes. Esses subprodutos podem ser particularmente tóxicos quando combinados com outros fatores de estresse, como temperaturas elevadas e condições de fermentação de baixo pH.

[0039] Embora a engenharia da trajetória metabólica seja capaz de produzir células de levedura com inúmeras propriedades vantajosas, as modificações holísticas do fluxo metabólico e do reequilíbrio redox são complicadas. Os requerentes usaram, portanto, formas avançadas de cruzamento de levedura e seleção fenotípica de alto rendimento para gerar leveduras que demonstram o aumento da produção de etanol, embora tenham um mínimo de características indesejáveis.

[0040] Duas cepas de leveduras parentais disponíveis comercialmente foram usadas para o acasalamento. O cruzamento e seleção para células de levedura híbridas resultantes que produziram uma quantidade aumentada de etanol resultou em uma cepa de levedura designada como cepa Saccharomyces cerevisiae DGY1, que é depositada sob o número de acesso No V18/015412 no National Measurement Institute em Victoria, Austrália e que tem o registro SISGEN brasileiro No A9D1003. Embora a análise esteja em andamento para determinar o genótipo da cepa híbrida, a cepa S. cerevisiae DGY1 já representa uma cepa de levedura robusta para a produção de etanol melhorada, particularmente em temperaturas de fermentação elevadas e condições de pH mais baixas.

[0041] Em algumas modalidades, o aumento na quantidade de etanol produzido pelas células de levedura híbrida é um aumento de pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5%, pelo menos 4,0%, pelo menos 4,5%, pelo menos 5,0%, pelo menos 5,5%, ou até mesmo pelo menos 6,0%, ou mais, em comparação com a quantidade de etanol produzida por qualquer uma das células de levedura parentais cultivadas nas mesmas condições. IV. Células de levedura híbrida que têm expressão de Dls1 reduzida

[0042] Dls1, codificado pelo gene YJL065c, é uma subunidade polipeptídica de 167 aminoácidos do complexo de acessibilidade à cromatina de levedura ISW2 (yCHRAC), que contém Isw2, Itc1, subunidade tipo Dpb3 (Dls1), e Dpb4 (consulte, por exemplo, Peterson, C.L. (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6:171 a 175 e Winston, F. e Carlson, M. (1992) Trends Genet. 8:387 a 391). Os atuais pesquisadores e seus colegas determinaram anteriormente que, na ausência de outras modificações genéticas, leveduras que têm uma alteração genética que reduz a quantidade de Dls1 funcional nas células exibem maior robustez durante a fermentação, permitindo fermentações em temperaturas mais altas e potencialmente mais curtas (dados não mostrados).

[0043] A redução na quantidade de Dls1 funcional produzida em uma célula pode ser realizada pela interrupção do gene YJL065c. A ruptura do gene YJL065c pode ser realizada com o uso de quaisquer métodos adequados que impeçam substancialmente a expressão de um produto do gene YJL065c funcional, isto é, Dls1. Métodos exemplificativos de ruptura conforme são conhecidos pelos versados na técnica incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial do gene YJL065c, incluindo a deleção completa ou parcial, por exemplo, da sequência de codificação de Dls1, do promotor, do terminador, de um intensificador ou de um outro elemento regulador; e deleção completa ou parcial de uma porção do cromossomo que inclui qualquer porção do gene YJL065c. Métodos específicos para romper o gene YJL065c incluem a realização de substituições ou inserções de nucleotídeo em qualquer porção do gene YJL065c, por exemplo, a sequência de codificação de Dls1, o promotor, o terminador, um intensificador ou um outro elemento regulador. De preferência, deleções, inserções e/ou substituições (coletivamente denominadas mutações) são realizadas por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. No entanto, a mutagênese química pode, em teoria, ser usada para romper o gene YJL065c.

[0044] As mutações no gene YJL065c podem reduzir a eficácia do promotor de YJL065c, reduzir a eficácia de um intensificador de YJL065c, interferir no splicing ou na edição do mRNA de YJL065c,

interferir na tradução do mRNA de YJL065c, introduzir um códon de parada na sequência de codificação de YJL065c para impedir a tradução da proteína tYJL065c de comprimento total, mudar a sequência de codificação da proteína Dls1 para produzir uma proteína menos ativa ou inativa ou reduzir a interação de Dls1 com outros componentes da proteína nuclear ou DNA, mudar a sequência de codificação da proteína Dls1 para produzir uma proteína menos estável ou alvejar a proteína para destruição, fazer com que a proteína Dls1 seja erroneamente enovelada ou seja incorretamente modificada (por exemplo, por glicosilação) ou interferir no tráfego celular da proteína Dls1. Em algumas modalidades, essas e outras manipulações genéticas atuam para reduzir ou impedir a expressão de uma proteína funcional Dls1 ou reduzir ou impedir a atividade biológica normal de Dls1.

[0045] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura híbrida incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Dls1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Dls1, bem como mutações adicionais que reduzem ou impedem a expressão de proteínas funcionais Isw2, Itc1 ou Dpb4 ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de proteínas Isw2, Itc1 ou Dpb4. Em algumas modalidades, as presentes células de levedura híbrida incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Dls1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Dls1, enquanto não têm mutações adicionais que reduzem ou impedem a expressão de proteínas funcionais Isw2, Itc1 ou Dpb4 ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de proteínas Isw2, Itc1 ou Dpb4.

[0046] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de Dls1 de S. cerevisiae exemplificado é mostrada abaixo como a SEQ ID NO: 1:

MNNETSGKET ASAPLCSPKL PVEKVQRIAK NDPEYMDTSD DAFVATAFAT EFFVQVLTHE SLHRQQQQQQ QQVPPLPDEL TLSYDDISAA IVHSSDGHLQ FLNDVIPTTK NLRLLVEENR VRYTTSVMPP NEVYSAYVVN DTAPKPNIVE IDLDNDEDDD EDVTDQE

[0047] Com base em tais dados de BLAST e Clustal W, é evidente que o polipeptídeo Dls1 de S. cerevisiae exemplificado (SEQ ID NO: 1) compartilha um grau muito alto de identidade de sequência com outros polipeptídeos Dls1 de S. cerevisiae conhecidos, bem como polipeptídeos Dls1 de outro Saccharomyces spp. Portanto, espera-se completamente que as presentes composições e métodos sejam aplicáveis às células de levedura que contêm tais polipeptídeos estruturalmente similares, bem como outras proteínas relacionadas, homólogos e polipeptídeos funcionalmente similares.

[0048] Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos da proteína Dls1 que é rompida tem uma identidade de sequência aminoácidos total com a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID Nº: 1

[0049] De preferência, a ruptura do gene YJL065c é realizada por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. Entretanto, a mutagênese química não é excluída como um método para produzir células de levedura modificadas.

[0050] Em algumas modalidades, a diminuição na quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional nas células modificadas é uma diminuição de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais em comparação com a quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional em células híbridas parentais que crescem sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, a redução de expressão de proteína funcional Dls1 nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais em comparação com a quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional em células híbridas parentais que crescem sob as mesmas condições.

[0051] Em algumas modalidades, o aumento adicional de álcool nas células modificadas, em comparação com as células híbridas parentais, é um aumento de pelo menos 0,1%, pelo menos 0,2%, pelo menos 0,3%, pelo menos 0,4%, pelo menos 0,5%, 0,6%, pelo menos 0,7%, pelo menos 0,8%, pelo menos 0,9%, pelo menos 1,0%, ou mais, em comparação com a quantidade de polipeptídeos Dls1 funcionais nas células híbridas parentais que crescem sob as mesmas condições. V. Células de levedura híbridas, incluindo mutações adicionais que afetam a produção de álcool, produção de glicerol e/ou produção de acetato

[0052] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura híbrida, opcionalmente, além de terem expressão reduzida de polipeptídeos Dls1 funcionais, incluem ainda modificações adicionais que afetam a produção de álcool, glicerol e/ou acetato.

[0053] Em modalidades particulares, as células de levedura híbridas incluem uma trajetória artificial ou alternativa resultante da introdução de um gene de fosfocetolase heterólogo e um gene de fosfotransacetilase heterólogo. Uma fosfocetolase exemplificativa pode ser obtida a partir de Gardnerella vaginalis (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_016786789). Uma fosfotransacetilase exemplificativa pode ser obtida a partir de Lactobacillus plantarum (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_003641060).

[0054] As células de levedura híbridas podem, ainda, incluir mutações que resultam na atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol nativa, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da via de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação de atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo, por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPD1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as Patentes Nº U.S. 9.175.270 (Elke et al.),

8.795.998 (Pronk et al.) e 8.956.851 (Argyros et al.).

[0055] A levedura modificada pode apresentar adicionalmente atividade aumentada de acetil-CoA sintase (também denominada acetil- CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido por hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outra razão) e converter o mesmo em acetil-CoA. Isso evita o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser alcançado introduzindo-se um gene de acetil-CoA sintase heterólogo nas células, aumentando a expressão de um gene endógeno de acetil-CoA sintase e semelhantes. Uma acetil-CoA sintase particularmente útil para a introdução em células pode ser obtida a partir de Methanosaeta concilii (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_013718460). Homólogos dessas enzimas, incluindo enzimas que têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%

e até mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a acetil-CoA sintase de Methanosaeta concilii supracitada, também são úteis nas presentes composições e métodos.

[0056] Em algumas modalidades, as células de levedura híbridas podem incluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de acetaldeído desidrogenase acetilante dependente de NAD+ e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da trajetória de glicerol é descrita, por exemplo, na Patente nº U.S.

8.795.998 (Pronk et al.). No entanto, na maioria das modalidades das presentes composições e métodos, a introdução de uma acetaldeído desidrogenase de acetilação e/ou uma liase de piruvato-formato não é necessária por causa da necessidade dessas atividades ser obviada pela atenuação da trajetória biossintética nativa para produzir Ac-CoA que contribui para desequilíbrio de cofator de redox. Consequentemente, as modalidades das presentes composições e métodos carecem, expressamente, de um gene (ou genes) heterólogo que codifica uma acetaldeído desidrogenase de acetilação, uma liase de piruvato-formato ou ambas.

[0057] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura híbrida modificadas compreendem adicionalmente uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma trajetória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidróxi-isovalerato; (c) 2,3-di-hidróxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato;

(d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade de acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di-hidróxi-ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxilase e álcool desidrogenase.

[0058] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas podem, ainda, superexpressar um polipeptídeo semelhante a transportador de açúcar (STL1) para aumentar a absorção de glicerol (consultar, por exemplo, Ferreira et al. (2005) Mol Biol Cell 16:2068 a 2076; Dušková et al. (2015) Mol Microbiol 97:541 a 559 e o documento No WO 2015023989 A1).

[0059] Em algumas modalidades, as células de levedura híbridas que compreendem uma trajetória biossintética de butanol compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de piruvato descarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade de piruvato descarboxilase. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem ainda uma deleção, mutação, superexpressão e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1, DPB3, CPR1, MAL23C, MNN4, PAB1, TMN2, HAC1, PTC1, PTC2, OSM1, GIS1, CRZ1, HUG1, GDS1, CYB2P, SFC1, MVB12, LDB10, C5SD, GIC1, GIC2, TDA9 e/ou YMR226C.

VI. Combinação de células de levedura híbrida com outras mutações benéficas

[0060] Em algumas modalidades, as células de levedura híbrida, opcionalmente em combinação com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool, glicerol ou acetato, incluem ainda qualquer número de genes adicionais de interesse que codificam proteínas de interesse. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidratos e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma β- glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma α-amilase, uma β- amilase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e modificadas de outra forma. VII. Uso da levedura híbrida para aumento da produção de álcool

[0061] As presentes composições e os métodos incluem métodos para aumentar a produção de álcool e/ou reduzir a produção de glicerol em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição "imprevista" para levedura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool, seja com o uso de hidrólise de amido cru, sacarificação e fermentação simultâneas ou outras variações padrão de produção de etanol convencional. Embora seja principalmente destinada à produção de álcool combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja. VIII. Células de levedura adequadas para hibridização e modificações adicionais

[0062] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Inúmeras cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais coimo alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhantes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, tais como glicoamilase ou α-amilase. IX. Substratos e Produtos

[0063] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboidrato incluindo, porém, sem limitação, amido de milho, cana-de- açúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhoras nas condições enzimáticas e químicas e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0064] Os produtos de fermentação de álcool incluem o composto orgânico que tem um grupo funcional hidroxila (-OH) ligado a um átomo de carbono. Álcoois exemplificativos incluem, porém, sem limitação, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n- pentanol, 2-pentanol, isopentanol e álcoois superiores. Os álcoois combustíveis mais comumente produzidos são etanol e butanol.

[0065] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas de levedura e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, porém, sem limitação, as composições e os métodos.

EXEMPLOS Exemplo 1. Construção da cepa DGY1

[0066] A cepa Saccharomyces cerevisiae DGY1 (abreviação DGY1) é uma cepa de levedura híbrida construído por meio do cruzamento de cepas haploides derivadas de duas cepas de produção de etanol de grão industrial disponíveis comercialmente, designadas no presente documento como Cepa A e Cepa B. As Cepas A e B foram esporuladas e segregantes haploides foram isolados. Um segregante de cada cepa foi cruzado para gerar a cepa híbrida DGY1, que está depositado sob o número de acesso no V18/015412 no National Measurement Institute em Victoria, Austrália que tem o no de registro SISGEN brasileiro A9D1003. Exemplo 2. Produção de etanol pela cepa DGY1 em diferentes temperaturas

[0067] A nova cepa de levedura DGY1 foi testado quanto à sua capacidade de produzir etanol em comparação com a levedura de referência FERMAXTM Gold (Martrex, Inc., Chaska, MN, EUA; doravante abreviada como, FG), uma conhecida cepa comercial usada para produção de álcool liquefeito a diferentes temperaturas. O liquefato (pasta fluida de milho moída com um teor de sólidos secos de 35%) foi preparado pela adição de 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds FERMGENTM 2,5 X (protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds glicoamilase variante de Trichoderma (TrGA), 2,28 SSCU/g ds α- amilase de Aspergillus (AcAA), 0,078 THU/g ds de Trealase OPTIMASH® e 0,113 FTU/g ds de fitase OPTIMASH®, ajustado para um pH de 4,8. 100 g de liquefato foram pesados em recipientes de 250 ml e inoculados com culturas frescas durante a noite de DGY1 ou FG e incubados por 66 horas a 32°C, 34°C, 37°C ou as condições de temperatura de rampa mostradas na Tabela 1. Um sistema de monitoramento de gás (ANKOM Technology) foi usado para registrar a taxa de fermentação com base na pressão cumulativa seguindo a produção de CO2 ao longo do tempo.

[0068] As amostras foram colhidas por centrifugação, filtradas através de filtros de 0,2 µm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) pelo uso de uma coluna de Phenomenex Rezex-RFQ Fast Fruit com uma taxa de fluxo isocrática de 1 ml/min em eluente 0,01 N H2SO4. Os padrões de calibração usados para quantificação incluíram quantidades conhecidas de etanol, glicose, glicerol e acetato. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 2. O aumento do etanol é relatado com referência ao FG. Tabela 1. Condição de rampa de temperatura Tempo (h) Temperatura (°C) 0-10 32,0 10-12 33,0 12-15 34,0 15-17 35,0 17-22 35,5 22-27 34,5 27-31 34,0 31-36 33,5 36-41 33,0 41-55 32,5 55 até o final 32,0

Tabela 2. Desempenho de FG e DGY1 em diferentes temperaturas Cepa Tempe- Glicose Glicerol Acetato Etanol Aumento ratura (g/l) (g/l) (g/l) (g/l) de etanol (˚C) (%) FG 32 1,0 15,4 0,9 142,9 - DGY1 32 0,4 14,5 1,0 145,9 2,1 FG 34 11,8 15,9 1,2 137,1 - DGY1 34 3,1 14,9 1,0 142,2 3,7 FG 37 66,8 14,8 1,7 112,6 - DGY1 37 61,3 14,5 1,7 115,6 2,7 FG rampa 14,4 16,0 1,1 136,1 - DGY1 rampa 0,8 15,0 1,0 143,5 5,4

[0069] A nova cepa, DGY1, produziu significativamente mais etanol, ou seja, cerca de 2 a mais de 5%, em comparação com FG, particularmente em temperaturas elevadas. DGY1 também produziu menos glicerol em comparação com FG. Exemplo 3. Construção de DGY1 com a deleção de YJL065c

[0070] DGY1 foi posteriormente modificado pela deleção do gene YJL065c (que codifica Dls1), resultando na cepa DGY1-Δ. A sequência de aminoácidos de Dls1 é fornecida abaixo como a SEQ ID Nº: 1.

MNNETSGKET ASAPLCSPKL PVEKVQRIAK NDPEYMDTSD DAFVATAFAT EFFVQVLTHE SLHRQQQQQQ QQVPPLPDEL TLSYDDISAA IVHSSDGHLQ FLNDVIPTTK NLRLLVEENR VRYTTSVMPP NEVYSAYVVN DTAPKPNIVE IDLDNDEDDD EDVTDQE

[0071] Com o uso de técnicas padrão de biologia molecular de levedura, o gene YJL065c foi rompido deletando-se essencialmente toda a sequência de codificação para Dls1, isto é, deletando-se a sequência de ácidos nucleicos a partir de 4 pares de bases antes do códon inicial até 10 pares de bases antes do códon de parada em ambos os alelos de S. cerevisiae. Todos os procedimentos se basearam na sequência de ácidos nucleicos publicamente disponível de YJL065c, que é fornecida abaixo como a SEQ ID Nº: 2:

ATGAACAACGAGACTAGTGGTAAAGAAACGGCGTCTGCACCTCTG TGTTCGCCCAAGTTACCTGTAGAAAAAGTGCAGAGAATAGCCAAG AATGATCCAGAATATATGGACACTTCGGATGACGCATTCGTAGCC ACAGCGTTTGCTACAGAATTCTTCGTCCAGGTGCTGACACATGAG TCCCTACATAGGCAACAGCAGCAGCAACAACAACAGGTACCGCC GCTCCCAGATGAACTCACGCTGTCGTACGATGACATCTCTGCCGC AATTGTGCACTCTTCTGACGGCCATCTGCAGTTTTTGAATGATGTG ATACCAACAACAAAGAATTTGAGGCTTCTAGTGGAAGAAAACCGA GTTAGATATACTACAAGTGTCATGCCCCCTAATGAAGTTTACTCCG CCTATGTGGTGAACGATACGGCTCCGAAGCCCAACATTGTCGAGA TTGATCTTGATAATGACGAAGACGACGACGAAGACGTTACTGATC AAGAATAA

[0072] A deleção do gene YJL065c em DGY1 foi confirmada por PCR em colônia. A levedura modificada foi cultivada em meio não seletivo para remover o plasmídeo que confere resistência a Canamicina usado para selecionar transformantes, resultando na levedura modificada que não necessitou de quaisquer suplementos de crescimento em comparação com a levedura parental. A cepa resultante (DGY1 com o gene YJL065c deletado) foi designada como DGY1-Δ. Exemplo 4. Produção de etanol por DGY1 e DGY1-Δ

[0073] As novas cepas de levedura DGY1 e DGY1-Δ, junto com as cepas de levedura parentais (referidas como Corante A e Cepa B), foram testadas quanto à sua capacidade de produzir etanol em fermentações em frasco de agitação a 32°C ou 35°C. O liquefato (isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds)

de 34% foi preparada pela adição de 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGENTM 2,5x (uma protease fúngica ácido), 0,33 GAU/g ds de glicoamilase variante Trichoderma reesei e 2,28 SSCU/g ds de α- amilase Aspergillus (AcAA) em pH 4,8. 50 g de liquefato foram pesados em frascos cônicos de 125 ml e inoculados com uma cultura de fermento fresca durante a noite por um OD600 final de 0,3. Os frascos foram incubados por 65 horas a 32°C ou 35°C com agitação (200 rpm). As amostras das fermentações em frasco de agitação foram colhidas por centrifugação, filtradas através de filtros de 0,2 µm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Waters série e2695) pelo uso de colunas de Bio-Rad Aminex HPX-87H a 65ºC, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de 0,01 N H2SO4. Padrões de calibração foram usados para quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. Os resultados para as fermentações a 35°C são mostrados na Tabela 3. Tabela 3. Análise do caldo de fermentação após fermentação com as cepas A e B, DGY1 e DGY1-Δ em liquefato a 35°C Aumento do etanol sobre Aumento do Glicose Glicerol Acetato Etanol a Cepa A etanol sobre Cepa (g/l) (g/l) (g/l) (g/l) (%) a Cepa B (%) Cepa A 2,44 13,17 0,94 133,19 - (-2,1) Cepa B 2,07 11,01 0,83 136,06 2,2 - DGY1 1,92 12,13 0,99 139,56 4,8 2,6 DGY1-Δ 1,74 12,43 1,17 140,66 5,6 3,4

[0074] A 35°C, DGY1 produziu significativamente mais etanol em comparação com as cepas de levedura parentais (isto é, 4,8% mais etanol do que a Cepa A e 2,6% mais etanol do que a Cepa B). DGY1-Δ produziu ainda mais etanol do que DGY1, isto é, 5,6% mais etanol do que a cepa A e 3,4% mais etanol do que a cepa B. Isso indica que a deleção YJL065c confere uma melhoria na produção de etanol nos antecedentes da cepa híbrida DGY1. A 32°C, a produção de etanol por DGY1 e DGY1-Δ foi semelhante à produzida pela Cepa A e B (dados não mostrados). Exemplo 5. Expressão de glucoamilase em DGY1 e DGY1-Δ

[0075] DGY1 e DGY1-Δ foram, cada um, ainda modificados para expressar uma de duas glicoamilases diferentes, designadas no presente documento como G1 e G2, por meio da transformação com cassetes de DNA que contêm um gene GA com códon otimizado fundido ao promotor FBA1 e ao terminador FBA1 de S. cerevisiae. As cepas de referência foram construídas transformando os mesmos cassetes de expressão de GA na Cepa A ou Cepa A com uma deleção de YJL065c (isto é, Cepa A-Δ). A integração dos cassetes de expressão de GA foi confirmada por PCR de colônia. A levedura modificada foi cultivada em meio não seletivo para remover o plasmídeo que confere resistência a antibióticos usados para selecionar transformantes, resultando na levedura modificada que não necessitou de quaisquer suplementos de crescimento em comparação com a levedura parental. Os transformantes nos quais o cassete de expressão de GA foram integrados no cromossomo foram identificados e projetados conforme indicado na Tabela 4. Tabela 4. Designações de cepas que expressam glicoamilase Cepa GA expressa Antecedentes Cepa A-G1 G1 Cepa A DGY1-G1 G1 DGY1 Cepa A-Δ-G2 G2 Cepa A-Δ (isto é, Cepa A ΔYJL065c) DGY1-Δ-G2 G2 DGY1-Δ (isto é, DGY1 ΔYJL065c)

Exemplo 6. Produção de etanol por levedura híbrida que expressa glicoamilase em liquefato

[0076] As novas cepas de levedura híbrida que expressam glicoamilase foram testadas quanto à sua capacidade de produzir etanol liquefeito, em comparação com as cepas de referência equivalentes que contêm as mesmas modificações, mas no antecedente da Cepa A (isto é, DGY1-G1 foi comparado com a cepa de referência Cepa A-G1, e DGY1-Δ-G2 foi comparado com a cepa de referência Cepa A-Δ-G2). Liquefeito, isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 34%, foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGENTM 2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,11 GAU/g ds de variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 2,28 SSCU/g ds de α-amilase de Aspergillus kawachii (AcAA) a pH 4,8. 50 g de liquefato foram pesados em frascos cônicos de 125 ml e inoculados com uma cultura de fermento fresca durante a noite por um OD600 final de 0,3. Os frascos foram incubados por 65 horas a 32°C ou 35°C com agitação (200 rpm). As amostras das fermentações em frasco de agitação foram colhidas por centrifugação, filtradas através de filtros de 0,2 µm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Waters série e2695) pelo uso de colunas de Bio- Rad Aminex HPX-87H a 65ºC, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de 0,01 N H2SO4. Padrões de calibração foram usados para quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. Os resultados para as fermentações a 35°C são mostrados na Tabela 5. O aumento do etanol é relatado em relação à cepa à base de FG que expressa o mesmo GA (isto é, DGY1-G1 é comparado à Cepa A-G1, e DGY1-Δ-G2 é comparado à Cepa A-Δ-G2).

Tabela 5. Análise do caldo de fermentação após fermentação com Cepa A que expressa GA e levedura de DGY1 em liquefato a 35°C Aumento Antece- Glicose Glicerol Acetato Etanol de etanol Cepa dentes GA (g/l) (g/l) (g/l) (g/l) (%) Cepa A-G1 Cepa A G1 37,69 11,50 0,51 127,7 - DGY1-G1 DGY1 G1 14,94 11,01 0,76 138,4 8,4 Cepa A-Δ-G2 Cepa A-Δ G2 23,76 11,39 0,57 134,36 - DGY1-Δ-G2 DGY1-Δ G2 1,61 11,32 0,88 137,23 2,1

[0077] DGY1-G1 produziu significativamente mais etanol em comparação com a Cepa A-G1 equivalente a 35°C (isto é, 8,4% mais etanol do a Cepa A-G1). DGY1-Δ-G2 produziu significativamente mais etanol em comparação com a cepa A-Δ-G2 equivalente (isto é, 2,1% mais etanol do a Cepa A-Δ-G2). A 32°C, a produção de etanol por DGY1- G1 foi semelhante à Cepa A-G1, e a produção de etanol por DGY1-Δ-G2 foi semelhante à Cepa A-Δ-G2 (dados não mostrados).

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de levedura, caracterizada pelo fato de que é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae DGY1 (depositada sob o número de acesso V18/015412 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália); ou um derivado da mesma, que tem as características definidoras da cepa de levedura de S. cerevisiae DGY1.

2. Cepa de levedura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, uma alteração genética que faz com que as células da cepa produzam uma quantidade diminuída de polipeptídeo Dls1 funcional.

3. Cepa de levedura, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as células da cepa compreendem um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato.

4. Cepa de levedura, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato codifica uma glicoamilase.

5. Cepa de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que as células da cepa compreendem uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

6. Cepa de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as células da cepa compreendem uma trajetória alternativa para produzir etanol.

7. Processo para produzir etanol a partir de um material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) sacarificar o material contendo amido para obter glicose; e (b) fermentar a glicose para produzir etanol com o uso de um organismo de fermentação; em que o organismo de fermentação é a cepa de

Saccharomyces cerevisiae DGY1 (depositada sob o número de acesso V18/015412 no National Measurement Institute, Victoria, Austrália); ou um derivado da mesma, que tem as características definidoras da cepa de S. cerevisiae DGY1.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura produz uma quantidade aumentada de álcool em comparação com as cepas progenitoras sob condições de fermentação equivalentes.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que as células da cepa de levedura compreendem, ainda, uma alteração genética que faz com que as células da cepa produzam uma quantidade diminuída de polipeptídeo Dls1 funcional.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que as células da cepa de levedura compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato codifica uma glicoamilase.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que as células da cepa compreendem uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que as células da cepa compreendem uma trajetória alternativa para produzir etanol.