BR112019014736A2

BR112019014736A2 - Células de levedura modificadas que superexpressam uma subunidade de adn polimerase

Info

Publication number: BR112019014736A2
Application number: BR112019014736-5A
Authority: BR
Inventors: Emily Gaby Payen Celia; Qi Min
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2020-03-10
Also published as: WO2018136385A1; CN110382520A; US20190382739A1; CA3050870A1; EP3571218A1

Abstract

a presente invenção revela composições e métodos referente a células de levedura modificadas que expressam em excesso uma subunidade de dna polimerase ii, resultando no aumento da produção de álcool. tais células de levedura são bem adequados para uso em produção comercial de álcool de combustível para aumentar o rendimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CÉLULAS DE LEVEDURA MODIFICADAS QUE SUPEREXPRESSAM UMA SUBUNIDADE DE DNA POLIMERASE. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório N²U.S. 62/447.845, depositado em 18 de janeiro de 2017, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA [002] As presentes composições e métodos referem-se a levedura geneticamente modificada que superexpressa uma subunidade de DNA polimerase II que resulta em produção de álcool aumentada a partir de um substrato contendo amido. Tal levedura é bem adequada para uso em produção de álcool combustível para aumentar o rendimento.

ANTECEDENTES [003] Muitos países produzem álcool combustível a partir de substratos fermentáveis, tais como amido de milho, cana-de-açúcar, mandioca e melaço. De acordo com a Associação de Combustíveis Renováveis (Washington DC, Estados Unidos), a produção de etanol combustível em 2015 chegou perto de 15 bilhões de galões apenas nos Estados Unidos.

[004] Butanol é um importante produto químico industrial e componente de combustível de substituição com uma variedade de aplicações, incluindo o uso como um aditivo de combustível renovável, um insumo químico na indústria de plásticos e um extrator de grau alimentar na indústria alimentícia e de aromas. Consequentemente, há uma alta demanda por álcoois, tais como butanol e isobutanol, bem como por métodos de produção eficazes e ecológicos.

[005] Em vista da grande quantidade de álcool produzida no mundo, até mesmo um pequeno aumento na eficácia de um organismo

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2/38 de fermentação pode resultar em um considerável aumento na quantidade de álcool disponível. Consequentemente, existe a necessidade de organismos que sejam mais eficazes na produção de álcool.

SUMÁRIO [006] São descritas composições e métodos relacionados às células de levedura modificadas que superexpressam uma subunidade de DNA polimerase II, resultando em produção de álcool aumentada a partir de um substrato contendo amido e métodos de uso das mesmas. Os aspectos e as modalidades das células de levedura modificadas e os métodos são descritos nos seguintes parágrafos independentemente numerados.

[007] Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, as células modificadas que compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma quantidade maior de polipeptídeos Dpb3 em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem durante a fermentação uma quantidade maior de álcool em comparação com a quantidade de álcool produzida pelas células progenitoras sob condições idênticas de fermentação.

[008] Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um polipeptídeo Dpb3 para um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equivalentes.

[009] Em algumas modalidades das células modificadasdo parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução deum cassete de expressão para expressar um polipeptídeo Dpb3.

[0010] Em algumas modalidades das células modificadasdo

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3/38 parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução de um gene YBR278w c exógeno.

[0011] Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 2, a alteração genética compreende a introdução de um promotor mais forte em um gene YBR278w c endógeno.

[0012] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a quantidade de aumento na expressão do polipeptídeo Dpb3 é pelo menos cerca de 30 vezes em comparação com o nível de expressão nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0013] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a quantidade de aumento na produção de mRNA que codifica o polipeptídeo Dpb3 é pelo menos cerca de 30 vezes em comparação com o nível nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0014] Em algumas modalidades, as células modificadas dos parágrafos 1 a 7, compreendem, ainda, ruptura do gene YJL065c.

[0015] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 8, as células produzem uma quantidade reduzida de polipeptídeos Dls1 funcionais.

[0016] Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 9, as células não produzem polipeptídeos Dls1.

[0017] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.

[0018] Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 11, compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

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4/38 [0019] Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 12, compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.

[0020] Em algumas modalidades das células modificadas dos parágrafos 1 a 13, as células são de um Saccharomyces spp.

[0021] Em outro aspecto, é fornecido um método para aumentar a produção de álcool a partir de células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato que compreende: introduzir em células de levedura progenitoras uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos Dpb3 em comparação com a quantidade produzida nas células progenitoras.

[0022] Em algumas modalidades do método do parágrafo 15, as células que têm a alteração genética introduzida são as células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 15.

[0023] Em algumas modalidades do método do parágrafo 15, as células que têm a alteração genética introduzida que aumenta a produção de polipeptídeos Dpb3 compreendem, ainda, uma alteração genética que reduz a quantidade de polipeptídeos Dls1 funcionais produzidos em comparação com as células progenitoras.

[0024] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes composições e métodos serão evidentes a partir da descrição, incluindo quaisquer Desenhos anexos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Visão Geral [0025] As presentes composições e métodos referem-se a células de levedura geneticamente modificadas que superexpressam polipeptídeos Dpb3 em comparação com células progenitoras idênticas de outro modo. As células modificadas produzem uma quantidade maior de álcool em comparação com as células progenitoras, cujos fenótipos são separadamente, e em combinação, vantajosos na produção de

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5/38 álcool combustível. Os aspectos e as modalidades da composição e métodos são descritos em detalhes no presente documento.

II. Definições [0026] Antes de descrever as células modificadas e métodos de uso em detalhes, os termos a seguir são definidos por questões de clareza. Os termos não definidos devem ser acordados com seus significados comuns conforme usados na técnica relevante.

[0027] Conforme usado no presente documento, álcool refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxil (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.

[0028] Conforme usado no presente documento, células de levedura, cepas de levedura ou simplesmente levedura referem-se a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccharomycetales. Os exemplos específicos de levedura são Saccharomyces spp., incluindo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0029] Conforme usado no presente documento, o sintagma células de levedura variantes, células de levedura modificadas ou sintagmas similares (consultar o disposto acima) se referem à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.

[0030] Conforme usado no presente documento, o sintagma substancialmente isento de uma atividade ou sintagmas similares significam que uma atividade especificada é indetectável em uma

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6/38 mistura por adição ou está presente em uma quantidade que não interferiría com o propósito pretendido da mistura por adição.

[0031] Conforme usado no presente documento, os termos polipeptídeo e proteína (e suas respectivas formas plurais) são usados intercambiavelmente para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-terminal. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0032] Conforme usado no presente documento, proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas proteínas relacionadas. Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de diferentes gêneros e/ou espécies, ou até mesmo diferentes classes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos). As proteínas relacionadas abrangem também homólogos determinados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por reatividade cruzada imunológica.

[0033] Conforme usado no presente documento, o termo proteína homóloga ou homólogo se refere a uma proteína que tem atividade

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7/38 e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Assim, pretende-se que o termo abranja enzimas iguais, similares ou correspondentes (isto é, em termos de estrutura e função) obtidas de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica similar (ou respostas imunológicas similares) à de uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com a atividade desejada (ou atividades desejadas).

[0034] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, Wl); e Devereux etal. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).

[0035] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas com o uso de alinhamentos progressivos em pares. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Parâmetros úteis de PILEUP incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, urn peso de comprimento

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8/38 de lacuna padrão de 0,10 e lacunas finais ponderadas. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89:10.915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N'-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0036] Conforme usado no presente documento, as frases substancialmente similar e substancialmente idêntico no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipicamente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em comparação com a sequência de referência (isto é, de tipo selvagem). O percentual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros-padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Parâmetros predefinidos para o algoritmo CLUSTAL W são:

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Penalidade por abertura de lacuna: Penalidade por extensão de lacuna: Matriz de peso de proteína:

Matriz de peso de DNA:

% de sequência divergente de atraso Distância de separação de lacuna: Peso de transições de DNA:

Listar resíduos hidrofílicos:

10,0

0,05 série BLOSUM

IUB

Usar matriz negativa:

Alternar penalidades específicas de resíduo:

Alternar penalidades hidrofílicas:

0,50

GPSNDQEKR

DESLIGADO

LIGADO

Alternar penalidade de separação de lacuna final DESLIGADO. [0037] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoácido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservadora. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[0038] Conforme usado no presente documento, o termo gene é sinônimo do termo alelo em referência a um ácido nucleico que codifica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegetativas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado.

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10/38 [0039] Conforme usado no presente documento, expressar um polipeptídeo e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomas) da célula.

[0040] Conforme usado no presente documento, superexpressar um polipeptídeo, aumentar a expressão de um polipeptídeo e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação genética especificada.

[0041] Conforme usado no presente documento, um cassete de expressão refere-se a um ácido nucleico que inclui uma sequência de codificação de aminoácido, promotores, terminadores e outra sequência de ácidos nucleicos necessários para permitir que o polipeptídeo codificado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expressão podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endógenos (isto é, existentes em uma célula).

[0042] Conforme usado no presente documento, os termos tipo selvagem e nativo são usados intercambiavelmente e se referem a proteínas ou cepas de genes encontradas na natureza.

[0043] Conforme usado no presente documento, o termo proteína de interesse se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja expresso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável ou semelhantes e pode ser expressa em altos níveis. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno modificado ou um gene heterólogo (isto é, gene de interesse) em relação à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0044] Conforme usado no presente documento, deleção de um

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11/38 gene refere-se a sia remoção do genoma de uma célula hospedeira. Quando um gene inclui elementos de controle {por exemplo, elementos intensificadores) que não estão localizados imediatamente adjacentes à sequência de codificação de um gene, a deleção de um gene se refere à deleção da sequência de codificação e, opcionalmente, elementos intensificadores adjacentes, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, sequências promotoras e/ou terminadoras, mas não requer a deleção de elementos de controle não adjacentes.

[0045] Conforme usado no presente documento, ruptura de um gene se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou química, isto é, mutação, que impeça substancialmente que uma célula produza um produto gênico funcional, por exemplo, uma proteína, em uma célula hospedeira. Métodos exemplificativos de ruptura incluem deleção completa ou parcial de qualquer porção de um gene, incluindo uma sequência de codificação de polipeptídeos, um promotor, um intensificador ou um outro elemento regulador, ou mutagênese do mesmo, em que a mutagênese abrange substituições, inserções, deleções, inversões e combinações e variações das mesmas, sendo que qualquer uma das mutações impede substancialmente a produção de um produto gênico funcional. Um gene também pode ser rompido com o uso de RNAi, antissenso ou qualquer outro método que anule a expressão de genes. Um gene pode ser rompido por deleção ou manipulação genética de elementos de controle não adjacentes.

[0046] Conforme usado no presente documento, os termos manipulação genética e alteração genética são usados intercambiavelmente e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substituição, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

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12/38 [0047] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo/proteína funcional é uma proteína que possui uma atividade, tal como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade tensoativa ou semelhantes, e que não foi mutagenizada, truncada ou, de outra forma, modificada para anular ou reduzir essa atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser termoestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.

[0048] Conforme usado no presente documento, um gene funcional é um gene com capacidade para ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes funcionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para serem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.

[0049] Conforme usado no presente documento, células de levedura foram modificadas para impedir a produção de uma proteína especificada se tiverem sido alteradas genética ou quimicamente para impedir a produção de uma proteína/polipeptídeo funcional que exibe uma atividade característica da proteína do tipo selvagem. Tais modificações incluem, porém sem limitação, deleção ou ruptura do gene que codifica a proteína (conforme descrito no presente documento), modificação do gene de modo que o polipeptídeo codificado careça da atividade supracitada, modificação do gene de modo a afetar a estabilidade ou o processamento prós-translacional e combinações das mesmas.

[0050] Conforme usado no presente documento, o termo parálogo refere-se a genes homólogos que são o resultado de um evento de duplicação.

[0051] Conforme usado no presente documento, atenuação de

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13/38 uma trajetória ou atenuação do fluxo através de uma trajetória, isto é, uma trajetória bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma trajetória metabólica. A atenuação de uma via pode ser alcançada por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituição de alelos do tipo selvagem desses genes por formas mutantes que codificam enzimas com atividade catalítica reduzida ou maiores valores Km, modificação dos promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificação genética das enzimas ou do mRNA que codifica essas enzimas para uma diminuição de estabilidade, mau direcionamento de enzimas para compartimentos celulares onde têm menor probabilidade de interagirem com o substrato e intermediários, o uso de RNA de interferência e semelhantes.

[0052] Conforme usado no presente documento, fermentação aeróbia refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0053] Conforme usado no presente documento, fermentação anaeróbica refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0054] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares um, uma, o e a abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a não ser que especificado de outro modo:

°C graus Centígrados

AA a-amilase bp pares de bases

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DNA	ácido desoxirribonucleico
DP	grau de polimerização
ds ou DS	sólidos secos
EtOH	etanol
g ou gm g/i GA	grama gramas por litro glicoamilase
GAU/g ds H₂O	unidades de glicoamilase por grama de sólidos secos água
HPLC	cromatografia líquida de alto desempenho
hr ou h	hora
kg M	quilograma molar
mg mL ou ml	miligrama mililitro
ml/min	mililitros por minuto
mM	milimolar
N	normal
nm	nanômetro
PCR	reação em cadeia de polimerase
PPm RNA	partes por milhão ácido ribonucleico
Δ	relacionado a uma deleção
pg pL e pi μΜ	micrograma microlitro micromolar

III. Células de levedura modificadas que têm maior expressão de

Dpb3 [0055]

Em um aspecto, são fornecidas células de levedura

modificadas, em que as células modificadas têm uma alteração genética

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15/38 que resulta na produção de quantidades maiores de polipeptídeos Dpb3 em comparação com as células progenitoras correspondentes (isto é, idênticas de outro modo). Dpb3 é uma subunidade épsilon de DNA polimerase II com aproximadamente 200 aminoácidos originalmente identificada em Saccharomyces cerevisiae (consultar, por exemplo, Araki, H. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4.867 a 4.872).

[0056] Os requerentes constataram que células de levedura que superexpressam polipeptídeos Dpb3 produzem uma quantidade maior de álcool em comparação com células progenitoras idênticas de outro modo. O aumento de produção de álcool é desejado, visto que melhora o rendimento de instalações de produção de álcool e representa uma melhor utilização de carbono a partir de materiais de partida contendo carboidrato.

[0057] Em algumas modalidades, o aumento na quantidade de polipeptídeos Dpb3 produzida pelas células modificadas é um aumento de pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, pelo menos 1.000% ou ainda pelo menos 3.000% ou mais em comparação com a quantidade de polipeptídeos Dpb3 produzidos por células progenitoras cultivadas sob as mesmas condições.

[0058] Em algumas modalidades, o aumento na força do promotor usado para controlar a expressão do polipeptídeo Dpb3 produzido pelas células modificadas é pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 75 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 110 vezes, pelo menos 120 vezes, pelo menos 130 vezes ou ainda pelo menos 135% vezes ou mais em comparação com a força do promotor nativo que controla a expressão de Dpb3, com base na quantidade de mRNA produzida.

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16/38 [0059] Em algumas modalidades, o aumento na quantidade de polipeptídeos Dpb3 produzida pelas células modificadas é um aumento de pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 75 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 110 vezes, pelo menos 120 vezes, pelo menos 130 vezes ou ainda pelo menos 135% vezes ou mais em comparação com a quantidade de polipeptídeos Dpb3 produzida pelas células progenitoras cultivadas sob as mesmas condições.

[0060] Em algumas modalidades, o aumento em produção de álcool pelas células modificadas é um aumento de pelo menos 1 %, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7% ou mais em comparação com a quantidade de álcool produzida pelas células progenitoras cultivadas sob as mesmas condições.

[0061] De preferência, a maior expressão de Dpb3 é atingida por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. Entretanto, a mutagênese química não é excluída como um método para produzir células de levedura modificadas.

[0062] Em algumas modalidades, as presentes composições e métodos envolvem introduzir em células de levedura um ácido nucleico com capacidade para direcionar a superexpressão ou maior expressão de um polipeptídeo Dpb3. Os métodos particulares incluem, porém sem limitação, (i) introduzir um cassete de expressão exógeno para produzir o polipeptídeo em uma célula hospedeira, opcionalmente, além de um cassete de expressão endógeno, (ii) substituir um cassete de expressão exógeno por um cassete de expressão endógeno que permite a produção de uma quantidade maior do polipeptídeo, (iii) modificar o

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17/38 promotor de um cassete de expressão endógeno para aumentar a expressão e/ou (iv) modificar qualquer aspecto da célula hospedeira para aumentar a meia-vida do polipeptídeo na célula hospedeira. [0063] Em algumas modalidades, a célula parental que é modificada já inclui um gene de interesse, tal como um gene que codifica um marcador selecionável, uma enzima processadora de carboidratos ou outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, um gene de interesse é subsequentemente introduzido nas células modificadas. [0064] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo Dpb3 de S. cerevisiae exemplificado (isto é, número de acesso ao EMBLE Z36146.1) é mostrada abaixo como a SEQ ID N^Q: 1:

[0065] MSNLVKEKAP VFPISKVKKI AKCDPEYVIT SNVAISATAF

AAELFVQNLV

RDNFRFLEDA

EPELHEDDGV

EESLVLAQLN

IKQLKKNSAL

EEEEEEDEVS

SKGKTSLRLS

DKKRELNMQP

EEEEPVHNEE

LNSIEECVEK

GRSDQEVVIE

LLDDSKDQQN

DKSTRSVASL LSRFQYKSAL DVGEHSDSSD IEVDHTKSTD P [0066] O banco de dados NCBI inclui mais de 100 entradas para polipeptídeos Dpb3 de S. cerevisiae e não se espera que variações naturais na sequência de aminoácidos natural afetem sua função.

[0067] Com base em tais dados de BLAST e Clustal W, fica evidente que o polipeptídeo Dpb3 de S. cerevisiae exemplificado compartilha um alto grau de identidade de sequência com polipeptídeos de outros organismos, e se espera que a superexpressão de proteínas funcional e/ou estruturalmente similares, proteínas homólogas e/ou proteínas substancialmente similares ou idênticas produza resultados benéficos similares.

[0068] Em modalidades particulares das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Dpb3 que é superexpressa em células de levedura modificadas tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%,

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18/38 pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou ainda pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID N^Q: 1.

IV. Células de levedura modificadas que têm maior expressão de Dpb3 e expressão de Dls1 reduzida [0069] Dls1, YJL065c, é uma subunidade de polipeptídeo de 167 aminoácidos do complexo de acessibilidade à cromatina da levedura ISW2 (yCHRAC) que contém Isw2, ltd, a subunidade semelhante a Dpb3 (Dls1) e Dpb4 (consultar, por exemplo, Peterson, C.L. (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6:171 a 175 e Winston, F. e Carlson, Μ. (1992) Trends Genet. 8:387 a 391). Os requerentes determinaram que leveduras que têm uma alteração genética que reduz a quantidade de Dls1 funcional na célula, na ausência de outras modificações genéticas, exibem maior robustez em uma fermentação de álcool, permitindo fermentações em temperatura mais alta e potencialmente mais curtas (dados não mostrados).

[0070] Dpb3 foi inicialmente identificado como um parálogo de Dls 1. Entretanto, conforme descrito no presente documento, embora alterações genéticas que reduzem a quantidade de Dls1 funcional na célula tenham aumentado a robustez da produção de álcool, o oposto é verdadeiro de que alterações genéticas reduziram a quantidade de polipeptídeo Dpb3 funcional. Consequentemente, em algumas modalidades das presentes composições e métodos, modificações em levedura que aumentam a expressão de Dpb3 são combinadas com modificações que reduzem ou eliminam a quantidade de Dls1 funcional na célula, aumentando, ainda, a quantidade de álcool produzida pela levedura geneticamente modificada resultante.

[0071] A redução na quantidade de Dls1 funcional produzido em

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19/38 uma célula pode ser acompanhada por ruptura do gene YJL065c. A ruptura do gene YJL065c pode ser realizada com o uso de quaisquer métodos adequados que impeçam substancialmente a expressão de um produto do gene YJL065c funcional, isto é, Dls1. Métodos exemplificativos de ruptura conforme são conhecidos pelos versados na técnica incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial do gene YJL065c, incluindo a deleção completa ou parcial, por exemplo, da sequência de codificação de Dls1, do promotor, do terminador, de um intensificador ou de um outro elemento regulador; e deleção completa ou parcial de uma porção do cromossomo que inclui qualquer porção do gene YJL065c. Métodos específicos para romper o gene YJL065c incluem a realização de substituições ou inserções de nucleotídeo em qualquer porção do gene YJL065c, por exemplo, a sequência de codificação de Dls1, o promotor, o terminador, um intensificador ou um outro elemento regulador. De preferência, deleções, inserções e/ou substituições (coletivamente denominadas mutações) são realizadas por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. No entanto, a mutagênese química pode, em teoria, ser usada para romper o gene YJL065c.

[0072] As mutações no gene YJL065c podem reduzir a eficácia do promotor de YJL065c, reduzir a eficácia de um intensificador de YJL065c, interferir no splicing ou na edição do mRNA de YJL065c, interferir na tradução do mRNA de YJL065c, introduzir um códon de parada na sequência de codificação de YJL065c para impedir a tradução da proteína tYJL065c de comprimento total, mudar a sequência de codificação da proteína Dls1 para produzir uma proteína menos ativa ou inativa ou reduzir a interação de Dls1 com outros componentes da proteína nuclear ou DNA, mudar a sequência de

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20/38 codificação da proteína Dls1 para produzir uma proteína menos estável ou alvejar a proteína para destruição, fazer com que a proteína Dls 1 seja erroneamente enovelada, ou seja, incorretamente modificada (por exemplo, por glicosilação) ou interferir no tráfego celular da proteína Dls1. Em algumas modalidades, essas e outras manipulações genéticas atuam para reduzir ou impedir a expressão de uma proteína funcional Dls1 ou reduzir ou impedir a atividade biológica normal de Dls1.

[0073] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Dls1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Dls1, bem como mutações adicionais que reduzem ou impedem a expressão de proteínas funcionais Isw2, ltd ou Dpb4 ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de proteínas Isw2, ltd ou Dpb4. Em algumas modalidades, as presentes células modificadas incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Dls1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Dls1, enquanto não têm mutações adicionais que reduzem ou impedem a expressão de proteínas funcionais Isw2, ltd ou Dpb4 ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de proteínas Isw2, ltd ou Dpb4.

[0074] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo Dls1 de S. cerevisiae exemplificado é mostrada abaixo como a SEQ ID N^Q: 2: [0075] MNNETSGKET ASAPLCSPKL PVEKVQRIAK NDPEYMDTSD DAFVATAFAT EFFVQVLTHE SLHRQQQQQQ QQVPPLPDEL TLSYDDISAA IVHSSDGHLQ FLNDVIPTTK NLRLLVEENR VRYTTSVMPP NEVYSAYVVN DTAPKPNIVE IDLDNDEDDD EDVTDQE [0076] Com base em tais dados de BLAST e Clustal W, é evidente que o polipeptídeo Dls1 de S. cerevisiae exemplificado (SEQ ID N^Q: 2) compartilha um grau muito alto de identidade de sequência com outros polipeptídeos Dls1 de S. cerevisiae conhecidos, bem como polipeptídeos Dls1 de outro Saccharomyces spp. Portanto, espera-se

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21/38 completamente que as presentes composições e métodos sejam aplicáveis às células de levedura que contêm tais polipeptídeos estruturalmente similares, bem como outras proteínas relacionadas, homólogos e polipeptídeos funcionalmente similares.

[0077] Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos da proteína Dls1 que é rompida tem uma identidade de sequência aminoácidos total com a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID N^Q: 2 [0078] De preferência, a ruptura do gene YJL065c é realizada por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. Entretanto, a mutagênese química não é excluída como um método para produzir células de levedura modificadas.

[0079] Em algumas modalidades, a diminuição na quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional nas células modificadas é uma diminuição de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais em comparação com a quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional em células parentais que crescem sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, a redução de expressão de proteína funcional Dls1 nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo

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22/38 menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais em comparação com a quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional em células parentais que crescem sob as mesmas condições.

[0080] Em algumas modalidades, o aumento adicional em álcool nas células modificadas, em comparação com as células que apenas superexpressam Dpb3, é um aumento de pelo menos 0,2%, pelo menos 0,4%, pelo menos 0,6%, pelo menos 0,8%, pelo menos 1,0% ou mais.

V. Combinação de expressão maior de Dpb3 com outras mutações que afetam a produção de álcool [0081] Em algumas modalidades, além de superexpressar polipeptídeos Dpb3, opcionalmente em combinação com reduzir a expressão de polipeptídeos Dls1 funcionais, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, modificações adicionais que afetam a produção de álcool.

[0082] Em modalidades particulares, as células de levedura modificadas incluem uma trajetória artificial ou alternativa resultante da introdução de um gene de fosfocetolase heterólogo e um gene de fosfotransacetilase heterólogo. Uma fosfocetolase exemplificativa pode ser obtida a partir de Gardnerella vaginalis (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_016786789). Uma fosfotransacetilase exemplificativa pode ser obtida a partir de Lactobacillus plantarum (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_003641060).

[0083] As células modificadas podem, ainda, incluir mutações que resultam na atenuação da via de biossíntese de glicerol nativa, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da via de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação da atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo, por meio da ruptura de um ou mais dentre

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23/38 os genes GPD), GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as patentes N²² U.S. 9.175.270 (Elke et al.), 8.795.998 (Pronk et al.) e 8.956.851 (Argyros etal.).

[0084] A levedura modificada pode apresentar, ainda, um aumento da atividade de acetil-CoA sintase (também denominada acetil-CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar {isto é, capturar) o acetato produzido pela hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outro motivo) e convertê-lo em Ac-CoA. Isso evita o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heterólogo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão de um gene endógeno da acetil-CoA sintase e semelhantes. Uma acetilCoA sintase particularmente útil para a introdução em células pode ser obtida a partir de Methanosaeta concilii (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_013718460). Homólogos dessas enzimas, incluindo enzimas que têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e até mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a acetil-CoA sintase de Methanosaeta co/?c/7/7supracitada, também são úteis nas presentes composições e métodos.

[0085] Em algumas modalidades, as células modificadas podem incluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de acetaldeído desidrogenase acetilante dependente de NAD⁺e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formiato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da via de glicerol é descrita, por exemplo, na Patente N²U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). No entanto, na maioria das modalidades das presentes composições e métodos, a introdução de uma acetaldeído

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24/38 desidrogenase de acetilação e/ou uma liase de piruvato-formato não é necessária por causa da necessidade dessas atividades ser obviada pela atenuação da trajetória biossintética nativa para produzir Ac-CoA que contribui para desequilíbrio de cofator de redox. Consequentemente, as modalidades das presentes composições e métodos carecem, expressamente, de um gene (ou genes) heterólogo que codifica uma acetaldeído desidrogenase de acetilação, uma liase de piruvato-formato ou ambas.

[0086] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas compreendem, ainda, uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma trajetória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidroxiisovalerato; (c) 2,3-di-hidróxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a via biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di-hidróxi-ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxilase e álcool desidrogenase.

[0087] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas podem, ainda, superexpressar um polipeptídeo semelhante a transportador de açúcar (STL1) para aumentar a absorção de glicerol (consultar, por exemplo, Ferreira et al. (2005) Mol Biol Cell 16:2.068 a 2.076; Dusková et al. (2015) Mol Microbiol 97:541 a 559 e o documento N² WO 2015023989 A1).

[0088] Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas que compreendem uma via biossintética de butanol

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25/38 compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, o que tem atividade piruvato decarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C.

[0089] SEÇÃO GOI

VI. Combinação de expressão maior de Dpb3 com outras mutações benéficas [0090] Em algumas modalidades, além de superexpressar polipeptídeos Dpb3, opcionalmente em combinação com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, qualquer número de genes de interesse adicionais que codificam proteínas de interesse. Genes de interesse adicionais podem ser introduzidos antes, durante ou após manipulações genéticas que resultam na superexpressão dos polipeptídeos Dpb3. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidrato e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma β-glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma aamilase, uma β-amilase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase,

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26/38 uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e modificadas de outra forma.

VII. Uso da levedura modificada para aumento de produção de álcool [0091] As presentes composições e os métodos incluem métodos para aumentar a produção de álcool e/ou reduzir a produção de glicerol em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição imprevista para levedura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool. Embora seja principalmente destinada à produção de álcool combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja.

VIII. Células de levedura adequadas para modificação [0092] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Inúmeras cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais coimo alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhantes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, tais como glicoamilase ou a-amilase.

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IX. Substratos e produtos [0093] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboidrato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-deaçúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0094] Produtos de fermentação de álcool incluem o composto orgânico que tem um grupo funcional hidroxila (-OH) ligado a um átomo de carbono. Álcoois exemplificativos incluem, porém sem limitação, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, npentanol, 2-pentanol, isopentanol e álcoois superiores. Os álcoois combustíveis mais comumente produzidos são etanol e butanol.

[0095] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas de levedura e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, mas não a limitar, as composições e os métodos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Deleção do gene YBR278wem S. cerevisiae [0096] Dpb3, codificado por YBR278w, é um parálogo de Dls1, codificado por YJL065c (lida, T. e Araki, H. (2004) Mol Cell Biol, 24:217 a 227). Conforme descrito acima, reduzir a quantidade de Dls1 produzido em células de levedura, sem outras modificações genéticas às células, aumentou a produção de álcool (dados não mostrados). Um experimento inicial foi realizado para determinar se reduzir a quantidade de Dpb3 produzido nas células de levedura também aumentou a produção de álcool.

[0097] Com o uso de técnicas de biologia molecular padrão, o gene YBR278w foi rompido deletando-se essencialmente toda a sequência

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28/38 de codificação para Dpb3. Todos os procedimentos se basearam na sequência de ácidos nucleicos publicamente disponível de YBR278w, que é fornecida abaixo como a SEQ ID N^Q 3 (5' a 3'):

[0098] ATGTCCAACTTAGTTAAAGAAAAAGCACCTGTCTTTCCT ATATCTAAAGTAAAGAAGATTGCCAAATGCGACCCCGAATACGTAA TTACATCTAATGTAGCTATATCAGCGACCGCATTCGCTGCTGAGTT ATTTGTACAGAATCTCGTCGAAGAATCGCTGGTCTTAGCACAACTG AATTCGAAAGGAAAGACAAGCCTACGATTAAGCCTAAATTCTATAG AAGAATGTGTCGAAAAAAGAGATAATTTCAGGTTTCTAGAGGATGC CATTAAACAACTGAAGAAGAATAGCGCACTCGACAAGAAGAGAGA ACTAAACATGCAACCGGGTCGGAGCGATCAAGAGGTTGTTATAGA AGAGCCTGAATTGCATGAGGATGATGGTGTAGAGGAAGAAGAAGA AGAAGACGAGGTATCCGAAGAAGAAGAGCCCGTACACAATGAAG AACTTCTTGATGATAGTAAAGATCAACAAAATGATAAATCCACGCG CAGTGTGGCAAGCTTGCTGTCGAGATTCCAGTATAAATCCGCACT AGACGTAGGAGAACACTCCGACTCTTCTGATATCGAAGTTGACCA TACGAAAAGCACCGATCCTTAG [0099] A levedura hospedeira usada para produzir as células de levedura modificadas estava comercialmente disponível em FERMAX™ Gold (Martrex, Inc., Chaska, MN, EUA, no presente documento FG). A deleção do gene YBR278w foi confirmada por PCR em colônia. A levedura modificada foi cultivada em meio não seletivo para remover o plasmídeo que confere resistência à Canamicina usado para selecionar transformantes, resultando na levedura modificada que não necessitou de quaisquer suplementos de crescimento em comparação com a levedura parental. Três cepas modificadas independentes, designadas DPB3del-1, DPB3del-2 e DPB3del-3, foram selecionadas para estudo adicional.

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Exemplo 2: Produção de etanol por levedura modificada com expressão reduzida de Dpb3 [00100] As leveduras DPB3del-1, DPB3del-2 e DPB3del-3 que abrigam a deleção do gene YBR278w foram testadas quanto à sua capacidade de produzir etanol em comparação com a levedura de teste de desempenho (isto é, FERMAX™ Gold), que é o tipo selvagem para o gene YBR278w) em liquefeito a 34 e 37°C. Liquefeito (isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 35%, foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGEN™ 2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 1,46 SSCU/g ds de α-amilase de Aspergillus kawachiia pH 4,8.

[00101] 2,5 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 10 ml e inoculados com culturas frescas durante a noite provenientes de colônias das cepas modificadas ou cepa FG e incubados em diferentes temperaturas. As amostras foram colhidas por centrifugação em 65 horas, filtradas através de filtros de 0,2 μιτι e analisadas quanto ao teor de glicose e etanol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com o uso de colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H a 55°C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 1. A produção de etanol é registrada em referência à cepa FG.

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Tabela 1. Análise do caldo de fermentação após a fermentação

Temperatura (°C)	Cepa	Glicose (g/i)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
34	FG	17,3	139,31	1
34	DPB3del-1	25,63	135,71	0,974
34	DPB3del-2	26,59	135,17	0,97
34	DPB3del-3	25,55	135,32	0,971
37	FG	55,99	122,08	1
37	DPB3del-1	78,58	108,4	0,888
37	DPB3del-2	78,38	108,64	0,89
37	DPB3del-3	78,81	108,17	0,886

[00102] As leveduras que abrigam a deleção do gene YBR278w c produziram menos etanol em comparação com a cepa de referência, particularmente em temperatura elevada.

Exemplo 3: Superexpressão de Dpb3 em S. cerevisiae [00103] A superexpressão de Dpb3-1 em ratos mostrou estar associada à tolerância ao calor (Hikaro Sato, H. et al. (2016) Plant Biotech J, 14:1.756 a 1.767). Um experimento inicial foi realizado para determinar se aumentar a quantidade de Dpb3 em levedura também aumenta a tolerância e a produção de álcool.

[00104] Quatro promotores com diferentes forças foram usados: TMP1 (aumento de 12 vezes em expressão), HTA1 (aumento de 28 vezes em expressão), EFB1 (aumento de 75 vezes em expressão) e FBA1 (aumento de 135 vezes em expressão). O aumento em vezes em expressão foi baseado na quantidade de mRNA produzido (dados não mostrados). Com o uso de técnicas-padrão, o promotor nativo de DPB3 foi permutado com cada um dos quatro promotores mencionados acima na levedura hospedeira FG mencionada anteriormente. As permutações de promotor do gene YBR278wforam confirmadas por PCR de colônia.

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31/38 [00105] A levedura modificada foi cultivada em meio não seletivo para remover o plasmídeo que confere resistência à Canamicina usado para selecionar transformantes, resultando na levedura modificada que não necessitou de quaisquer suplementos de crescimento em comparação com a levedura parental. Três cepas independentes foram selecionadas para cada variante com permutação de promotor, denominadas TMP1-DPB3, HTA1-DPB3, EFB1-DPB3 e FBA1-DPB3, que foram usadas para estudo adicional.

Exemplo 4: Produção de etanol por levedura modificada com expressão maior de Dpb3 [00106] As cepas de levedura que abrigam a superexpressão do gene YBR278w foram testadas quanto à sua capacidade de produzir etanol em comparação com a levedura de teste de desempenho (isto é, FERMAX™ Gold), que é o tipo selvagem para o gene YBR278w, em liquefeito a 34 e 37°C. Liquefeito (isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 35%, foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGEN™ 2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 1,46 SSCU/g ds de a-amilase de AKAA (Aspergillus kawachii) a pH 4,8.

[00107] 2,5 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 10 ml e inoculados com culturas frescas durante a noite provenientes de colônias das cepas modificadas ou cepa FG e incubados a 34C. As amostras foram colhidas por centrifugação após 65 horas, filtradas através de filtros de 0,2 μιτι e analisadas quanto ao teor de glicose e etanol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com o uso de colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H a 55°C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Os resultados das análises são mostrados nas Tabelas 2 a 5. A produção de etanol é registrada em referência à cepa FG.

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Tabela 2. Análise de caldo de fermentação com leveduras que abrigam os promotores TMP1, HTA1 e EFB1 a 34°C

Cepa	Glicose (g/l)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	43,47	128,05	1
TMP1-DPB3-1	42,85	127,49	0,996
TMP1-DPB3-2	43,05	128,07	1
TMP1-DPB3-3	43,13	128,33	1,002
HTA1-DPB3-1	41,27	127,76	0,998
HTA1-DPB3-2	41,92	127,98	0,999
HTA1-DPB3-3	41,56	128,3	1,002
EFB1-DPB3-1	24,81	136,35	1,065
EFB1-DPB3-2	24,36	136,86	1,069
EFB1-DPB3-3	25,78	135,12	1,063

Tabela 3. Análise de caldo de fermentação com leveduras que abrigam o promotor FBA1 a 34°C

Cepa	Glicose (g/l)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	28,25	132,8	1
FBA1-DPB3-1	22,9	134,47	1,013
FBA1-DPB3-2	22,06	135,24	1,018
FBA1-DPB3-3	22,5	134,58	1,013

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Tabela 4. Análise de caldo de fermentação com leveduras que abrigam os promotores TMP1, HTA1 e EFB1 a 37°C

Cepa	Glicose (g/l)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	69,43	118,73	1
TMP1-DPB3-1	70,02	119,34	1,005
TMP1-DPB3-2	71,27	119	1,002
TMP1-DPB3-3	70,03	118,99	1,002
HTA1-DPB3-1	69,71	118,98	1,002
HTA1-DPB3-2	70,3	119,34	1,005
HTA1-DPB3-3	69,62	119,39	1,006
EFB1-DPB3-1	62,61	123,25	1,038
EFB1-DPB3-2	59,89	124,12	1,045
EFB1-DPB3-3	59,5	124,25	1,046

Tabela 5. Análise de caldo de fermentação com leveduras que abrigam o promotor FBA1 a 37°C

Cepa	Glicose (g/l)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	58,86	118,37	1
FBA1-DPB3-1	56,18	119,9	1,013
FBA1-DPB3-2	56,28	119,88	1,013
FBA1-DPB3-3	55,82	119,87	1,013

[00108] As leveduras que abrigam o gene YBR278w controlado pelos promotores EFB1 e FBA1 produziram significativamente (isto é, >1%) mais etanol em comparação com a cepa de referência, particularmente a 34°C.

[00109] Conforme mostrado n Tabela 6, as leveduras que abrigam o gene YBR278w controlado pelo promotor EFB1 também produziram significativamente (isto é, -0,7%) mais etanol em comparação com a cepa de referência a uma temperatura mais baixa de 33°C e um ds mais alto de 35,8.

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Tabela 6. Análise de caldo de fermentação com leveduras que abrigam os promotores EFB1 a 32°C e um ds mais alto

Temperatura (°C)	DS (%)	Cepa	Tempo de amostragem (h)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG	Glicose (g/l)	Glicose em comparação com FG
32	35,8	FG	55	149,51	1	9,02	1
32	35,8	EFB1-DPB3	55	150,4	1,007	5,91	0,65

[00110] A levedura que abriga os diferentes promotores foi também testada quanto à sua capacidade de produzir etanol em comparação com a levedura de teste de desempenho em liquefeito incubado de acordo com as condições de elevação de temperatura mostradas na Tabela 7. Liquefeito, isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 35%, foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGEN™2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 1,46 SSCU/g ds de a-amilase de Aspergillus kawachii a pH 4,8.

Tabela 7. Condição de rampa de temperatura

Tempo (hora)	Temperatura (°C)
0-10	32
10-12	33
12-15	34
15-17	35
17-22	35,5
22-27	34,5
27-31	34
31-36	33,5
36-41	33
41-55	32,5
55 até o final	32

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35/38 [00111] 30 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 250 ml e inoculados com culturas frescas durante a noite provenientes de colônias da cepa modificada ou cepa FG sob as condições de elevação de temperatura. Um sistema de monitoramento de gás (ANKOM Technology) foi usado para registrar a taxa de fermentação com base na pressão cumulativa seguindo a produção de CO2 ao longo do tempo. As amostras foram colhidas por centrifugação, filtradas através de filtros de 0,2 pm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com 0 uso de colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H a 55°C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Um volume de injeção de amostra de 2,5 pl foi usado. Os padrões de calibração usados para a quantificação incluíram quantidades conhecidas de DP4+, DP3, DP2, DP1, glicerol e etanol. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 8. O aumento de etanol é registrado em referência à cepa FG.

Tabela 8. Análise de caldo de fermentação após fermentação sob as condições de elevação de temperatura

Cepa	Glicose (g/l)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	24,57	137,21	1
TMA1-DPB3	26,04	135,54	0,988
HTA1-DPB3	24,27	136,93	0,988
EFB1-DPB3	12,08	143,23	1,044
FBA1-DPB3	22,85	137,83	1,005

[00112] A levedura que abriga 0 gene YBR278w controlado pelo promotor EFB1 produziu significativamente (isto é, >4%) mais etanol em comparação com a cepa de referência sob as condições de elevação de temperatura. Com base na totalidade dos dados experimentais, parece que um aumento de pelo menos 30 vezes em força de promotor, com base na produção de mRNA, é necessário para atingir um aumento

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36/38 significativo em produção de álcool como resultado de superexpressão de Dpb3. O aumento correspondente na quantidade de proteína Dpb1 produzida nas células pode ser mais baixo.

Exemplo 5: Superexpressão de Dpb3 em combinação com expressão reduzida de Dls1 [00113] Foi realizado um experimento para determinar se aumentar a quantidade de Dpb3 em combinação com reduzir a quantidade de Dls 1 (codificado pelo gene YJL065c) em levedura aumentaria ainda mais a tolerância e a produção de álcool em comparação com aumentar Dpb3 apenas. Com o uso de técnicas-padrão, o promotor nativo de Dpb3 foi permutado com o promotor EFB1 na levedura hospedeira FG mencionada anteriormente, em que a deleção de YJL065cto\ realizada. A permutação de promotor do gene YBR278wto\ confirmada por PCR de colônia. As leveduras que abrigam a deleção de YJL065c e o promotor EFB1 em frente aos genes Dpb3 foram também testadas quanto à sua capacidade de produzir etanol em comparação com a levedura de teste de desempenho em liquefeito incubado de acordo com as condições de elevação de temperatura mostradas na Tabela 6. Liquefeito, isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 35%, foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGEN™2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 1,46 SSCU/g ds de α-amilase de Aspergillus kawachiia pH 4,8.

[00114] 50 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 125 ml e inoculados com culturas frescas durante a noite provenientes de colônias da cepa modificada ou cepa FG a 32°C e sob as condições de elevação de temperatura. As amostras foram colhidas por centrifugação em 55 horas, filtradas através de filtros de 0,2 pm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com o uso de colunas Bio-Rad Aminex HPX

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87H a 55°C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Um volume de injeção de amostra de 2,5 μΙ foi usado. Os padrões de calibração usados para a quantificação incluíram quantidades conhecidas de DP4+, DP3, DP2, DP1, glicerol e etanol. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 9 e na Tabela 10. O aumento de etanol é registrado em referência à cepa FG.

Tabela 9. Análise de caldo de fermentação após fermentação sob as condições de elevação de temperatura

Cepa	Glicose (g/i)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	9,22	137,29	1
YJL065C-DEL	2,16	141,62	1,032
EFB1-Dpb3	1,6	142,11	1,035
EFB1-Dpb3-YJL065c-DEL	0,5	143,26	1,043

[00115] Conforme mostrado na Tabela 9, as leveduras que abrigam a deleção de gene YJL065c além do gene YBR278w controlado pelo promotor EFB1 (isto é, que superexpressam Dpb3) produziram significativamente (isto é, quase 1%) mais etanol em comparação com a levedura que superexpressa Dpb3 apenas e mais de 4% mais do que a cepa de referência não modificada sob condições de elevação de temperatura.

Tabela 10. Análise do caldo de fermentação após a fermentação a 32°C

Cepa	Glicose (g/i)	Etanol (g/l)	Etanol em comparação com FG
FG	0,63	141,33	1
YJL065C-DEL	1,85	142,51	1,008
EFB1-DPB3	0,45	143,28	1,014
EFB1-DPB3-YJL065C -DEL	0,54	144,07	1,019

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38/38 [00116] Conforme mostrado na Tabela 10, as leveduras que abrigam a deleção de YJL065c além do gene YBR278w controlado pelo promotor EFB1 {isto é, que superexpressam Dpb3) produziram cerca de 0,5% mais etanol em comparação com as leveduras que superexpressam Dpb3 apenas e quase 2% mais do que a cepa de referência não modificada a 32°C.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, caracterizadas pelo fato de que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma maior quantidade de polipeptídeos Dpb3 em comparação com as células progenitoras, sendo que as células modificadas produzem, durante a fermentação, uma maior quantidade de álcool em comparação com a quantidade de álcool produzida pelas células progenitoras sob condições idênticas de fermentação.
2. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução, nas células progenitoras, de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um polipeptídeo Dpb3 para um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equivalentes.
3. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo Dpb3.
4. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um gene YBR278w c exógeno.
5. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um promotor mais forte em um gene YBR278w c endógeno.
6. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na expressão do polipeptídeo Dpb3 é pelo

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2/3 menos cerca de 30 vezes em comparação com o nível de expressão nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.
7. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na produção do mRNA que codifica o polipeptídeo Dpb3 é pelo menos cerca de 30 vezes em comparação com o nível nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.
8. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, a ruptura do gene YJL065c.
9. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizadas pelo fato de que as células produzem uma quantidade reduzida de polipeptídeos Dls1 funcionais.
10. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizadas pelo fato de que as células não produzem polipeptídeos Dls1.
11. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizadas pelo fato de que as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidrato.
12. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma alteração na via de glicerol e/ou na via de acetil-CoA.
13. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma via alternativa para produção de etanol.

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14. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizadas pelo fato de que as células são de um Saccharomyces spp.
15. Método para aumentar a produção de álcool a partir de células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir, em células de levedura progenitoras, uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos Dpb3 em comparação com a quantidade produzida nas células progenitoras.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as células que têm a alteração genética introduzida são as células modificadas que são as células, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as células que têm a alteração genética introduzida que aumenta a produção de polipeptídeos Dpb3 compreendem, ainda, uma alteração genética que reduz a quantidade de polipeptídeos Dls1 funcionais produzidos em comparação com as células progenitoras.