BR112020004021A2

BR112020004021A2 - levedura modificada que compreende transportadores mediados por atp específicos para glicose

Info

Publication number: BR112020004021A2
Application number: BR112020004021-5A
Authority: BR
Inventors: Daniel Joseph Macool; Yehong Jamie Wang; Paula Johanna Maria Teunissen; Quinn Qun Zhu
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2020-09-08
Also published as: EP3676288A1; CN111065648A; CA3073387A1; UY37859A; WO2019046043A1; AR113105A1

Abstract

A invenção refere-se a composições e métodos relacionados a levedura modificada com expressão exógena, ou quantidades aumentadas, de transportadores mediados por ATP específicos para glicose. A levedura modificada produz uma quantidade aumentada de etanol em comparação com as células progenitoras. Tal levedura é particularmente útil para produção em larga escala de etanol a partir de substratos de amido.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "LEVEDURA MODIFICADA QUE COMPREENDE TRANSPOR- TADORES MEDIADOS POR ATP ESPECÍFICOS PARA GLICOSE".

CAMPO DA TÉCNICA

[001] As presentes composições e métodos referem-se à levedura modificada que abriga transportadores mediados por ATP específicos para glicose. A levedura modificada produz uma quantidade maior de etanol em uma fermentação de hidrolisado de amido em comparação com levedura de outro modo idêntica. Tal levedura é particularmente útil para produção em larga escala de etanol a partir de substratos de amido.

ANTECEDENTES

[002] A primeira geração de produção de etanol à base de levedura converte açúcares em etanol combustível. A produção de etanol combustível anual por levedura é cerca de 90 bilhões de litros mundialmente (Gombert, A.K. e van Maris. A.J. (2015) Curr Opin Biotechnol. 33:81 a 86). Estima-se que cerca de 70% do custo de produção de etanol seja a matéria-prima. Visto que o volume de produção é tão grande, que até mesmo pequenos aprimoramentos de rendimento terão um impacto econômico massivo através da indústria.

[003] Bioquimicamente, a conversão de glicose em etanol e dióxido de carbono redox-neutra, com o rendimento teórico máximo sendo cerca de 51%. Entretanto, durante o cultivo da levedura, há um excedente de NADH que é usado para produzir glicerol para equilíbrio redox e proteção osmótica. O rendimento industrial atual de fermentação por levedura de mingau de milho para produção de etanol é cerca de 45%, assim, há oportunidade de aumentar o rendimento de etanol em mais de 10%, o que pode se traduzir em nove bilhões de litros adicionais de etanol. Além do dióxido de carbono inevitável, biomassa de levedura e glicerol são os dois maiores subprodutos desse processo de fermentação.

[004] Monossacarídeos e outros açúcares simples são as fontes de carbono e energia favorecidas de Saccharomyces cerevisiae (Leandro, M.J., et al. (2009) FEMS Yeast Res. 9: 511 a 525). Muitos transportadores de monossacarídeo operam por difusão facilitada para mover tais moléculas ao longo de um gradiente de concentração favorável através da membrana celular, de uma maneira independente de energia. Outros transportadores de monossacarídeo são consumidores de energia, permitindo a absorção de moléculas de açúcar contra um gradiente de concentração, acoplado ao movimento simultâneo de um próton. Tais transportadores usualmente operam apenas quando açúcar limitado está presente em um meio de crescimento. A absorção de hexoses em S. cerevisiae ocorre apenas através da difusão facilitada (Lagunas, R. (1993) FEMS Microbiol. Rev. 10:229 a 242) mediada por cerca de vinte transportadores, incluindo as proteínas Hxt, com propriedades cinéticas e modos de regulação diferentes (Reifenberger, E. et al. (1997) Eur. J. Biochem. 245:324 a 333). A absorção de açúcar tem um efeito significativo sobre o fluxo metabólico (Elbing, K.D. et al. (2004) Eur. J. Biochem. 271:4.855 a

4.864), impactando o crescimento celular, repressão catabólica, fermentação e respiração (Goffrini et al. (2002) J. Bacteriol. 184:427 a 432; Barnett, J.A. e Entian, K.D. (2005) Yeast 22:835 a 894).

[005] A modificação genética de levedura para conservação de energia livre é uma das estratégias para aumentar o rendimento de etanol (Gombert e van Maris, supra). O crescimento de levedura exige energia na forma de ATP. Se o consumo de ATP pudesse ser aumentado, isso poderia aumentar o rendimento de etanol em açúcar, devido ao fato de que mais açúcar poderia ter que ser convertido em etanol e dióxido de carbono para fornecer a mesma quantidade de ATP para manutenção celular, assumindo-se que a fração aumentada do açúcar é convertida em etanol e não biomassa e glicerol. Foi relatado que a superexpressão de fosfatase alcalina de vacúolo (Ph08) aumentou o rendimento de etanol (Semkiv, M.V. et al. (2014) BMC Biotechnol. 14:42). Entretanto, o desafio com a introdução de tais drenos de ATP não estequiométricos, especialmente para implantação industrial, está no ajuste fino entre o impacto positivo e a robustez celular diminuída (Gombert e van Maris, supra).

[006] A cepa de S. cerevisiae foi geneticamente modificada com um transportador de sacarose mediado por ATP. Nas cepas geneticamente modificadas, o requisito de ATP para extrusão de próton diminui o rendimento anaeróbico de ATP em sacarose, que resulta em rendimento de etanol aumentado (Basso, T.O. et al. (2011) Met. Eng. 13:694 a 703). Entretanto, na indústria de produção de etanol atual, a sacarose não é o principal substrato nos EUA.

[007] Continua a existir a oportunidade para ligar o conceito de conservação de energia livre com a absorção de açúcar crescente para aumentar o rendimento de etanol.

SUMÁRIO

[008] Esta invenção fornece composições e métodos para aumentar a produção de etanol em levedura por expressão de transportadores mediados por ATP específicos para glicose. Os aspectos e modalidades das composições e métodos são descritos nos parágrafos a seguir, independentemente enumerados.

[009] 1. Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, em que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma quantidade maior de transportador mediado por ATP específico para glicose em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem durante a fermentação uma quantidade maior de etanol em comparação com a quantidade de etanol produzida pelas células progenitoras sob condições idênticas de fermentação.

[0010] 2. Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um transportador mediado por ATP específico para glicose a um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equivalentes.

[0011] 3. Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1 ou 2, em que a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar um transportador mediado por ATP específico para glicose.

[0012] 4. Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1 ou 2, a alteração genética compreende a introdução de um gene exógeno que codifica um transportador mediado por ATP específico para glicose.

[0013] 5. Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 4, o gene exógeno é de um organismo selecionado dentre o grupo que consiste em Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrate, Arabis alpine, Brassica rapa, Capsella rubella, Camelina sativa, e Eutreme salsugineus.

[0014] 6. Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 4 ou 5, o gene exógeno é selecionado dentre o grupo que consiste em AtSTP9, AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S, e EsSTP9S.

[0015] 7. Em algumas modalidades das células modificadas do parágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução de um promotor mais forte em um gene endógeno que codifica um transportador mediado por ATP específico para glicose.

[0016] 8. Em algumas modalidades das células modificadas dos parágrafos 1 a 7, a quantidade de aumento na produção de etanol é pelo menos cerca de 2%, em comparação com o nível nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

[0017] 9. Em algumas modalidades, as células modificadas dos parágrafos 1 a 8 compreendem, ainda, uma alteração genética que introduz um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de uma trajetória de fosfocetolase exógena.

[0018] 10. Em algumas modalidades das células modificadas dos parágrafos 1 a 9, as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.

[0019] 11. Em algumas modalidades, as células modificadas dos parágrafos 1 a 10, compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

[0020] 12. Em algumas modalidades das células modificadas dos parágrafos 1 a 11, as células são de um Saccharomyces spp.

[0021] 13. Em outro aspecto, é fornecido um método para aumentar a quantidade de etanol produzido por células cultivadas em um substrato de hidrolisado de amido que compreende: introduzir em células de levedura progenitoras uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos transportadores mediados por ATP específicos para glicose em comparação com a quantidade produzida nas células progenitoras.

[0022] 14. Em algumas modalidades do método do parágrafo 13, as células não produzem uma quantidade significativa de glicerol adicional em comparação com quantidade produzida pelas células progenitoras.

[0023] 15. Em algumas modalidades do método do parágrafo 13 ou 14, a produção aumentada dos polipeptídeos transportadores mediados por ATP específicos para glicose aumenta o consumo de ATP nas células.

[0024] 16. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 13 a 15, o hidrolisado de amido compreende pelo menos 5 g/l de glicose.

[0025] 17. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 13 a 16, as células que têm a alteração genética introduzida são as células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 12.

[0026] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes células modificadas e métodos serão evidentes a partir da descrição, incluindo as Figuras anexas.

BREVES DESCRIÇÕES DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1 é um mapa de um cassete de expressão AtSTP9S.

[0028] A Figura 2 é um mapa do plasmídeo pZK41Wn-H3SP9.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Definições

[0029] Antes de descrever as presentes leveduras e métodos em detalhes, os termos a seguir são definidos para maior clareza. Os termos não definidos devem ser acordados com seus significados comuns conforme usados na técnica relevante.

[0030] Conforme usado no presente documento, o termo "álcool" refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.

[0031] Conforme usado no presente documento, os termos "células de levedura", "cepas de levedura" ou simplesmente "levedura" se referem a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccharomycetales. Os exemplos específicos de levedura são Saccharomyces spp., incluindo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0032] Conforme usado no presente documento, o sintagma "células de levedura geneticamente modificadas", "células de levedura variantes", "células de levedura modificadas" ou sintagmas similares referem-se à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.

[0033] Conforme usado no presente documento, os termos "polipeptídeo" e "proteína" (e suas respectivas formas plurais) são usados de forma intercambiável para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-terminal. O polímero pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0034] Conforme usado no presente documento, as proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas como "proteínas relacionadas" ou "homólogas". Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de gêneros e/ou espécies diferentes, ou classes diferentes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos), ou artificialmente projetadas. As proteínas relacionadas também englobam homólogos determinados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por reatividade cruzada imunológica ou determinados por suas funções.

[0035] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína homóloga" se refere a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Assim, pretende-se que o termo abranja enzimas iguais, similares ou correspondentes (isto é, em termos de estrutura e função) obtidas de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica similar (ou respostas imunológicas similares) à de uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com a atividade desejada (ou atividades desejadas).

[0036] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, WI); e Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).

[0037] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos progressivos por pareamento. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Os parâmetros de PILEUP úteis incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento da lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderados. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros "W", "T" e "X" determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M′5, N′-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0038] Conforme usado no presente documento, os sintagmas "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipicamente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em comparação com a sequência de referência (isto é, do tipo selvagem). O percentual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0 Penalidade por extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de sequência divergente de atraso 40 Distância de separação de lacuna: 8 peso de transições de DNA: 0,50 Listar resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Usar matriz negativa: DESLIGADO Alternar Penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade por separação de lacuna final DESLIGADO

[0039] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoácido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservadora. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[0040] Conforme usado no presente documento, o termo "gene" é sinônimo do termo "alelo" em referência a um ácido nucleico que codifica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegetativas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado. O termo "alelo" é, de modo geral, preferencial quando um organismo contém mais de um gene similar, em cujo caso, cada gene similar diferente é denominado um "alelo" distinto.

[0041] Conforme usado no presente documento, o termo "expressar um polipeptídeo" e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomos) da célula.

[0042] Conforme usado no presente documento, "superexpressar um polipeptídeo", "aumentar a expressão de um polipeptídeo" e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação genética especificada.

[0043] Conforme usado no presente documento, um "cassete de expressão" se refere a um fragmento de DNA que inclui um promotor e região de codificação de aminoácido e um terminador (isto é, promotor::região de codificação de aminoácido::terminador) e outra sequência de ácidos nucleicos necessária para permitir que o polipeptídeo codificado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expressão podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endógenos (isto é, existentes em uma célula).

[0044] Conforme usado no presente documento, os termos "tipo selvagem" e "nativo" são usados de forma intercambiável e se referem a genes, proteínas ou cepas que são encontrados na natureza ou que não são intencionalmente modificados pela vantagem da levedura descrita no presente.

[0045] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de interesse" se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja expresso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável ou semelhantes e pode ser expressa. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno ou um gene heterólogo (isto é, "gene de interesse") em relação à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0046] Conforme usado no presente documento, os termos "manipulação genética" e "alteração genética" são usados ide forma intercambiável e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substituição, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0047] Conforme usado no presente documento, um "polipeptídeo/proteína funcional" é uma proteína que possui uma atividade, tal como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade tensoativa ou semelhantes, e que não sofreu mutagênese, truncada ou, de outra forma, modificada para anular ou reduzir essa atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser termoestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.

[0048] Conforme usado no presente documento, um "gene funcional" é um gene com capacidade para ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes funcionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para serem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.

[0049] Conforme usado no presente documento, "atenuação de uma trajetória" ou "atenuação do fluxo através de uma trajetória", isto é, uma trajetória bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma trajetória metabólica. A atenuação de uma trajetória pode ser obtida por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, mas sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituir alelos do tipo selvagem desses genes com formas mutantes que codificam enzimas com atividade catabólica reduzida ou valores de Km aumentados, modificar os promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificar geneticamente as enzimas ou o mRNA que codifica essas enzimas para uma estabilidade diminuída, extraviar as enzimas para compartimentos celulares em que as mesmas são menos prováveis de interagir com substrato e intermediários, o uso de RNA interferente, e semelhantes.

[0050] Conforme usado no presente documento, "fermentação aeróbia" refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0051] Conforme usado no presente documento, "fermentação anaeróbica" refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0052] Conforme usado no presente documento, a expressão "fim da fermentação" refere-se ao estágio de fermentação em que a vantagem econômica de continuar a fermentação para produzir uma pequena quantidade de álcool adicional é excedida pelo custo de continuar a fermentação em termos de custos fixos e variáveis. Em um sentido mais geral, "fim da fermentação" refere-se ao ponto em que uma fermentação não produzirá mais uma quantidade significativa de álcool adicional, isto é, não mais que cerca de 1% de álcool adicional.

[0053] Conforme usado no presente documento, a expressão "fluxo de carbono" refere-se à taxa de renovação de moléculas de carbono através de uma trajetória metabólica. O fluxo de carbono é regulado por enzimas envolvidas nas trajetórias metabólicas, tal como a trajetória para metabolismo de glicose e a trajetória para metabolismo de maltose.

[0054] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a não ser que especificado de outro modo: EC comissão de enzima EtOH etanol AA α-amilase GA glicoamilase °C graus centígrados bp pares de bases DNA ácido desoxirribonucleico ds ou DS sólidos secos g ou gm grama g/l gramas por litro H2O água HPLC cromatografia líquida de alta eficiência hr ou h hora kg quilograma M molar mg miligrama mL ou ml mililitro min minuto mM milimolar N normal nm nanômetro PCR reação em cadeia de polimerase Ppm partes por milhão ∆ relacionado a uma deleção µg micrograma µL e µl microlitro µM micromolar U/g unidades/grama SAPU unidade de protease ácida espectrofotométrica SSU unidade de amido solúvel II. Levedura modificada que abriga um transportador mediado por ATP específico para glicose

[0055] As presentes composições e métodos são baseados na constatação de que a levedura modificada que superexpressa um transportador mediado por ATP específico para glicose produz mais etanol em uma fermentação de hidrolisado de amido do que uma levedura progenitora de outro modo idêntica. Sem se ater a uma teoria, acredita-se que a introdução de um transportador mediado por ATP afete tanto a absorção de glicose quanto o consumo de ATP, resultando em um aumento geral nos produtos desejáveis do metabolismo de levedura.

[0056] As tentativas anteriores de modificar levedura para aumentar a produção de etanol envolveram transportadores de monossacarídeo que absorvem monossacarídeo através de difusão facilitada, que é independente de energia (ATP). Adicionalmente, estudos anteriores mostraram que a superexpressão de transportadores de monossacarídeo de levedura facilitativos aumenta a absorção de açúcar e a taxa de produção de etanol, mas não o rendimento de produção de etanol final. Consequentemente, a presente levedura modificada e métodos são claramente distinguíveis da levedura descrita anteriormente pelo fato de que envolvem transportadores passivos e afetam o rendimento de etanol, não meramente a taxa de produção.

[0057] Em algumas modalidades da presente composição e métodos, o transportador mediado por ATP específico para glicose é um transportador endógeno que é levado a ser superexpresso introduzindo- se na levedura progenitora uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma cópia de adição do transportador, por exemplo, na forma de um cassete de expressão. Em algumas modalidades, o transportador mediado por ATP específico para glicose é um transportador endógeno levado a ser superexpresso modificando-se o gene endógeno na levedura progenitora, tal como introduzindo-se um promotor mais forte.

[0058] Em algumas modalidades da presente composição e métodos, o transportador mediado por ATP específico para glicose é de Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrate, Arabis alpine, Brassica rapa, Capsella rubella, Camelina sativa, Eutreme salsugineus ou um organismo relacionado. Em algumas modalidades, o transportador mediado por ATP específico para glicose é codificado por um gene selecionado dentre AtSTP9, AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S e EsSTP9S. Em algumas modalidades, o transportador mediado por ATP específico para glicose é AtSTP9, AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S, EsSTP9S, uma proteína estrutural ou funcionalmente similar ou uma proteína homóloga.

[0059] Em algumas modalidades, o transportador mediado por ATP específico para glicose é de Arabidopsis thaliana, por exemplo, o transportador mediado por ATP específico para glicose que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades,

a sequência de aminoácidos do transportador mediado por ATP específico para glicose tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2.

[0060] Em algumas modalidades, a presença de um cassete de expressão de transportador mediado por ATP específico para glicose resulta em um aumento na produção de etanol de pelo menos 0,5%, pelo menos 1,0%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,1%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 4,0%, pelo menos 4,5%, pelo menos 4,8% ou mais. Em algumas modalidades, a presença de um cassete de expressão de transportador mediado por ATP específico para glicose não resulta adicionalmente em um aumento significativo em produção de glicerol, por exemplo, um aumento menor que 10%, menor que 9%, menor que 8%, menor que 7%, menor que 6%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2% ou mesmo menor que 1% em produção de glicerol. Em algumas modalidades, a presença de um cassete de expressão de transportador mediado por ATP específico para glicose não resulta adicionalmente em um aumento significativo em produção de acetato, por exemplo, um aumento menor que 10%, menor que 9%, menor que 8%, menor que 7%, menor que 6%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2% ou mesmo menor que 1% em produção de acetato. Em algumas modalidades, a presença de um cassete de expressão de transportador mediado por ATP específico para glicose resulta em uma diminuição na produção de acetato.

[0061] Em algumas modalidades, a presente levedura modificada e métodos estão associados a fermentações que envolvem sólidos altamente dissolvidos e altas concentrações de glicose, isto é, condições sob as quais transportadores mediados por ATP específicos para glicose não exercem tipicamente um papel no metabolismo de levedura. Em algumas modalidades, a concentração de glicose é pelo menos 5 g/l, pelo menos 10 g/l, pelo menos 20 g/l, pelo menos 30 g/l, pelo menos 40 g/l, pelo menos 50 g/l, pelo menos 60 g/l, pelo menos 70 g/l, pelo menos 80 g/l, pelo menos 90 g/l ou mesmo pelo menos 100 g/l. Os níveis de glicose de pico durante a fermentação são tipicamente 100 a 120 g/l (10 a 12% em p/v). III. Mutações adicionais que afetam a produção de álcool

[0062] As presentes leveduras modificadas podem incluir adicionalmente ou podem excluir expressamente mutações que resultam na atenuação do caminho de biossíntese de glicerol nativo, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da via de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação da atividade de glicerol 3- fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo, por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPD1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as Patentes nos U.S. 9.175.270 (Elke et al.), 8.795.998 (Pronk et al.) e 8.956.851 (Argyros et al.).

[0063] A levedura modificada pode apresentar adicionalmente atividade aumentada de acetil-CoA sintase (também chamada de acetil- CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido por hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outra razão) e converter o mesmo em acetil-CoA. Isso evita o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heterólogo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão de um gene endógeno da acetil-CoA sintase e semelhantes.

Uma acetil-CoA sintase particularmente útil para introdução em células pode ser obtida a partir de Methanosaeta concilii (UniProt/TrEMBL número de acesso: WP_013718460). Homólogos dessas enzimas, incluindo enzimas que têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e até mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a acetil-CoA sintase de Methanosaeta concilii supracitada, também são úteis nas presentes composições e métodos. Em outras modalidades, a presente levedura modificada não tem acetil-CoA sintase aumentada.

[0064] Em algumas modalidades, as presentes leveduras modificadas podem incluir, adicionalmente, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de desidrogenase acetaldeído de acetilação dependente de NAD+ e/ou um gene heterólogo que codifica um piruvato-formato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da trajetória de glicerol é descrita, por exemplo, na Patente no U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). Em algumas modalidades, a presente levedura não tem um gene heterólogo que codifica acetaldeído desidrogenase de acetilação dependente de NAD+ e/ou que codifica uma piruvato-formato liase.

[0065] Em algumas modalidades, a presente levedura modificada compreende, ainda, uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma trajetória biossintética de isobutanol. A trajetória biossintética de isobutanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidroxi-isovalerato; (c) 2,3-di-hidroxi-isovalerato em 2- cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. A trajetória biossintética de isobutanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di- hidróxi-ácido desidratase, cetoisovalerato descarboxilase e álcool desidrogenase.

[0066] Em algumas modalidades, as leveduras modificadas que compreendem uma trajetória biossintética de butanol compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato descarboxilase. A levedura pode compreender uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato descarboxilase. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que tem atividade de piruvato descarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C. Em outras modalidades, as presentes células de levedura modificadas não compreendem, ainda, uma trajetória biossintética de butanol.

[0067] A presente levedura modificada pode incluir qualquer número de genes de interesse adicionais que codificam proteínas de interesse, incluindo marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidratos e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitações, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transquetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma β-glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma α- amilase, uma β-amilase, uma glucoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. As proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e, de outro modo, modificadas. IV. Uso da levedura modificada para maior produção de álcool

[0068] A presente levedura e métodos de uso da mesma incluem métodos para aumentar a produção de álcool em reações de fermentação. Tais métodos não se limitam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a presente levedura geneticamente modificada seja uma substituição "imprevista" para levedura convencional em qualquer instalação de fermentação de álcool. Embora seja principalmente destinada à produção de etanol combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja. V. Levedura adequada para modificação

[0069] A levedura é um micro-organismo eucariota unicelular classificado como membro do reino fungus e inclui organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Várias cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tal como alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhantes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, como glucoamilase, α-amilase e celulase. VI. Substratos e produtos

[0070] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboidrato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-de- açúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0071] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, mas não a limitar, as cepas e os métodos.

EXEMPLOS Exemplo 1 Materiais e métodos Preparação de liquefact

[0072] O liquefact (pasta fluida de farinha de milho) foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds FERMGENTM (protease fúngica ácida) 2,5x, 0,33 de GAU/g ds de TrGA (glucoamilase de Trichoderma) e 1,46 SSU/g ds de AKAA (α-amilase de Aspergillus), ajustada a um pH de 5,4. Ensaios de frasco de soro:

[0073] 2 ml de YPD em placas de 24 poços foram inoculados com células de levedura e as culturas puderam se desenvolver de um dia para o outro a um OD entre 25 a 30. 2,5 ml de liquefact foram transferidos para frascos de soro (Chemglass, nº de catálogo: CG-4904- 01) e a levedura foi adicionada a cada frasco a um OD final de cerca de 0,4 a 0,6. As tampas dos frascos foram instaladas e perfuradas com agulha (BD, nº de catálogo: 305111) para ventilação (para liberar CO2), então, incubadas a 32 °C com agitação a 200 RPM por 65 horas. Ensaios de AnKom:

[0074] 300 µl da cultura de levedura concentrada durante a noite foram adicionados a cada um dentre os inúmeros recipientes ANKOM preenchidos com 50 g de liquefact preparado (consultar acima) para uma OD final de 0,3. As garrafas foram, então, incubadas a 32 °C com agitação a 150 RPM por 65 horas. Análise por HPLC:

[0075] As amostras das culturas de ampolas de soro e ensaios AnKom foram coletadas em tubos de Eppendorf por centrifugação por 12 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram filtrados com o uso de filtros de PTFE de 0,2 µM e, então, usados para análise de HPLC (Agilent Technologies, série 1200) com as seguintes condições: colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H, temperatura de funcionamento de 55 °C. 0,6 ml/min de fluxo isocrático 0,01 N de H 2SO4, 2,5 µl de volume de injeção. Padrões de calibração foram usados para quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. Todos os valores são expressos em g/l. Exemplo 2 Construtos para superexpressão de um transportador mediado por ATP específico para glicose com otimização de códon

[0076] O gene para transportador mediado por ATP específico para glicose 9 de Arabidopsis thaliana (AtSTP9) sofreu otimização de códon e foi, então, sintetizado para gerar AtSTP9S. As sequências de aminoácidos e nucleotídeos de AtSTP9S e seu produto de expressão, AtSTP9S, são mostradas abaixo como a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO 2, respectivamente.

[0077] Sequência de nucleotídeos do gene AtSTP9S (SEQ ID NO: 1):

ATGGCTGGTGGTGCCTTTGTCTCCGAAGGTGGCGGTGGAGGCAA CTCTTACGAAGGTGGCGTTACCGTCTTTGTTATCATGACCTGTATT GTTGCCGCTATGGGAGGTTTGCTATTTGGTTACGACTTGGGTATC TCTGGCGGTGTCACCTCTATGGAAGAGTTCTTGTCCAAGTTTTTCC CAGAAGTTGACAGACAAATGCACGAAGCCAGACGTGAAACTGCTT ACTGCAAGTTCGATAACCAATTGCTACAATTGTTCACCTCTTCCTT GTACTTGGCTGCCTTAGTCTCTTCCTTTGTTGCTTCTGCTGTCACC AGAAAGTACGGTAGAAAGATTTCCATGTTTGTTGGTGGCGTCGCT TTCTTGATCGGTTCTTTGTTCAACGCCTTTGCTACCAACGTTGCTA TGTTGATCATTGGTAGATTGCTATTGGGTGTCGGCGTCGGTTTTG CTAATCAATCTACTCCAGTTTACTTGTCCGAAATGGCTCCAGCCAA GATCAGAGGTGCTTTGAACATCGGTTTTCAAATGGCTATCACCATT GGTATCTTGGTTGCCAATTTGATCAACTACGGTACTTCTCAAATGG CTAGAAACGGTTGGAGAGTCTCCTTGGGTTTAGCTGCCGTTCCAG CTGTCGTTATGGTCATCGGTTCCTTTGTCTTGCCAGACACTCCCAA CTCTATGTTGGAAAGAGGCAAGTACGAACAAGCTAGAGAAATGTT GCAAAAGATTCGTGGTGCTGACAACGTTGATGAAGAGTTTCAAGA CTTGTGTGATGCTTGCGAAGCTGCCAAGAAAGTCGAAAACCCTTG GAAGAACATCTTTCAACACGCCAAGTACAGACCAGCTTTGGTTTTC TGTTCTGCTATTCCATTCTTTCAACAGATCACTGGTATCAACGTCA TCATGTTTTACGCTCCAGTTTTGTTCAAGACTTTGGGTTTTGCCGA CGATGCTTCTTTGATTTCCGCTGTCATCACTGGTGCTGTCAATGTT GTCTCTACCTTGGTTTCCATCTACGCTGTTGACAGATACGGTAGAC GTATCTTGTTCTTAGAAGGTGGCATTCAAATGATCATTAGCCAAAT CGTTGTCGGTACCTTGATCGGTATGAAGTTTGGCACCACTGGTTC TGGCACCTTGACTCCAGCTACAGCCGACTGGATTTTGGCTTTCAT CTGTTTGTACGTTGCTGGATTTGCCTGGTCTTGGGGTCCATTGGG TTGGCTAGTTCCATCCGAAATCTGTCCATTGGAAATCAGACCAGCT GGTCAAGCCATCAACGTTTCTGTCAACATGTTCTTTACCTTCTTGA TTGGTCAATTTTTCTTGACTATGTTGTGTCACATGAAGTTTGGTTTG TTTTACTTCTTTGGTGGAATGGTTGCTGTCATGACTGTCTTTATCTA CTTCTTGTTACCAGAAACCAAGGGTGTTCCTATCGAAGAGATGGG CAGAGTCTGGAAGCAACACCCATTCTGGAAGAGATACATTCCAGA CGATGCTGTTATCGGTGGCGGTGAAGAGAACTACGTCAAGGAAGT TTAA

[0078] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo AtSTP9S (SEQ ID NO: 2):

MAGGAFVSEGGGGGNSYEGGVTVFVIMTCIVAAMGGLLFGYDLGIS GGVTSMEEFLSKFFPEVDRQMHEARRETAYCKFDNQLLQLFTSSLYL AALVSSFVASAVTRKYGRKISMFVGGVAFLIGSLFNAFATNVAMLIIGR LLLGVGVGFANQSTPVYLSEMAPAKIRGALNIGFQMAITIGILVANLINY GTSQMARNGWRVSLGLAAVPAVVMVIGSFVLPDTPNSMLERGKYEQ AREMLQKIRGADNVDEEFQDLCDACEAAKKVENPWKNIFQHAKYRP ALVFCSAIPFFQQITGINVIMFYAPVLFKTLGFADDASLISAVITGAVNV VSTLVSIYAVDRYGRRILFLEGGIQMIISQIVVGTLIGMKFGTTGSGTLT PATADWILAFICLYVAGFAWSWGPLGWLVPSEICPLEIRPAGQAINVS VNMFFTFLIGQFFLTMLCHMKFGLFYFFGGMVAVMTVFIYFLLPETKG VPIEEMGRVWKQHPFWKRYIPDDAVIGGGEENYVKEV

[0079] Um cassete de expressão AtSTP9S que consiste em um AtSTP9S sintético (SEQ ID NO: 1) sob o controle de um promotor HXT3 (SEQ ID NO: 3; YDR345C) e terminador FBA1 (SEQ ID NO: 4; YKL060C) foi produzido com o uso de procedimentos padrão.

[0080] A sequência de nucleotídeos do promotor HXT3 é mostrada abaixo como a SEQ ID NO 3:

GGAGGAGGAGCAATGAAATGAAAGGAAAAAAAATACTTTCTTTTTC TTGAAAAAAGAAAAAAATTGTAAGATGAGCTATTCGCGGAACATTC TAGCTCGTTTGCATCTTCTTGCATTTGGTTGGTTTTCAATAGTTCG GTAATATTAACGGATACCTACTATTATCCCCTAGTAGGCTCTTTTC ACGGAGAAATTCGGGAGTGCTTTTTTTCCGTGCGCATTTTCTTAGC TATATTCTTCCAGCTTCGCCTGCTGCCCGGTCATCGTTCCTGTCAC GTAGTTTTTCCGGATTCGTCCGGCTCATATAATACCGCAATAAACA CGGAATATCTCGTTCCGCGGATTCGGTTAAACTCTCGGTCGCGGA TTATCACAGAGAAAGCTTCGTGGAGAATTTTTCCAGATTTTCCGCT TTCCCCGATGTTGGTATTTCCGGAGGTCATTATACTGACCGCCATT ATAATGACTGTACAACGACCTTCTGGAGAAAGAAACAACTCAATAA CGATGTGGGACATTGGAGGCCCACTCAAAAAATCTGGGGACTATA TCCCCAGAGAATTTCTCCAGAAGAGAAGAAAAGTCAAAGTTTTTTT CACTTGGGGGTTGCATATAAATACAGGCGCTGTTTTATCTTCAGCA TGAATATTCCATAATTTTACTTAATA

[0081] A sequência de nucleotídeos do terminador FBA1 é mostrada abaixo como a SEQ ID NO 4:

GTTAATTCAAATTAATTGATATAGTTTTTTAATGAGTATTGAATCTGT TTAGAAATAATGGAATATTATTTTTATTTATTTATTTATATTATTGGT CGGCTCTTTTCTTCTGAAGGTCAATGACAAAATGATATGAAGGAAA TAATGATTTCTAAAATTTTACAACGTAAGATATTTTTACAAAAGCCT AGCTCATCTTTTGTCATGCACTATTTTACTCACGCTTGAAATTAACG GCCAGTCCACTGCGGAGTCATTTCAAAGTCATCCTAATCGATCTAT CGTTTTTGATAGCTCATTTTGGAG

[0082] Uma representação do cassete de expressão AtSTP9S é ilustrada na Figura 1. O plasmídeo pK41Wn-H3SP9, mostrado na Figura 2, inclui um cassete de expressão AtSTP9S integrado a jusante do locus YHL041W do cromossomo de Saccharomyces. A composição funcional e estrutural do plasmídeo pK41Wn-H3SP9 é descrita na Tabela 1. Tabela 1. Elementos funcionais e estruturais do plasmídeo pZK41Wn- H3SP9 Elemento funcional/estrutural Descrição Fragmento "YHL041W3ʹ", a Fragmento de DNA de 78 bp (identificado como jusante do locus YHL041W YHL041W3ʹ na Figura 2) de S. cerevisiae Fragmento "YHL041WM", a Fragmento de DNA de 80 bp (identificado como jusante do locus YHL041W YHL041WM na Figura 2) de S. cerevisiae Gene ColE1 marcador de réplicon Essas sequências não fazem parte do fragmento de e resistência à ampicilina DNA integrado no genoma da levedura Fragmento "YHL041W5ʹ", a Fragmento de DNA de 76-bp (identificado como jusante do locus YHL041W YHL041W5ʹ na Figura 2) Promotor HXT3::AtSTP9s:: O cassete de expressão de AtSTP9s com terminador FBA1 otimização de códon que codifica o transportador específico para glicose mediado por ATP 9, derivado de A. thaliana

[0083] Para facilitar a integração do fragmento SwaI do plasmídeo pZK41Wn-H3SP9 na região a jusante do locus YHL041W em levedura, um plasmídeo (pYRH426; não mostrado) foi construído para expressar a proteína 9 associada a CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interespaçadas Aglomeradas) (Cas9) e um sgRNA específico para a jusante do locus YHL041W específico com o uso da sequência 5ʹ-GCTGATAATACGCTAAACGA-3ʹ; SEQ ID NO: 5). Exemplo 3 Geração de uma cepa de levedura que expressam um transportador mediado por ATP específico para glicose

[0084] A cepa de levedura FERMAX® GOLD (Martrex, Inc., MD, EUA; no presente documento, "FG") foi usada como uma cepa progenitora para introduzir o cassete de expressão AtSTP9S. As células foram transformadas com um fragmento de 2.949 bp de SwaI contendo o cassete de expressão AtSTP9S do plasmídeo pZK41Wn-H3SP9 (Figura 2) e do plasmídeo pYRH426. Um transformante com o fragmento de SwaI de pZK41Wn-H3SP9 integrado a jusante do locus YHL041W foi selecionado e designado como cepa G027.

[0085] A nova cepa de levedura de FG G027 e sua cepa progenitora, FG, foram desenvolvidas em culturas de ampola e seus produtos de fermentação analisados como descrito no Exemplo 1. O desempenho em termos de produção de etanol, glicerol e acetato é mostrado na Tabela 3. Tabela 3. FG versus G027 em ensaios de frasco Cepa Transgene (ou EtOH Glicerol Acetato transgenes) expresso FG nenhuma 142,27 17,17 0,93 G027 AtSTP9s 145,19 17,06 0,92

[0086] A cepa G027 produziu cerca de 2% mais etanol que a cepa progenitora e produziu quantidades similares de glicerol e acetato.

[0087] Para confirmar o desempenho da levedura modificada, as cepas G027 e FG foram analisadas em ensaios AnKom, conforme descrito no Exemplo 1. O desempenho em termos de produção de etanol, glicerol e acetato é mostrado na Tabela 4. Tabela 4. FG versus G027 em ensaios AnKom Cepa Transgene (ou transgenes) EtOH Glicerol Acetato expresso FG nenhuma 138,82 16,01 0,81 G027 AtSTP9s 141,75 16,07 0,82

[0088] O aumento em produção de etanol com a G027 foi de 2,1% em comparação com a progenitora, FG, confirmando os resultados de ensaios de frasco (Tabela 3). A produção de glicerol e acetato foi similar à levedura progenitora. Exemplo 4 Identificação de Homólogos de AtSTP9

[0089] AtSTP9 codifica um transportador mediado por ATP específico para glicose que pertence à superfamília de facilitador principal. Como outros transportadores de açúcar, AtSTP9 compartilha estruturas conservadas, incluindo doze domínios transmembranares e cinco motivos de sequência (Leandro et al. (2009) Yeast Res. 9: 511 a 525). Com o uso da sequência de aminoácidos de AtSTP9 como uma consulta, seis homólogos com mais de 93% de identidade foram encontrados nos bancos de dados públicos. Os homólogos são listados na Tabela 5. Tabela 5. AtSTP9 e homólogos de bancos de dados públicos Nome do Fonte % de Identidade Número de acesso Gene com AtSTP9 ao GenBank AtSTP9 Arabidopsis thaliana (100%) NP_175449 AaSTP9 Arabis alpina 94,4% KFK35926

Nome do Fonte % de Identidade Número de acesso Gene com AtSTP9 ao GenBank AlSTP9 Arabidopsis lyrate 98,1% OJJ99073 BrSTP9 Brassica rapa 93,2% XP_009147845 CrSTP9 Capsella rubella 94,8% XM_006305941 CsSTP9 Camelina sativa 95,2% XM_010463575 EsSTP9 Eutreme salsugineum 93,8% XM_006393101 Exemplo 5 Construtos para expressão de homólogos de transportador mediado por ATP específico para glicose com otimização de códon

[0090] Os seis homólogos selecionados de AtSTP9 (Tabela 5) sofreram otimização de códon e foram, então, sintetizados para gerar os genes AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S e EsSTP9S.

[0091] Conforme foi o caso com o cassete de expressão AtSTP9S, os cassetes de expressão homólogos AtSTP9S estavam sob o controle do promotor HXT3 (SEQ ID NO: 3; YDR345C) e do terminador FBA1 (SEQ ID NO: 4; YKL060C) e integrados em um plasmídeo adequado para propagação. Exemplo 6 Geração de cepas homólogas de AtSTP9 a partir de levedura industrial FERMAXTM Gold

[0092] A cepa FG foi usada como um progenitor para introduzir os cassetes de expressão AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S e EsSTP9S, conforme descrito no Exemplo 2. As leveduras foram transformadas com fragmentos SwaI que continham individualmente os cassetes de expressão AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S e EsSTP9S juntamente com o plasmídeo pYRH426. Um transformante de cada transformação foi selecionado e designado como cepa G304, G286, G293, G296, G300 e G303, respectivamente.

[0093] As novas cepas de levedura de FG e a cepa progenitora, FG, foram desenvolvidas em culturas de ampola e seus produtos de fermentação analisados como descrito no Exemplo 1. O desempenho em termos de produção de etanol, glicerol e acetato é mostrado na Tabela 6. Tabela 6. FG versus G286, G293, G296, G300, G303 e G304 em ensaios de frasco Cepa Transgene expresso EtOH Glicerol Acetato FG nenhuma 135,87 17,21 0,60 G286 AlSTP9S 141,19 18,98 0,81 G293 BrSTP9S 141,49 18,91 0,83 G296 CaSTP9S 138,48 19,42 0,69 G300 CrSTP9S 139,50 18,97 0,72 G303 EsSTP9S 138,24 19,11 0,80 G304 AaSTP9S 138,07 18,91 0,74

[0094] Cada uma das novas cepas de levedura FG produziu mais etanol que o progenitor FG, o que é desejável em termos de desempenho, entretanto, todas as novas cepas FG produziram mais glicerol e acetato, que não são, de modo geral, produtos desejáveis.

[0095] Para confirmar o desempenho de novas cepas FG, as cepas G286, G293, G296, G300, G303, G304, juntamente com FG e G027 (do Exemplo 3), foram analisadas em ensaios de AnKom, conforme descrito no Exemplo 1. O desempenho em termos de produção de etanol, glicerol e acetato é resumido na Tabela 7. Tabela 7. FG versus G027, G286, G293, G296, G300, G303 e G304 em ensaios de AnKom

Cepa Transgene EtOH Glicerol Acetato expresso FG nenhuma 135,51 16,27 0,68 G027 AtSTP9S 138,50 16,43 0,65 G286 AlSTP9S 142,53 18,23 0,75 G293 BrSTP9S 142,27 18,19 0,77 G296 CaSTP9S 142,58 17,06 0,79 G300 CrSTP9S 142,06 18,11 0,76 G303 EsSTP9S 143,16 18,15 0,79 G304 AaSTP9S 142,96 18,20 0,75

[0096] Conforme demonstrado anteriormente (por exemplo, Exemplo 3, Tabela 4), o aumento em produção de etanol com a G027 foi cerca de 2% em comparação com o progenitor, FG, sem a produção de uma quantidade adicional significativa de glicerol e/ou acetato. Os aumentos em produção de etanol com as cepas G286, G293, G296, G300, G303 e G304 foi maior que 4,8% em comparação com o progenitor, mas foram acompanhados pela produção de significativamente mais glicerol e acetato.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, caracterizadas pelo fato de que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma quantidade maior de transportador mediado por ATP específico para glicose em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem durante a fermentação uma quantidade maior de etanol em comparação com a quantidade de etanol produzida pelas células progenitoras sob condições idênticas de fermentação.

2. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um transportador mediado por ATP específico para glicose a um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equivalentes.

3. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar um transportador mediado por ATP específico para glicose.

4. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um gene exógeno que codifica um transportador mediado por ATP específico para glicose.

5. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que o gene exógeno é de um organismo selecionado dentre o grupo que consiste em Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrate, Arabis alpine, Brassica rapa, Capsella rubella, Camelina sativa e Eutreme salsugineus.

6. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 4 ou

5, caracterizadas pelo fato de que o gene exógeno é selecionado dentre o grupo que consiste em AtSTP9, AaSTP9S, AlSTP9S, BrSTP9S, CrSTP9S, CsSTP9S e EsSTP9S.

7. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um promotor mais forte em um gene endógeno que codifica um transportador mediado por ATP específico para glicose.

8. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na produção de etanol é pelo menos cerca de 2%, em comparação com o nível nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

9. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma alteração genética que introduz um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de uma trajetória de fosfocetolase exógena.

10. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de que as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.

11. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil- CoA.

12. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizadas pelo fato de que as células são de um Saccharomyces spp.

13. Método para aumentar a quantidade de etanol produzido por células cultivadas em um substrato de hidrolisado de amido caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir em células de levedura progenitoras uma alteração genética que aumenta a produção de polipeptídeos transportadores mediados por ATP específicos para glicose em comparação com a quantidade produzida nas células progenitoras.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as células não produzem uma quantidade significativa de glicerol adicional em comparação com quantidade produzida pelas células progenitoras.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a produção aumentada dos polipeptídeos transportadores mediados por ATP específicos para glicose aumenta o consumo de ATP nas células.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de amido compreende pelo menos 5 g/l de glicose.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que as células que têm a alteração genética introduzida são as células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.