CN111065648A - 包含葡萄糖特异性、atp介导的转运蛋白的经修饰的酵母 - Google Patents
包含葡萄糖特异性、atp介导的转运蛋白的经修饰的酵母 Download PDFInfo
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Abstract
描述了涉及表达外源或增加量的葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母的组合物和方法。与亲本细胞相比，经修饰的酵母生产增加量的乙醇。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。
Description
技术领域
本发明的组合物和方法涉及具有葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母。与在其他方面相同的酵母相比，经修饰的酵母在淀粉水解产物发酵中产生增加量的乙醇。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。
背景技术
第一代基于酵母的乙醇生产将糖转化为燃料乙醇。全世界酵母的年度燃料乙醇产量为约900亿升(Gombert,A.K.和van Maris.A.J.(2015)Curr.Opin.Biotechnol[生物技术现状].33:81-86)。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为所述生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也将具有巨大的经济影响。
生化方面，葡萄糖向乙醇和二氧化碳的转化是氧化还原中性的，最大理论产率为约51％。然而，在酵母生长过程中，存在过剩的NADH，用于生产甘油以实现氧化还原平衡和渗透保护。目前，从玉米醪液中酵母发酵的用于乙醇生产的工业产率为约45％，因此，有机会将乙醇的产率再增加10％，这可以转化为另外的九十亿升乙醇。除不可避免的二氧化碳外，酵母生物质和甘油是该发酵过程的两个主要副产物。
单糖和其他简单糖是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的首选碳和能量来源(Leandro,M.J.,等人(2009)FEMS Yeast Res[欧洲微生物学会联合会酵母研究].9:511-25)。许多单糖转运蛋白通过促进扩散而起作用，以能量独立的方式使此类分子沿细胞膜上的浓度梯度移动。其他单糖转运蛋白是耗能的，允许糖分子以浓度梯度摄取，与质子的同时运动相结合。此类转运蛋白通常仅在生长培养基中存在有限的糖时才起作用。酿酒酵母中己糖的摄取仅通过约二十种转运蛋白(包括Hxt蛋白)介导的促进扩散而发生(Lagunas,R.(1993)FEMS Microbiol.Rev[欧洲微生物学会联合会微生物学研究].10:229-42)，这些转运蛋白具有不同的动力学特性和调节方式(Reifenberger,E.等人(1997)Eur.J.Biochem[欧洲生物化学杂志].245:324-33)。糖摄取对代谢通量有重要影响(Elbing,K.D.等人(2004)Eur.J.Biochem[欧洲生物化学杂志].271:4855-64)，影响细胞生长、分解代谢抑制、发酵和呼吸(Goffrini等人(2002)J.Bacteriol[细菌学杂志].184:427-32；Barnett,J.A.和Entian,K.D.(2005)Yeast[酵母]22:835-94)。
工程化酵母实现自由能守恒是提高乙醇产率的策略之一(Gombert和van Maris,同上)。酵母的生长需要ATP形式的能量。在假设增加的糖的级分转化为乙醇而不是生物质和甘油的情况下，如果ATP的消耗可以增加，则可以提高糖的乙醇产率，因为必须将更多的糖转化为乙醇和二氧化碳以提供相同量的ATP用于细胞维持。据报道，液泡碱性磷酸酶(Ph08)的过表达提高了乙醇的产率(Semkiv,M.V.等人(2014)BMC Biotechnol[BMC生物技术].14:42)。然而，引入此类非化学计量的ATP消耗(尤其是工业应用)面临的挑战在于，在积极影响与降低的细胞稳健性之间进行微调(Gombert和van Maris,同上)。
酿酒酵母菌株已用ATP介导的蔗糖转运蛋白进行了工程化。在工程化的菌株中，质子挤出所需的ATP降低了蔗糖上的厌氧ATP产率，从而导致乙醇产率提高(Basso,T.O.等人(2011)Met.Eng[代谢工程化].13:694-703)。然而，在当前的乙醇生产工业中，在美国，蔗糖不是主要底物。
将自由能守恒的概念与增加的糖摄取联系起来以增加乙醇产率的机会仍然存在。
发明内容
本发明提供了通过表达葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白来增加酵母中乙醇生产的组合物和方法。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生增加量的葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白，其中在相同发酵条件下与亲本细胞产生的乙醇量相比所述经修饰的细胞在发酵过程中产生增加量的乙醇。
2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括引入核酸的亲本细胞中，所述核酸能够指导葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.在如段落1或2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括引入用于表达葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的表达盒。
4.在如段落1或2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括引入编码葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的外源基因。
5.在如段落4所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述外源基因来自选自下组的生物体，该组由以下组成：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琴叶拟南芥(Arabidopsislyrate)、小花南芥(Arabis alpine)、芜菁(Brassica rapa)、荠菜(Capsella rubella)、亚麻荠(Camelina sativa)、和Eutreme salsugineus。
6.在如段落4或5所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述外源基因选自下组，该组由以下组成：AtSTP9、AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、和EsSTP9S。
7.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括在编码葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的内源基因中引入更强的启动子。
8.在如段落1-7所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比乙醇生产的增加量为至少约2％。
9.在一些实施例中，段落1-8所述的修饰的细胞进一步包含遗传改变，所述遗传改变引入了编码外源磷酸转酮酶途径的多肽的一种或多种多核苷酸。
10.在如段落1-9所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
11.在一些实施例中，如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
12.在如段落1-11中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp.)。
13.在另一方面，提供了一种用于增加生长于淀粉水解产物底物上的细胞的乙醇生产的量的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与亲本细胞中产生的量相比使葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白多肽的生产增加的遗传改变。
14.在如段落13所述的方法的一些实施例中，与亲本细胞产生的量相比，所述细胞不会产生大量另外的甘油。
15.在如段落13或14所述的方法的一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白多肽的增加的生产增加了细胞中的ATP消耗。
16.在段落13-15中任一项所述的方法的一些实施例中，所述淀粉水解产物包含至少5g/L的葡萄糖。
17.在段落13-16中任一项所述的方法的一些实施例中，具有引入的遗传改变的细胞是如段落1-12中任一项所述的经修饰的细胞。
根据包括附图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
附图说明
图1是AtSTP9S表达盒的图谱。
图2是质粒pZK41Wn-H3SP9的图谱。
具体实施方式
I.定义
在详细地描述本发明的酵母和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
如本文所使用的，术语“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。
如本文所使用的，术语“酵母细胞”、酵母菌株、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物体。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物体以及用于生产可饮用醇的生物体，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的，短语“工程化的酵母细胞”、“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”、或相似短语是指包括本文所述的基因修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的缀合。所述定义中还包括，例如，包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他经修饰的多肽。
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”或“同源物”。这类蛋白质可以衍生自不同属和/或物种的生物体，或不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)，或者是人工设计的蛋白质。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的、或通过他们的功能确定的同源物。
如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，该术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:2444；威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics Computer Group)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS 5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人,(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了该比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M'5、N'-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。当生物体包含一个以上相似基因时，通常优选术语“等位基因”，在这种情况下，每个不同的相似基因被称为不同的“等位基因”。
如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型”细胞所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。
如本文所使用的，“表达盒”是指DNA片段，其包括启动子、和氨基酸编码区和终止子(即启动子::氨基酸编码区::终止子)以及允许在细胞中产生编码的多肽所需的其他核酸序列。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然”可互换使用，并且是指自然界发现的基因、蛋白质或菌株，或者由于当前描述的酵母的优点而无意修饰的基因、蛋白质或菌株。
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能被表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性性质等)的蛋白，并且其未被诱变、截短或以其他方式修饰以废除或减少该活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(通常是蛋白)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有减少的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即生物化学途径)，泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间产物的通量的任何基因或化学操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的，表述“发酵结束”是指发酵阶段，其中就固定和可变成本而言，连续发酵的成本超出了连续发酵产生少量另外醇的经济优势。在更一般的意义上，“发酵结束”是指发酵将不再产生大量另外的醇，即不超过约1％的另外醇的点。
如本文所使用的，表达“碳通量”是指碳分子通过代谢途径的周转率。碳通量是由代谢途径中涉及的酶调节的，例如葡萄糖代谢途径和麦芽糖代谢途径。
如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
EC 酶学委员会
EtOH 乙醇
AA α-淀粉酶
GA 葡糖淀粉酶
℃ 摄氏度
bp 碱基对
DNA 脱氧核糖核酸
ds或DS 干固体
g或gm 克
g/L 克/升
H2O 水
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kg 千克
M 摩尔的
mg 毫克
mL或ml 毫升
min 分钟
mM 毫摩尔的
N 正常
nm 纳米
PCR 聚合酶链式反应
ppm 份/百万份
Δ 与缺失有关
μg 微克
μL和μl 微升
μM 微摩尔的
U/g 单位/克
SAPU 分光光度酸蛋白酶单位
SSU 可溶淀粉单元
II.包含葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母
本发明的组合物和方法基于以下发现：过表达葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的经修饰的酵母比在其他方面相同的亲本酵母在淀粉水解产物发酵中产生更多的乙醇。在不限于理论的情况下，据信引入ATP介导的转运蛋白会影响葡萄糖摄取和ATP消耗，导致酵母代谢的所需产物的总体增加。
先前修饰酵母以增加乙醇生产的尝试涉及单糖转运蛋白，该单糖转运蛋白通过促进扩散而摄取单糖，这与能量(ATP)无关。此外，先前的研究表明，过表达促进型酵母单糖转运蛋白可增加糖的摄取和乙醇的生产速率，但不能提高最终乙醇的生产产率。因此，本发明的经修饰的酵母和方法与先前描述的酵母明显不同，因为它们确实涉及被动转运蛋白，并且它们不仅影响生产速率，而且影响乙醇的产率。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白是内源性转运蛋白，通过将编码所述转运蛋白的附加拷贝的核酸序列(例如以表达盒的形式)引入亲本酵母中而导致所述内源性转运蛋白过表达。在一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白是内源性转运蛋白，通过修饰亲本酵母中的内源基因(例如通过引入更强的启动子)而导致所述内源性转运蛋白过表达。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrate)、小花南芥(Arabis alpine)、芜菁(Brassica rapa)、荠菜(Capsella rubella)、亚麻荠(Camelinasativa)、Eutreme salsugineus、或相关生物体。在一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白被选自以下的基因编码：AtSTP9、AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、和EsSTP9S。在一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白是AtSTP9、AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、EsSTP9S、结构或功能上相似的蛋白质或同源蛋白质。
在一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白来自拟南芥，例如，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白表达盒的存在导致乙醇生产增加至少0.5％、至少1.0％、至少1.5％、至少2.0％、至少2.1％、至少2.5％、至少3.0％、至少4.0％、至少4.5％、至少4.8％、或更多。在一些实施例中，葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白表达盒的存在不会另外导致甘油生产的显著增加，例如，小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或甚至小于1％的甘油生产的增加。在一些实施例中，葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白表达盒的存在不会另外导致乙酸生产的显著增加，例如，小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或甚至小于1％的乙酸生产的增加。在一些实施例中，葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白表达盒的存在会导致乙酸生产的减少。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母和方法与涉及高溶解固体和高葡萄糖浓度(即葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白通常在酵母代谢中不起作用的条件)的发酵有关。在一些实施例中，所述葡萄糖浓度为至少5g/L、至少10g/L、至少20g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、至少60g/L、至少70g/L、至少80g/L、至少90g/L、或甚至至少100g/L。发酵过程中的峰值葡萄糖水平通常为100-120g/L(10％-12％w/v)。
III.影响醇生产的另外的突变
本发明的经修饰的酵母可以进一步包括，或明确排除导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为乙酰辅酶A。这避免了乙酸对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产率的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(Methanosaetaconcilii)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。在其他实施例中，本发明经修饰的酵母不具有增加的乙酰辅酶A合酶。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母还可包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。在一些实施例中，本发明的酵母不具有编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶和/或编码丙酮酸甲酸酯裂解酶的异源基因。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。所述异丁醇生物合成途径可能包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸盐至乙酰乳酸盐；(b)乙酰乳酸盐至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。所述异丁醇生物合成途径可能包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。所述酵母在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中可能包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，所述酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。在其他实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞没有进一步包含丁醇生物合成途径。
本发明的经修饰的酵母可包括任何数量的编码目的蛋白的另外的目的基因，所述目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。
IV.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途
本发明的酵母及其使用方法包括在发酵反应中增加醇生产的方法。此类方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品。虽然主要旨在用于燃料乙醇生产，但是本发明的酵母也可以用于生产可饮用酒精，包括葡萄酒和啤酒。
V.适合修饰的酵母
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物体。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、克鲁维酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购获得的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，例如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和纤维素酶。
VI.底物和产物
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。
鉴于本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制菌株和方法。
实例
实例1
材料与方法
液化物制备：
液化物(玉米粉浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM(酸性真菌蛋白酶)2.5x、0.33GAU/g ds TrGA(木霉(Trichoderma)葡糖淀粉酶)以及1.46SSU/g dsAKAA(曲霉(Aspergillus)α-淀粉酶)，调整至pH 5.4来制备。
血清瓶测定：
向在24孔板中的2mL YPD接种酵母细胞，并且使培养物生长过夜以至25-30之间的OD。将2.5mL液化液转移至血清小瓶(Chemglass公司，目录号：CG-4904-01)，并将酵母添加至每个小瓶中至最终OD为约0.4-0.6。安装小瓶的盖并用针(BD公司，目录号305111)刺穿以用于通风(以释放CO2)，然后在200RPM振荡下在32℃孵育65小时。
AnKom测定：
将300μL浓缩的酵母过夜培养物添加到填充有50g制备的液化物(参见上述)的多个ANKOM瓶中的每个，以达到0.3的最终OD。然后将所述瓶在150RPM振荡下在32℃孵育65小时。
HPLC分析：
通过在14,000RPM下离心12分钟在Eppendorf管中采集来自血清瓶和AnKom测定的培养物的样品。将上清液用0.2μM PTFE过滤器过滤，并且然后在以下条件下用于HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)分析：Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，运行温度为55℃。0.6ml/min等度流速，0.01N H2SO4，2.5μl注射体积。使用校准标准物用于定量乙酸、乙醇、甘油、和葡萄糖。所有值以g/L表达。
实例2
用于密码子优化、葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白过表达的构建体来自拟南芥的葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白9的基因(AtSTP9)经过密码子优化，然后合成以生成AtSTP9S。AtSTP9S及其表达产物AtSTP9S的核苷酸和氨基酸序列分别显示为如下SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。
AtSTP9S基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：
ATGGCTGGTGGTGCCTTTGTCTCCGAAGGTGGCGGTGGAGGCAACTCTTACGAAGGTGGCGTTACCGTCTTTGTTATCATGACCTGTATTGTTGCCGCTATGGGAGGTTTGCTATTTGGTTACGACTTGGGTATCTCTGGCGGTGTCACCTCTATGGAAGAGTTCTTGTCCAAGTTTTTCCCAGAAGTTGACAGACAAATGCACGAAGCCAGACGTGAAACTGCTTACTGCAAGTTCGATAACCAATTGCTACAATTGTTCACCTCTTCCTTGTACTTGGCTGCCTTAGTCTCTTCCTTTGTTGCTTCTGCTGTCACCAGAAAGTACGGTAGAAAGATTTCCATGTTTGTTGGTGGCGTCGCTTTCTTGATCGGTTCTTTGTTCAACGCCTTTGCTACCAACGTTGCTATGTTGATCATTGGTAGATTGCTATTGGGTGTCGGCGTCGGTTTTGCTAATCAATCTACTCCAGTTTACTTGTCCGAAATGGCTCCAGCCAAGATCAGAGGTGCTTTGAACATCGGTTTTCAAATGGCTATCACCATTGGTATCTTGGTTGCCAATTTGATCAACTACGGTACTTCTCAAATGGCTAGAAACGGTTGGAGAGTCTCCTTGGGTTTAGCTGCCGTTCCAGCTGTCGTTATGGTCATCGGTTCCTTTGTCTTGCCAGACACTCCCAACTCTATGTTGGAAAGAGGCAAGTACGAACAAGCTAGAGAAATGTTGCAAAAGATTCGTGGTGCTGACAACGTTGATGAAGAGTTTCAAGACTTGTGTGATGCTTGCGAAGCTGCCAAGAAAGTCGAAAACCCTTGGAAGAACATCTTTCAACACGCCAAGTACAGACCAGCTTTGGTTTTCTGTTCTGCTATTCCATTCTTTCAACAGATCACTGGTATCAACGTCATCATGTTTTACGCTCCAGTTTTGTTCAAGACTTTGGGTTTTGCCGACGATGCTTCTTTGATTTCCGCTGTCATCACTGGTGCTGTCAATGTTGTCTCTACCTTGGTTTCCATCTACGCTGTTGACAGATACGGTAGACGTATCTTGTTCTTAGAAGGTGGCATTCAAATGATCATTAGCCAAATCGTTGTCGGTACCTTGATCGGTATGAAGTTTGGCACCACTGGTTCTGGCACCTTGACTCCAGCTACAGCCGACTGGATTTTGGCTTTCATCTGTTTGTACGTTGCTGGATTTGCCTGGTCTTGGGGTCCATTGGGTTGGCTAGTTCCATCCGAAATCTGTCCATTGGAAATCAGACCAGCTGGTCAAGCCATCAACGTTTCTGTCAACATGTTCTTTACCTTCTTGATTGGTCAATTTTTCTTGACTATGTTGTGTCACATGAAGTTTGGTTTGTTTTACTTCTTTGGTGGAATGGTTGCTGTCATGACTGTCTTTATCTACTTCTTGTTACCAGAAACCAAGGGTGTTCCTATCGAAGAGATGGGCAGAGTCTGGAAGCAACACCCATTCTGGAAGAGATACATTCCAGACGATGCTGTTATCGGTGGCGGTGAAGAGAACTACGTCAAGGAAGTTTAA
AtSTP9S多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
MAGGAFVSEGGGGGNSYEGGVTVFVIMTCIVAAMGGLLFGYDLGISGGVTSMEEFLSKFFPEVDRQMHEARRETAYCKFDNQLLQLFTSSLYLAALVSSFVASAVTRKYGRKISMFVGGVAFLIGSLFNAFATNVAMLIIGRLLLGVGVGFANQSTPVYLSEMAPAKIRGALNIGFQMAITIGILVANLINYGTSQMARNGWRVSLGLAAVPAVVMVIGSFVLPDTPNSMLERGKYEQAREMLQKIRGADNVDEEFQDLCDACEAAKKVENPWKNIFQHAKYRPALVFCSAIPFFQQITGINVIMFYAPVLFKTLGFADDASLISAVITGAVNVVSTLVSIYAVDRYGRRILFLEGGIQMIISQIVVGTLIGMKFGTTGSGTLTPATADWILAFICLYVAGFAWSWGPLGWLVPSEICPLEIRPAGQAINVSVNMFFTFLIGQFFLTMLCHMKFGLFYFFGGMVAVMTVFIYFLLPETKGVPIEEMGRVWKQHPFWKRYIPDDAVIGGGEENYVKEV
使用标准程序制备由在HXT3启动子(SEQ ID NO:3；YDR345C)和FBA1终止子(SEQID NO:4；YKL060C)的控制下的合成的AtSTP9S(SEQ ID NO:1)组成的AtSTP9S表达盒。
HXT3启动子的核苷酸序列如以下SEQ ID NO:3所示：
GGAGGAGGAGCAATGAAATGAAAGGAAAAAAAATACTTTCTTTTTCTTGAAAAAAGAAAAAAATTGTAAGATGAGCTATTCGCGGAACATTCTAGCTCGTTTGCATCTTCTTGCATTTGGTTGGTTTTCAATAGTTCGGTAATATTAACGGATACCTACTATTATCCCCTAGTAGGCTCTTTTCACGGAGAAATTCGGGAGTGCTTTTTTTCCGTGCGCATTTTCTTAGCTATATTCTTCCAGCTTCGCCTGCTGCCCGGTCATCGTTCCTGTCACGTAGTTTTTCCGGATTCGTCCGGCTCATATAATACCGCAATAAACACGGAATATCTCGTTCCGCGGATTCGGTTAAACTCTCGGTCGCGGATTATCACAGAGAAAGCTTCGTGGAGAATTTTTCCAGATTTTCCGCTTTCCCCGATGTTGGTATTTCCGGAGGTCATTATACTGACCGCCATTATAATGACTGTACAACGACCTTCTGGAGAAAGAAACAACTCAATAACGATGTGGGACATTGGAGGCCCACTCAAAAAATCTGGGGACTATATCCCCAGAGAATTTCTCCAGAAGAGAAGAAAAGTCAAAGTTTTTTTCACTTGGGGGTTGCATATAAATACAGGCGCTGTTTTATCTTCAGCATGAATATTCCATAATTTTACTTAATA
FBA1终止子的核苷酸序列如以下SEQ ID NO:4所示：
GTTAATTCAAATTAATTGATATAGTTTTTTAATGAGTATTGAATCTGTTTAGAAATAATGGAATATTATTTTTATTTATTTATTTATATTATTGGTCGGCTCTTTTCTTCTGAAGGTCAATGACAAAATGATATGAAGGAAATAATGATTTCTAAAATTTTACAACGTAAGATATTTTTACAAAAGCCTAGCTCATCTTTTGTCATGCACTATTTTACTCACGCTTGAAATTAACGGCCAGTCCACTGCGGAGTCATTTCAAAGTCATCCTAATCGATCTATCGTTTTTGATAGCTCATTTTGGAG
AtSTP9S表达盒的示意图如图1所示。如图2所示，质粒pK41Wn-H3SP9在酵母染色体YHL041W基因座的下游包括整合的AtSTP9S表达盒。质粒pK41Wn-H3SP9的功能和结构组成在表1中描述。
表1.质粒pZK41Wn-H3SP9的功能和结构元件
为了促进质粒pZK41Wn-H3SP9的SwaI片段整合到酵母中YHL041W基因座的下游区域，构建了质粒(pYRH426；未显示)以表达CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)相关蛋白9(Cas9)和对YHL041W基因座下游特异的sgRNA，使用序列5′-GCTGATAATACGCTAAACGA-3′；SEQ ID NO:5)。
实例3
表达葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的酵母菌株的产生
将
GOLD酵母菌株(玛翠公司(Martrex,Inc.)，马里兰州，美国；本文称为“FG”)用作亲本菌株以引入AtSTP9S表达盒。用含有来自质粒pZK41Wn-H3SP9(图2)的AtSTP9S表达盒的2,949bp SwaI片段和质粒pYRH426转化细胞。选择一种在YHL041W基因座的下游整合有来自pZK41Wn-H3SP9的SwaI片段的转化体，并将其命名为菌株G027。
将新的FG酵母菌株G027和其亲本菌株FG一起在小瓶培养物中生长，并且其发酵产物如实例1中所述进行分析。关于乙醇、甘油和乙酸生产的性能在表3中示出。
表3.小瓶测定中FG与G027的比较
菌株G027生产的乙醇比亲本菌株多约2％，并生产相似量的甘油和乙酸。
为了证实经修饰的酵母的性能，如实例1中所述，在AnKom测定中分析了菌株G027和FG。关于乙醇、甘油和乙酸生产的性能在表4中示出。
表4.AnKom测定中FG与G027的比较
与亲本FG相比，G027的乙醇生产增加了2.1％，证实了小瓶测定的结果(表3)。甘油和乙酸的生产与亲本酵母相似。
实例4
鉴定AtSTP9的同源物
AtSTP9编码葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白，该转运蛋白属于主要的促进子超家族。与其他糖转运蛋白一样，AtSTP9有保守的结构，包括十二个跨膜结构域和五个序列基序(Leandro等人(2009)Yeast Res[酵母研究].9:511-25)。使用AtSTP9的氨基酸序列作为查询，在公共数据库中发现了六个同一性超过93％的同源物。同源物列于表5中。
表5.AtSTP9和来自公共数据库中的同源物
实例5
用于密码子优化的、葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白同源物的表达的构建体
对AtSTP9的六个选择的同源物(表5)进行密码子优化，然后合成以生成AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、和EsSTP9S基因。
与AtSTP9S表达盒一样，AtSTP9S同源表达盒在HXT3启动子(SEQ ID NO:3；YDR345C)和FBA1终止子(SEQ ID NO:4；YKL060C)的控制下，并整合到合适的质粒中进行繁殖。
实例6
从工业酵母FERMAXTM Gold产生AtSTP9同源菌株
如实例2中所述，使用FG菌株作为亲本引入AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、和EsSTP9S表达盒。用分别包含AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、和EsSTP9S表达盒的SwaI片段以及质粒pYRH426转化酵母。从每个转化中选择一个转化体，分别命名为菌株G304、G286、G293、G296、G300和G303。
将新的FG酵母菌株和亲本菌株FG一起在小瓶培养物中生长，并且其发酵产物如实例1中所述进行分析。关于乙醇、甘油和乙酸生产的性能在表6中示出。
表6.小瓶测定中FG与G286、G293、G296、G300、G303和G304的比较
| 菌株 | 表达的转基因 | EtOH | 甘油 | 乙酸 |
| FG | 无 | 135.87 | 17.21 | 0.60 |
| G286 | AlSTP9S | 141.19 | 18.98 | 0.81 |
| G293 | BrSTP9S | 141.49 | 18.91 | 0.83 |
| G296 | CaSTP9S | 138.48 | 19.42 | 0.69 |
| G300 | CrSTP9S | 139.50 | 18.97 | 0.72 |
| G303 | EsSTP9S | 138.24 | 19.11 | 0.80 |
| G304 | AaSTP9S | 138.07 | 18.91 | 0.74 |
每一种新的FG酵母菌株产生的乙醇比FG亲本更多，这在性能上是可取的，然而，所有新的FG菌株均产生更多的甘油和乙酸，这通常不是理想的产物。
如实例1中所述，为了证实新的FG菌株的性能，在AnKom测定中分析了菌株G286、G293、G296、G300、G303、G304以及FG和G027(来自实例3)。关于乙醇、甘油和乙酸生产的性能在表7中总结出。
表7.AnKom测定中FG与G027、G286、G293、G296、G300、G303和G304的比较
| 菌株 | 表达的转基因 | EtOH | 甘油 | 乙酸 |
| FG | 无 | 135.51 | 16.27 | 0.68 |
| G027 | AtSTP9S | 138.50 | 16.43 | 0.65 |
| G286 | AlSTP9S | 142.53 | 18.23 | 0.75 |
| G293 | BrSTP9S | 142.27 | 18.19 | 0.77 |
| G296 | CaSTP9S | 142.58 | 17.06 | 0.79 |
| G300 | CrSTP9S | 142.06 | 18.11 | 0.76 |
| G303 | EsSTP9S | 143.16 | 18.15 | 0.79 |
| G304 | AaSTP9S | 142.96 | 18.20 | 0.75 |
如先前所证明的(例如，实例3，表4)，与亲本FG相比，G027的乙醇生产增加了约2％，而没有大量另外的甘油和/或乙酸的生产。与亲本相比，G286、G293、G296、G300、G303和G304菌株的乙醇生产增加了4.8％以上，但同时甘油和乙酸的生产也显著增加。
Claims (17)
1.衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生增加量的葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白，其中在相同发酵条件下与亲本细胞产生的乙醇量相比所述经修饰的细胞在发酵过程中产生增加量的乙醇。
2.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括将核酸引入亲本细胞中，所述核酸能够指导葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.如权利要求1或2所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括引入用于表达葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的表达盒。
4.如权利要求1或2所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括引入编码葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的外源基因。
5.如权利要求4所述的经修饰的细胞，其中所述外源基因来自选自下组的生物体，该组由以下组成：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrate)、小花南芥(Arabis alpine)、芜菁(Brassica rapa)、荠菜(Capsella rubella)、亚麻荠(Camelinasativa)、和Eutreme salsugineus。
6.如权利要求4或5所述的经修饰的细胞，其中所述外源基因选自下组，该组由以下组成：AtSTP9、AaSTP9S、AlSTP9S、BrSTP9S、CrSTP9S、CsSTP9S、和EsSTP9S。
7.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括在编码葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白的内源基因中引入更强的启动子。
8.如权利要求1-7中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比乙醇生产的增加量为至少约2％。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含遗传改变，所述遗传改变引入了编码外源磷酸转酮酶途径的多肽的一种或多种多核苷酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
12.如权利要求1-11中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞属于酵母属物种。
13.用于增加生长于淀粉水解产物底物上的细胞的乙醇生产的量的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与亲本细胞中产生的量相比使葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白多肽的生产增加的遗传改变。
14.如权利要求13所述的方法，其中与亲本细胞产生的量相比，所述细胞不会产生大量另外的甘油。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述葡萄糖特异性、ATP介导的转运蛋白多肽的增加的生产增加了所述细胞中的ATP消耗。
16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述淀粉水解产物包含至少5g/L的葡萄糖。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中具有引入的遗传改变的细胞是如权利要求1-12中任一项所述的经修饰的细胞。
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