CN110177801B - 具有改善的醇生产的酵母 - Google Patents

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Abstract

本文描述了与酵母细胞相关的组合物和方法，所述酵母细胞具有产生增强的胁迫耐受性和/或增加的醇生产的基因突变。此类酵母非常适合用于醇生产以减少发酵时间和/或增加产量。

Description

具有改善的醇生产的酵母
优先权
本申请要求2016年11月9日提交的美国临时申请序列号62/419,786的优先权，将其通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明的菌株和方法涉及具有基因突变的酵母，所述基因突变产生增强的胁迫耐受性和/或增加的醇生产。此类酵母非常适合用于醇生产以减少发酵时间和/或增加产量。
背景技术
许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区)，仅仅在美国，2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。
丁醇是一种重要的工业化学品和滴入燃料(drop-in fuel)组分，其具有多种应用，包括作为可再生燃料添加剂、塑料工业中的原料化学品、以及食品和香料工业中的食品级提取剂的用途。因此，对醇(例如丁醇和异丁醇)以及有效和环境友好的生产方法有很高的需求。
鉴于世界上生产的大量醇，即使发酵生物的效率的极小提高也可导致可用醇量的巨大增加。因此，存在对更有效地生产醇的生物的需要。
发明内容
描述了涉及具有增强的胁迫耐受性和/或能够增加醇生产的经修饰的酵母细胞的方法。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变使得经修饰的细胞与亲本细胞相比产生了减少量的功能性Dls1多肽，其中所述经修饰的细胞在发酵过程中(i)在相同发酵温度下产生与亲本细胞相比增加量的醇和/或(ii)在更高发酵温度下产生与亲本细胞相比相同量的醇。
2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括在所述亲本细胞中存在的YJL065c基因的破坏。
3.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏是所述YJL065c基因全部或部分缺失的结果。
4.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏是包含所述YJL065c基因的基因组DNA的部分缺失的结果。
5.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏是所述YJL065c基因诱变的结果。
6.在如段落2-5中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏与在所述YJL065c基因的遗传基因座处引入目的基因组合进行。
7.在如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞不产生功能性Dls1多肽。
8.在如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞不产生Dls1多肽。
9.在一些实施例中，如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞还包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
10.在一些实施例中，如段落1-9中任一项所述的经修饰的细胞还包含在所述甘油途径和/或所述乙酰辅酶A途径中的改变。
11.在一些实施例中，如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞还包含用于制备乙醇的备选途径。
12.在一些实施例中，如段落1-11中任一项所述的经修饰的细胞还包含用于制备丁醇的途径。
13.在如段落1-12中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp.)。
14.在另一方面，提供了用于生产经修饰的酵母细胞的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入遗传改变，与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少或阻止了功能性Dls1多肽的产生，从而产生经修饰的细胞，所述经修饰的细胞在发酵过程中(i)在相同发酵温度下产生与亲本细胞相比增加量的醇和/或(ii)在更高发酵温度下产生与亲本细胞相比相同量的醇。
15.在如段落14所述的方法的一些实施例中，所述遗传改变包括通过遗传操作破坏所述亲本细胞中的YJL065c基因。
16.在如段落14或15所述的方法的一些实施例中，所述遗传改变包括使用遗传操作使所述亲本细胞中的YJL065c基因缺失。
17.在如段落14-16中任一项所述的方法的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏与在所述YJL065c基因的遗传基因座处引入目的基因组合进行。
18.在如段落14-17中任一项所述的方法的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏与在所述甘油途径和/或所述乙酰辅酶A途径中进行改变组合进行。
19.在如段落14-18中任一项所述的方法的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏与添加用于制备乙醇的备选途径组合进行。
20.在如段落14-19中任一项所述的方法的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏与添加用于制备丁醇的途径组合进行。
21.在如段落14-20中任一项所述的方法的一些实施例中，所述YJL065c基因的破坏与引入编码碳水化合物加工酶的外源基因组合进行。
22.在如段落14-21中任一项所述的方法的一些实施例中，所述经修饰的细胞来自酵母属物种。
23.在如段落14-22中任一项所述的方法的一些实施例中，所述醇是乙醇和/或丁醇。
24.在另一方面，提供了通过如段落14-23中任一项所述的方法产生的经修饰的酵母细胞。
根据包括附图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
附图说明
图1是示出酵母产异丁醇菌(isobutanologen)菌株A和B的以克/升/小时(g/L/h)计的估计的单位体积率(volumetric rate)的图。菌株B包括YJL065c基因缺失。
图2是示出酵母产异丁醇菌菌株A和B的瞬时异丁醇生产率(以克/升/小时(g/L/h)计)的图。
具体实施方式
I.概述
本发明的组合物和方法涉及经修饰的酵母细胞，所述经修饰的酵母细胞相比它们的亲本细胞具有增强的胁迫耐受性和/或增加的醇生产。当用于醇生产时，经修饰的细胞允许在更高的温度下进行发酵，导致产生给定量的醇所需的时间量减少和/或在给定的发酵体积下醇生产增加。这些优点中的任何一个或两者都允许醇生产者在更短的时间内制备更多的醇，从而增加供世界消费的醇供应。
II.定义
在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。
如本文所使用的，“丁醇”是指单独的丁醇异构体1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、和/或异丁醇(也称为2-甲基-1-丙醇)或其混合物。
如本文所使用的，“酵母细胞”酵母菌株，或简称“酵母”是指来自子囊菌门和担子菌门的生物。示例性酵母是来自酵母目的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的，短语“基本上无活性”或相似短语意指特定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N末端到C末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经自然地或通过干预被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰是例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分轭合。该定义中还包括，例如，包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白被认为是“相关的蛋白”。此类蛋白可衍生自不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，该术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的三级、二级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白诱导与参考蛋白相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，将同源蛋白工程化以产生具有所希望活性的酶。
序列之间的同源性程度可使用本领域已知的任何适合方法来确定(参见例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:2444；程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学电脑集团(Genetics ComputerGroup),威斯康星州麦迪逊)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA；和Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。该方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS 5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用的算法的另一个实例是由Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:5873-87)描述的BLAST算法。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人,(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了该比对的灵敏度与速度。该BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M’5、N’-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
空位开放罚分：10.0
空位延伸罚分：0.05
蛋白质权重矩阵：BLOSUM系列
DNA权重矩阵：IUB
延迟发散序列％：40
空位分隔距离：8
DNA转换权重：0.50
列表亲水残基：GPSNDQEKR
使用负性矩阵：关
切换特殊残基罚分：开
切换亲水罚分：开
切换结束空位分隔罚分关。
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽实质上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白或菌株。
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且可以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的，“基因缺失”是指该基因从宿主细胞的基因组中除去。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止宿主细胞中细胞产生功能性基因产物(例如，蛋白)的基因或化学操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
如本文所使用的，“主要遗传决定子”是指基因或其遗传操作，所述基因或其遗传操作对于在不存在其他基因或其遗传操作的情况下赋予特定表型是必要和充分的。然而，特定基因对于赋予特定表型是必要和充分的，这并不排除通过进一步的遗传操作可以实现对表型产生另外的作用的可能性。
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性性质等)的蛋白，并且其未被诱变、截短或以其他方式修饰的废除或减少该活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(通常是蛋白)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以防止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白质/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以防止产生特定蛋白质”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即生物化学途径)，泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间产物的通量的任何基因或化学操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有降低的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对降低的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间产物相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的，单数冠词“一种(a)”、“一种(an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文结合在此。除非另有说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
℃ 摄氏度
AA α-淀粉酶
bp 碱基对
DNA脱氧核糖核酸
DP 聚合度
ds或DS 干固体
EtOH 乙醇
g或gm 克
g/L 克每升
GA 葡糖淀粉酶
GAU/g ds 葡糖淀粉酶单元/克干固体
H2O 水
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kg 千克
M 摩尔
mg 毫克
mL或ml 毫升
ml/min 毫升每分钟
mM 毫摩尔
N正常
nm 纳米
PCR 聚合酶链式反应
ppm 份/百万份
SAPU/g ds 蛋白酶单元/克干固体
SSCU/g ds 真菌α-淀粉酶单元/克干固体
Δ与缺失有关
μg 微克
μL和μl微升
μM 微摩尔
III.具有降低的或消除的Dls1活性的经修饰的酵母细胞
在一方面，提供了经修饰的酵母细胞，该经修饰的酵母具有遗传改变，所述遗传改变使得经修饰的菌株的细胞与相应的亲本细胞相比产生减少量的功能性Dls1多肽(可替代地称为Dls1p或YJL065c多肽)。Dls1是ISW2酵母染色质可及性复合物(yCHRAC)的具有167个氨基酸的多肽亚基，所述复合物含有Isw2、Itc1、Dpb3样亚基(Dls1)和Dpb4(参见，例如，Peterson,C.L.(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.[遗传学与发育的最新观点]6:171-75以及Winston,F.和Carlson,M.(1992)Trends Genet.[遗传学趋势]8:387-91)。
申请人已经发现，具有影响Dls1功能的遗传改变的酵母在醇发酵过程中呈现出增加的稳健性，以允许更高温度和可能更短的发酵。更短的发酵时间允许醇生产设施在给定的时间段内进行更多的发酵，以提高生产率。更短的发酵时间和更高的发酵温度还降低了发酵过程中污染的风险，并且取决于环境条件，减少了冷却发酵反应以维持酵母活力的需要。与亲本细胞相比，经修饰的酵母细胞在升高的发酵温度下也产生增加量的醇。显然所希望的是增加的醇生产，因为这提高了醇生产设施的产量，并且代表了对起始植物材料更好的碳利用。不受理论限制，据信，减少或消除酵母细胞中功能性Dls1的量导致了ISW2/yCHRAC(其影响与耐热性和增加的醇耐受性相关的环境胁迫反应基因)功能的改变。
功能性YJL065c蛋白量的减少可能是由于亲本菌株中存在的YJL065c基因的破坏。因为YJL065c基因的破坏是赋予经修饰的细胞耐热性和增加的醇生产表型的主要遗传决定子，因此，在一些实施例中，经修饰的细胞仅需要包含破坏的YJL065c基因，而所有其他基因可以保持完整。在其他实施例中，与衍生经修饰的细胞的亲本细胞相比，所述经修饰的细胞可任选地包括另外的遗传改变。虽然此类另外的遗传改变不是赋予所述表型所必需的，但它们可赋予经修饰的细胞其他的优点。
YJL065c基因的破坏可以使用基本上阻止功能性YJL065c基因产物(即Dls1)表达的任何适合方法进行。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失YJL065c基因，包括完全或部分缺失例如Dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或其他调节元件；以及使包含YJL065c基因任何部分的染色体部分的完全或部分缺失。破坏YJL065c基因的具体方法包括在YJL065c基因的任何部分(例如，Dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或插入。优选地，缺失、插入和/或取代(统称为突变)通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作来进行，与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。尽管如此，理论上，化学诱变可用于破坏YJL065c基因。
YJL065c基因突变可降低YJL065c启动子的效率、降低YJL065c增强子的效率、干扰YJL065c mRNA的剪接或编辑、干扰YJL065c mRNA的翻译、将终止密码子引入YJL065c编码序列以防止全长tYJL065c蛋白的翻译、改变Dls1蛋白的编码序列以产生活性更低或无活性的蛋白或减少Dls1与其他核蛋白成分或DNA的相互作用、将Dls1蛋白的编码序列改变以产生更不稳定的蛋白质或靶向蛋白质进行破坏、导致Dls1蛋白质错误折叠或被错误修饰(例如，通过糖基化)、或干扰Dls1蛋白的细胞运输。在一些实施例中，这些和其他遗传操作用于减少或阻止功能性Dls1蛋白的表达，或减少或阻止Dls1的正常生物活性。
在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞包括减少或阻止功能性Dls1蛋白表达的基因操作，或者减少或阻止Dls1的正常生物活性的基因操作；以及减少或阻止功能性Isw2、Itc1或Dpb4蛋白表达的另外的突变，或者减少或阻止Isw2、Itc1或Dpb4蛋白的正常生物活性的另外的突变。在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞包括减少或阻止功能性Dls1蛋白表达的基因操作，或者减少或阻止Dls1的正常生物活性的基因操作；而不具有减少或阻止功能性Isw2、Itc1或Dpb4蛋白表达的另外的突变，或者减少或阻止Isw2、Itc1或Dpb4蛋白的正常生物活性的另外的突变。
在一些实施例中，经修饰的细胞的功能性Dls1多肽的量的减少是与在同样条件下生长的亲本细胞中的功能性Dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性Dls1蛋白的表达的减少是与在同样条件下生长的亲本细胞中的功能性Dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。
在一些实施例中，经修饰的细胞中醇的增加是与在同样条件下生长的亲本细胞中产生的醇量相比，至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或更多的增加。
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作进行YJL065c基因的破坏，与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码选择性标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。
示例性酿酒酵母Dls1多肽的氨基酸序列如下SEQ ID NO:1所示：
基于NCBI蛋白质数据库的BLAST搜索，SEQ ID NO:1的氨基酸序列与其他已知的酵母属物种Dls1多肽之间的关系如表1所示：
表1.与其他酿酒酵母Dls1多肽相比的SEQ ID NO:1
来自酿酒酵母S288c的Dls1p多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相同。来自表1的Dls1多肽的氨基酸序列如下所示：
Dls1p[酿酒酵母VL3](SEQ ID NO:2)：
Dls1p[酿酒酵母YJM1549](SEQ ID NO:3)：
Dls1p[酿酒酵母YJM689](SEQ ID NO:4)：
Dls1p[酿酒酵母YJM681](SEQ ID NO:5)：
Dls1p[酿酒酵母YJM195](SEQ ID NO:6)：
Dls1p[酿酒酵母FostersO](SEQ ID NO:7):
Dls1p[酿酒酵母YJM555](SEQ ID NO:8)：
Dls1p[酿酒酵母YJM1326](SEQ ID NO:9)：
Dls1p[酿酒酵母YJM1355](SEQ ID NO:10)：
Dls1p[酿酒酵母YJM270](SEQ ID NO:11)：
Dls1p[酿酒酵母YJM470](SEQ ID NO:12)：
DLS1样蛋白[库德里阿兹威酵母IFO 1802](SEQ ID NO:13)：
DLS1样蛋白[真贝酵母](SEQ ID NO:14)：
Dls1p[酿酒酵母x库德里阿兹威酵母VIN7](SEQ ID NO:15)：
Dls1p[S.arboricola H-6](SEQ ID NO:16)：
如图1中的序列比对(使用具有默认参数的Clustal W进行)所示，氨基酸SEQ IDNO:1也与McIlwain,S.J.等人((2016)G3(贝塞斯达)6:1757-66；参见G3杂志网站上可获得的表S3)中提到的Dls1/YJL065c多肽具有99.4％的同一性。KZV10208的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:17)所示：
值得注意的是McIlwain,S.J.等人没有将Dls1/YJL065c多肽或YJL065c基因鉴定为与胁迫耐受性(包括耐热性)或醇生产有关。
基于此类BLAST和Clustal W数据，显然示例性酿酒酵母Dls1多肽(SEQ ID NO:1)与其他已知酿酒酵母Dls1多肽以及来自其他酵母属物种的Dls1多肽具有非常高程度的序列同一性。因此，完全预期本发明的组合物和方法适用于含有此类结构相似的多肽、以及其他相关的蛋白质、同源物和功能相似的多肽的酵母细胞。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，以生产水平改变了的Dls1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或17的氨基酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或17具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，被破坏的YJL065c基因编码Dls1蛋白，所述Dls1蛋白与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或17的氨基酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如，与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或17具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
本文提供的氨基酸序列信息容易地允许技术人员鉴定任何酵母中的Dls1蛋白和编码Dls1蛋白的核酸序列，并在YJL065c基因中产生适当的破坏以影响Dls1蛋白的产生。
IV.减少的Dls1与影响醇生产的另外突变的组合
在一些实施例中，除了遗传改变(其导致经修饰的菌株的细胞与相应的亲本细胞相比产生减少量的功能性Dls1蛋白)之外，本发明的经修饰的细胞还包括编码目的蛋白的任何数量的另外的目的基因。
在组合物和方法的特定实施例中，用于制备乙醇的替代性人工途径是引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因的结果。示例性磷酸转酮酶可以从阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_016786789)获得。示例性磷酸转乙酰酶可以从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_003641060)获得。
本发明的经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知这些突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一种或多种来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为Ac-CoA。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产量的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因导入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从鬃毛甲烷菌(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、和甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞还可包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱组合的此类基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺失编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞还包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，该丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，该异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下组的底物至产物的转化，该组由以下组成：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，该异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞还包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞还在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一种或多种内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。
V.减少的Dls1与另外的目的蛋白的组合
在一些实施例中，除了遗传改变(与相应的亲本细胞相比，导致经修饰的菌株的细胞产生减少量的功能性Dls1蛋白)之外，任选地与有益于醇生产的其他遗传修饰的组合，本发明的经修饰的酵母细胞还包括任何数量的编码目的蛋白的另外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，这些遗传操作导致功能性Dls1蛋白的表达降低。
目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶和其他商业上相关的多肽，其包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。
VI.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途
本发明的组合物和方法包括在发酵反应中使用经修饰的酵母提高醇生产效率的方法。与使用亲本细胞进行的其他等效发酵相比，这些方法包括在升高的温度下，和任选地，更短的时间段内进行发酵。例如，使用经修饰的酵母细胞的发酵可以在高于用于亲本酵母细胞的发酵温度1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或甚至7℃或更多下进行，其条件是经修饰的酵母能够与亲本酵母在参考温度制备的相比，在升高的温度下制备至少相同量的醇。与使用亲本酵母所需的发酵时间量相比，更高温度的发酵可任选地运行持续所述时间的99％、97％、95％、90％、85％、80％或更少，其条件是经修饰的酵母能够与亲本酵母在参考温度和时间制备的相比，在升高的温度下制备至少相同量的醇。
可替代地，这些方法包括与使用亲本细胞进行的其他等效发酵相比，在大约相同的温度下和大约相同的时间长度内进行发酵，其中在等同的条件下，经修饰的酵母细胞产生比亲本酵母多至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、或甚至至少5％的醇。
经修饰的酵母在升高的温度下进行发酵，在更短的时间段内进行发酵以及在常规发酵条件下增加醇产量的优点可以组合以最大化对特定醇生产设施的益处。
在一些实施例中，可以在发酵之前从发酵培养基中除去固体。在一些实施例中，原位分离技术(ISPR)可用于从发酵中除去产物醇，因为产物醇由微生物产生。在美国专利申请号2014/0073820和美国专利申请号2015/0267225中描述了从发酵液中除去固体以及生产和回收醇的方法。
VII.适合修饰的酵母细胞
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，其包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种、Lachancea属物种和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所希望的特征，例如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。
VIII.底物和产物
从许多糖类底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶和化学条件以及机械方法的无数变化和改进也是如此。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。
醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
鉴于本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制菌株和方法。
实例
实例1.酿酒酵母中YJL065c的缺失
进行遗传筛选以鉴定耐热性的酿酒酵母突变体，其能够在升高的温度(即37℃对32℃)下改善生长，并且鉴定并选择了许多候选基因用于进一步测试(数据未示出)。选择用于进一步分析的基因之一是YJL065c，其编码Dls1。Dls1的氨基酸序列在以下作为SEQ IDNO:1提供。
使用标准酵母分子生物学技术，通过缺失Dls1的基本上完整的编码序列，即通过缺失在酿酒酵母的起始密码子之前的4个碱基对到两个等位基因的终止密码子之前的10个碱基对的核酸序列来破坏YJL065c基因。所有程序均基于可公开获得的YJL065c的核酸序列，其在下文作为SEQ ID NO:18(5'至3')提供：
ATGAACAACGAGACTAGTGGTAAAGAAACGGCGTCTGCACCTCTGTGTTCGCCCAAGTTACCTGTAGAAAAAGTGCAGAGAATAGCCAAGAATGATCCAGAATATATGGACACTTCGGATGACGCATTCGTAGCCACAGCGTTTGCTACAGAATTCTTCGTCCAGGTGCTGACACATGAGTCCCTACATAGGCAACAGCAGCAGCAACAACAACAGGTACCGCCGCTCCCAGATGAACTCACGCTGTCGTACGATGACATCTCTGCCGCAATTGTGCACTCTTCTGACGGCCATCTGCAGTTTTTGAATGATGTGATACCAACAACAAAGAATTTGAGGCTTCTAGTGGAAGAAAACCGAGTTAGATATACTACAAGTGTCATGCCCCCTAATGAAGTTTACTCCGCCTATGTGGTGAACGATACGGCTCCGAAGCCCAACATTGTCGAGATTGATCTTGATAATGACGAAGACGACGACGAAGACGTTACTGATCAAGAATAA。
用于制备经修饰的酵母细胞的宿主酵母是可商购的FERMAXTM Gold(玛翠公司(Martrex,Inc.)，美国明尼苏达州查斯卡)。通过菌落PCR确认YJL065c基因的缺失。将经修饰的酵母在非选择性培养基中培养以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。
实例2：经修饰的酵母的乙醇生产
在32℃、35℃和37℃液化物中，以及在表1中所示的温度缓慢升高条件下，测试了具有基因YJL065c缺失的酵母(即YCP047)与基准酵母(即FERMAXTM Gold，本文为“FG”，其为YJL065c基因的野生型)相比的生产乙醇的能力。液化物(即，玉米面粉浆料，其具有干固体(ds)值为35％)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds AKAA(白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶)在pH 4.8制备。
表1.温度缓慢升高条件
将50克液化物称入250ml容器中，并用来自YCP047菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在不同温度孵育。使用气体监测系统(安卡姆科技公司(ANKOMTechnology))基于随着时间的推移产生CO2带来的累积压力来记录发酵速率。通过离心收集样品，通过0.2μm过滤器过滤，并使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)在55℃通过HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies1200系列))分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果如表2所示。报道了相对于FG菌株的乙醇增加。
表2.用YCP047和FG酵母发酵后发酵液的分析
特别是在升高的温度下，与参考菌株相比，具有基因YJL065c缺失的酵母产生显著更多的乙醇(即，几乎高达5％)。
实例3：表达葡糖淀粉酶的经修饰的酵母的乙醇生产
使用与前述实例中所述相同的条件和程序，测试了具有基因YJL065c缺失并进一步表达前述里氏木霉葡糖淀粉酶的CS4变体的酵母(即YCP119)与基准酵母(即，SYNERXIATMADY，此处为“SA”，其为YJL065c基因的野生型)相比的生产乙醇的能力。分析样品的乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量，并且结果如表3所示。报道了相对于SA菌株的乙醇增加。
表3.用YCP119和SA酵母发酵后发酵液的分析
特别是在升高的温度下，具有基因YJL065c缺失并且还表达GA的酵母与参考菌株相比产生显著更多的乙醇(即，超过5％)。
实例4：具有替代性乙醇途径的经修饰的酵母的乙醇生产
测试了具有基因YJL065c缺失并且进一步包括产生乙醇的备选途径(即，通过表达异源磷酸转酮酶、异源磷酸转乙酰酶和乙酰化乙醛脱氢酶，如国际专利申请WO 2015/148272(Miasnikov等人)中所述)的酵母，与亲本酵母(其包括替代性乙醇途径但不具有基因YJL065c缺失)相比的生产乙醇的能力。在这种情况下，将亲本酵母命名为“G032”，并且将经修饰的酵母命名为“G032-ΔYJL065c”。测定条件和程序如前述实例中所述，不同之处在于仅在上述温度缓慢升高条件下测试了酵母。再次分析样品的乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。结果示于表4中。
表4.用G032酵母发酵后发酵液的分析
如前所述，在具有基因YJL065c缺失的酵母中观察到了增加的乙醇生产。
实例5：在32℃在高干固体中，经修饰的酵母的乙醇生产
在32℃下具有干固体(DS)值为36.6％的液化物中，测试了具有基因YJL065c缺失的酵母(即YCP047)与FG基准酵母相比的生产乙醇的能力。液化物(即，玉米面粉浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds AKAA(白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶)在pH 4.8制备。
将50克液化物称入100ml容器中，并用来自YCP047菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在不同温度孵育。通过离心在48和55小时收集样品，通过0.2μm过滤器过滤，并使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中等度流速为0.6ml/min)在55℃通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的乙醇。分析结果如表5所示。报道了在相同条件下相对于FG菌株的乙醇增加。
表5.用YCP047和FG酵母发酵后发酵液的分析
在32℃下具有更高干固体值的液化物中，与参考菌株相比，具有基因YJL065c缺失的酵母产生显著更多的乙醇(即，高达约2％)。
实例6：在34℃在高干固体中，经修饰的酵母的乙醇生产
在34℃下具有干固体(DS)值为34.4％和35.5％干固体的液化物中，测试了具有基因YJL065c缺失的酵母(即YCP047)与FG基准酵母相比的生产乙醇的能力。液化物(即，玉米面粉浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds AKAA(白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶)在pH 4.8制备。
将50克液化物称入100ml容器中，并用来自YCP047菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在不同温度孵育。通过离心在48和55小时收集样品，通过0.2μm过滤器过滤，并使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中等度流速为0.6ml/min)在55℃通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的乙醇。分析结果如表5所示。报道了在相同条件下相对于FG菌株的乙醇增加。
表6.用YCP047和FG酵母发酵后发酵液的分析
在34℃下具有更高DS值的液化物中，与参考菌株相比，具有基因YJL065c缺失的酵母产生显著更多的乙醇(即，高达约2％)。
实例7：经修饰的酵母的丁醇生产
用于构建含用于产生异丁醇的异源途径的重组酿酒酵母(即产异丁醇菌)的方法描述于美国专利号9,422,581、9,169,467和8,409,834以及美国专利申请公开号2014/0051133和2014/0093930中，将这些参考文献中的每一个通过引用以其全文结合。
将产异丁醇菌工程化以含有异源异丁醇途径，该途径由以下组成：乙酰乳酸合酶、酮醇酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶基因(本文称为“菌株A”)。如上所述，通过使菌株A中的基因YJL065c缺失构建另外的酵母菌株(本文称为“菌株B”)。
使用过滤的玉米醪培养基和50％(w/v)玉米油脂肪酸作为提取溶剂，使产异丁醇菌菌株A(单一分离物)和B(分离物1和2)在32℃下在配备有ANKOM RF气体生产系统(安卡姆科技公司，纽约州马斯顿(Macedon NY))的玻璃瓶中生长48小时。添加葡糖淀粉酶以将淀粉转化为葡萄糖。通过使用ANKOM系统测量逐步形成的二氧化碳来估计异丁醇的产生。
与不含基因YJL065c缺失的菌株A相比，含有基因YJL065c缺失的菌株B在更高的异丁醇水溶液浓度(图2)下呈现出更高的单位体积生产率(图1)。

Claims (15)

1.一种衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含所述亲本细胞中存在的YJL065c基因的破坏，其中所述亲本细胞中存在的YJL065c基因的破坏是使YJL065c基因缺失的遗传操作的结果，使得所述经修饰的细胞与所述亲本细胞相比产生减少量的功能性Dls1多肽，其中所述经修饰的细胞在发酵过程中 (i) 在相同发酵温度下产生与亲本细胞相比增加量的醇和/或 (ii) 在更高发酵温度下产生与亲本细胞相比相同量的醇，
其中，所述经修饰的酵母细胞是酿酒酵母（S. cerevisiae）且还包含：
(a) 用于制备乙醇的替代性途径，其包含异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因；或
(b) 丁醇生物合成途径，其是异丁醇生物合成途径，包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下组的底物至产物的转化，该组由以下组成：(i) 丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) 乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(iii) 2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(iv)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(v) 异丁醛至异丁醇。
2.如权利要求1所述的经修饰的酵母细胞，其中所述YJL065c基因的破坏是(a) 所述YJL065c基因全部或部分缺失的结果；或(b) 包含所述YJL065c基因的基因组DNA的部分缺失的结果。
3.如权利要求1所述的经修饰的酵母细胞，其中所述YJL065c基因的破坏是所述YJL065c基因的破坏与在所述YJL065c基因的遗传基因座处引入目的基因组合进行。
4.如权利要求1所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞不产生功能性Dls1多肽，或其中所述细胞不产生Dls1多肽。
5.如权利要求1所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞还包含编码葡糖淀粉酶的外源基因。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
7.一种用于生产经修饰的酵母细胞的方法，所述方法包括：破坏亲本酵母细胞中的YJL065c基因，其中所述破坏亲本酵母细胞中的YJL065c基因是使YJL065c基因缺失的遗传操作的结果，与所述亲本细胞相比，所述破坏减少或阻止了功能性Dls1多肽的产生，从而产生经修饰的细胞，所述经修饰的细胞在发酵过程中 (i) 在相同发酵温度下产生与亲本细胞相比增加量的醇和/或 (ii) 在更高发酵温度下产生与亲本细胞相比相同量的醇，其中进行所述YJL065c基因的破坏与以下的组合：
(a) 添加用于制备乙醇的替代性途径，其包含异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因；或
(b) 添加丁醇生物合成途径，其是异丁醇生物合成途径，包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下组的底物至产物的转化，该组由以下组成：(i) 丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(iii) 2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(iv)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(v) 异丁醛至异丁醇；
其中所述经修饰的细胞是酿酒酵母。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述YJL065c基因的破坏是使用遗传操作使所述亲本细胞中的YJL065c基因缺失的结果，且其中进行所述YJL065c基因的破坏与以下的组合：
(a) 在所述YJL065c基因的遗传基因座处引入目的基因；和／或
(b)引入编码葡糖淀粉酶的外源基因。
9.如权利要求 7或8所述的方法，其中
(a) 所述醇是乙醇和/或异丁醇；或
(b) 所述丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
10.在发酵反应中使用经修饰的酵母提高醇生产效率的方法，其中所述经修饰的酵母细胞衍生自亲本酵母细胞，所述经修饰的细胞包含所述亲本细胞中存在的YJL065c基因的破坏，其中所述亲本细胞中存在的YJL065c基因的破坏是使YJL065c基因缺失的遗传操作的结果，使得所述经修饰的细胞与所述亲本细胞相比产生减少量的功能性Dls1多肽，其中所述经修饰的细胞在发酵过程中 (i) 在相同发酵温度下产生与亲本细胞相比增加量的醇和/或 (ii) 在更高发酵温度下产生与亲本细胞相比相同量的醇，其中所述经修饰的酵母细胞是酿酒酵母。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述YJL065c基因的破坏是
(a) 所述YJL065c基因全部或部分缺失的结果；和／或
(b) 包含所述YJL065c基因的基因组DNA的部分缺失的结果。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述YJL065c基因的破坏是与在所述YJL065c基因的遗传基因座处引入目的基因组合进行。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞不产生功能性Dls1多肽，或其中所述细胞不产生Dls1多肽。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含
(a) 编码葡糖淀粉酶的外源基因；和／或
(b) 用于制备乙醇的替代性途径，其包含异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因；或
(c) 丁醇生物合成途径，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下组的底物至产物的转化，该组由以下组成：(i) 丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) 乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(iii) 2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(iv)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(v)异丁醛至异丁醇。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述(c) 丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019025784A2 (pt) * 2017-06-06 2020-07-07 Danisco Us Inc. levedura com produção de álcool melhorada
CN111727196A (zh) * 2017-10-24 2020-09-29 丹尼斯科美国公司 具有改善的醇生产的酵母
WO2020146357A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-16 Danisco Us Inc Hybrid yeast with increased ethanol production
EP3938381A1 (en) * 2019-03-14 2022-01-19 Danisco US Inc. Over-expression of cytochrome b2 in yeast for increased ethanol production
CA3144631A1 (en) * 2019-06-24 2020-12-30 Danisco Us Inc Disruption of cdc42 effectors in yeast for increased alcohol and lysine production
EP4022076A1 (en) 2019-08-29 2022-07-06 Danisco US Inc. Expression of beta-glucosidase in yeast for improved ethanol production
WO2024123691A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Danisco Us Inc. Increased ethanol production by yeast in high dissolved solids

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1929753A (zh) * 2004-01-13 2007-03-14 麦斯特味公司 衍生自烟熏调味剂的低味抗微生物剂
WO2015148272A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Danisco Us Inc. Altered host cell pathway for improved ethanol production
WO2016019337A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 PATRA, Biranchi Narayan Compositions for improving cells and organisms
CN105814191A (zh) * 2013-08-15 2016-07-27 拉勒曼德匈牙利流动管理有限责任公司 通过甘油回收改进微生物中的产物产率和生产的方法
CN110741014A (zh) * 2017-06-06 2020-01-31 丹尼斯科美国公司 具有改善的醇生产的酵母

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2060632A1 (en) 2007-10-29 2009-05-20 Technische Universität Berlin Method of modifying a yeast cell for the production of ethanol
EP2277989A1 (en) 2009-07-24 2011-01-26 Technische Universiteit Delft Fermentative glycerol-free ethanol production
US9175315B2 (en) 2010-06-18 2015-11-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation
KR20140092759A (ko) * 2011-03-24 2014-07-24 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 숙주 세포 및 아이소부탄올의 제조 방법
US8956851B2 (en) 2011-04-05 2015-02-17 Lallemand Hungary Liquidity Management, LLC Methods for the improvement of product yield and production in a microorganism through the addition of alternate electron acceptors
MX2014013446A (es) 2012-05-11 2014-12-08 Butamax Advanced Biofuels Llc Enzimas de cetol-acido reductoisomerasa y metodos de uso.
US9605281B2 (en) 2012-09-12 2017-03-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the fermentative production of alcohols
US9512408B2 (en) 2012-09-26 2016-12-06 Butamax Advanced Biofuels Llc Polypeptides with ketol-acid reductoisomerase activity
US20150267225A1 (en) 2012-10-11 2015-09-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1929753A (zh) * 2004-01-13 2007-03-14 麦斯特味公司 衍生自烟熏调味剂的低味抗微生物剂
CN105814191A (zh) * 2013-08-15 2016-07-27 拉勒曼德匈牙利流动管理有限责任公司 通过甘油回收改进微生物中的产物产率和生产的方法
WO2015148272A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Danisco Us Inc. Altered host cell pathway for improved ethanol production
WO2016019337A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 PATRA, Biranchi Narayan Compositions for improving cells and organisms
CN110741014A (zh) * 2017-06-06 2020-01-31 丹尼斯科美国公司 具有改善的醇生产的酵母

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Disruption of Six ORFs on Saccharomyces cerevisiae Chromosome X: the YJL069c Gene of Unknown Function is Essential to Cell Viability;MICHELINE VANDENBOL等;《YEAST》;19991230;摘要，第1412页左栏第4段，第1414页左栏第3段，表3 *
Identification of novel genes responsible for ethanol and/or thermotolerance by transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae;Hyun-Soo Kim等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20110510;第1159-1172页 *
Improvement of the multiple-stress tolerance of an ethanologenic Saccharomyces cerevisiae strain by freeze-thaw treatment;Pingying Wei等;《Biotechnol Lett.》;20070531;第1501-1508页 *
酵母蛋白质YJL084c的磷酸化分析;石晓钟等;《生物化学与生物物理学报》;20020831;第433-438页 *

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