BR112019025784A2 - levedura com produção de álcool melhorada - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a composições e métodos relacionados a células de levedura que têm uma mutação genética que dá origem ao aumento de produção de álcool. Tal levedura é bem adequada para uso na produção de álcool para reduzir o tempo de fermentação e/ou aumentar os rendimentos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LEVEDURA COM PRODUÇÃO DE ÁLCOOL MELHORADA".
[001] As presentes cepas e métodos referem-se à levedura que tem uma mutação genética que resulta em aumento de produção de etanol. Tal levedura é bem adequada para uso na produção de álcool para reduzir o tempo de fermentação e/ou aumentar os rendimentos.
[002] Muitos países produzem álcool combustível a partir de substratos fermentáveis, tais como amido de milho, cana-de-açúcar, mandioca e melaço. De acordo com a Associação de Combustíveis Renováveis (Washington DC, Estados Unidos), a produção de etanol combustível em 2015 chegou perto de 15 bilhões de galões apenas nos Estados Unidos.
[003] Butanol é um importante produto químico industrial e componente de combustível de substituição com uma variedade de aplicações, incluindo o uso como um aditivo de combustível renovável, um insumo químico na indústria de plásticos e um extrator de grau alimentar na indústria alimentícia e de aromas. Consequentemente, há uma alta demanda por álcoois, tais como butanol e isobutanol, bem como por métodos de produção eficazes e ecológicos.
[004] São descritos métodos relacionados a células de levedura modificadas com capacidade para aumentar a produção de álcool. Aspectos e modalidades das composições e métodos são descritos nos parágrafos independentemente numerados a seguir.
[005] Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modificadas derivadas de células de levedura parentais, caracterizadas pelo fato de que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma menor quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional em comparação com as células parentais, caracterizadas pelo fato de que as células modificadas produzem, durante a fermentação, uma maior quantidade de etanol em comparação com as células parentais sob condições de fermentação equivalentes.
[006] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com o parágrafo 1, a alteração genética compreende uma ruptura do gene YDR155c presente nas células parentais.
[007] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com o parágrafo 2, a ruptura do gene YDR155c é o resultado da deleção da totalidade ou de parte do gene YDR155c.
[008] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com o parágrafo 2, a ruptura do gene YDR155c é o resultado da deleção de uma porção do DNA genômico que compreende o gene YDR155c.
[009] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com o parágrafo 2, a ruptura do gene YDR155c é o resultado da mutagênese do gene YDR155c.
[0010] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 2 a 5, a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a introdução de um gene de interesse no locus genético do gene YDR155c.
[0011] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, as células não produzem os polipeptídeos Cpr1 funcionais.
[0012] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, as células não produzem os polipeptídeos Cpr1.
[0013] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.
[0014] Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil- CoA.
[0015] Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.
[0016] Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 11 compreendem, ainda, uma ruptura do gene YJL065 presente nas células parentais.
[0017] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 12, as células não produzem os polipeptídeos Dls1 funcionais.
[0018] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 13, as células são de um Saccharomyces spp.
[0019] Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 14, a quantidade de etanol produzida pelas células de levedura modificadas e células de levedura parentais é medida 24 horas após a inoculação de um substrato de amido hidrolisado compreendendo 34 a 35% de sólidos dissolvidos e com um pH de 4,8 a 5,4.
[0020] Em um outro aspecto, é fornecido um método para produzir uma célula de levedura modificada que compreende a introdução de uma alteração genética em uma célula de levedura parental, cuja alteração genética reduz ou impede a produção de polipeptídeo Cpr1 funcional em comparação com as células parentais, produzindo, assim,
células modificadas que produzem, durante a fermentação, uma maior quantidade de etanol em comparação com as células parentais sob condições de fermentação equivalentes.
[0021] Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 16, a alteração genética compreende romper o gene YDR155c nas células parentais por manipulação genética.
[0022] Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 16 ou 17, a alteração genética compreende a deleção do gene YDR155c nas células parentais com o uso de manipulação genética.
[0023] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 18, a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a introdução de um gene de interesse no locus genético do gene YDR155c.
[0024] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 19, a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a execução de uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.
[0025] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 20, a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a adição de uma trajetória alternativa para a produção de etanol.
[0026] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 21, a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a ruptura do gene YJL065 presente nas células parentais.
[0027] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 22, a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a introdução de um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.
[0028] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 23, a célula modificada é de um Saccharomyces spp.
[0029] Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 24, a quantidade de etanol produzida pelas células de levedura modificadas e células de levedura parentais é medida 24 horas após a inoculação de um substrato de amido hidrolisado compreendendo 34-35% de sólidos dissolvidos e com um pH de 4,8 a 5,4.
[0030] Em um outro aspecto, são fornecidas células de levedura modificadas produzidas pelo método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 25.
[0031] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes células modificadas e métodos serão evidentes a partir da descrição.
DESCRIÇÃO DETALHADA Visão Geral
[0032] As presentes composições e métodos referem-se às células de levedura modificadas que demonstram aumento de produção de etanol em comparação com suas células parentais. Quando usadas para a produção de etanol, as células modificadas permitem rendimentos aumentados e ou tempos de fermentação menores, aumentando, assim, o abastecimento de etanol para o consumo mundial. II. Definições
[0033] Antes de descrever as presentes cepas e métodos em detalhes, os termos a seguir são definidos para maior clareza. Os termos não definidos devem ser reconhecidos por seus significados ordinários, conforme usado na técnica relevante.
[0034] Conforme usado no presente documento, "álcool" refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.
[0035] Conforme usado no presente documento, "butanol" refere- se aos isômeros de butanol 1-butanol, 2-butanol, terc-butanol e/ou isobutanol (também conhecido como 2-metil-1-propanol) individualmente ou como misturas dos mesmos.
[0036] Conforme usado no presente documento, "células de levedura", cepas de levedura ou simplesmente "levedura" referem-se a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccharomycetales. Exemplos específicos de levedura são Saccharomyces spp., incluindo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui organismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cervejas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.
[0037] Conforme usado no presente documento, a frase "células de levedura variantes", "células de levedura modificadas" ou frases similares (consultar o disposto acima) se referem à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.
[0038] Conforme usado no presente documento, a frase "substancialmente isento de uma atividade" ou frases similares significam que uma atividade especificada é indetectável em uma mistura por adição ou está presente em uma quantidade que não interferiria com o propósito pretendido da mistura por adição.
[0039] Conforme usado no presente documento, os termos "polipeptídeo" e "proteína" (e suas respectivas formas plurais) são usados intercambiavelmente para se referir a polímeros de qualquer comprimento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-terminal. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.
[0040] Conforme usado no presente documento, proteínas funcional e/ou estruturalmente similares são consideradas "proteínas relacionadas". Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de diferentes gêneros e/ou espécies, ou até mesmo diferentes classes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos). As proteínas relacionadas abrangem também homólogos determinados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por reatividade cruzada imunológica.
[0041] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína homóloga" se refere a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólogos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Assim, pretende-se que o termo abranja enzimas iguais, similares ou correspondentes (isto é, em termos de estrutura e função) obtidas de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta imunológica similar (ou respostas imunológicas similares) à de uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com a atividade desejada (ou atividades desejadas).
[0042] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, WI); e Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).
[0043] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas com o uso de alinhamentos progressivos em pares. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Parâmetros úteis de PILEUP incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento de lacuna padrão de 0,10 e lacunas finais ponderadas. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo,
Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros "W", "T" e "X" determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M′5, N′-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.
[0044] Conforme usado no presente documento, as frases "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipicamente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em comparação com a sequência de referência (isto é, de tipo selvagem). O percentual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0 Penalidade por extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de sequências divergentes de atraso 40
Distância de separação de lacuna: 8 Peso de transições de DNA: 0,50 Listar resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Uso de matriz negativa: DESLIGADO Alternar penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade de separação de lacuna final DESLIGADO.
[0045] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoácido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substituição conservadora. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).
[0046] Conforme usado no presente documento, o termo "gene" é sinônimo do termo "alelo" em referência a um ácido nucleico que codifica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegetativas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado.
[0047] Conforme usado no presente documento, os termos "tipo selvagem" e "nativo" são usados intercambiavelmente e se referem a proteínas ou cepas de genes encontradas na natureza.
[0048] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de interesse" se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja expresso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável ou semelhantes e pode ser expressa em altos níveis. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno modificado ou um gene heterólogo (isto é, "gene de interesse") em relação à cepa parental. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.
[0049] Conforme usado no presente documento, "deleção de um gene" refere-se a sia remoção do genoma de uma célula hospedeira. Quando um gene inclui elementos de controle (por exemplo, elementos intensificadores) que não estão localizados imediatamente adjacentes à sequência de codificação de um gene, a deleção de um gene se refere à deleção da sequência de codificação e, opcionalmente, elementos intensificadores adjacentes, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, sequências promotoras e/ou terminadoras, mas não requer a deleção de elementos de controle não adjacentes.
[0050] Conforme usado no presente documento, "ruptura de um gene" se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou química, isto é, mutação, que impeça substancialmente que uma célula produza um produto gênico funcional, por exemplo, uma proteína, em uma célula hospedeira. Métodos exemplificativos de ruptura incluem deleção completa ou parcial de qualquer porção de um gene, incluindo uma sequência de codificação de polipeptídeos, um promotor, um intensificador ou um outro elemento regulador, ou mutagênese do mesmo, em que a mutagênese abrange substituições, inserções, deleções, inversões e combinações e variações das mesmas, sendo que qualquer uma das mutações impede substancialmente a produção de um produto gênico funcional. Um gene também pode ser rompido com o uso de RNAi, antissenso ou qualquer outro método que anule a expressão de genes. Um gene pode ser rompido por deleção ou manipulação genética de elementos de controle não adjacentes.
[0051] Conforme usado no presente documento, os termos "manipulação genética" e "alteração genética" são usados intercambiavelmente e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substituição, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.
[0052] Conforme usado no presente documento, um "determinante principalmente genético" se refere a um gene, ou manipulação genética do mesmo, que é necessário e suficiente para conferir um fenótipo especificado na ausência de outros genes, ou manipulações genéticas dos mesmos. Entretanto, o fato de um gene específico ser necessário e suficiente para conferir um fenótipo especificado não exclui a possibilidade de que efeitos adicionais ao fenótipo possam ser alcançados por outras manipulações genéticas.
[0053] Conforme usado no presente documento, um "polipeptídeo/proteína funcional" é uma proteína que possui uma atividade, tal como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade tensoativa ou semelhantes, e que não foi mutagenizada, truncada ou, de outra forma, modificada para anular ou reduzir essa atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser termoestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.
[0054] Conforme usado no presente documento, um "gene funcional" é um gene com capacidade para ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes funcionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para serem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.
[0055] Conforme usado no presente documento, células de levedura foram "modificadas para impedir a produção de uma proteína especificada" se tiverem sido alteradas genética ou quimicamente para impedir a produção de uma proteína/polipeptídeo funcional que exibe uma atividade característica da proteína do tipo selvagem. Tais modificações incluem, porém sem limitação, deleção ou ruptura do gene que codifica a proteína (conforme descrito no presente documento), modificação do gene de modo que o polipeptídeo codificado careça da atividade supracitada, modificação do gene de modo a afetar a estabilidade ou o processamento prós-translacional e combinações das mesmas.
[0056] Conforme usado no presente documento, "atenuação de uma trajetória" ou "atenuação do fluxo através de uma trajetória", isto é, uma trajetória bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipulação genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma trajetória metabólica. A atenuação de uma trajetória pode ser alcançada por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituição de alelos do tipo selvagem desses genes por formas mutantes que codificam enzimas com atividade catalítica reduzida ou maiores valores Km, modificação dos promotores ou outros elementos reguladores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificação genética das enzimas ou do mRNA que codifica essas enzimas para uma diminuição de estabilidade, mau direcionamento de enzimas para compartimentos celulares onde têm menor probabilidade de interagirem com o substrato e intermediários, o uso de RNA de interferência e semelhantes.
[0057] Conforme usado no presente documento, "fermentação aeróbia" refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.
[0058] Conforme usado no presente documento, "fermentação anaeróbica" refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.
[0059] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a menos que especificado de outra forma: °C graus Centígrados AA α-amilase bp pares de bases DNA ácido desoxirribonucleico DP grau de polimerização ds ou DS sólidos secos EtOH etanol g ou gm grama g/l gramas por litro GA glicoamilase GAU/g ds unidades de glicoamilase por grama de sólidos secos H2O água HPLC cromatografia líquida de alto desempenho hr ou h hora kg quilograma M molar mg miligrama mL ou ml mililitro ml/min mililitros por minuto mM milimolar N normal nm nanômetro PCR reação em cadeia de polimerase ppm partes por milhão SAPU/g ds unidades de protease por grama de sólidos secos SSCU/g ds unidades de alfa-amilase fúngica por grama de sólidos secos Δ relacionado a uma deleção μg micrograma μL e µl microlitro μM micromolar III. Células de levedura modificadas que têm atividade de Cpr1 reduzida ou eliminada
[0060] Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modificadas, sendo que a levedura modificada tem uma alteração genética que faz com que as células da cepa modificada produzam uma menor quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional (alternativamente chamado de polipeptídeo Cpr1p ou YDR155c) em comparação com as células parentais fora isso idênticas. Cpr1 é uma peptidil-prolil cis-trans isomerase de 162 aminoácidos que acelera o dobramento de proteínas. Cpr1 se localiza no núcleo e acredita-se que tenha múltiplos papéis na estrutura de cromatina, divisão celular e transporte (Hasumi, H. e Nishikawa, T. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1161: 161 a 167; Brown, C.R. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:48017 a 48026 e Arevalo- Rodriguez, M. e Heitman, J. (2005) Eukaryot. Cell 4:17 a 29.
[0061] Os requerentes constataram que a levedura que tem uma alteração genética que afeta a função de Cpr1 demonstra maior produção de etanol em fermentações, permitindo maiores rendimentos, menores tempos de fermentação ou ambos. Tempos de fermentação mais curtos permitem que as instalações de produção de álcool executem mais fermentação em um determinado período de tempo, aumentando a produtividade. Tempos de fermentação mais curtos e temperaturas de fermentação mais altas também reduzem o risco de contaminação durante uma fermentação e, dependendo das condições ambientes, reduzem a necessidade de resfriar a reação de fermentação para manter a viabilidade da levedura.
[0062] A redução na quantidade de proteína YDR155c funcional pode resultar da ruptura do gene YDR155c presente na cepa parental. Devido à ruptura do gene YDR155c ser um determinante genético primário para conferir fenótipo de produção de etanol aumentado às células modificadas, em algumas modalidades, as células modificadas precisam compreender apenas um gene YDR155c rompido, enquanto todos os outros genes podem permanecer intactos. Em outras modalidades, as células modificadas podem opcionalmente incluir alterações genéticas adicionais em comparação com as células parentais a partir das quais são derivadas. Embora tais alterações genéticas adicionais não sejam necessárias para conferir o fenótipo descrito, as mesmas podem conferir outras vantagens às células modificadas.
[0063] A ruptura do gene YDR155c pode ser realizada com o uso de quaisquer métodos adequados que impeçam substancialmente a expressão de um produto do gene YDR155c funcional, isto é, Cpr1. Métodos exemplificativos de ruptura conforme são conhecidos pelos versados na técnica incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial do gene YDR155c, incluindo a deleção completa ou parcial, por exemplo, da sequência de codificação de Cpr1, do promotor, do terminador, de um intensificador ou de um outro elemento regulador; e deleção completa ou parcial de uma porção do cromossomo que inclui qualquer porção do gene YDR155c. Métodos específicos para romper o gene YDR155c incluem a realização de substituições ou inserções de nucleotídeo em qualquer porção do gene YDR155c, por exemplo, a sequência de codificação de Cpr1, o promotor, o terminador, um intensificador ou um outro elemento regulador. De preferência,
deleções, inserções e/ou substituições (coletivamente denominadas mutações) são realizadas por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. No entanto, a mutagênese química pode, em teoria, ser usada para romper o gene YDR155c.
[0064] As mutações no gene YDR155c podem reduzir a eficácia do promotor de YDR155c, reduzir a eficácia de um intensificador de YDR155c, interferir no splicing ou na edição do mRNA de YDR155c, interferir na tradução do mRNA de YDR155c, introduzir um códon de parada na sequência de codificação de YDR155c para impedir a tradução da proteína tYDR155c de comprimento total, mudar a sequência de codificação da proteína Cpr1 para produzir uma proteína menos ativa ou inativa ou reduzir a interação de Cpr1 com outros componentes da proteína nuclear ou DNA, mudar a sequência de codificação da proteína Cpr1 para produzir uma proteína menos estável ou alvejar a proteína para destruição, fazer com que a proteína Cpr1 seja erroneamente enovelada ou seja incorretamente modificada (por exemplo, por glicosilação) ou interferir no tráfego celular da proteína Cpr1. Em algumas modalidades, essas e outras manipulações genéticas atuam para reduzir ou impedir a expressão de uma proteína funcional Cpr1 ou reduzir ou impedir a atividade biológica normal de Cpr1.
[0065] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Cpr1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Cpr1.
[0066] Em algumas modalidades, a redução da quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%,
pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em comparação à quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional em células parentais cultivadas sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, a redução da expressão de proteína Cpr1 funcional nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em comparação à quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional em células parentais cultivadas sob as mesmas condições.
[0067] Em algumas modalidades, o aumento de álcool nas células modificadas é um aumento de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, ou mais, em comparação à quantidade de álcool produzida em células parentais cultivadas sob as mesmas condições.
[0068] De preferência, a ruptura do gene YDR155c é realizada por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. No entanto, a mutagênese química não é excluída como um método de preparação de células de levedura modificadas.
[0069] Em algumas modalidades, a célula parental que é modificada já inclui um gene de interesse, tal como um gene que codifica um marcador selecionável, uma enzima processadora de carboidratos ou outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, um gene de introduzido é subsequentemente introduzido nas células modificadas.
[0070] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cpr1 de S. cerevisiae exemplificado é mostrada abaixo como a SEQ ID Nº: 1:
[0071] Com base em uma busca BLAST do banco de dados de proteínas do NCBI, o polipeptídeo Cpr1 descrito é 100% idêntico a pelo menos dez depósitos: Tabela 1. SEQ ID Nº: 1 em comparação com outros polipeptídeos Cpr1 de S. cerevisiae Descrição Valor E % de Número de Identidade acesso GenBank Cpr1p [S. cerevisiae S288c] 2,8E-79 100% NP_010439.1 Cpr1p [S. cerevisiae VL3] 2,8E-79 100% EGA87502.1 Cpr1p [S. cerevisiae AVRI796] 2,8E-79 100% EGA75445.1 Cpr1p [S. cerevisiae RM11-1a] 2,8E-79 100% EDV08157.1 Cpr1p [S. cerevisiae Kyokai No.7] 2,8E-79 100% GAA22386.1 Cpr1p [S. cerevisiae JAY291] 2,8E-79 100% EEU04638.1.1 Cpr1p [S. cerevisiae FostersO] 2,8E-79 100% EGA63002.1 Cpr1p [S. cerevisiae YJM789] 2,8E-79 100% EDN60494.1 Cpr1p [S. cerevisiae Vin13] 2,8E-79 100% EGA79484.1 Cpr1p [S. cerevisiae CEN.PK113-7D] 2,8E-79 100% EIW11359.1
[0072] Espera-se que as presentes composições e métodos sejam aplicáveis a outros polipeptídeos Cpr1 estruturalmente similares, bem como outras proteínas relacionadas, homólogos e polipeptídeos funcionalmente similares.
[0073] Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos da proteína Cpr1 que é alterada nos níveis de produção tem um grau especificado de identidade de sequência de aminoácidos total com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, por exemplo, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID Nº: 1.
[0074] Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, o gene YDR155c que é rompido codifica uma proteína Cpr1 que tem um grau especificado de identidade de sequência de aminoácidos total com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, por exemplo, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID Nº: 1.
[0075] As informações da sequência de aminoácidos fornecidas no presente documento permitem prontamente que o versado na técnica identifique uma proteína Cpr1 e a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Cpr1, em qualquer levedura, e faça rupturas apropriadas no gene YDR155c para afetar a produção da proteína Cpr1.
[0076] Em algumas modalidades, a redução da quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em comparação à quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional em células parentais cultivadas sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, a redução da expressão de proteína Cpr1 funcional nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em comparação à quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional em células parentais cultivadas sob as mesmas condições.
[0077] Em algumas modalidades, o aumento de produção de etanol pelas células modificadas, em comparação com células parentais fora isso idênticas, é um aumento de pelo menos 0,2%, pelo menos 0,4%, pelo menos 0,6%, pelo menos 0,8%, pelo menos 1,0%, pelo menos 1,2%, pelo menos 1,4%, pelo menos 1,6%, pelo menos 1,8%, pelo menos 2,0% ou mais. IV. Células de levedura modificadas que têm expressão de Cpr1 reduzida e expressão de Dls1 reduzida
[0078] Em algumas modalidades, além de expressarem quantidades reduzidas de polipeptídeos Cpr1 funcionais, as presentes células de levedura modificadas expressam também quantidades reduzidas de polipeptídeos Dls1 funcionais.
[0079] Dls1, codificada por YJL065c, é uma subunidade de polipeptídeo de 167 aminoácidos do complexo de acessibilidade à cromatina da levedura ISW2 (yCHRAC) que contém Isw2, Itc1, a subunidade semelhante a Dpb3 (Dls1) e Dpb4 (consultar, por exemplo, Peterson, C.L. (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6:171 a 175 e Winston, F. e Carlson, M. (1992) Trends Genet. 8:387 a 391). Os requerentes constataram que a levedura que tem uma alteração genética que reduz a quantidade de Dls1 funcional na célula, na ausência de outras modificações genéticas, exibe maior robustez numa fermentação de álcool, permitindo fermentações a temperatura mais alta e potencialmente mais curtas (dados não mostrados).
[0080] A redução da quantidade de Dls1 funcional produzida em uma célula pode ser conseguida por ruptura do gene YJL065c. A ruptura do gene YJL065c pode ser realizada com o uso de quaisquer métodos adequados que impeçam substancialmente a expressão de um produto do gene YJL065c funcional, isto é, Dls1. Métodos exemplificativos de ruptura conforme são conhecidos pelos versados na técnica incluem, porém sem limitação: deleção completa ou parcial do gene YJL065c, incluindo a deleção completa ou parcial, por exemplo, da sequência de codificação de Dls1, do promotor, do terminador, de um intensificador ou de um outro elemento regulador; e deleção completa ou parcial de uma porção do cromossomo que inclui qualquer porção do gene YJL065c. Métodos específicos para romper o gene YJL065c incluem a realização de substituições ou inserções de nucleotídeo em qualquer porção do gene YJL065c, por exemplo, a sequência de codificação de Dls1, o promotor, o terminador, um intensificador ou um outro elemento regulador. De preferência, deleções, inserções e/ou substituições (coletivamente denominadas mutações) são realizadas por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. No entanto, a mutagênese química pode, em teoria, ser usada para romper o gene YJL065c.
[0081] As mutações no gene YJL065c podem reduzir a eficácia do promotor de YJL065c, reduzir a eficácia de um intensificador de YJL065c, interferir no splicing ou na edição do mRNA de YJL065c, interferir na tradução do mRNA de YJL065c, introduzir um códon de parada na sequência de codificação de YJL065c para impedir a tradução da proteína tYJL065c de comprimento total, mudar a sequência de codificação da proteína Dls1 para produzir uma proteína menos ativa ou inativa ou reduzir a interação de Dls1 com outros componentes da proteína nuclear ou DNA, mudar a sequência de codificação da proteína Dls1 para produzir uma proteína menos estável ou alvejar a proteína para destruição, fazer com que a proteína Dls1 seja erroneamente enovelada ou seja incorretamente modificada (por exemplo, por glicosilação) ou interferir no tráfego celular da proteína Dls1. Em algumas modalidades, essas e outras manipulações genéticas atuam para reduzir ou impedir a expressão de uma proteína funcional Dls1 ou reduzir ou impedir a atividade biológica normal de Dls1.
[0082] Em algumas modalidades, as presentes células modificadas incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Dls1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Dls1, bem como mutações adicionais que reduzem ou impedem a expressão de proteínas funcionais Isw2, Itc1 ou Dpb4 ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de proteínas Isw2, Itc1 ou Dpb4. Em algumas modalidades, as presentes células modificadas incluem manipulações genéticas que reduzem ou impedem a expressão de uma proteína funcional Dls1, ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de Dls1, enquanto não têm mutações adicionais que reduzem ou impedem a expressão de proteínas funcionais Isw2, Itc1 ou Dpb4 ou reduzem ou impedem a atividade biológica normal de proteínas Isw2, Itc1 ou Dpb4.
[0083] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo Dls1 de S. cerevisiae exemplificado é mostrada abaixo como a SEQ ID Nº: 3:
[0084] MNNETSGKET ASAPLCSPKL PVEKVQRIAK
[0085] Com base em tais dados de BLAST e Clustal W, é evidente que o polipeptídeo Dls1 de S. cerevisiae exemplificado (SEQ ID Nº: 3)
compartilha um grau muito alto de identidade de sequência com outros polipeptídeos Dls1 de S. cerevisiae conhecidos, bem como polipeptídeos Dls1 de outro Saccharomyces spp. Portanto, espera-se completamente que as presentes composições e métodos sejam aplicáveis às células de levedura que contêm tais polipeptídeos estruturalmente similares, bem como outras proteínas relacionadas, homólogos e polipeptídeos funcionalmente similares.
[0086] Em algumas modalidades das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos da proteína Dls1 que é afetada tem uma identidade de sequência de aminoácidos total com a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID Nº: 3.
[0087] De preferência, a ruptura do gene YJL065c é realizada por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia molecular específicas de sequência, em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. No entanto, a mutagênese química não é excluída como um método de preparação de células de levedura modificadas.
[0088] Em algumas modalidades, a redução da quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em comparação à quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional em células parentais cultivadas sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, a redução da expressão de proteína Dls1 funcional nas células modificadas é uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, em comparação à quantidade de polipeptídeo Dls1 funcional em células parentais cultivadas sob as mesmas condições.
[0089] Em algumas modalidades, o aumento adicional da produção de etanol pelas células modificadas, em comparação com células que têm apenas a expressão de Cpr1 reduzida, é um aumento de pelo menos 0,2%, pelo menos 0,4%, pelo menos 0,6%, pelo menos 0,8%, pelo menos 1,0%, pelo menos 1,2%, pelo menos 1,4%, pelo menos 1,6%, pelo menos 1,8%, pelo menos 2,0% ou mais. V. Combinação de expressão reduzida de Cpr1 com outras mutações que afetam a produção de álcool
[0090] Em algumas modalidades, além de expressarem quantidades reduzidas de polipeptídeos Cpr1 funcionais, opcionalmente em combinação com expressão reduzida de polipeptídeos Dls1 funcionais, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, modificações adicionais que afetam a produção de etanol.
[0091] Em modalidades particulares, as células de levedura modificadas incluem uma trajetória artificial ou alternativa que resulta da introdução de um gene da fosfocetolase heterólogo e um gene da fosfotransacetilase heterólogo. Uma fosfocetolase exemplificativa pode ser obtida a partir de Gardnerella vaginalis (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_016786789). Uma fosfotransacetilase exemplificativa pode ser obtida a partir de Lactobacillus plantarum (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_003641060).
[0092] As células modificadas podem incluir, ainda, mutações que resultam na atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol nativa, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redução ou eliminação da atividade de glicerol 3- fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase atividade (GPP) dependente de NAD endógeno, por exemplo por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPD1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as patentes Nos U.S. 9.175.270 (Elke et al.),
8.795.998 (Pronk et al.) e 8.956.851 (Argyros et al.).
[0093] A levedura modificada pode apresentar, ainda, um aumento da atividade de acetil-CoA sintase (também denominada acetil-CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido pela hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outro motivo) e convertê-lo em Ac-CoA. Isso evita o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de acetil-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heterólogo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão de um gene endógeno da acetil-CoA sintase e semelhantes. Uma acetil- CoA sintase particularmente útil para a introdução em células pode ser obtida a partir de Methanosaeta concilii (Número de Acesso UniProt/TrEMBL: WP_013718460). Homólogos dessas enzimas, incluindo enzimas que têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e até mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a acetil-CoA sintase de Methanosaeta concilii supracitada, também são úteis nas presentes composições e métodos.
[0094] Em algumas modalidades, as células modificadas podem incluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com atividade de acetaldeído desidrogenase acetilante dependente de NAD+ e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formato liase. A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da trajetória de glicerol é descrita, por exemplo, na patente no U.S. 8.795.998 (Pronk et al.). No entanto, na maioria das modalidades das presentes composições e métodos, a introdução de uma acetaldeído desidrogenase acetilante e/ou uma piruvato-formato liase não é necessária pois a necessidade dessas atividades é anulada pela atenuação da trajetória biossintética nativa de preparação de Ac-CoA que contribui para o desequilíbrio de cofator redox. Assim, modalidades das presentes composições e métodos carecem expressamente de um gene heterólogo (ou genes heterólogos) que codifica uma acetaldeído desidrogenase acetilante, uma piruvato-formato liase ou ambas.
[0095] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas compreendem, ainda, uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma trajetória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidróxi- isovalerato; (c) 2,3-di-hidróxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2- cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redutoisomerase, di-hidróxi- ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxilase e álcool desidrogenase.
[0096] Em algumas modalidades, as células de levedura modificadas que compreendem uma trajetória biossintética de butanol compreendem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mutação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxilase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C.
SEÇÃO GOI VI. Combinação de expressão reduzida de Cpr1 com outras mutações benéficas
[0097] Em algumas modalidades, além de expressarem quantidades reduzidas de polipeptídeos, Cpr1 opcionalmente, em combinação com outras modificações genéticas que beneficiam a produção de álcool, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, qualquer número de genes de interesse adicionais que codificam proteínas de interesse. Genes de interesse adicionais podem ser introduzidos antes, durante ou após manipulações genéticas que resultam na expressão reduzida de polipetídeos Cpr1. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboidratos e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma β-glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma α- amilase, uma β-amilase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e modificadas de outra forma. VII. Células de levedura adequadas para modificação
[0098] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccharomyces spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, Lachancea e Schizosaccharomyces spp. Inúmeras cepas de levedura estão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais coimo alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhantes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, tais como glicoamilase ou α-amilase. VIII. Substratos e produtos
[0099] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboidrato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-de- açúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecânicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.
[00100] Produtos de fermentação de álcool incluem o composto orgânico que tem um grupo funcional hidroxila (-OH) ligado a um átomo de carbono. Álcoois exemplificativos incluem, porém sem limitação, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n- pentanol, 2-pentanol, isopentanol e álcoois superiores. Os álcoois combustíveis mais comumente produzidos são etanol e butanol.
[00101] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, mas não a limitar, as cepas e os métodos.
EXEMPLOS Exemplo 1. Deleção de YDR155c em Saccharomyces cerevisiae
[00102] A triagem genética foi realizada para identificar mutantes de S. cerevisiae com capacidade para a produção de etanol melhorada após 24 horas de fermentação, e inúmeros genes candidatos foram identificados e selecionados para testes adicionais (dados não mostrados). Um dos genes selecionados para análise adicional foi YDR155c, que codifica Cpr1. A sequência de aminoácidos de Cpr1 é fornecida abaixo como a SEQ ID Nº: 1.
[00103] Com o uso de técnicas padrão de biologia molecular de levedura, o gene YDR155c foi rompido deletando-se essencialmente toda a sequência de codificação para Cpr1, isto é, deletando-se a sequência de ácidos nucleicos a partir de 4 pares de bases antes do códon inicial até 10 pares de bases antes do códon de parada em ambos os alelos de S. cerevisiae. Todos os procedimentos se basearam na sequência de ácidos nucleicos publicamente disponível de YDR155c, que é fornecida abaixo como a SEQ ID Nº: 2 (5ʹ a 3ʹ):
[00104] A levedura hospedeira usada para produzir as células de levedura modificadas estava comercialmente disponível em FERMAX™ Gold (Martrex, Inc., Chaska, MN, EUA). A deleção do gene YDR155c foi confirmada por PCR em colônia. A levedura modificada foi cultivada em meio não seletivo para remover o plasmídeo que confere resistência a Canamicina usado para selecionar transformantes, resultando na levedura modificada que não necessitou de quaisquer suplementos de crescimento em comparação com a levedura parental. Exemplo 2: Produção de etanol por levedura modificada com expressão reduzida de Cpr1
[00105] A levedura FG-155c portadora da deleção do gene YDR155c foi testada quanto a sua capacidade para produzir etanol em comparação com a levedura da marca de referência (isto é, FERMAX™ Gold, que é do tipo selvagem para o gene YDR155c) em liquefeito a 32 e 34°C. Liquefeito (isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 34,2%) foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGENTM 2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 1,46 SSCU/g ds de α-amilase de Aspergillus kawachii a pH 4,8.
[00106] 50 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 100 ml e inoculados com culturas frescas cultivadas durante a noite provenientes de colônias da cepa modificada ou cepa FG a 32°C e 34°C. As amostras foram colhidas por centrifugação em 24 e 55 h, filtradas através de filtros de 0,2 µm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com o uso de colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H a 55 °C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Um volume de injeção de amostra de 2,5 µl foi usado. Os padrões de calibração usados para a quantificação incluíram quantidades conhecidas de DP4+, DP3, DP2, DP1, glicerol e etanol. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 2. O aumento de etanol é registrado em referência à cepa FG. Tabela 2. Análise do caldo de fermentação após fermentação por 24 e 55 h Tempo Cepa Temp. Glicose Etanol (g/l) Aumento de etanol em (°C) (g/l) comparação com FG (%) (h) 24 FG 32 44,10 108,35 1* 24 FG-155c 32 34,79 110,22 1,7 24 FG 34 41,12 110,50 1* 24 FG-155c 34 35,13 111,78 1,2 55 FG 32 0 146,62 1* 55 FG-155c 32 0 146,20 1,0 55 FG 34 2,02 144,65 1* 55 FG-155c 34 2,70 142,30 1,0 valor de referência nominal
[00107] A levedura portadora da deleção do gene YDR155c produziu significativamente mais etanol (isto é, quase 1,2 a 1,7%) em comparação com a cepa de referência não modificada a 32°C e 34°C em 24 h.
Exemplo 3. Expressão reduzida de Cpr1 em combinação com expressão reduzida de Dls1
[00108] Um experimento foi realizado para determinar se a redução da quantidade de Cpr1 em combinação com a redução da quantidade de Dls1 (codificado pelo gene YJL065c) em levedura aumenta adicionalmente aumenta tolerância e produção de álcool em comparação com a redução de Cpr1 apenas. Com o uso de técnicas padrão de biologia molecular de levedura, o gene YDR155c foi rompido deletando-se essencialmente toda a sequência de codificação para Cpr1 na levedura hospedeira FG previamente mencionada na qual havia sido realizada a deleção de YJL065c (FG-65c). As leveduras portadoras da deleção de YJL065c e da deleção de Cpr1 (FG-65c-155c) foram testadas quanto a sua capacidade para produzir etanol em comparação com a levedura da marca de referência em liquefeito incubado a 32°C. Liquefeito (isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 34,1%) foi preparado adicionando- se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGENTM 2,5x (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) e 1,46 SSCU/g ds de α-amilase de Aspergillus kawachii a pH 4,8.
[00109] 50 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 250 ml e inoculados com culturas frescas durante a noite provenientes de colônias da cepa FG-65c e FG-65c-155c e incubados a 32°C durante 24 h. Um sistema de monitoramento de gás (ANKOM Technology) foi usado para registrar a taxa de fermentação com base na pressão cumulativa seguindo a produção de CO2 ao longo do tempo. As amostras foram colhidas por centrifugação, filtradas através de filtros de 0,2 µm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com o uso de colunas Bio- Rad Aminex HPX-87H a 55°C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Um volume de injeção de amostra de 2,5 µl foi usado. Os padrões de calibração usados para a quantificação incluíram quantidades conhecidas de DP4+, DP3, DP2, DP1, glicerol e etanol. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 3. O aumento de etanol em 24h é registrado em referência à cepa FG-65c. Tabela 3. Análise do caldo de fermentação durante 24h com levedura FG, FG-65c e FG-65c-155c Temperatura Cepa Glicose Glicerol Etanol Aumento de (g/l) (g/l) etanol (%) (°C) (g/l) 32 FG-65c 51,69 13,01 106,12 1* 32 FG-65c- 44,88 13,57 109,13 2,8 155c 32 FG 52,05 13,08 108,20 - valor de referência nominal
[00110] A levedura portadora da deleção do gene YDR155c além da deleção do gene DLS1 (YJ065c) produziu significativamente mais etanol (isto é, quase 2,8%) em comparação com a cepa portadora da deleção do gene DLS1 apenas em 24 horas. Note que a levedura FG- 65c no final produz mais etanol em 48 horas do que a levedura FG do tipo selvagem (dados não mostrados); no entanto, é relativamente "lenta em começar" e produz menos etanol em 24 horas. A deleção do gene YDR155c, portanto, parece aumentar a taxa de crescimento inicial da levedura FG-65c. Exemplo 4: Produção de etanol por levedura modificada que tem uma trajetória de etanol alternativa
[00111] A levedura portadora da deleção do gene YDR155c e que expressa, ainda, uma trajetória alternativa para produzir etanol (isto é, expressando-se uma fosfocetolase heteróloga, uma fosfotransacetilase heteróloga e uma acetaldeído desidrogenase acetilante, conforme descrito no pedido de patente internacional no WO 2015/148272 (Miasnikov et al.)), foi testada quanto a sua capacidade para produzir etanol em comparação com a levedura parental, que incluía a trajetória de etanol alternativa, mas não tinha uma deleção do gene YDR155c. Nesse caso, a levedura parental é designada "GPY10009" e a levedura modificada é designada "GPY10009-155c". As condições de ensaio e os procedimentos foram descritos nos Exemplos anteriores. As amostras foram analisadas quanto ao teor de etanol, glicose e glicerol e os resultados são mostrados na Tabela 4. Um aumento de etanol em 24 h é registrado em referência à cepa GPY10009. Tabela 4. Análise do caldo de fermentação após fermentação durante 24 h com FG, GPY10009 e GPY10009-155c a 32°C Temp. Cepa Glicose (g/l) Glicerol Etanol Aumento de (g/l) (g/l) etanol (%) (°C) 32 FG 52,05 13,08 108,20 - 32 GPY10009 52,81 12,51 106,72 1* 32 GPY10009-155c 46,29 12,93 109,05 2,2 valor de referência nominal
[00112] A levedura portadora da deleção do gene YDR155c e que também expressa a trajetória alternativa produziu significativamente mais etanol (isto é, mais de 2%) em comparação com levedura equivalente sem a deleção de YDR155c em 24 horas. Note que a levedura GPY10009 no final produz mais etanol em 48 horas do que a levedura FG do tipo selvagem (dados não mostrados); no entanto, é relativamente "lenta em começar" e produz menos etanol em 24 horas. A deleção do gene YDR155c, portanto, parece aumentar a taxa de crescimento inicial da levedura GPY10009. Exemplo 5: Produção de etanol por levedura modificada que expressa glicoamilase
[00113] A levedura que expressa a variante CS4 de glicoamilase de
Trichoderma reesei previamente mencionada e portadora, ainda, da deleção do gene YDR155c (isto é, SA-155c) foi testada quando a sua capacidade para produzir etanol em comparação com a levedura da marca de referência, que não tinha uma deleção de YDR155c (isto é, SYNERXIATM ADY, no presente documento "SA", que é o tipo selvagem para o gene YDR155c) em liquefeito a 32°C por 24 h. O liquefeito (isto é, pasta fluida de farinha de milho que tem um valor de sólido seco (ds) de 34,3%) foi preparado adicionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGENTM 2,5x (uma protease fúngica ácida), nenhuma CS4 (uma variante de glicoamilase de Trichoderma reesei) exógena foi adicionada e 1,46 SSCU/g ds de α-amilase de Aspergillus kawachii a pH 4,8.
[00114] 5 gramas de liquefeito foram pesados em frascos de 10 ml e inoculados com culturas frescas cultivadas durante a noite provenientes de colônias das cepas SA e SA-155c e incubados a 32°C por 24 h. As amostras foram colhidas por centrifugação, filtradas através de filtros de 0,2 µm e analisadas quanto ao teor de etanol, glicose, acetato e glicerol por HPLC (Agilent Technologies série 1200) com o uso de colunas Bio-Rad Aminex HPX-87H a 55°C, com uma taxa de fluxo isocrática de 0,6 ml/min em eluente de H2SO4 0,01 N. Um volume de injeção de amostra de 2,5 µl foi usado. Os padrões de calibração usados para a quantificação incluíam quantidades conhecidas de DP4+, DP3, DP2, DP1, glicerol e etanol. Os resultados das análises são mostrados na Tabela 5. O aumento de etanol é registrado em referência à cepa SA.
Tabela 5. Análise do caldo de fermentação após a fermentação com cepas AS e AS-155c Temp. Cepa Glicose Glicerol Acetato Etanol (g/l) Aumento de (g/l) (g/l) (g/l) etanol (%) (°C) 32 SA-155c 67,53 14,61 0,31 99,35 4,0 32 SA 80,89 13,35 0,26 95,49 1* valor de referência nominal
[00115] A levedura portadora da deleção do gene YDR155c e que também expressa a glicoamilase produziu significativamente mais etanol (isto é, cerca de 4%) em comparação com as cepas sem a deleção de YDR155c em 24 horas.
Claims (26)
1. Células de levedura modificadas derivadas de células de levedura parentais, caracterizadas pelo fato de que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma menor quantidade de polipeptídeo Cpr1 funcional em comparação com as células parentais, sendo que as células modificadas produzem, durante a fermentação, uma maior quantidade de etanol em comparação com as células parentais sob condições de fermentação equivalentes.
2. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende uma ruptura do gene YDR155c presente nas células parentais.
3. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é o resultado da deleção da totalidade ou de parte do gene YDR155c.
4. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é o resultado da deleção de uma porção do DNA genômico que compreende o gene YDR155c.
5. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é o resultado da mutagênese do gene YDR155c.
6. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizadas pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a introdução de um gene de interesse no locus genético do gene YDR155c.
7. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadas pelo fato de que as células não produzem o polipeptídeos Cpr1.
8. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadas pelo fato de que as células não produzem o polipeptídeos Cpr1.
9. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de que as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.
10. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil- CoA.
11. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.
12. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma ruptura do gene YJL065 presente nas células parentais.
13. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizadas pelo fato de que as células não produzem polipeptídeos Dls1 funcionais.
14. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizadas pelo fato de que as células são de um Saccharomyces spp.
15. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de etanol produzida pelas células de levedura modificadas e células de levedura parentais é medida 24 horas após a inoculação de um substrato de amido hidrolisado compreendendo 34 a 35% de sólidos dissolvidos e com um pH de 4,8 a 5,4.
16. Método para produzir uma célula de levedura modificada que caracterizado pelo fato de que compreende introduzir uma alteração genética em uma célula de levedura parental, cuja alteração genética reduz ou impede a produção do polipeptídeo Cpr1 funcional em comparação com as células parentais, produzindo, assim, células modificadas que produzem, durante a fermentação, uma maior quantidade de etanol em comparação com as células parentais sob condições de fermentação equivalentes.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a alteração genética compreende romper o gene YDR155c nas células parentais por manipulação genética.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a alteração genética compreende a deleção do gene YDR155c nas células parentais com o uso de manipulação genética.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a introdução de um gene de interesse no locus genético do gene YDR155c.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16a 19, caracterizado pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a execução de uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a adição de uma trajetória alternativa para a produção de etanol.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com ruptura do gene YJL065 presente nas células parentais.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que a ruptura do gene YDR155c é realizada em combinação com a introdução de um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é de um Saccharomyces spp.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo fato de que a quantidade de etanol produzida pelas células de levedura modificadas e células de levedura parentais é medida 24 horas após a inoculação de um substrato de amido hidrolisado compreendendo 34 a 35% de sólidos dissolvidos e com um pH de 4,8 a 5,4.
26. Células de levedura modificadas caracterizadas pelo fato de serem produzidas pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 25.
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