BR112020024118A2 - Superexpressão do ativador/repressor transcricional gis1 em levedura para produção aumentada de etanol - Google Patents

Abstract

superexpressão do ativador/repressor transcricional gis1 em levedura para produção aumentada de etanol. a presente invenção refere-se a composições e métodos relacionados a células de levedura modificadas que superexpressam o ativador/repressor transcricional, gis1. as células de levedura produzem uma quantidade maior de etanol em comparação com suas células progenitoras. tal levedura é particularmente útil para produção em larga escala de etanol a partir de substratos de amido quando uma produção aumentada de etanol é desejável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUPEREX- PRESSÃO DO ATIVADOR/REPRESSOR TRANSCRICIONAL GIS1 EM LEVEDURA PARA PRODUÇÃO AUMENTADA DE ETANOL".

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] As presentes composições e métodos referem-se a células de levedura modificadas que superexpressam o ativador/repressor transcricional, GIS1. As células de levedura produzem uma quantidade maior de etanol em comparação com suas células progenitoras. Tal le- vedura é particularmente útil para produção em larga escala de etanol a partir de substratos de amido quando uma produção aumentada de eta- nol é desejável.

ANTECEDENTES

[0002] A produção de etanol à base de levedura se baseia na con- versão de açúcares em etanol. A atual produção anual de etanol com- bustível por meio desse método é de cerca de 90 bilhões de litros em todo o mundo. Estima-se que cerca de 70% dos custos da produção de etanol seja a matéria-prima. Visto que o volume da produção de etanol é tão grande, até mesmo pequenas melhorias de rendimento têm im- pacto econômico massivo para a indústria. A conversão de um mol de glicose em dois mols de etanol e dois mols de dióxido de carbono é redox neutra, sendo que o rendimento teórico máximo é de cerca de 51%. O atual rendimento industrial é de cerca de 45%; portanto, há pos- sibilidades para aumentar a produção de etanol. Apesar de avanços na produtividade de levedura, há a necessidade de modificar adicional- mente as trajetórias metabólicas de levedura para maximizar a produ- ção de etanol ao mesmo tempo que não aumenta a produção de sub- produtos indesejáveis.

SUMÁRIO

[0003] As presentes composições e métodos referem-se a células de levedura modificadas que superexpressam o ativador/repressor transcricional, GIS1. As células de levedura são caracterizadas por ní- veis aumentados de produção de etanol em comparação com suas cé- lulas progenitoras. Os aspectos e modalidades das composições e mé- todos são descritos nos parágrafos a seguir, independentemente enu- merados.

1. Em um aspecto, são fornecidas células de levedura modi- ficadas derivadas de células de levedura progenitoras, sendo que as células modificadas compreendem uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma quantidade maior de poli- peptídeos GIS1 em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem durante a fermentação uma quanti- dade maior de álcool em comparação com a quantidade de álcool pro- duzida pelas células progenitoras sob condições idênticas de fermenta- ção.

2. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de um polipeptídeo de GIS1 para um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equivalentes.

3. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de GIS1.

4. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 1, a alteração genética compreende a introdução de gene YDRO96W exógeno.

5. Em algumas modalidades das células modificadas do pa- rágrafo 2, a alteração genética compreende a introdução de um promo- tor mais forte em um gene YDRO96W endógeno.

6. Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a quantidade de aumento na expres- são do polipeptídeo GIS1 é pelo menos cerca de 10 vezes em compa- ração com o nível de expressão nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

7. Em algumas modalidades das células modificadas de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a quantidade de aumento na produ- ção de mRNA que codifica o polipeptídeo GIS1 é pelo menos cerca de vezes em comparação com o nível nas células progenitoras cultiva- das sob condições equivalentes.

8. Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, as células compreen- dem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de carboidratos.

9. Em algumas modalidades, as células modificadas dos pa- rágrafos 1 a 8, compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de gli- cerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

10. Em algumas modalidades, as células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.

11. Em algumas modalidades das células modificadas, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, as células são de um Saccharomyces Spp.

12. Em outro aspecto, é fornecido um método para aumentar a produção de etanol em células de levedura cultivadas em um substra- tos de carboidrato que compreende: introduzir em células de levedura progenitoras uma alteração genética que faz com que as células modi- ficadas produzam uma quantidade maior de polipeptídeos de GIS1 em comparação com as células progenitoras, em que as células modifica- das produzem uma quantidade maior de etanol em comparação com as células progenitoras, de outro modo idênticas sob condições de fermen- tação equivalentes.

13. Em algumas modalidades do método do parágrafo 12, a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para direcionar a expressão de GIS1 a um nível maior que o da célula progenitora cultivada sob condi- ções equivalentes.

14. Em algumas modalidades do método do parágrafo 12, a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expres- são para expressar GIS1.

15. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 14, as células compreendem, ainda, um ou mais genes da trajetória de fosfocetolase.

16. Em algumas modalidades do método do parágrafo 15, os genes da trajetória de fosfocetolase são selecionados a partir do grupo consistindo em fosfocetolase, fosfotransacetilase e acetil desidrogenase de acetilação.

17. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 16, a quantidade de aumento na expressão de GIS1 é pelo menos 10 vezes maior em comparação com o nível de expressão em células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes, com base na expressão de mRNA que codifica GIS1.

18. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 17, as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima de processamento de carboidrato.

19. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 18, as células compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil-CoA.

20. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 19, as células compreendem, ainda, uma trajetória al- ternativa para produzir etanol.

21. Em algumas modalidades do método de qualquer um dos parágrafos 12 a 20, as células são de uma Saccharomyces Spp.

[0004] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes célu- las modificadas e métodos ficarão evidentes a partir da descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA |. Definições

[0005] Antes de descrever as presentes leveduras e métodos em detalhes, os termos a seguir são definidos para maior clareza. Os ter- mos não definidos devem ser reconhecidos por seus significados ordi- nários, conforme usado na técnica relevante.

[0006] Conforme usado no presente documento, o termo "álcool" refere-se a um composto orgânico no qual um grupo funcional hidroxila (-OH) é ligado a um átomo de carbono saturado.

[0007] Conforme usado no presente documento, os termos "células de levedura", "cepas de levedura" ou simplesmente "levedura" se refe- rem a organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Uma levedura exemplificativa é uma levedura de germinação da ordem Saccha- romycetales. Os exemplos específicos de levedura são Saccharomyces Spp., incluindo, porém sem limitação, S. cerevisiae. A levedura inclui or- ganismos usados para a produção de álcool combustível, bem como organismos usados para a produção de álcool potável, incluindo cepas de levedura especializadas e patenteadas usadas para produzir cerve- jas de sabores distintos, vinhos e outras bebidas fermentadas.

[0008] Conforme usado no presente documento, o sintagma "célu- las de levedura geneticamente modificadas", "células de levedura vari- antes", "células de levedura modificadas" ou sintagmas similares refe- rem-se à levedura que inclui as modificações e características genéticas descritas no presente documento. A levedura variante/modificada não inclui levedura de ocorrência natural.

[0009] Conforme usado no presente documento, os termos "poli- peptídeo" e "proteína" (e suas respectivas formas plurais) são usados de forma intercambiável para se referir a polímeros de qualquer compri- mento que compreendem resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácidos são usados no presente documento, e todas as sequências são apresentadas de uma direção N-terminal para C-ter- minal. O polímero pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por in- tervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de identificação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exem- plo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações co- nhecidas na técnica.

[0010] Conforme usado no presente documento, as proteínas fun- cional e/ou estruturalmente similares são consideradas como "proteínas relacionadas" ou "homólogas". Tais proteínas podem ser derivadas de organismos de gêneros e/ou espécies diferentes, ou classes diferentes de organismos (por exemplo, bactérias e fungos), ou artificialmente pro- jetadas. As proteínas relacionadas também englobam homólogos deter- minados por análise de sequência primária, determinados por análise de estrutura secundária ou terciária ou determinados por reatividade cruzada imunológica ou determinados por suas funções.

[0011] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína homóloga" se refere a uma proteína que tem atividade e/ou estrutura similar a uma proteína de referência. Não se pretende que os homólo- gos necessariamente sejam relacionados evolutivamente. Assim, pre- tende-se que o termo abranja enzimas iguais, similares ou correspon- dentes (isto é, em termos de estrutura e função) obtidas de diferentes organismos. Em algumas modalidades, é desejável identificar um ho- mólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária si- milar à proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas homólogas induzem resposta (ou respostas) imunológica similar à de uma proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas ho- mólogas são geneticamente modificadas para produzir enzimas com a atividade (ou atividades) desejada.

[0012] O grau de homologia entre sequências pode ser determinado com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica (consul- tar, por exemplo, Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Ne- edleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444; programas, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, WI); e Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387 a 395).

[0013] Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveis de homologia de sequência. PILEUP cria um alinhamento de múl- tiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos progressivos por pareamento. O mesmo também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, (Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351 a 360). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp ((1989) CABIOS 5:151 a 153). Os parâmetros de PILEUP úteis incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento da lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderados. Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et a/. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410) e Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.887). Um programa BLAST par- ticularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (consultar, por exemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460 a 480). Parâmetros "W", "T" e "X" determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUMG6?2 (consultar, por exemplo, Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N':-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0014] Conforme usado no presente documento, os sintagmas "substancialmente similar" e "substancialmente idêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significam tipica- mente que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma se- quência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 91% de identidade, pelo menos cerca de 92% de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de iden- tidade, pelo menos cerca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 98% de identidade ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de identidade ou mais em compara- ção com a sequência de referência (isto é, do tipo selvagem). O percen- tual de identidade de sequência é calculado com o uso do algoritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et a/. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. Os parâmetros padrão para o al- goritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0

Penalidade por extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de sequência divergente de atraso: 40 Distância de separação de lacuna: 8 Peso de transições de DNA: 0,50 Listar resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Usar matriz negativa: DESLIGADO Alternar Penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade por separação de lacuna final! DESLIGADO

[0015] Uma outra indicação de que dois polipeptídeos são substan- cialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo de forma cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservadoras de aminoá- cido são imunologicamente reativos de forma cruzada. Assim, um poli- peptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por uma substitui- ção conservadora. Uma outra indicação de que duas sequências de áci- dos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[0016] Conforme usado no presente documento, o termo "gene" é sinônimo do termo "alelo" em referência a um ácido nucleico que codi- fica e direciona a expressão de uma proteína ou RNA. Formas vegeta- tivas de fungos filamentosos são geralmente haploides, portanto, uma única cópia de um gene especificado (isto é, um único alelo) é suficiente para conferir um fenótipo especificado. O termo "alelo" é, de modo geral, preferencial quando um organismo contém mais de um gene similar, em cujo caso, cada gene similar diferente é denominado um "alelo" distinto.

[0017] Conforme usado no presente documento, o termo "expressar um polipeptídeo" e termos similares referem-se ao processo celular de produzir um polipeptídeo com o uso do maquinário de tradução (por exemplo, ribossomos) da célula.

[0018] Conforme usado no presente documento, "superexpressar um polipeptídeo", "aumentar a expressão de um polipeptídeo" e termos similares referem-se a expressar um polipeptídeo em níveis mais altos que o normal em comparação com aqueles observados com células progenitoras ou do tipo selvagem que não incluem uma modificação ge- nética especificada. A superexpressão pode ser descrita em termos de níveis de MRNA ou níveis de polipeptídeo, conforme as condições ex- perimentais permitam.

[0019] Conforme usado no presente documento, um "cassete de ex- pressão" se refere a um fragmento de DNA que inclui um promotor e região de codificação de aminoácido e um terminador (isto é, promo- tor::região de codificação de aminoácido::terminador) e outra sequência de ácidos nucleicos necessária para permitir que o polipeptídeo codifi- cado seja produzido em uma célula. Os cassetes de expressão podem ser exógenos (isto é, introduzidos em uma célula) ou endógenos (isto é, existentes em uma célula).

[0020] Conforme usado no presente documento, os termos "fun- dido" e "fusão" em relação a dois fragmentos de DNA, tais como um promotor e a região codificadora de um polipeptídeo, se referem a uma ligação física que faz com que os dois fragmentos de DNA se tornem uma única molécula.

[0021] Conforme usado no presente documento, os termos "tipo sel- vagem" e "nativo" são usados de forma intercambiável e se referem a genes, proteínas ou cepas encontrados na natureza ou que não são intencionalmente modificados pela vantagem da levedura descrita no presente.

[0022] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de interesse" se refere a um polipeptídeo que se deseja que seja ex- presso na levedura modificada. Tal proteína pode ser uma enzima, uma proteína de ligação ao substrato, uma proteína tensoativa, uma proteína estrutural, um marcador selecionável, um transdutor de sinal, um recep- tor, um transportador, um fator de transcrição, um fator de tradução, um cofator ou semelhantes, e pode ser expressa. A proteína de interesse é codificada por um gene endógeno ou um gene heterólogo (isto é, "gene de interesse") em relação à cepa progenitora. A proteína de interesse pode ser expressa intracelularmente ou como uma proteína secretada.

[0023] Conforme usado no presente documento, "ruptura de um gene" se refere amplamente a qualquer manipulação genética ou quíi- mica, isto é, mutação, que impeça substancialmente que uma célula produza um produto gênico funcional, por exemplo, uma proteína, em uma célula hospedeira. Métodos exemplificativos de ruptura incluem de- leção completa ou parcial de qualquer porção de um gene, incluindo uma sequência de codificação de polipeptídeos, um promotor, um inten- sificador ou um outro elemento regulador, ou mutagênese do mesmo, em que a mutagênese abrange substituições, inserções, deleções, in- versões e combinações e variações das mesmas, sendo que qualquer uma das mutações impede substancialmente a produção de um produto gênico funcional. Um gene também pode ser rompido com o uso de CRISPR, RNAi, antissenso ou qualquer outro método que anule a ex- pressão de genes. Um gene pode ser rompido por deleção ou manipu- lação genética de elementos de controle não adjacentes. Conforme usado no presente documento, "deleção de um gene" refere-se a sua remoção do genoma de uma célula hospedeira. Quando um gene inclui elementos de controle (por exemplo, elementos intensificadores) que não estão localizados imediatamente adjacentes à sequência de codifi-

cação de um gene, a deleção de um gene se refere à deleção da se- quência de codificação e, opcionalmente, elementos intensificadores adjacentes, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, sequências promotoras e/ou terminadoras, mas não requer a deleção de elementos de controle não adjacentes. A deleção de um gene também se refere à deleção de uma parte da sequência de codificação, ou uma parte de promotor imediatamente ou não imediatamente adjacente à sequência de codificação, em que não há atividade funcional do gene interessado existente na célula geneticamente modificada.

[0024] Conforme usado no presente documento, os termos "mani- pulação genética" e "alteração genética" são usados intercambiavel- mente e referem-se à alteração/mudança de uma sequência de ácidos nucleicos. A alteração pode incluir, porém sem limitação, uma substitui- ção, uma deleção, uma inserção ou uma modificação química de pelo menos um ácido nucleico na sequência de ácidos nucleicos.

[0025] Conforme usado no presente documento, um "polipeptí- deo/proteína funcional" é uma proteína que possui uma atividade, como uma atividade enzimática, uma atividade de ligação, uma propriedade tensoativa, um transdutor de sinal, um receptor, um transportador, um fator de transcrição, um fator de tradução, um cofator ou similares, e que não sofreu mutação, foi truncada ou modificada de outro modo para abolir ou reduzir tal atividade. Polipeptídeos funcionais podem ser ter- moestáveis ou termoinstáveis, conforme especificado.

[0026] Conforme usado no presente documento, um "gene funcio- nal" é um gene que pode ser usado por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo, tipicamente uma proteína. Genes fun- cionais são a antítese de genes rompidos, que são modificados de modo que não possam ser usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo ou tenham uma capacidade reduzida para se- rem usados por componentes celulares para produzir um produto gênico ativo.

[0027] Conforme usado no presente documento, células de leve- dura foram "modificadas para impedir a produção de uma proteína es- pecificada" se tiverem sido alteradas genética ou quimicamente para impedir a produção de uma proteína/polipeptídeo funcional que exibe uma atividade característica da proteína do tipo selvagem. Tais modifi- cações incluem, porém sem limitação, deleção ou ruptura do gene que codifica a proteína (conforme descrito no presente documento), modifi- cação do gene de modo que o polipeptídeo codificado careça da ativi- dade supracitada, modificação do gene de modo a afetar a estabilidade ou o processamento prós-translacional e combinações das mesmas.

[0028] Conforme usado no presente documento, "atenuação de uma trajetória" ou "atenuação do fluxo através de uma trajetória", isto é, uma trajetória bioquímica, refere-se amplamente a qualquer manipula- ção genética ou química que reduza ou interrompa completamente o fluxo de substratos bioquímicos ou intermediários através de uma traje- tória metabólica. A atenuação de uma trajetória pode ser obtida por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos. Tais métodos incluem, mas sem limitação: deleção completa ou parcial de um ou mais genes, substituir alelos do tipo selvagem desses genes com formas mutantes que codificam enzimas com atividade catabólica reduzida ou valores de Km aumentados, modificar os promotores ou outros elementos regula- dores que controlam a expressão de um ou mais genes, modificar ge- neticamente as enzimas ou o MRNA que codifica essas enzimas para uma estabilidade diminuída, extraviar as enzimas para compartimentos celulares em que as mesmas são menos prováveis de interagir com substrato e intermediários, o uso de RNA interferente, e semelhantes.

[0029] Conforme usado no presente documento, "fermentação ae- róbia" refere-se ao crescimento na presença de oxigênio.

[0030] Conforme usado no presente documento, "fermentação ana- eróbica" refere-se ao crescimento na ausência de oxigênio.

[0031] Conforme usado no presente documento, a expressão "fim da fermentação" refere-se ao estágio de fermentação em que a vanta- gem econômica de continuar a fermentação para produzir uma pequena quantidade de álcool adicional é excedida pelo custo de continuar a fer- mentação em termos de custos fixos e variáveis. Em um sentido mais geral, "fim da fermentação" se refere ao ponto em que uma fermentação não produzirá mais uma quantidade significativa de álcool adicional, isto é, não mais que cerca de 1% de álcool adicional ou sem mais substrato restante para produção de álcool adicional.

[0032] Conforme usado no presente documento, uma "unidade de glicoamilase (GAU)" é definida como a quantidade de glicoamilase ne- cessária para produzir 1 g de glicose por hora de substrato de amido solúvel (4% ds) sob condições de ensaio a 60 ºC e pH 4,2.

[0033] Conforme usado no presente documento, uma "unidade de protease ácida espectrofotométrica (SAPU)" é a quantidade de ativi- dade de protease que libera um micromol de tirosina por minuto de um substrato de caseína sob condições de ensaio padrão.

[0034] Conforme usado no presente documento, uma "unidade de amido solúvel (SSU)" é baseada no grau de hidrólise de substrato de amido de batata solúvel (4% DS) por uma alíquota de a-amilase a pH 4,5, 50 ºC. O teor de açúcar redutor é medido com o uso do método DNS, conforme descrito por Miller, G.L. ((1959) Anal. Chem. 31:426 a 428).

[0035] Conforme usado no presente documento, os artigos singula- res "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências ci- tadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de refe- rência em sua totalidade. As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a não ser que especificado de outro modo: ºC graus centígrados AA a-amilase AADH acetaldeído desidrogenases ADH álcool desidrogenase bp pares de bases DNA ácido desoxirribonucleico dsouDS sólidos secos EC comissão de enzima EtoH etanol gougm grama gl gramas por litro GA glicoamilase GAU unidade de glicoamilase HPLC cromatografia líquida de alta eficiência hrouh hora kg quilograma M molar mg miligrama min minuto mL ouml mililitro mM milimolar MRNA RNA mensageiro N normal nm nanômetro PCR reação em cadeia de polimerase PKL fosfocetolase ppm partes por milhão PTA fosfotransacetilase SAPU unidade de protease ácida espectrofotométrica

SSU unidade de amido solúvel A relacionado a uma deleção vg micrograma uL eu! microlitro uM micromolar Il. Superexpressão de GIS1 em levedura aumenta a produção de etanol em levedura

[0036] GIS1 é um fator de transcrição envolvido na regulação de expressão de genes mediante privação de nutrientes. O mesmo reco- nhece e se liga ao elemento pós-deslocamento diáuxico 5'-T[/ATJAGG- GAT-3' (SEQ ID NO: 1) na região promotora. O mesmo pode atuar como um ativador transcricional (por exemplo, de genes de estresse como SSA3, HSP12 e HSP26) assim como um repressor (por exemplo, de pirofosfato fosfatase DPP1). GIS1 também atua como um repressor transcricional responsivo a danos em DNA de fotoliase PHR1. GIS1 e RPH1 também mostraram controlar o número de genes envolvidos em formação de acetato e glicerol, metabólitos que foram implicados no en- velhecimento.

[0037] Foi também constatado que a superexpressão de GIS1 pode aumentar a produção de etanol em mais de 1% em levedura não gene- ticamente modificada assim como levedura geneticamente modificada que abriga uma trajetória geneticamente modificada. Análises RNAseq sugerem que o gene GIS1 é normalmente expresso de modo fraco. À superexpressão em 10 vezes de GIS1 aumenta a produção de etanol em levedura de outro modo idêntica em pelo menos 1%. O polipeptídeo de GIS1 exemplificado é de Saccharomyces cerevisiae S288c (Número de Acesso ao GenBank NP 010381.1; SEQ ID NO: 5; infra). O Genbank lista inúmeras outras sequências de polipeptídeos com uma alta porcen- tagem de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5, seguidas por um grande número de outros polipeptídeos similares. Espera-se que a maioria, se não todos, esses polipeptídeos similares produzam resulta- dos similares em células de levedura.

[0038] Em modalidades particulares das presentes composições e métodos, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GIS1 que é superexpressa em células de levedura modificadas tem pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou ainda pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 5.

[0039] O aumento na quantidade de GIS1 produzido pelas células modificadas pode ser um aumento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1.000%, ou mais, em comparação com a quantidade de GIS1 produzida por células progenitoras cultivadas sob as mesmas condi- ções. Alternativa ou adicionalmente, o aumento na quantidade de GIS1 produziu as células modificadas pode ser pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes ou pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou mais, em comparação com a quantidade de GIS1 produzida por células progenitoras cultivadas sob condições iguais.

[0040] O aumento na força do promotor usado para controlar a ex- pressão de controle do GIS1 produzido pelas células modificadas pode ser pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou mais, em comparação com a força do pro- motor nativo que controla a expressão de GIS1, com base na quanti- dade de mRNA produzida.

[0041] É entendido que a força relativa do promotor não é um valor escalar exato. Também pode depender grandemente do meio de cul- tura, tempo de fermentação, temperatura e outras condições. Os valo- res obtidos a partir de dados de RNAsegq coletados durante o curso do tempo de fermentação em meio industrial são os mais preferenciais, en- tretanto, os dados experimentais e/ou da literatura obtidos sob cultivo diferente podem ser também usados para seleção de promotor recom- binante.

[0042] De preferência, a expressão de GIS1 aumentada é alcan- çada por manipulação genética com o uso de técnicas de biologia mo- lecular específicas de sequência em oposição à mutagênese química, que normalmente não é direcionada a sequências de ácidos nucleicos específicas. Entretanto, a mutagênese química não é excluída como um método para produzir células de levedura modificadas.

[0043] Em algumas modalidades, as presentes composições e mé- todos envolvem introduzir em células de levedura um ácido nucleico com capacidade para direcionar a superexpressão ou maior expressão de um polipeptídeo de GIS1. Métodos particulares incluem, porém sem limitação, (i) introduzir um cassete de expressão exógeno para produzir o polipeptídeo em uma célula hospedeira, opcionalmente além de um cassete de expressão endógeno, (ii) substituir um cassete de expressão exógeno por um cassete endógeno que permite a produção de uma quantidade aumentada do polipeptídeo, (iii) modificar o promotor de um cassete de expressão endógeno para aumentar a expressão, (iv) au- mentar o número de cópias dos cassetes iguais ou diferentes para su- perexpressão de GIS1, e/ou (v) modificar qualquer aspecto da célula hospedeira para aumentar a meia-vida do polipeptídeo na célula hospe- deira.

[0044] Em algumas modalidades, a célula progenitora que já é mo- dificada inclui uma trajetória de interesse geneticamente modificada, como uma trajetória de PKL, para aumentar a produção de etanol, ou qualquer outra trajetória para aumentar a produção de álcool. Em algu- mas modalidades, a célula progenitora que é modifica já inclui um gene de interesse, tal como um gene que codifica um marcador selecionável, uma enzima processadora de carboidratos ou outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, um gene de interesse é subsequentemente in- troduzido nas células modificadas. Ill. Células de levedura modificadas que superexpressam GIS1 e alojam uma trajetória de PKL exógena

[0045] A expressão aumentada de GIS1 pode ser combinada com expressão de genes da trajetória de PKL para aumentar ainda mais a taxa de produção e/ou os níveis de produção máximos de etanol em células de levedura.

[0046] As células de levedura geneticamente modificadas que têm uma progenitora de PKL heteróloga foram descritas anteriormente no documento nº WO2015148272 (Miasnikov et a/.). Essas células expres- sam fosfocetolase (PKL), fosfotransacetilase (PTA) e acetil desidroge- nase de acetilação (AADH) heterólogas, opcionalmente com outras en- zimas, para canalizar o fluxo de carbono na direção oposta à trajetória de glicerol e em direção à síntese de actil-CoA, que, então, é convertida em etanol. Tais células modificadas têm capacidade de produção de etanol aumentada em um processo de fermentação em comparação com células de levedura progenitoras, de outro modo, idênticas. IV. Superexpressão de GIS1 em combinação com outras mutações que afetam a produção de etanol

[0047] Em algumas modalidades, adicionalmente a superexpressar GIS1, opcionalmente em combinação com a presença de uma trajetória de PKL exógena, as presentes células de levedura modificadas incluem modificações adicionais que afetam a produção de etanol.

[0048] As células modificadas podem incluir, ainda, as mutações que resultam em atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol na- tiva e/ou trajetória de glicerol de reutilização, que são conhecidas por aumentar a produção de álcool. Métodos para a atenuação da trajetória de biossíntese de glicerol em levedura são conhecidos e incluem redu- ção ou eliminação da atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) ou glicerol fosfato fosfatase (GPP) dependente de NAD endó- geno, por exemplo, por meio da ruptura de um ou mais dentre os genes GPDA1, GPD2, GPP1 e/ou GPP2. Consultar, por exemplo, as patentes n% U.S. 9.175.270 (Elke et a/.), 8.795.998 (Pronk et a/.) e 8.956.851 (Ar- gyros et al.). Métodos para aprimorar a via de glicerol de reutilização por superexpressão de glicerol desidrogenase (GCY1) e di-hidroxiacetona quinase (DAK1) para converter glicerol em fosfato de di-hidroxiacetona (Zhang et al. (2013) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40:1.153 a 1.160).

[0049] A levedura modificada pode apresentar, ainda, atividade au- mentada de acetil-CoA sintase (também chamada de acetil-CoA ligase) (EC 6.2.1.1) para sequestrar (isto é, capturar) o acetato produzido por hidrólise química ou enzimática de acetil-fosfato (ou presente no meio de cultura da levedura por qualquer outra razão) e converter o mesmo em acetil-CoA. Isso reduz parcialmente o efeito indesejável de acetato no crescimento de células de levedura e pode, ainda, contribuir para um melhoramento no rendimento de álcool. O aumento da atividade de ace- til-CoA sintase pode ser conquistado introduzindo-se um gene heteró- logo da acetil-CoA sintase em células, aumentando a expressão de um gene endógeno da acetil-CoA sintase e semelhantes.

[0050] Em algumas modalidades, as células modificadas podem in- cluir, ainda, um gene heterólogo que codifica uma proteína com ativi- dade de acetaldeído desidrogenase acetilante (AADH) dependente de NAD* e/ou um gene heterólogo que codifica uma piruvato-formato liase (PFL). A introdução de tais genes em combinação com a atenuação da trajetória de glicerol é descrita, por exemplo, na Patente nº U.S.

8.795.998 (Pronk et al/.). Em algumas modalidades das presentes com- posições e métodos, a levedura carece expressamente de um gene he- terólogo (ou genes heterólogos) que codifica uma acetaldeído desidro- genase acetilante, uma piruvato-formato liase ou ambas.

[0051] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas podem, ainda, superexpressar um polipeptídeo semelhante a transportador de açúcar (STL1) para aumentar a absorção de glicerol (consultar, por exemplo, Ferreira et al. (2005) Mol Biol Cell 16:2.068 a

2.076; Dusková et al. (2015) Mol Microbiol 97:541 a 559 e o documento nº WO 2015023989 A1).

[0052] Em algumas modalidades, as presentes células de levedura modificadas incluem, ainda, uma trajetória biossintética de butanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de butanol é uma traje- tória biossintética de isobutanol. Em algumas modalidades, a trajetória biossintética de isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para a conversão de produto selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) piruvato em acetolac- tato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidroxi-isovalerato; (c) 2,3-di-hidroxi-iso- valerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em algumas modalidades, a via bi- ossintética de isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade acetolactato sintase, ceto-ácido redu- toisomerase, di-hidroxi-ácido desidratase, cetoisovalerato decarboxi- lase e álcool desidrogenase.

[0053] Em algumas modalidades, as células de levedura modifica- das que compreendem uma trajetória biossintética de butanol compre- endem, ainda, uma modificação em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato descarboxilase. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem uma deleção, mu- tação e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que tem atividade piruvato descarboxilase. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo que tem atividade piruvato decarboxi- lase é selecionado dentre o grupo que consiste em: PDC1, PDC5, PDC6 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as células de levedura compreendem, ainda, uma deleção, mutação e/ou substituição em um ou mais polinucleotídeos endógenos que codificam FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C. V. Superexpressão de GIS1 em combinação com outras mutações benéficas

[0054] Em algumas modalidades, além da superexpressão de GIS1, opcionalmente em combinação com outras modificações genéti- cas que beneficiam a produção de álcool, as presentes células de leve- dura modificadas incluem, ainda, qualquer número de genes de inte- resse adicionais que codificam proteínas de interesse ou de redução da produção da mesma. Genes de interesse adicionais podem ser introdu- zidos antes, durante ou após manipulações genéticas que resultam na superexpressão dos polipeptídeos de GIS1. As proteínas de interesse incluem marcadores selecionáveis, enzimas processadoras de carboi- dratos e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, po- rém sem limitação, uma enzima selecionada dentre o grupo que con- siste em uma desidrogenase, uma transcetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma B- glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma a-amilase, uma B-ami- lase, uma glicoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cuti- nase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase. Proteínas de interesse podem ser secretadas, glicosiladas e modificadas de outra forma.

VI. Uso da levedura modificada para aumento de produção de ál- cool

[0055] As presentes cepas de levedura e métodos de uso, portanto, são para a produção de álcool em levedura. Tais métodos não se limi- tam a um processo específico de fermentação. Espera-se que a pre- sente levedura geneticamente modificada seja uma substituição "impre- vista" para levedura convencional em qualquer instalação de fermenta- ção de álcool, seja com o uso de hidrólise de amido cru, sacarificação e fermentação simultâneas ou outras variações padrão de produção de etanol convencional. Embora seja principalmente destinada à produção de álcool combustível, a presente levedura também pode ser usada para a produção de álcool potável, incluindo vinho e cerveja. VII. Células de levedura adequadas para modificação

[0056] Leveduras são micro-organismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino fúngico e incluem organismos dos filos Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que podem ser usadas para a produção de álcool incluem, porém sem limitação, Saccha- romyces Spp., incluindo S. cerevisiae, bem como Kluyveromyces, La- chancea e Schizosaccharomyces spp. Inúmeras cepas de levedura es- tão comercialmente disponíveis, muitas das quais foram selecionadas ou geneticamente modificadas para características desejadas, tais como alta produção de álcool, rápida taxa de crescimento e semelhan- tes. Algumas leveduras foram geneticamente modificadas para produzir enzimas heterólogas, como glucoamilase ou a-amilase. VII. Substratos e produtos

[0057] A produção de álcool a partir de vários substratos de carboi- drato, incluindo, porém sem limitação, amido de milho, cana-de-açúcar, mandioca e melaço, é bem conhecida, assim como inúmeras variações e melhorias nas condições enzimáticas e químicas e processos mecâ- nicos. Acredita-se que as presentes composições e métodos sejam completamente compatíveis com tais substratos e condições.

[0058] Os produtos de fermentação de álcool incluem o composto orgânico que tem um grupo funcional hidroxila (-OH) ligado a um átomo de carbono. Álcoois exemplificativos incluem, porém sem limitação, me- tanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-pentanol, isopentanol e álcoois superiores. Os álcoois combustíveis mais comumente produzidos são etanol e butanol.

[0059] Esses e outros aspectos e modalidades das presentes cepas de levedura e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição.

EXEMPLOS

[0060] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar, ainda, porém sem limitação, as composições e os métodos descritos.

Exemplo 1. Materiais e métodos

[0061] Os protocolos a seguir foram empregados a não ser que es- pecificado de outro modo.

Preparação de liquefeito

[0062] O liquefeito (pasta fluida de milho moído) foi preparado adi- cionando-se 600 ppm de ureia, 0,124 SAPU/g ds de FERMGENTY 2,5X (uma protease fúngica ácida), 0,33 GAU/g ds de glicoamilase (uma gli- coamilase variante de Trichoderma) e 1,46 SSU/g ds de GC626 (a-ami- lase de Aspergillus), ajustado para um pH de 4,8.

Ensaios de AnKom

[0063] 300 ul da cultura de levedura concentrada durante a noite foram adicionados a cada um dentre os inúmeros recipientes ANKOM preenchidos com 30 g de liquefeito preparado para uma OD final de 0,3.

Os recipientes foram, então, incubados a 32 “C com agitação (150 RPM) por 65 horas.

Análise de HPLC

[0064] As amostras dos experimentos de frasco de soro e AnKkom foram coletadas em tubos Eppendorf por centrifugação por 12 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram filtrados com filtros de PTFE 0,2 UM e, então, usados para análise de HPLC (Agilent Technologies série 1200) com as seguintes condições: Colunas Bio-Rad Aminex HPX- 87H, temperatura de execução de 55 ºC. Fluxo isocrático a 0,6 ml/min de H2SOa 0,01 N, 2,5 ul de volume de injeção. Padrões de calibração foram usados para quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. As amostras dos experimentos de vasos de agitação foram coletadas em tubos Eppendorf por centrifugação por 15 minutos a 14.000 RPM. Os sobrenadantes foram diluídos por um fator de 11 com o uso de H2SO,4 5 MM e incubados por 5 min a 95 ºC. Após o resfriamento, as amostras foram filtradas com filtros de 0,2 uM Corning FiltrEX CLS3505 e, então, usadas para análise de HPLC. 10 ul foram injetados em um HPLC Agilent série 1200 equipado com um detector de índice de refra- ção. A coluna de separação usada foi uma coluna Phenomenex Rezex- RFQ Fast Acid H+ (8%). A fase móvel foi H2SO4 5 mM, e a taxa de fluxo foi 1,0 ml/min a 85 ºC. A Mistura Padrão de Calibração de HPLC da Bion Analytical foi usada para a quantificação de acetato, etanol, glicerol e glicose. Exceto se especificado de outro modo, todos os valores são expressos em g/|. Exemplo 2. Superexpressão de GIS1 com otimização de códon em levedura

[0065] GIS1, codificado pelo gene YDRO96W de Saccharomyces cerevisiae S288c, sofreu otimização de códon e foi sintetizado para gerar o gene artificial, "GIS1S", mostrado como a SEQ ID NO: 2:

ATGGAAATCAAGCCAGTCGAAGTTATCGACGGTGTTCCAGTCTTC AAGCCATCTATGATGGAATTTGCCAATTTTCAATACTTCATTGACG AAATCACCAAGTTTGGTATCGAAAACGGTATTGTCAAGGTTATTCC TCCCAAGGAATGGCTGGAATTGTTGGAAGGTTCTCCACCTGCTGA ATCCTTGAAGACTATCCAACTAGATTCTCCAATTCAACAGCAAGCC AAGAGATGGGACAAACACGAAAACGGTGTCTTTTCCATCGAAAAC GAATACGACAACAAGTCTTACAACTTGACACAATGGAAGAATTTGG CTGAATCCTTGGATTCTAGAATCAGTCAAGGTGACTTCAACGACAA GACCTTAAAGGAAAACTGCAGAGTCGATTCTCAACAGGATTGTTA CGATTTGGCTCAATTACAAATCTTGGAATCCGACTTCTGGAAGACC ATTGCCTTTTCCAAGCCATTCTACGCTGTTGACGAAAACTCTTCCA TCTTCCCATACGACTTGACTTTATGGAACTTGAACAATTTGCCAGA TTCTATCAACTCCAGCAACAGACGTTTGCTAACTGGTCAATCCAAG TGTATCTTTCCATGGCACTTGGACGAACAAAACAAGTGTTCTATCA ACTACTTGCACTTCGGTGCTCCAAAGCAATGGTACTCCATTCCATC TGCCAACACCGATCAATTCTTGAAGATCCTATCCAAGGAACCATCA AGCAACAAGGAAAATTGTCCAGCTTTCATCCGTCATCAAAACATCA TTACTTCTCCAGACTTTTTGAGAAAGAACAATATCAAGTTCAACAG AGTTGTCCAATTTCAACATGAATTTATCATTACCTTTCCTTACTGTA TGTACTCCGGTTTCAACTACGGTTACAACTTTGGCGAATCTATCGA GTTCATCTTAGATCAGCAAGCTGTTGTCAGAAAGCAACCATTGAAG TGTGGTTGCGGCAACAAGAAAGAAGAGAGAAAGTCTGGTCCATTT TCCAACTTGTCTTACGACTCCAACGAAAGCGAACAACGTGGTTCT ATTACCGACAACGACAATGATTTGTTTCAAAAGGTCAGATCCTTCG ACGAATTGCTAAACCACTCCTCTCAAGAATTGCAAAACTTGGAAGA CAACAAGAATCCATTGTTTTCCAACATCAATATGAACAGACCACAA AGCTCCTCTTTGAGGTCTACTACACCAAACGGTGTCAACCAATTCOT TGAACATGAATCAAACTACCATCAGCAGAATTTCCTCTCCATTGTT ATCAAGAATGATGGACTTGTCCAACATCGTGGAACCAACCTTGGA CGATCCTGGTTCCAAGTTCAAGAGAAAGGTTTTGACTCCACAATTA CCACAAATGAACATTCCATCCAACTCTTCCAACTTTGGTACTCCTT CTTTGACCAATACAAACTCCTTGCTATCAAACATCACTGCTACATC TACCAATCCATCCACCACTACCAACGGCTCTCAAAACCACAACAAT GTCAACGCCAATGGTATCAACACCTCTGCTGCCGCTTCCATCAAC AATAACATTTCCTCTACCAACAATTCTGCCAATAACAGCTCTTCCA ACAATAACGTTTCTACTGTTCCATCTTCCATGATGCACTCTTCCAC CTTGAATGGTACTTCTGGTTTGGGTGGCGACAACGATGACAACAT GTTAGCTTTGAGCCTAGCTACCTTGGCCAACAGTGCTACTGCTTC TCCAAGATTGACCTTACCACCTTTGTCTTCACCAATGAATCCCAAC GGTCACACTTCCTACAACGGTAACATGATGAACAATAACTCTGGTA ACGGTTCCAACGGTAGCAACTCTTACTCCAATGGTGTCACCACTG CTGCCGCTACCACTACATCTGCTCCACACAACTTGTCCATCGTTTC TCCAAACCCTACCTACAGTCCAAATCCCTTGTCTCTATACTTGACC AACTCCAAGAATCCATTGAACTCTGGTTTGGCTCCATTATCTCCTT CCACTTCTAACATTCCATTCTTGAAGAGAAACAATGTCGTTACCCT AAACATCTCCAGAGAAGCCTCCAAGTCTCCAATCTCTTCCOTTTGTC AACGACTACCGTTCTCCATTGGGTGTTTCCAATCCATTGATGTACT CTTCCACTATCAACGATTACTCCAACGGTACTGGTATCCGTCAAAA CAGCAACAACATCAATCCATTGGACGCTGGTCCATCTTTTTCTCOCOT TTGCACAAGAAACCAAAGATTTTGAACGGCAATGACAACTCCAATT TGGACAGCAACAATTTCGATTACTCTTTTACTGGTAACAAGCAAGA ATCCAATCCATCTATCTTGAACAACAATACCAACAATAACGACAAC TACAGAACTTCTTCCATGAACAACAATGGTAACAATTACCAAGCTC ACTCTTCCAAGTTTGGTGAAAACGAAGTCATCATGTCCGATCACG GTAAGATTTACATCTGTAGAGAATGTAACAGACAATTTTCCTCTGG TCACCATCTAACCAGACACAAAAAGTCAGTTCATTCTGGTGAAAAG CCACACTCTTGTCCAAGATGTGGTAAAAGATTCAAGAGAAGAGAT CATGTCTTGCAACACTTGAACAAGAAAATCCCATGCACTCAAGAAA TGGAAAACACCAAGTTGGCTGAATCTTAA

[0066] O promotor de ADR1 (representado pela SEQ ID NO: 3) foi ligado de modo operacional à extremidade 5' da sequência de codifica- ção de GIS1s com otimização de códon para controlar a expressão:

AATAGAGTATGATTATTTTTTITATATTTTTTTTITTITTGGAAAACAAA ATTCTTATAGTAAMAGTAAGGAATAGTAGCAGAATATTTTTCTGAAGT GTTTATAATAAAGGGAGAACCGGGAAAGTAGCAAAATGATTGGTT AATTTATGCAAATCAATCTTATACTTCCAACGAATAAGAGGGAGTA TATCAAAACAGAGTAACAATAAACTTTTGCTATGACACCTTTTCTIT CTTTCAAAGATAAAAGAATAAGGCTTTTCTATAGTAGTCGAGCAAA TGTTGGAATAAGGAGGTATGGAATTTTGAAAATAGCCTGAGAAATT CAGATCAATGATATATAACTGTTGTCTTCAAAAGGTCTTCAAGGGA AGAAAATTTCCGATCGGAAGTCCAGAATAAATACCACAAGTATAGC ACAATAAACAACAGCACAACAACAATAATAACAACACCTGTAGCGA AAACGTTTTCCTATTTTTAAGGCGTTGTTCTTTGAAAACCTGTGGC GAAGTAAAACATGAAAACAAATGAAAACACCGCCAAACCAAGAAA AGAACAACGAAAAAATATCACTTTTATTTAGTTCACAACGGCTAAC TATCGACGTTCACCCTTCCTCAGTCTATCACATCOGTCCTTAGCOTCOG AACAACGCCGATAGGCATCAAGTTACATTGAGCTTTACTGCACGTT CCCGCATGATGCCATTGACTAGGGCCCGCCCTTTCGGCAATCATT CTAGCATGTTCCGCATGTTC

[0067] O terminador de Eno2 (locus YHR174W;, SEQ ID NO: 4) foi ligado de modo operacional ligado à extremidade 3' da sequência de codificação de GIS1s com otimização de códon para completar o cas- sete de expressão ADR1Pro::GIS1ss::Ebo2Ter:

GTGCACCTTTTITTITCTCCOTTCCAGTGCATTATGCAATAGACAGCA CGAGTCTTTGAAAAAGTAACTTATAAAACTGTATCAATTTTTAAACC TAAATAGATTCATAAACTATTCGTTAATATAAAGTGTTCTAAACTAT GATGAAAAAATAAGCAGAAAAGACTAATAATTCTTAGTTAAAAGCA CTTTACAACTTGTCACCGTGGTGGAAGTTTTCACCG

[0068] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GIS1 de Saccharomyces cerevisiae S288c (Número de acesso ao GenBank NP 010381.1) é mostrada abaixo como a SEQ ID NO: 5:

MEIKPVEVIDGVPVFKPSMMEFANFQYFIDEITKFGIENGIVKVIPPKE WLELLEGSPPAESLKTIQLDSPIQQQAKRWDKHENGVFSIENEYDNK SYNLTQWKNLAESLDSRISQGDFNDKTLKENCRVDSQQDCYDLAQL QILESDFWKTIAFSKPFYAVDENSSIFPYDLTLWNLNNLPDSINSSNRR LLTGQASKCIFPWHLDEQNKCSINYLHFGAPKQWYSIPSANTDQFLKIL SKEPSSNKENCPAFIRHOQNIITSPDFLRKNNIKFNRVVQFQHEFIITFPY CMYSGFNYGYNFGESIEFILDQOQAVVRKQPLKCGCGNKKEERKSGP FSNLSYDSNESEQRGSITONDNDLFQKVRSFDELLNHSSQELQNLED NKNPLFSNINMNRPQSSSLRSTTPNGVNQFLNMNQTTISRISSPLLSR MMDLSNIVEPTLDDPGSKFKRKVLTPQLPQMNIPSNSSNFGTPSLTN TNSLLSNITATSTNPSTTTNGSQNHNNVNANGINTSAAASINNNISSTN NSANNSSSNNNVSTVPSSMMHSSTLNGTSGLGGDNDDNMLALSLAT LANSATASPRLTLPPLSSPMNPNGHTSYNGNMMNNNSGNGSNGSN SYSNGVTTAAATTTSAPHNLSIVSPNPTYSPNPLSLYLTNSKNPLNSG LAPLSPSTSNIPFLKRNNVVTLNISREASKSPISSFVNDYRSPLGVSNP LMYSSTINDYSNGTGIRQNSNNINPLDAGPSFSPLHKKPKILNGNDNS NLDSNNFDYSFTGNKQESNPSILNNNTNNNDNYRTSSMNNNGNNYQ AHSSKFGENEVIMSDHGKIYICRECNRQFSSGHHLTRHKKSVHSGEK PHSCPRCGKRFKRRDHVLQHLNKKIPCTQEMENTKLAES

[0069] Esse cassete de expressão foi amplificado com o uso de ini- ciadores com sequências de flanqueamento adequadas para promover a inserção no sítio POT7 (YHRO76W) e transformado em (i) FERMAXTY Gold (Martrex Inc., Minnesota, EUA; abreviado no presente documento, "FG"), uma levedura de fermentação bem conhecida usada na indústria de etanol de grãos ou (ii) FG-PKL, levedura FG geneticamente modifi- cada que tem uma trajetória de fosfocetolase (PKL) heteróloga que en- volve a expressão de fosfocetolase (PKL), fosfotransacetilase (PTA) e acetil desidrogenada acetilante (AADH), conforme descrito no docu- mento nº WO2015148272 (Miasnikov et a/.). A inserção esperada do cassete de expressão de GIS1 nas duas cepas progenitoras foi confir- mada por PCR.

Exemplo 3. Produção de álcool com o uso de levedura que supe- rexpressa GIS1s

[0070] As cepas que superexpressam GIS1 foram testadas em um ensaio de Ankom, contendo 30 g de liquefeito. As fermentações foram realizadas a 32 ºC por 55 horas. As amostras do final da fermentação foram analisadas por HPLC. Os resultados são resumidos nas Tabelas 1e2. Tabela 1. Resultados de HPLC das cepas FG e FG-GIS1s (9) (9) (9) (9) etanol (%) Fo ses fos Tras To Tabela 2. Resultados de HPLC de FG-PKL e FG-PKL-GIS1s (9) (9) (9) (9) etanol (%) EE es ss om e)

[0071] A superexpressão de GIS1 resultou em 1,4% de aumento de produção de etanol em levedura de FG, que é reconhecida como uma levedura robusta de alta produção de etanol para a indústria de etanol de combustível, ao passo em que não é um organismo geneticamente modificado. A superexpressão de GIS1s resultou em 1,1% de aumento de produção de etanol em levedura FG geneticamente modificada para ter uma trajetória de PKL exógena. Esses resultados novamente de- monstram que a superexpressão de GIS1 é benéfica para aumentar a produção de etanol.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Células de levedura modificadas derivadas de células de levedura progenitoras, caracterizadas pelo fato de que as células modi- ficadas compreendem uma alteração genética que faz com que as cé- lulas modificadas produzam uma quantidade maior de polipeptídeos GIS1 em comparação com as células progenitoras, em que as células modificadas produzem durante a fermentação uma quantidade maior de álcool em comparação com a quantidade de álcool produzida pelas cé- lulas progenitoras sob condições idênticas de fermentação.

2. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a in- trodução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capaci- dade para direcionar a expressão de um polipeptídeo de GIS1 a um nível superior ao da célula progenitora cultivada sob condições equiva- lentes.

3. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a in- trodução de um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de GIS1.

4. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a in- trodução de um gene YDRO96W exógeno.

5. Células modificadas, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que a alteração genética compreende a in- trodução de um promotor mais forte em um gene YDRO96W endógeno.

6. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na expressão do polipeptídeo de GIS1 é pelo menos cerca de vezes em comparação com o nível de expressão nas células proge- nitoras cultivadas sob condições equivalentes.

7. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de aumento na produção de mRNA que codifica o polipeptídeo de GIS1 é pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com o nível nas células progenitoras cultivadas sob condições equivalentes.

8. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de que as células compre- endem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processa- dora de carboidratos.

9. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil- CoA.

10. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de que compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.

11. Células modificadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadas pelo fato de que as células são de um Saccharomyces Spp.

12. Método para aumentar a produção de etanol em células de levedura cultivadas em um substrato de carboidrato, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir em células de levedura proge- nitoras uma alteração genética que faz com que as células modificadas produzam uma quantidade maior de polipeptídeos de GIS1 em compa- ração com as células progenitoras, em que as células modificadas pro- duzem uma quantidade maior de etanol em comparação com as células progenitoras, de outro modo idênticas sob condições de fermentação equivalentes.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução nas células progenitoras de um ácido nucleico com capacidade para di- recionar a expressão de GIS1 a um nível maior que o da célula proge- nitora cultivada sob condições equivalentes.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que a alteração genética compreende a introdução de um cassete de expressão para expressar GIS1.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 14, caracterizado pelo fato de que as células compreendem, ainda, um ou mais genes da trajetória de fosfocetolase.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que os genes da trajetória de fosfocetolase são sele- cionados dentre o grupo que consiste em fosfocetolase, fosfotransace- tilase e acetil desidrogenase de acetilação.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 16, caracterizado pelo fato de que a quantidade de aumento na expressão de GIS1 é pelo menos 10 vezes maior em comparação com o nível de expressão em células progenitoras cultivadas sob con- dições equivalentes, com base na expressão de mRNA que codifica GIS1.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 17, caracterizado pelo fato de que as células compreendem, ainda, um gene exógeno que codifica uma enzima processadora de car- boidratos.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 18, caracterizado pelo fato de que as células compreendem, ainda, uma alteração na trajetória de glicerol e/ou na trajetória de acetil- CoA.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 19, caracterizado pelo fato de que as células compreendem, ainda, uma trajetória alternativa para a produção de etanol.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 20, caracterizado pelo fato de que as células são de um Sac- charomyces Spp.