CN101516383A - 治疗疾病的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗受治疗者的方法和组合物,包括破坏受治疗者的病态细胞。所述方法包括从受治疗者获得细胞群体并且确定获得的细胞群体中至少一种疾病标记基因的活性。然后将编码致死细胞的多肽的多核苷酸分子引入细胞,其中所述致死多肽的表达受至少一种先前鉴别的疾病标记基因的启动子控制。引入多核苷酸后,用诱导所述致死多肽表达的条件处理细胞以破坏表达所述疾病标记基因的细胞。破坏病态细胞后,将没有表达杀死细胞所需程度的致死多肽的剩余活细胞与死细胞分离,并且将活细胞返还到受治疗者。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及治疗受治疗者的方法和组合物,包括通过在表达至少一种疾病标记基因的细胞中引起致死多肽的选择性表达来破坏受治疗者的病态(diseased)细胞。
发明背景
癌症是不受控制的细胞生长导致的一类疾病,其仅在美国就引起每年超过300,000人的顽固性疼痛和死亡。一般来说,致癌基因是促进癌细胞生长的基因。相信癌症的发展依赖于致癌基因的激活和生长抑制基因的同时失活(Park,M,“Oncogenes(致癌基因)”,选自The Genetic Basis of HumanCancer(人类癌症遗传基础)(B.Vogelstein等人编,)第205-228页(1998))。致癌基因是细胞原癌基因的突变的、显性形式,其刺激细胞增殖,而肿瘤抑制基因是隐性的并且通常抑制细胞增殖。
用化疗剂治疗癌症患者仍然是治疗全身性疾病的主要方法,并且化疗剂的剂量强度和临床响应率之间有直接的联系。然而,增加化疗的剂量具有明显的副作用,包括广泛破坏骨髓造血祖细胞并伴随破坏外周骨髓和淋巴细胞结构。通常将干细胞移植和高剂量化疗连同使用以促进化疗后造血系统的恢复。
通常使用同种异体干细胞移植,其是来自患者以外的供体的干细胞的移植。然而,同种异体移植方案具有高死亡率,这主要是由于移植物抗宿主疾病(GVD),其中移植细胞攻击患者自身组织。
自体干细胞移植是一种在高剂量化疗前分离患者的干细胞并接着将其再注入的方案。自体移植避免与GVD相关的并发症,但是有可能导致肿瘤细胞从干细胞产物中再注入。肿瘤细胞的再注入是重要的,因为基因标记研究已经证明再注入的肿瘤细胞可以直接导致疾病的复发和不好的临床结果。例如,在淋巴瘤、白血病、乳腺癌和成神经细胞瘤的情况下,在外周血液干细胞移植方案中至少一些污染的肿瘤细胞具有体外(Ross等人,Blood 82:2605-2610(1993))和在患者中产克隆生长的能力。
为了避免向经受自体干细胞移植的患者再注入癌细胞,医生们已经尝试“清除”骨髓细胞中的污染肿瘤细胞。已经开发多种离体(ex vivo)清除污染干细胞群体(population)的肿瘤细胞的方法。例如,使用针对膜抗原的单克隆抗体和细胞毒性药物、毒素、光疗和生物调节物或使用细胞毒性药物可以将肿瘤污染减少1至3个数量级(Seiden等人,J.InfusionalChemotherapy 6:17-22(1996),通过引用并入)。在另一个方案中,将针对肿瘤细胞的抗体轭合到放射性同位素已经用于尝试清除肿瘤细胞。由于肿瘤细胞和祖细胞通常表现出相似的细胞表面蛋白表型,所以使用细胞毒性药物和/或放射性可能不是特异性的,并且使用这种技术可以延迟移入。虽然清除效力低得多,但是也已经使用选择CD34+造血祖细胞来减少肿瘤细胞的再注入。此外,由于肿瘤细胞可以经常显示CD34抗原,所以这些基于CD34的选择方法的特异性可能不够充分。
因此,本领域需要从用于自身移植目标的细胞群体中特异性清除病态细胞的新方法。
发明概述
本发明涉及治疗受治疗者的方法和组合物,包括破坏受治疗者的病态细胞。在一个实施方案中,所述方法包括从受治疗者获得细胞群体并且确定获得的细胞群体中至少一种疾病标记基因的活性。然后将编码选择标记和致死多肽的多核苷酸分子引入细胞,其中所述致死多肽的表达受至少一种先前鉴别的疾病标记基因的启动子控制。致死肽定义为其自身致死细胞或其产生致死细胞的产物的多肽。引入所述多核苷酸后,将细胞暴露于选定条件以获得含有所述多核苷酸的细胞,然后用诱导所述致死多肽表达的条件处理细胞以破坏表达所述疾病标记基因的细胞。破坏病态细胞后,将没有表达杀死细胞所需程度的致死多肽的剩余活细胞与死细胞分离,并且将活细胞返还(restore)到受治疗者。
在本发明一个实施方案中,在将细胞返还到受治疗者前,切除引入细胞的多核苷酸。在另一个实施方案中,在将细胞返还到受治疗者前,不从细胞切除多核苷酸。这能够在疾病复发出现时,在体内破坏返还的细胞。
本发明另一个实施方案涉及对需要治疗异常疾患(abnormal condition)的受治疗者进行个性化治疗的方法,所述方法包括从受治疗者获得细胞群体,确定细胞群体中至少一种疾病标记基因的活性,分离所述疾病标记基因的至少一种启动子,并且通过将启动子直接或间接地连接到编码致死所述细胞的多肽的多核苷酸而产生治疗性(therapeutic)多核苷酸,并将其置于进一步包含选择标记的载体。将治疗性多核苷酸引入细胞并且将细胞暴露于选定条件以获得含有所述多核苷酸的细胞,然后用诱导所述致死多肽表达的条件处理细胞,从而破坏表达所述疾病标记基因的细胞。然后将剩余活的、非病态细胞返还到受治疗者。
附图简述
图1描述了使用本发明方法的典型治疗程序的工作流程图。图1描述的方法包括基因组整合、选择和杀死。所述构建体可以任选地从基因组切除。该图也列出了属于本发明范围的方法的非限制性变化。基因组整合(G1、G2或G3)的任何方法均可以与选择(S1、S2或S3)和杀死细胞(K1、K2、K3或K4)的任何方法组合。如果基因组中存在可以允许切除的组件(component),同样也可以选择基因组切除(E1、E2或E3)的任何方法。
图2描述本发明的治疗性多核苷酸的一个实施方案。在图2中,PE3-1基因程序(gene program)是基因组整合选择者/报道基因。PE3-2基因程序是驱动致死多肽(如DTA)表达的疾病标记基因启动子。PE3-3基因程序是驱动重组酶(如Cre)表达的诱导型启动子,如TetO。PE3-4基因程序是驱动诱导物cDNA(inducer cDNA)(如rTTA)表达的组成型启动子。PE3-ns基因程序是可以用于提高靶向效力的负选择者/报道基因。箭头符号代表重组酶(如Cre)识别的顺式调节序列,如loxP。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括染色质修饰结构域(CMD)的区域。GIS-1和GIS-2是基因组整合位点。
图3描述本发明的治疗性多核苷酸的另一个实施方案。在图3中,PE3-1基因程序是基因组整合选择者/报道基因。PE3-2和PE3-3基因程序各自为驱动Rheo转录因子两半中的一半(one of two halves)表达的疾病标记基因启动子。PE3-4基因程序是驱动致死多肽(如DTA)表达的Rheo启动子。Rheo启动子需要有Rheo转录因子,其包含在配体存在下结合到一起的两个亚基。Rheo转录因子的每个亚基分别在PE3-2和PE3-3基因程序中表达。PE3-5基因程序是驱动诱导物cDNA(如rTTA)表达的组成型启动子。PE3-6基因程序是驱动重组酶(如Cre)表达的诱导型启动子,如TetO。PE3-ns基因程序是可以用于提高靶向效力的负选择者/报道基因。箭头符号代表重组酶(如Cre)识别的顺式调节序列,如loxP。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括染色质修饰结构域(CMD)的区域。GIS-1和GIS-2是基因组整合位点。
图4描述本发明的治疗性多核苷酸的另一个实施方案。在图4中,PE3-1基因程序是基因组整合选择者/报道基因。PE3-2基因程序是驱动致死多肽(如DTA)表达的疾病标记基因启动子。PE3-3基因程序是驱动致死多肽表达的疾病标记基因启动子。所述启动子和致死多肽与PE3-2基因程序中的启动子和致死多肽可以是相同的或不同的。PE3-4基因程序是驱动诱导物cDNA(如rTTA)表达的组成型启动子。PE3-5基因程序是驱动重组酶(如Cre)表达的诱导型启动子,如TetO。PE3-ns基因程序是可以用于提高靶向效力的负选择者/报道基因。箭头符号代表重组酶(如Cre)识别的顺式调节序列,如loxP。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括染色质修饰结构域(CMD)的区域。GIS-1和GIS-2是基因组整合位点。
图5描述本发明的治疗性多核苷酸的一个实施方案。在图5中,PE3-1基因程序是基因组整合选择者/报道基因。PE3-2基因程序是驱动致死多肽(如DTA)表达的疾病标记基因启动子。PE3-3基因程序是驱动诱导物cDNA(如rTTA)表达的组成型启动子。PE3-4基因程序是驱动重组酶(如Cre)表达的诱导型启动子,如TetO。PE3-5基因程序是驱动促进祖细胞去分化的因子的表达的组成型启动子。PE3-ns基因程序是可以用于提高靶向效力的负选择者/报道基因。箭头符号代表重组酶(如Cre)识别的顺式调节序列,如loxP。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括染色质修饰结构域(CMD)的区域。GIS-1和GIS-2是基因组整合位点。
图6描述本发明的治疗性多核苷酸的一个实施方案。在图6中,PE3-1基因程序是在组成型启动子的控制下的neo选择者基因。PE3-2基因程序是驱动诱导物cDNA(如rTTA)表达的疾病标记基因启动子。PE3-3基因程序是驱动致死多肽(如DTA)表达的诱导型启动子,如TetO。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括有染色质修饰结构域(CMD)的存在的区域。
图7描述本发明的治疗性多核苷酸的一个实施方案。在图7中,PE3-1基因程序是由祖细胞特异性启动子驱动的基因组整合选择者,如neo。PE3-2基因程序是驱动诱导物cDNA(如rTTA)表达的疾病标记基因启动子。PE3-3基因程序是驱动杀手基因(killer gene)(如DTA)表达的诱导型启动子,如TetO。PE3-4基因程序是驱动第二诱导物cDNA(如)表达的组成型启动子。PE3-5基因程序是驱动表达重组酶(如Cre)以缺失构建体的诱导型启动子,如。箭头符号代表重组酶识别的顺式调节序列,如loxP位点。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括有染色质修饰结构域(CMD)的存在的区域。
图8描述本发明的治疗性多核苷酸的一个实施方案。在图8中,PE3-1基因程序是由干细胞启动子驱动的基因组整合选择者基因。PE3-2基因程序是驱动诱导物cDNA(如rTTA)表达的疾病标记基因启动子。PE3-3基因程序是驱动基于酶的底物向杀手基因(如胸苷激酶)的致死转化的诱导型启动子,如TetO。PE3-ns基因程序是负选择者基因,如驱动胞嘧啶脱氨酶(CDA)或白喉(DTA)表达以提高靶向效力的组成型启动子。圆圈代表多核苷酸序列中可以包括有染色质修饰结构域(CMD)的存在的区域。GIS-1和GIS-2是基因组整合位点。
发明详述
本发明涉及治疗受治疗者的方法和组合物,包括破坏受治疗者的病态细胞。所述方法包括从受治疗者获得细胞群体并且确定获得的细胞群体中至少一种疾病标记基因的活性。然后将编码致死细胞的多肽的多核苷酸分子引入细胞,其中所述致死多肽的表达受至少一种先前鉴别的疾病标记基因的启动子控制。引入所述多核苷酸后,用诱导所述致死多肽表达的条件处理细胞以破坏表达所述疾病标记基因的细胞。破坏病态细胞后,将没有表达杀死细胞所需程度的致死多肽的剩余活细胞与死细胞分离,并且将活细胞返还到受治疗者。
在本发明一个实施方案中,在将细胞返还到受治疗者前,切除引入细胞的多核苷酸。在另一个实施方案中,在将细胞返还到受治疗者前,不从细胞切除多核苷酸。这能够在疾病复发出现时,在体内破坏再引入的细胞。
如本文所用,“病态细胞”用于表示有任何异常的代谢、组织学、生长速率、有丝分裂速率或表型的一个或多个细胞。如本文所用,涉及细胞的术语“表型”用于表示来自特定组织或器官的细胞正常表达的蛋白质的集合。例如,根据是否存在细胞表面标记(如是细胞表面抗原的分化簇(clusters of differentiation)(CD因子)),可以评估或分类个体分离细胞的表型。虽然通常认为细胞的表型是细胞表达或含有的蛋白质的集合,但是仅需要确定单一蛋白质的存在与否即可充分地将细胞分类于给定群体或亚群或评估其表型。因此如本文所用,术语“表型”用于根据是否存在至少一种蛋白质或其部分而暗示细胞所属的特定群体或亚群。例如,本发明的特定实施方案包括分离通常在外周血液和骨髓中发现的CD34+细胞。继续此实例,分离细胞的给定群体或亚群的表型可以简单地表示为CD34阳性(CD34+)或CD34阴性(CD34-)。当然,本发明的方法也预期(contemplate)确定是否存在多于一种的蛋白质以将细胞分类于给定的细胞群体或亚群。可以用于分类细胞表型的CD蛋白质的实例包括但不限于CD3、CD38、CD59、CD49、CD54、CD61(玻连蛋白受体)、CD71、CD73(SH3)、CD90(Thy-1)、CD105(SH2)、CD117、CD133、CD144和CD166。也可以使用其他蛋白质来确定给定细胞或细胞群体的表型。可以用于分类细胞表型的其它蛋白质的实例包括但不限于转录因子(诸如OCT4、cdx2和Sox2)、转运蛋白(诸如胎盘ABC转运蛋白(ABC-p))和其它细胞表面抗原(诸如硫酸角蛋白相关抗原、TRA-1-60、TRA-1-81、Thy-1和阶段特异性胚胎抗原(SSEA)(如SSEA-1、SSEA-2、SSEA-3和SSEA-4))。用于分类细胞表型的蛋白质的更多实例包括生长因子受体,诸如成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子α(TGFα)、转化生长因子β(TGFβ)、激活蛋白IIa和骨形成蛋白(BMP)的受体,以及主要组织相容性复合体(MHC)蛋白,即I类和II类MHC蛋白。还有更多用于鉴别细胞表型的标记的实例是CK(细胞角蛋白)9、CK19、pdx-1、巢蛋白、Pax-6、Nkx2.2、神经丝、Tau、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、MAP2激酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrilliary acidic protein,GFAP)和环核苷酸磷酸二酯酶。此外,检测是否存在蛋白质的部分或结构域而非整体蛋白质以评估或分类细胞表型也是可能的。例如,一些蛋白质可能包括诸如SH1、SH2、SH3、SH4等的src同源结构域(SH),其存在与否可以足以充分地评估或分类细胞表型,如SH2+或SH2-。如以上公开,特定蛋白质的缺少也可以评估或分类细胞表型。
鉴别细胞表型的方法包括但不限于使用诸如抗-CD34抗体的抗原特异性抗体的标准免疫组织化学技术。评估或分类细胞表型的其它方法包括但不限于标准印迹技术(诸如蛋白质印迹法和RNA印迹法)和聚合酶链式反应(PCR)技术(诸如逆转录酶PCR(RT-PCR))。其实,应该清楚可以使用间接方法评估或分类细胞表型,所述间接方法诸如测量或检测mRNA的测定(如RT-PCR)。评估或分类细胞表型的其它方法包括微阵列技术和流式细胞术技术。用于根据细胞的表型分类细胞的流式细胞术技术的实例参见Practical Flow Cytometry(实用流式细胞术),第3版,Wiley-Liss,Inc.(1995),其特此通过引用并入。
例如,与取自相同来源或组织的其它细胞相比,病态细胞可能具有异常表型。例如,造血干细胞正常表达CD34和CD59,但不表达CD4,CD4由胸腺细胞、T辅助细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞、树突细胞或粒细胞正常表达。因此就本发明而言,可以认为任何表达CD34、CD59和CD4的造血干细胞具有异常表型,即所述细胞是病态的。在一个实施方案中,所述细胞包括造血干细胞,其中所述造血干细胞的至少一部分是病态细胞。
干细胞的其它实例包括但不限于肝干细胞、乳腺干细胞、胰腺干细胞、神经元干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞。干细胞可以是或不是多能的(pluripotent)。“多能细胞”包括能够分化成或产生多能、多潜能(multipotent)、寡能(oligopotent)和单能(unipotent)细胞的细胞和它们的后代。“多潜能细胞”包括能够分化成或产生多潜能、寡能和单能祖细胞和/或一种或多种成熟或部分成熟细胞类型(除非源于多潜能细胞的成熟或部分成熟细胞类型限于特定的组织、器官或器官系统的细胞)的细胞和它们的后代。如本文所用,“部分成熟细胞”是表现出来自相同器官或组织的成熟细胞的至少一种表型(如形态学或蛋白质表达)特征的细胞。例如,多潜能造血祖细胞和/或其后代拥有分化成或产生一种或多种类型的寡能细胞(诸如骨髓祖细胞和淋巴祖细胞)的能力,并且还产生正常发现于血液中的其它成熟细胞组分。“寡能细胞”包括其分化成成熟或部分成熟细胞的能力比多潜能细胞更加有限的细胞和其后代。然而,寡能细胞仍然拥有分化成寡能和单能细胞和/或给定组织、器官或器官系统的一种或多种成熟或部分成熟细胞类型的能力。寡能细胞的一个实例是骨髓祖细胞,其最终可以产生成熟或部分成熟的红细胞、血小板、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞和单核细胞。“单能细胞”包括拥有分化成或产生其它单能细胞和/或一种类型的成熟或部分成熟的细胞类型的能力的细胞和它们的后代。如本文所用,术语“祖细胞”用于表示能够分化成至少部分成熟的细胞,但是在培养基中缺乏无限自我更新能力的细胞和它们的后代。如本文所用,祖细胞可以是多能的、多潜能的、寡能的或甚至是单能的。
本发明的方法包括从需要治疗的受治疗者获得细胞群体。如本文所用,术语“受治疗者”与术语“患者”互换使用,并且用于表示动物,特别是哺乳动物,并且甚至更加特别的是非人或人灵长类。
如本文所用,当使用涉及细胞时,术语“获得”意在表示从受治疗者移除细胞的任何过程。当从受治疗者获得它们时,细胞不需要分离或纯化。细胞可以获自受治疗者的任何体液(如血液、血清、尿、唾液、脑脊髓液)或受治疗者的组织样品(如活体检查、骨髓抽取液)。获得后,即可以分离所需的细胞。
如本文所用,当使用涉及细胞或细胞群体时,术语“分离的”或“分离”或其变体表示所述细胞或细胞群体已经与存在的围绕所述一个或多个细胞的大部分周围环境分子和/或材料分离(当所述一个或多个细胞与生物系统(如骨髓)有关时)。当确定细胞是否已经“分离”时,不考虑诸如水、盐和缓冲剂的材料的浓度。因此,术语“分离的”既非意在暗示或表示特定表型的细胞的纯化群体,也非意在表示完全缺乏碎片、无活性细胞或不同表型细胞的细胞群体。分离细胞的方法应该不限于本文描述的发明范围。例如,可以使用公知的方法分离细胞,例如流式细胞术或利用细胞表型的其他方法。分离细胞的另外方法包括使用治疗性构建体可以含有的正或负选择者,以便可以在将治疗性多核苷酸引入细胞之前或之后分离细胞。因此,在一个实施方案中,构建体可以包含可用于将所需细胞与最初获得的其他细胞“分离”的正选择者。如本文所用,当使用涉及细胞或细胞群体时,术语“纯化的”表示所述一个或多个细胞已经与正常包围所述一个或多个细胞的几乎所有材料分离(当所述一个或多个细胞与生物系统有关时)。因此,就十分接近于被纯化的分离细胞的细胞和/或材料而言,“纯化的”是依赖于条件变化的相对术语。因此,认为分离的造血细胞在分离后是纯化的,即使洗涤或进一步的处理去除了至少一些细胞碎片、无活性细胞、不同表型的细胞或诸如蛋白质和/或糖类的细胞或分子。术语纯化的不是用于表示从被纯化的细胞中除去所有预期除去的物质。因此,一些量的杂质可以伴随纯化的细胞存在。
在一个实施方案中,所述至少一种疾病标记基因的活性是在获得细胞后确定的。在另一个实施方案中,所述至少一种疾病标记基因的活性是在获得细胞前确定的。因此,如果受治疗者的疾病或异常疾患表现出疾病或异常疾患(其中已经确认一系列疾病标记基因的活性)的典型症状或标记,那么可以假设或推断一种或多种疾病标记基因的活性。如本文所用,疾病标记基因意在表示其表达水平可以用于评估、诊断或帮助诊断疾病或异常疾患的基因。疾病标记基因包括只在病态细胞中表达的基因和在正常细胞中表达但是在病态细胞中以升高的水平表达的基因。虽然疾病标记基因最公知的实例是致癌基因,但是本发明的方法不限于致癌基因。致癌基因的种类的实例包括但不限于生长因子、生长因子受体、蛋白质激酶、程序性细胞死亡调节基因和转录因子。致癌基因的具体实例包括但不限于sis、erbB、erb B-2、ras、abl、myc和bcl-2以及TERT。其他疾病标记基因的实例包括肿瘤相关抗原基因和在病态细胞中过度表达的其他基因(如MAGE-1、癌胚抗原、酪氨酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn和Thompson-Friedenreich抗原(TF))。
一旦确定疾病标记基因,将这些疾病标记基因的启动子置于治疗性多核苷酸。如本文所用,术语治疗性多核苷酸用于表示为了破坏病态细胞而向细胞群体引入的多核苷酸。在一个实施方案中,将启动子插入多核苷酸以便其可操作地连接到编码致死细胞的多肽的多核苷酸的一部分。因此,本方法利用病态细胞的异常活性以便病态细胞将最终破坏其自身。如本文所用,术语“可操作地连接”表示核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点阵列(array))和第二个核酸序列之间的功能连接,其中表达控制序列指导相应于第二个序列的核酸的转录。在另一个实施方案中,所述启动子与所述致死多肽的表达间接相关。例如,疾病标记启动子可以可操作地连接到激活第二启动子的转录因子,所述第二启动子可操作地连接到编码致死多肽的多核苷酸。
本文使用的术语“启动子”和其在本领域中使用的相同。即术语启动子是指允许结合RNA聚合酶以启动遗传序列转录的DNA区域。许多疾病标记基因的序列,包括启动子区,在本领域是已知的并且可在公共数据库(如GenBank)中获得。因此,一旦在获得的或分离的细胞中鉴别出疾病标记基因,可以容易地鉴别和获得启动子序列。本发明的另一个方面涉及鉴别可以分离其启动子并置于治疗性多核苷酸中的疾病标记基因。因此,疾病标记基因的身份(identity)对本发明的具体实施方案可能不重要,只要可以分离并在随后设置或环境中使用所述启动子。因此,本发明包括使用来自尚未鉴别的疾病标记基因的启动子。一旦鉴别新的疾病标记基因,确定启动子功能需要的遗传序列就可以是常规技术或实验问题。事实上,存在几个商业方案帮助确定所关注的基因的启动子区。例如,Ding等人最近阐述了通过渐进地缺失人Sprouty4基因的5’-侧翼序列获得的新型Sprouty4基因的启动子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.,287:L52-L59(2004),其通过引用并入)。简单地说,一旦确定转录起始位点,即可使用普通PCR引物产生PCR片段,以单向方式克隆5’-侧翼区段的区段。将产生的区段克隆于荧光素酶报道基因载体并且测量荧光素酶活性以确定人Sprouty4基因启动子区。
获得并确认疾病标记基因启动子的方案的另一个实例包括以下步骤:(1)获得相似/相同组织类型的癌性和非癌性细胞/组织样品;(2)从样品中分离总RNA或mRNA;(3)执行癌性和非癌性RNA的差别微阵列分析;(4)鉴别候选癌症特异性转录物;(5)鉴别与所述癌症特异性转录物相关的基因组序列;(6)获得或合成所述癌症特异性转录物的预测转录起始位点上游和下游的DNA序列;(7)使用来自步骤6的不同长度的DNA设计和制备启动子报道基因载体;以及(8)在癌性和非癌性细胞/组织以及不相关的细胞/组织中检测启动子报道基因载体。
插入治疗性多核苷酸的启动子的来源可以是天然的或合成的,并且启动子的来源不应该限制本文所述的发明的范围。换句话说,所述启动子可以是从获得的或分离的细胞直接克隆的,或者所述启动子可以是先前已从不同来源克隆的,或所述启动子可以是已经合成的。
在一个实施方案中,所述启动子可操作地连接到编码多肽的多核苷酸,所述多肽在表达时致死表达其的细胞,原因是所述多肽自身是致死的或所述多肽产生致死的化合物。如本文所用,致死细胞的多肽也包括以任何方式诱导细胞死亡的多肽,包括但不限于坏死、凋亡和细胞毒性。可以致死细胞的多肽的实例包括但不限于凋亡诱导肿瘤抑制基因(例如但不限于p53、Rb和BRCA-1)、毒素(仅举几个例子,例如白喉毒素(DTA)、志贺氏菌神经毒素、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、CSE-V2和蝎蛋白质毒素的其他变体)、自杀基因(诸如胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶)和细胞毒性基因(诸如肿瘤坏死因子、干扰素α)。本发明不受致死蛋白质的身份的限制,只要所述蛋白质能够致死表达其的细胞。
在另一个实施方案中,所述疾病标记基因启动子与所述致死多肽的表达间接相关。在一个实施方案中,所述疾病标记基因启动子可操作地连接到编码转录因子的多核苷酸,并且编码所述致死多肽的多核苷酸可操作地连接到被所述转录因子激活的启动子。所述转录因子可以是仅在配体存在时激活转录的配体依赖性转录因子,例如由它们各自的配体激活的类固醇受体超家族的成员(如糖皮质激素、雌激素、孕酮、类视黄醇(retinoid)、蜕皮激素和其类似物和模拟物),或四环素激活的rTTA。转录因子可以是自然存在的多肽或含有来自两个或多个不同转录因子的结构域的嵌合多肽。例如,配体结合结构域、反式激活域和DNA结合结构域各自可以从两个或三个不同的转录因子获得。在一个实施方案中,转录因子是受存在的配体水平紧密调节的转录因子。在另一个实施方案中,可以在不同的多肽上表达转录因子的结构域,以便仅当两个多肽二聚化到一起(且存在配体)时才发生转录的激活。这种系统的一个实例是嵌合蜕皮激素受体系统,参见美国专利第7,091,038号、美国公布专利申请第2002/0110861、2002/0119521、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416号,以及国际公布申请第WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO 2005/108617号,其均通过引用整体并入。非类固醇蜕皮激素激动剂调节的系统的实例是哺乳动物诱导型表达系统(New England Biolabs,Ipswich,MA)。
为了将治疗性多核苷酸引入细胞,可以使用含有所选启动子和编码致死多肽的多核苷酸的载体。例如,所述载体可以是质粒载体、单链或双链噬菌体载体或单链或双链RNA或DNA病毒载体。此类载体可以通过将DNA和RNA引入细胞的公知技术引入细胞。病毒载体可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在后一种情况下,病毒繁殖通常仅发生于互补宿主细胞。如本文所用,术语“宿主细胞”或“宿主”用于表示含有(harboring)一个或多个治疗性多核苷酸的本发明的细胞。
因此,所述载体必须至少包括来自疾病标记基因的启动子和编码致死多肽的多核苷酸。所述载体的其他组件可以包括但不限于选择标记、染色质修饰结构域、驱动所述载体也可能存在的其他多肽表达的附加启动子、基因组整合位点、重组位点和分子插入支点(pivot)。所述载体可以包括任何数量的这些附加元件,以便可以使构建体适合期望治疗方法的具体目标。
在本发明的一个实施方案中,引入细胞的载体进一步包含“选择标记基因”,其在表达时表明已经将本发明的治疗性构建体整合到宿主细胞的基因组。在这一方式中,选择者基因可以是基因组整合的正标记。虽然对本发明的方法不重要,但是选择标记基因的存在允许医生选择其中载体构建体已经整合到细胞基因组的活细胞群体。因此,本发明的某些实施方案包括选择已经成功整合载体的细胞。如本文所用,当与细胞联合使用时,术语“选择”或其变体意在表示选择具有特异的遗传组成或表型的细胞的标准公知方法。典型的方法包括但不限于在存在诸如G418、新霉素和氨苄青霉素的抗生素下培养细胞。选择标记基因的其他实例包括但不限于赋予二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸抗性的基因。选择的其他方法包括但不限于允许使用胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶作为选择剂的选择标记基因。然后包括含有一个或多个抗生素抗性基因的载体构建体的细胞将能够忍受培养基中的抗生素。同样地,不包括含有一个或多个抗生素抗性基因的载体构建体的细胞将不能忍受培养基中的抗生素。
如本文所用,“染色质修饰结构域”(CMD)指与维持和/或改变染色质结构(例如但不限于DNA绝缘子)相关的各种蛋白质相互作用的核苷酸序列。参见Ciavatta,D等人,Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.,103(26):9958-9963(2006),其通过引用并入本文。CMD的实例包括但不限于鸡β球蛋白绝缘子和鸡超敏位点4(cHS4)。例如,一种或多种基因程序之间不同CMD序列的使用可以促进差别CMD DNA序列作为“微型同源臂”与多种微生物或体外重组工程技术的组合使用,以在现有多基因和单基因穿梭载体之间“交换”基因程序。染色质修饰结构域的其他实例为本领域所知,或者可以容易鉴别。
本发明使用的特定载体是编码蛋白质或其部分的表达载体。通常,此类载体包含可操作地连接到待表达的多核苷酸的有效促进在宿主中表达的顺式作用控制区。合适的反式作用因子由宿主提供,由互补载体提供或在引入宿主时由载体自身提供。
许多表达载体可以用于表达蛋白质。此类载体包括染色体载体、游离型载体和病毒衍生载体,例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(诸如腺伴随病毒、慢病毒、杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒(pseudorabies viruses)和逆转录病毒)的载体和衍生自其组合的载体,例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的那些,如粘粒和噬菌粒。根据本发明的这一方面,所有载体均可以用于表达。通常在这点上,适于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸或蛋白质的任何载体均可以用于表达。
将表达载体中的DNA序列可操作地连接到合适的表达控制序列,包括例如,指导mRNA转录的启动子。附加启动子的代表包括但不限于组成型启动子和组织特异性或诱导型启动子。组成型真核启动子的实例包括但不限于小鼠金属硫蛋白I基因启动子(Hamer等人,J.Mol.Appl.Gen.1:273-288(1982));疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell 31:355-365(1982));SV40早期启动子(Benoist等人,Nature(London)290:304-310(1981));和牛痘病毒启动子。所有以上列出的参考文献通过引用并入本文。可以用于驱动蛋白质的表达的启动子的另外实例包括但不限于组织特异性启动子和其他具体蛋白质的内源启动子,例如白蛋白启动子(肝细胞)、胰岛素原启动子(胰腺β细胞)以及类似启动子。通常,表达构建体将包含转录、启动和终止位点,并且在转录区包含翻译的核糖体结合位点。所述构建体表达的成熟转录物的编码部分可以包括待翻译多肽开始处的翻译起始AUG和合适地位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
此外,构建体可以包括调节和产生表达的控制区。通常,此类区域将通过控制转录而起作用,特别是如阻抑物结合位点和增强子。
含有合适核苷酸序列以及合适启动子和其他合适控制序列的载体可以使用适合于表达期望多肽的多种公知技术引入本发明的细胞。
真核载体的实例包括但不限于可从Stratagene获得的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG;可从Amersham Pharmacia Biotech获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL;以及可从Clontech获得的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其他载体是公知的并且是可商业获得的。
含有用于快速插入和去除基因程序元件的分子插入支点的特别有用的载体参见美国公布专利申请第2004/0185556号、美国专利申请第11/233,246号和国际公布申请第WO 2005/040336和WO 2005/116231号,其均通过引用并入。此类载体的实例是UltraVectorTM生成系统(IntrexonCorp.,Blacksburg,VA)。如本文所用,“基因程序”是遗传元件的组合,其包含启动子(P)、表达序列(E)和3’调节序列(3),因此图中出现的“PE3”是基因程序。可以在位于基因程序每个元件的侧翼的分子支点之间容易地交换基因程序中的元件。如本文所用,分子支点定义为含有以线性方式排列的至少两个不易变异的(non-variable)罕见(rare)或不常见(uncommon)的限制位点的多核苷酸。在一个实施方案中,分子支点包含以线性方式排列的至少三个不易变异的罕见或不常见的限制位点。通常,任何一个分子支点不会包括同一基因程序中任何其他分子支点的罕见或不常见的限制位点。给定限制酶作用依赖的多于6个核苷酸的同族序列被称为“罕见”限制位点。然而存在比统计预测的发生频率更低的6bp限制位点,并且这些位点和切割它们的内切核酸酶被称为“不常见”限制位点。罕见或不常见限制酶的实例包括但不限于AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaBI、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、Afl III、Pvu I、NgoMIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I和Sse8781 I。
载体还可以包含称为回归内切核酸酶(HE)酶的第二类限制酶的限制位点。HE酶具有大型不对称限制位点(12-40碱基对),并且它们的限制位点是自然界不常见的。例如,称为I-SceI的HE具有18bp的限制位点(5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′(SEQ ID NO:1)),预测其在每7×1010个随机序列碱基对中仅出现一次。这一出现率相当于在20倍于哺乳动物基因组大小的基因组中只有一个位点。HE位点的罕见性质极大地增加了以下可能性:如果克隆载体质粒的合适位置包括HE位点,那么遗传工程师可以在不破坏基因程序完整性的情况下切割基因程序。
选择在宿主细胞中表达的合适载体和启动子是公知程序,并且载体的构建和向宿主引入以及其在宿主中的表达的必要技术是本领域的常规技术。
构建体向细胞的引入可以是瞬时转染、稳定转染或可以是载体的基因座特异性插入。载体向宿主细胞的瞬时和稳定转染可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现。许多标准实验室手册描述了此类方法,如Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基础方法)(1986);Keown等人,1990,Methods Enzymol.185:527-37;Sambrook等人,2001,MolecularCloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验手册),第三版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,N.Y,其特此通过引用并入。这些稳定转染方法导致载体向细胞基因组的随机插入。此外,一般来说,载体的拷贝数量和方向也是随机的。
在本发明的一个实施方案中,载体被插入到基因组的生物中性位点(bio-neutral site)。生物中性位点是基因组中构建体的插入对细胞的正常功能干扰非常小(如果有)的位点。可以使用可用的生物信息学来分析生物中性位点。本领域已知许多生物中性位点,如ROSA等同基因座(ROSA-equivalent locus)。其他生物中性位点可以使用本领域公知的常规技术鉴别。使用本领域已知的方法执行基因组插入位点的鉴定。当将载体引入细胞时,为了控制构建体的位置、拷贝数量和/或方向,可以使用基因座特异性插入方法。基因座特异性插入方法为本领域所公知并且包括但不限于同源重组和重组酶介导的基因组插入。当然,如果将基因座特异性插入方法用于本发明的方法,那么载体可以包含帮助这种基因座特异性插入(例如但不限于同源重组)的元件。例如,载体可以包括一、二、三、四或更多基因组整合位点(GIS)。如本文所用,“基因组整合位点”定义为载体序列中其核苷酸序列与细胞的基因组的部分是相同的或近似相同的而允许载体插入基因组的部分。特别地,载体可以包括至少位于疾病标记基因启动子和编码致死多肽的多核苷酸的侧翼的两个基因组插入位点。当然,GIS可以位于附加元件,或甚至载体中存在的所有元件的侧翼。
在另一个实施方案中,基因座特异性插入可以通过重组酶位点特异性基因插入执行。简单而言,细菌重组酶(诸如但不限于PhiC31整合酶)可以作用于人基因组中的“假”重组位点。这些假重组位点可以是使用重组酶的基因座特异性插入的靶。重组酶位点特异性基因插入参见Thyagarajan,B等人,Mol.Cell Biol.21(12):3926-34(2001),其特此通过引用并入。可以用于重组酶位点特异性基因插入的重组酶和它们各自的位点的其他实例包括但不限于丝氨酸重组酶,诸如R4和TP901-1。
本发明的其他实施方案包括但不限于细胞的基因型分型(genotyping)。本文所用的术语基因型分型与其在本领域中使用的相同。具体地,本发明的方法的特定实施方案提供在诱导杀死病态细胞之前或之后对细胞的基因型分型。此外,本方法预期了对细胞进行一次或多次基因型分型以用于质量保证的目的。可以以提供关于全部或部分细胞基因组的遗传序列信息的任何方式执行基因型分型。例如,基因型分型可以通过分离DNA和随后的测序来执行,或它可以通过PCR方法或限制分析或其任何组合执行。
可以执行受治疗者细胞的基因型分型以确定受治疗者的基因组表达概况(genomic profile)。这一信息可以用于确定受治疗者是否易诱发(predispose)突变事件,所述突变事件会使受治疗者在返还到受治疗者的非病态细胞的后代中更易疾病复发。突变事件的诱因(predisposition)一般可以通过检测编码DNA合成的基因和修复的基因或与受治疗者的突变事件相关的其他基因的变化或突变来鉴别。具体类型的疾病的诱因可以通过检测与该疾病相关的基因的变化或突变而鉴别。受治疗者基因型的知识可以用于为每个受治疗者设计合适的治疗性多核苷酸。例如,如果受治疗者易诱发特定疾病,那么特定疾病特异性的启动子或致死多肽可以是最合适的。如果受治疗者易诱发疾病的复发,则优选不切除治疗性多核苷酸,以便在较晚时可以在体内清除病态细胞(如果需要)。在另一个实例中,受治疗者的基因型可以用于确定基因组中特定插入位点是更加合适或更加不合适。基于受治疗者基因组表达概况的个性化治疗性多核苷酸的设计可以根据如图1所示的多核苷酸的每个参数的选择进行。如上所述,其部分容易互换的载体系统完美地适合于装配基于受治疗者基因型的受治疗者特异性的治疗性多核苷酸。
此外,本发明的方法的特定实施方案包括切除治疗性多核苷酸。通常,本发明的方法将导致治疗性多核苷酸向所有或大多数细胞的引入,无论所述细胞的疾病状态如何。因此,可能需要从非病态细胞移除所述治疗性多核苷酸。为了帮助其自身切除,构建体可以因此包含诸如重组酶位点的附加元件。重组酶位点的一个实例包括但不限于公知的cre-lox上的loxP位点或与Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3解离酶、ФC31、TndX、XerC和XerD重组酶相关的重组酶位点。可以使用其他的重组酶位点,条件是有合适的重组酶可以作用于所述重组酶位点。构建体也可以含有编码一种或多种重组酶的基因。重组酶的表达可以处于诱导型启动子的控制下,以便在期望的时间诱导切除。
在本发明的一个实施方案中,所述治疗性多核苷酸可以在已经破坏病态细胞之后并且在将存活细胞返还到受治疗者之前,从存活细胞中切除。在另一个实施方案中,可以将存活细胞返还到受治疗者而不切除治疗性多核苷酸。在这一实施方案中,可以在将细胞返还到受治疗者后的任何时间于体内诱导致死多肽的表达。如果受治疗者疾病复发,可以使用这一实施方案。许多原因可以引起复发,包括受治疗者易诱发突变事件,所述突变事件导致在返还到受治疗者的非病态细胞的后代中的疾病复发。复发也可能是由于在将细胞返还到受治疗者前未完全清除所有病态细胞而发生的。在体内破坏病态细胞的能力(如,通过让致死多肽处于诱导型启动子控制下并向受治疗者提供诱导剂)允许受治疗者避免额外的离体移植循环和与该循环相关的风险(如移植前清除骨髓所需的照射/化疗)。这一实施方案也允许临床医生控制致死多肽的体内发作、水平和持续时间。
在进一步的实施方案中,所述治疗性多核苷酸可以包含化学抗性基因,如多药耐药性基因mdr1。化学抗性基因可以处于组成型(如CMV)或诱导型(如)启动子控制下。在这一实施方案中,如果受治疗者疾病复发,临床医生可以应用更强剂量的化疗剂以破坏病态细胞,而返还的细胞将不受所述试剂影响。通过将化学抗性基因置于诱导型启动子下,可以避免所述化学抗性基因的不必要的表达,但是它在疾病复发的情况下仍然可用。如果返还细胞自身成为病态的,则仍然可以通过诱导致死多肽的表达破坏它们,如上所述。
更多的实施方案预期了在将细胞再引入受治疗者之前分析和/或扩增(expanding)存活细胞群体。例如,在将细胞返还到受治疗者之前,可以使用本文描述或提及的任何方法或方案对存活细胞进行基因型分型和/或表型分析(phenotyped)。
在另一个方面,本发明提供了可以与本发明的方法联合使用的试剂盒。根据本发明这一方面的试剂盒可以包含一个或多个容器,其可以含有选自由一种或多种核酸分子、限制酶和一种或多种含有此类核酸分子的细胞组成的组的一种或多种组分。本发明的试剂盒可以进一步包含含有适用于培养本发明的细胞的细胞培养基的一个或多个容器、含有适用于培养本发明细胞的抗生素的一个或多个容器、含有缓冲剂的一个或多个容器、含有转染试剂的一个或多个容器和/或含有酶促反应底物的一个或多个容器。
本发明的试剂盒可以含有可以用于本发明的许多核酸分子。本发明试剂盒可以提供的核酸分子的实例包括含有启动子、编码致死多肽的序列、增强子、抑制子(repressor)、选择标记、转录信号、翻译信号、引物杂交位点(例如用于测序或PCR)、重组位点、限制位点和多聚接头、在阻抑型tRNA存在下阻抑翻译终止的位点、阻抑型tRNA编码序列、编码结构域和/或区域的序列、复制起点、端粒、着丝粒及类似序列的核酸分子。除了转录调节序列之外,本发明的核酸分子还可以包含任何一种或多种这些特征,如上所述。
本发明的试剂盒可以包含含有一种或多种重组蛋白的容器。合适的重组蛋白包括但不限于Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3解离酶、ФC31、TndX、XerC和XerD。其他合适的重组位点和蛋白质是与可从Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA获得的GATEWAYTM克隆技术相关的那些,并描述于GATEWAYTM克隆技术产品资料,其全部公开内容通过引用并入本文。
在使用中,本发明试剂盒中提供的含有一种或多种疾病标记基因启动子(P)的核酸分子可以与致死多肽的表达多核苷酸(E)和3’调节序列(3)组合以制备PE3基因程序。例如,含有一个或多个3’调节序列的核酸分子可以提供为在所述3’调节序列的5’和3’末端具有分子支点。
本发明的试剂盒也可以提供有引物。通常设计这些引物以与具有特定核苷酸序列的分子复性。例如,可以设计这些引物用于PCR以扩增特定核酸分子。所述试剂盒还可以提供有测序引物。
本发明试剂盒可以提供一种或多种缓冲剂(如一、二、三、四、五、八、十、十五种)。这些缓冲剂可以以工作浓度提供,或可以以浓缩的形式提供然后稀释到工作浓度。这些缓冲剂通常将包含盐、金属离子、辅助因子、金属离子螯合剂等,以增加缓冲剂自身或缓冲剂中的分子的活性或稳定。此外,可以以干燥或含水形式提供这些缓冲剂。当以干燥形式提供缓冲剂时,使用前通常将它们溶于水中。
本发明的试剂盒可以包含以上列出的或本文其他地方描述的组分的几乎任何组合。如本领域技术人员所理解,本发明试剂盒提供的组分将因试剂盒预期的用途而变化。因此,可以设计执行本申请列出的各种功能的试剂盒,并且所述试剂盒的组分将因此而变化。
本发明进一步涉及执行本发明的一种或多种方法的说明书。此类说明书可以指导使用者适于执行本发明方法的条件。本发明的说明书可以是有形的形式,例如书面说明书(如印刷(type)于纸上),或者可以是无形的形式,例如经计算机盘(computer disk)或通过互联网获得。
应理解,不需要提供执行本发明方法的说明书全文或(如果所述说明书包括于试剂盒中)使用试剂盒的说明书全文。例如,本发明试剂盒将不含有此类全长说明书的情况的一个实例是当所提供的用法说明告知所述试剂盒的使用者在何处获得实施可以使用所述试剂盒的方法的说明书时。因此,执行本发明方法的说明书可以从互联网的网页、单独出售或分发的手册或其他产品资料等获得。因此,本发明包括为试剂盒的使用者指引一个或多个可以找到未直接随所述试剂盒包装和/或分配的说明书的位置的试剂盒。此类说明书可以是任何形式,包括但不限于电子或印刷形式。
以下实施例说明但不限制本发明的方法。对本领域技术人员明显的,在医学治疗和基因表达系统中通常遇到的多种条件和参数的其他合适修饰和改编属于本发明的精神和范围。
实施例
实施例1
从髓细胞性白血病患者的血液中获得和分离CD34+细胞。用本发明的治疗性多核苷酸构建体离体处理分离的细胞,所述构建体包含处于组成型、遍在性(ubiquitous)巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的新霉素(neo)选择基因和处于TERT启动子控制下的诱导型反式激活蛋白(trans-activator)rTTA。白喉(DTA)毒素编码序列由TetO诱导型启动子控制。然后在促进所述治疗性构建体向基因组的随机整合的条件下执行细胞转化。通过加入G418选择稳定的转化体。然后用四环素或多西环素处理存活的集落,以激活DTA致死基因产物在那些其中TERT启动子驱动rTTA蛋白质产物的表达的细胞中的表达。四环素或多西环素的加入和rTTA的表达导致杀死其中TERT启动子具有活性的病态细胞。
图6所示的载体是可用于本实施例的方法的载体设计的一个实例。使用本领域所知的方法执行基因组插入位点的鉴定。在一个实施方案中,构建体已经插入生物中性位点的细胞在向含有所述构建体的细胞提供选择压力的条件下生长和扩增。
对这些扩增的集落进行表型分析以指示是否存在疾病标记基因。也可以评估表型以确定细胞维持祖细胞可塑性的能力,所述能力通过已知的祖细胞生物标记(包括但不限于CD34+生物标记)评估。然后,将通过此最终表型分析的细胞群体移植于供体患者。移植前,可以经化学或放射方法融化(ablate)患者的血液细胞/骨髓。
实施例2
从患有血细胞起源癌症的患者的血液中获得并分离外周血细胞。用本发明的治疗性多核苷酸构建体离体处理分离的细胞,所述构建体包含处于醛脱氢酶启动子控制下的新霉素(neo)选择基因和处于TERT启动子控制下的诱导型反式激活蛋白rTTA。白喉(DTA)毒素编码序列由TetO诱导型启动子控制,并且CMV组成型启动子控制反式激活蛋白的表达。依次地,诱导型启动子控制Cre重组酶的表达。LoxP位点位于构建体的5’和3’末端每个构建体基因程序的侧翼。在促进异源DNA向基因组的随机整合的条件下执行细胞转化。由于醛脱氢酶启动子在含有所述构建体的祖细胞中以高水平表达,因此向细胞培养基加入G418以选择显示祖细胞表型的稳定转化体。然后用四环素或多西环素处理存活的集落,以激活DTA致死基因产物在其中TERT启动子驱动rTTA蛋白质产物的表达的细胞中的表达。
图7所示的载体是可用于本实施例的方法的载体设计的一个实例。使用本领域所知的方法执行基因组插入位点的鉴定。在一个实施方案中,构建体已经插入生物中性位点的细胞在向含有构建体的细胞提供选择压力的条件下生长和扩增。
对这些扩增的集落进行表型分析以指示是否存在疾病标记基因。也可以评估表型以确定细胞维持祖细胞可塑性的能力,所述能力通过已知的祖细胞生物标记(包括但不限于CD34+和醛脱氢酶)评估。然后,将通过此最终表型分析的细胞群体移植于供体患者。移植前,可以经化学或放射方法融化患者的血液细胞/骨髓。可以在任何时间,通过将细胞暴露于蜕皮激素受体激动剂以诱导Cre重组酶的表达,来诱导载体的切除。
实施例3
为了在术后癌症患者中防止转移和减少循环癌细胞,如乳腺癌细胞,从患有或曾患乳腺癌的患者中获得并分离外周血细胞。用治疗性构建体离体处理这些分离的细胞,所述构建体包含处于遍在性、组成型表达的磷酸甘油酸激酶(phospho-glycerate kinase,PGK)启动子控制下的胞嘧啶脱氨酶(cytodine deaminase)(CDA)基因和与生物中性ROSA等同基因座同源的DNA部分。在构建体中,neo选择基因由醛脱氢酶启动子控制,并且诱导型反式激活蛋白rTTA由TERT启动子控制。此外,单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)编码序列由TetO诱导型启动子和与位于第一DNA区的3’的生物中性ROSA等同基因座同源的DNA附加区控制。白喉(DTA)毒素基因也由组成型表达的CMV启动子控制。在促进经同源重组的基因座特异性插入的条件下执行细胞转化。因为醛脱氢酶启动子在祖细胞中以高水平表达,所以通过加入G418来选择显示祖细胞表型的稳定转化体。
图8所示的载体是可用于本实施例的方法的载体设计的一个实例。具体地,所述构建体在生物中性ROSA等同基因座处插入基因组。构建体DTA选择者的丢失表明同源重组是成功的。用5-氟胞嘧啶的处理作为CDA选择者基因丢失的负选择者。使用本领域所知的方法执行基因组插入位点的鉴定。
选择并扩增其中位于同源重组区内部的构建体部分已经在生物中性ROSA等同基因座处整合于基因组的集落。然后用四环素或多西环素和更昔洛韦(gancyclovir)处理这些扩增的细胞。四环素或多西环素的处理将导致表达所选的疾病标记基因的细胞中TetO启动子的激活,其将依次地激活TK基因产物的表达。更昔洛韦处理选择性地杀死以高表达水平表达胸苷激酶的细胞。
对这些扩增的集落进行表型分析以指示是否存在疾病标记基因。也可以评估表型以确定细胞维持祖细胞可塑性的能力,所述能力通过已知的祖细胞生物标记(包括但不限于CD34+和醛脱氢酶)评估。然后,将通过此最终表型分析的细胞群体移植于供体患者。移植前,可以经化学或放射方法融化患者的血液细胞/骨髓。
实施例4
从患有血细胞起源癌症的患者的血液中获得并分离外周血细胞。用本发明的治疗性多核苷酸构建体离体处理分离的细胞,所述构建体包含处于醛脱氢酶启动子控制下的新霉素(neo)选择基因和处于TERT启动子控制下的白喉(DTA)毒素编码序列。在促进异源DNA向基因组的随机整合的条件下执行细胞转化。由于醛脱氢酶启动子在含有所述构建体的祖细胞中以高水平表达,因此向细胞培养基加入G418以选择显示祖细胞表型的稳定转化体。
使用本领域所知的方法执行基因组插入位点的鉴定。在一个实施方案中,构建体已经插入生物中性位点的细胞在向含有所述构建体的细胞提供选择压力的条件下生长和扩增。
对这些扩增的集落进行表型分析以指示是否存在疾病标记基因。也可以评估表型以确定细胞维持祖细胞可塑性的能力,所述能力通过已知的祖细胞生物标记(包括但不限于CD34+和醛脱氢酶)评估。然后,将通过此最终表型分析的细胞群体移植于供体患者而不切除所述治疗性多核苷酸。移植前,可以经化学或放射方法融化患者的血液细胞/骨髓。
当患者血细胞癌症复发时,移植细胞中来自TERT启动子的DTA表达将被激活,从而破坏这些细胞。
实施例5
从患有血细胞起源癌症的患者的血液中获得并分离外周血细胞。用本发明的治疗性多核苷酸构建体离体处理分离的细胞,所述构建体包含处于醛脱氢酶启动子控制下的新霉素(neo)选择基因和处于TERT启动子控制下的诱导型反式激活蛋白反式激活蛋白。依次地,诱导型启动子控制DTA的表达。在促进异源DNA向基因组的随机整合的条件下执行细胞转化。由于醛脱氢酶启动子在含有所述构建体的祖细胞中以高水平表达,因此向细胞培养基加入G418以选择显示祖细胞表型的稳定转化体。然后用激动剂处理存活的集落,以激活DTA致死基因产物在其中TERT启动子驱动蛋白质产物表达的细胞中的表达。
使用本领域所知的方法执行基因组插入位点的鉴定。在一个实施方案中,构建体已经插入生物中性位点的细胞在向含有所述构建体的细胞提供选择压力的条件下生长和扩增。
对这些扩增的集落进行表型分析以指示是否存在疾病标记基因。也可以评估表型以确定维持祖细胞可塑性的细胞能力,所述能力通过已知的祖细胞生物标记(包括但不限于CD34+和醛脱氢酶)评估。然后,将通过此最终表型分析的细胞群体移植于供体患者而不切除所述治疗性多核苷酸。移植前,可以经化学或放射方法融化患者的血液细胞/骨髓。
现在已经完全地描述了本发明,本领域普通技术人员应理解,可以在广泛和等同的条件、配方和其他参数的范围内执行同样的操作而不影响本发明或其任何实施方案的范围。本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用整体完全并入本文。
Claims (55)
1.一种通过破坏受治疗者的病态细胞来治疗疾病的方法,所述方法包括:
(a)从所述受治疗者获得细胞群体;
(b)确定所述细胞的所述群体中至少一种疾病标记基因的活性;
(c)将编码选择标记和致死所述细胞的多肽的多核苷酸引入所述细胞,其中所述致死多肽的表达受所述至少一种疾病标记基因的启动子的直接或间接控制;
(d)将所述细胞暴露于选定条件以获得含有所述多核苷酸的细胞;
(e)用诱导所述致死多肽表达的条件处理所述细胞,其中所述致死多肽的所述表达杀死表达所述至少一种疾病标记基因的所述细胞;
(f)将所述杀死的细胞与剩余活的、非病态细胞分离,其中所述活细胞没有表达足以杀死所述非病态细胞程度的所述致死多肽;以及
(g)将所述活的、非病态细胞返还到所述受治疗者。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述启动子可操作地连接到编码所述致死多肽的所述多核苷酸。
3.如权利要求1所述的方法,其进一步包括在步骤(a)后分离所述细胞。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述细胞选自由造血干细胞、肝干细胞、乳腺干细胞、胰腺干细胞和神经元干细胞组成的组。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述细胞是造血干细胞。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸的所述引入包括所述多核苷酸向所述细胞的瞬时转染。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸的所述引入包括所述多核苷酸向所述细胞的稳定转染。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸包含至少两个基因程序。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述疾病标记基因的所述启动子连接于第一和第二分子插入支点之间。
10.如权利要求8所述的方法,其中编码所述致死多肽的所述多核苷酸连接于第二和第三分子插入支点之间。
11.如权利要求9或10所述的方法,其中所述分子插入支点包含毗邻排列的三个或四个罕见或不常见限制位点,所述罕见或不常见限制位点选自由与AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、Afl III、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、SgfI、SrfI和Sse878I限制酶相关的限制位点组成的组。
12.如权利要求8所述的方法,其中多核苷酸进一步包含至少一个染色质修饰结构域。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述多核苷酸的所述引入包括所述多核苷酸的基因座特异性插入。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述基因座特异性插入选自由同源重组和重组酶介导的基因组插入组成的组。
15.如权利要求13所述的方法,其中所述多核苷酸包含至少两个基因组整合位点。
16.如权利要求14所述的方法,其中所述多核苷酸包含至少两个基因组整合位点。
17.如权利要求1所述的方法,其进一步包括确定所述多核苷酸是否插入基因组的生物中性位点的步骤。
18.如权利要求1所述的方法,其进一步包括在向所述受治疗者返还所述细胞前,从所述细胞的基因组切除所述多核苷酸的步骤。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述切除包括位点特异性重组酶活性。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述多核苷酸进一步包括至少两个重组酶位点。
21.如权利要求1所述的方法,其中在返还到所述受治疗者前,所述多核苷酸没有从所述剩余活的、非病态细胞中切除。
22.如权利要求1所述的方法,其进一步包括在所述细胞已经返还到所述受治疗者后,诱导所述致死多肽表达的步骤。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述进一步的步骤在所述受治疗者的所述疾病复发后执行。
24.一种对需要治疗疾病的受治疗者进行个性化治疗的方法,所述方法包括:
(a)从所述受治疗者获得细胞群体;
(b)确定所述细胞的所述群体中至少一种疾病标记基因的活性;
(c)分离所述至少一种疾病标记基因的至少一种启动子;
(d)将所述启动子直接或间接地连接到编码致死所述细胞的多肽的多核苷酸;
(e)将所述连接的多核苷酸置于包含选择标记的载体;
(f)将所述多核苷酸引入所述细胞;
(g)将所述细胞暴露于选定条件以获得包含所述多核苷酸的细胞;
(h)用诱导所述致死多肽表达的条件处理所述细胞,其中所述致死多肽的所述表达杀死表达所述至少一种疾病标记基因的所述细胞;
(i)将所述杀死的细胞与剩余活的、非病态细胞分离,其中所述活细胞没有表达足以杀死所述非病态细胞程度的所述致死多肽;以及
(j)将所述活的、非病态细胞返还到所述受治疗者。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述启动子可操作地连接到编码所述致死多肽的所述多核苷酸。
26.如权利要求24所述的方法,其进一步包括在步骤(a)后分离所述细胞。
27.如权利要求24所述的方法,其中所述细胞选自由造血干细胞、肝干细胞、乳腺干细胞、胰腺干细胞和神经元干细胞组成的组。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述细胞是造血干细胞。
29.如权利要求24所述的方法,其进一步包括确定所述多核苷酸是否插入基因组的生物中性位点的步骤。
30.如权利要求25所述的方法,其中所述启动子是通过将所述启动子连接于第一和第二分子插入支点之间而可操作地连接到编码所述致死多肽的所述多核苷酸的,所述第二分子插入支点位于所述启动子的3’末端。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述分子插入支点包含毗邻排列的三个或四个罕见或不常见限制位点,所述罕见或不常见限制位点选自由与AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、SwaI、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、Afl III、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、SgfI、SrfI和Sse878I限制酶相关的限制位点组成的组。
32.一种通过破坏受治疗者的病态细胞来治疗疾病的方法,所述方法包括:
(a)从所述受治疗者获得细胞群体;
(b)确定所述细胞的所述群体中至少一种疾病标记基因的活性;
(c)将编码致死所述细胞的多肽的多核苷酸分子引入所述细胞,其中所述致死多肽的表达受所述至少一种疾病标记基因的启动子的控制,并且其中所述启动子可操作地连接到编码所述致死多肽的所述多核苷酸;
(d)用诱导所述致死多肽表达的条件处理所述细胞,其中所述致死多肽的所述表达杀死表达所述至少一种疾病标记基因的所述细胞;
(e)将所述杀死的细胞与剩余活的、非病态细胞分离,其中所述活细胞没有表达足以杀死所述非病态细胞程度的所述致死多肽;
(f)将所述活的、非病态细胞返还到所述受治疗者。
33.如权利要求32所述的方法,其进一步包括分离所述细胞。
34.如权利要求32所述的方法,其中所述细胞选自由造血干细胞、肝干细胞、乳腺干细胞、胰腺干细胞和神经元干细胞组成的组。
35.如权利要求34所述的方法,其中所述细胞是造血干细胞。
36.如权利要求34所述的方法,其中所述多核苷酸的所述引入包括所述多核苷酸向所述细胞的瞬时转染。
37.如权利要求34所述的方法,其中所述多核苷酸的所述引入包括所述多核苷酸向所述细胞的稳定转染。
38.如权利要求34所述的方法,其中所述多核苷酸包含至少两个基因程序。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述疾病标记基因的所述启动子连接于第一和第二所述分子插入支点之间。
40.如权利要求39所述的方法,其中编码所述致死多肽的所述多核苷酸连接于第二分子插入支点和第三分子插入点之间。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述多核苷酸进一步包含至少一种选择标记。
42.如权利要求41所述的方法,其中多核苷酸进一步包含至少一个染色质修饰结构域。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述多核苷酸的所述引入包括所述多核苷酸的基因座特异性插入。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述基因座特异性插入选自由同源重组和重组酶介导的基因组插入组成的组。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述多核苷酸包含至少两个基因组整合位点。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述多核苷酸包含至少两个基因组整合位点。
47.如权利要求46所述的方法,其进一步包括在向所述受治疗者返还所述细胞前,从所述细胞的基因组切除所述多核苷酸。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述切除包括位点特异性重组酶活性。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述多核苷酸进一步包含至少两个重组酶位点。
50.一种对需要治疗异常疾患的受治疗者进行个性化治疗的方法,所述方法包括:
(a)从所述受治疗者获得细胞群体;
(b)确定所述细胞的所述群体中至少一种疾病标记基因的活性;
(c)分离所述至少一种疾病标记基因的至少一种启动子;
(d)通过将所述启动子可操作地连接到编码致死所述细胞的多肽的多核苷酸而产生治疗性多核苷酸;
(e)将所述治疗性多核苷酸引入所述细胞;
(f)用诱导所述致死多肽表达的条件处理所述细胞,其中所述致死多肽的所述表达杀死表达所述至少一种疾病标记基因的所述细胞;
(g)将所述杀死的细胞与剩余活的、非病态细胞分离,其中所述活细胞没有表达足以杀死所述非病态细胞程度的所述致死多肽;
(h)将所述活的、非病态细胞返还到所述受治疗者。
51.如权利要求50所述的方法,其进一步包括分离所述细胞。
52.如权利要求51所述的方法,其中所述细胞选自由造血干细胞、肝干细胞、乳腺干细胞、胰腺干细胞和神经元干细胞组成的组。
53.如权利要求52所述的方法,其中所述细胞是造血干细胞。
54.如权利要求53所述的方法,其中所述启动子向编码所述致死多肽的所述多核苷酸的所述可操作地连接包括将所述启动子连接于第一和第二分子插入支点之间,所述第二分子插入支点位于所述启动子的3’末端。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述分子插入支点包含毗邻排列的三个或四个罕见或不常见限制位点,所述罕见或不常见限制位点选自由与AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、SwaI、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、Afl III、PvuI、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、SgfI、SrfI和Sse878I限制酶相关的限制位点组成的组。
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