KR20180101535A - 생체내 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환 (dRMCE)을 위한 시스템과 방법 및 이들의 질환 모형 - Google Patents

생체내 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환 (dRMCE)을 위한 시스템과 방법 및 이들의 질환 모형 Download PDF

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rna
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조슈아 브레유닉
모이즈 다니엘퍼
기범 김
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세다르스-신나이 메디칼 센터
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Abstract

생체내 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환에서 이용을 위한 공여자 벡터 및 시스템이 본원에서 설명된다. 도입유전자 발현의 일관되고, 엄격하고, 손쉬운 조사를 위한 동물 모형이 또한 설명된다. 이들 동물 모형을 이용하여 치료적 약물을 선별검사하는 방법, 그리고 치료 방법이 더욱 설명된다.

Description

생체내 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환 (dRMCE)을 위한 시스템과 방법 및 이들의 질환 모형
배경
본 명세서에서 모든 간행물은 마치 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 편입된다. 하기 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에서 제공된 임의의 정보가 현재 청구된 발명의 선행 기술이거나 또는 이와 유관하고, 또는 구체적으로 또는 함축적으로 참고된 임의의 간행물이 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다.
유전적으로 가공된 생쥐 모형 (GEMMs), 특히 조건적 신체 모자이크현상을 실시가능하게 하는 것들은 역유전학을 시간- 및 조직-특이적 방식으로 수행하기 위한 최적 표준이었다. GEMM 산출이 힘든 과정인 점을 고려하면, 많은 대안적 비-GEMM 모형, 예를 들면, 전기천공-매개된 (EP) 전달 및 바이러스 유전자 전달이 신체 모자이크를 창출하는, 예를 들면, 종양을 모형화하는 더욱 신속한 수단으로서 점점 더 이용되고 있다. 양쪽 기술은 체내에서 사실상 어디든지 표적으로 할 수 있다. 테트라사이클린-조절된 시스템 (TRE) 및 shRNAs 이외에, EP는 트랜스포손, 예를 들면, piggyBac (PB-EP)를 최근에 통합하였고, 생체내에서 안정된 유도성 트랜스제네시스 및 종양 산출을 실시가능하게 하였다.
속도 및 유연성을 제공함에도 불구하고, PB-EP 및 바이러스 방법은 많은 함정을 안고 있다. 바이러스 벡터는 한정된 유상하중을 갖고, 면역 반응을 촉발하고, 복잡한 제조 전문지식을 필요로 하고, 그리고 PB-EP 및 바이러스 전달 둘 모두 그들의 예측할 수 없는 유전체 통합 패턴, 차후 삽입 돌연변이유발 및 후성적 도입유전자 침묵을 겪는다. 기능 획득 (GOF) 돌연변이의 규문을 위해 가장 중요하게는, 양쪽 비-GEMM 기술은 도입유전자 사본수 변이 (CNV) 또는 염색체-위치 가변성에 의해 종종 유발되는 클론 유전자형/표현형 가변성을 유발하고, 반면 GEMMs는 생쥐 가공 동안 정량된 일정한 유전자량 및 접합성을 담보한다. 이런 이유로, GOF 단백질 기능의 비-GEMM-기초된 평가는 종종, 과다발현 인공물, 의도하지 않은 세포독성 및 전사 억제와 같은 과생리적 현상에 의해 혼란스럽다.
따라서, 당해 분야에서 연구 적용, 질환 모형화, 약물 선별검사 및 요법을 위한 이들 유형의 동물 모형 및 도구에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 남아있다.
도면의 간단한 설명
예시적인 구체예가 참조된 도면에서 도해된다. 본원에서 개시된 구체예와 도면은 제한보다는 예시로서 고려되는 것으로 의도된다.
도면 1 (a-f)은 이형접합성 mTmG에서 dRMCE가 본 발명의 다양한 구체예에 따라서 생체내에서 및 시험관내에서 3가지 재조합 계통을 산출한다는 것을 보여준다. a) Flp-Cre 발현 벡터는 dRMCE 공여자 벡터의 존재에서 Rosa26m TmG 대립형질에 대한 Cre-매개된 절제 또는 dRMCE를 촉매작용하여, 2가지 상이한 재조합 산물을 유발한다. b) 이형접합성 Rosa26 WT/mTmG mNSCs의 뉴클레오펙션은 3가지 가능한 계통: tdTomato+, EGFP+ 및 TagBFP2+를 유발한다. c) 비중복 형광 컬러로 대표적인 세포의 라이브 영상화. 눈금자: 100μm. d) Flp-Cre 발현 벡터 및 공여자 플라스미드의 DNA 혼합물로 P2 이형접합성 Rosa26 WT/mTmG 새끼에서 VZ/SVZ 세포를 표적으로 하는 표준 출생후 전기천공 프로토콜. e) 출생후 EP는 시험관내 뉴클레오펙션 실험을 개괄하고, 그리고 EP후 2 주까지 후각 신경발생 및 줄무늬체 아교발생을 산출한다. 눈금자: 100μm. f) 상이한 농도의 재조합효소 및 공여자 플라스미드의 DNA 혼합물은 생체내에서 MADR 및 Cre-절제 재조합 반응 둘 모두의 다양한 효율을 유발하고, 생체내 dRMCE 반응 효율이 조정될 수 있다는 것을 예증한다.
도면 2 (a-g)는 생체내 dRMCE를 이용한 신체 모자이크의 신속한 산출이 본 발명의 다양한 구체예에 따라서 자생 종양 모형화에 이용될 수 있다는 것을 보여준다. a-b) Hras G12V 종양유전자로 동형접합성 Rosa26m TmG P2 새끼에서 출생후 EP는 2가지 상이한 종양 유형 (청색-단독 Rosa26 HrasG12Vx2 및 청색-및-녹색 Rosa26 HrasG12Vx1 )을 생산한다. c) EP후 3 개월에 동형접합성 mTmG 에서 대표적인 종양 형성. 청색-단독 Rosa26 HrasG12Vx2 세포는 청색-및-녹색 Rosa26 HrasG12Vx1 보다 종양의 더욱 큰 섹션을 점유한다. 눈금자: 2mm. d-e, j) TagBFP2 리포터에 묶인 Nf1, Pten 및 Trp53에 대항하여 miR-E shRNAs에 대한 공여자 구조체, 그리고 TagBFP2+ 세포가 Pdgfra+임을 보여주는 대표적인 6-개월령 생쥐 시상 단면. 눈금자: 200μm 및 20μm. f-g) P50 뇌에서 이형접합성 Rosa26 WT/mTmG 에서 소아 신경교종 돌연변이 및 차후 과형성의 2개 조합을 인코딩하는 2개의 공여자 구조체. 눈금자: 2mm. i) Nf1, Pten 및 Trp53에 대항하여 miR-E shRNAs에 대한 공여자 구조체는 qPCR에 의해 계측될 때, 거의 80% mRNA 수준 녹다운 효율을 유발한다.
도면 3 (a-d)은 FACS 분석에 의한 이형접합성 mTmG mNSCs에서 dRMCE 효율의 계측, 그리고 본 발명의 다양한 구체예에 따라서 비-클론 개체군 수준에서 정확한 단백질 번역의 확증을 묘사한다. a) 이용된 재조합효소-발현 플라스미드의 계통도, b) FACS 분석은 신경 줄기 세포에서 근사 dRMCE 효율, 그리고 Flp-2A-Cre 및 Flp-IRES-Cre 사이에 그들의 촉매 효율에서 명백한 차이 없음을 지시한다, c) 분류된 세포는 HrasG12V를 발현하지만, tdTomato 또는 EGFP를 발현하지 않는다. 눈금자: 50μm. d) 비-클론 응집 세포로부터 정상적인 도입유전자 생산 및 FACS 음성 개체군에서 이의 결여를 지시하는 웨스턴 블롯. tdTomato 발현의 제거 역시 관찰된다.
도면 4 (a-g)는 본 발명의 다양한 구체예에 따라서 유전자의 과다발현 및 GOF 돌연변이를 규문하는데 이용될 수 있는 dRMCE-양립성 유도성 공여자 구조체를 묘사한다. a) dRMCE-양립성 TRE 플라스미드 b) 이형접합성 mTmG mNSCs는 a)에서 플라스미드로 핵내 도입되고, 퓨로마이신으로 처리되고, 그리고 무색 개체군으로 변한다. 눈금자: 10μm c) rtTA-V10-AU1을 구조성으로 발현하는 세포주에서 EGFP 발현의 유도. 눈금자: 50μm d) 독시사이클린 처리 시에, 개체군-너비 균일한 발현 분포에서 Dll1을 발현하는 TRE 세포주. 눈금자: 20μm. (e-g) 4가지 상이한 dRMCE 공여자 플라스미드 (이들 모두 rtTA-V10-AU1을 보유하고, 그리고 SM-FP-Flag, -Myc, -HA 및 -V5를 각각 보유)를 창출한 후, 단일 Rosa26 대립형질을 보유하는 이형접합성 mTmG mNSCs가 4가지 전술한 SM-FP 변이체 플라스미드 모두로 핵내 도입되고, 퓨로마이신으로 처리되고, 그리고 독시사이클린으로 처리되었다. SM-FP 프로브의 유도는 SM-FP 신호의 겹침이 없다는 것을 보여주고, 각 세포가 Rosa26 CAG 프로모터 제어 하에 정확하게 하나의 SM-FP 변이체를 갖는다는 것을 증명하고, 그리고 또한, 4가지 컬러의 비례하는 비율은 4개의 SM-FP 공여자 플라스미드 각각이 유사한 효율에서 재조합된다는 것을 보여준다.
도면 5 (a-c)는 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, Rosa26mTmG 좌위에서 tdTomato 카세트의 dRMCE-매개된 절제 및 공여자 카세트의 통합을 확증하는 PCR 선별검사 및 웨스턴 블롯 분석을 묘사한다. a) 표시된 부위에서 PCR 분석에 종속되는 플라스미드 및 대립형질의 계통도. 이용된 프라이머는 표 1에서 열거된다. b) PCR 선별검사 분석은 rtTA-V10-AU1 카세트가 퓨로마이신 처리에 내성인 세포에서 CAG-프로모터의 하류에 정확하게 통합된다는 것을 드러낸다. c) 독시사이클린 유도 시에 rtTA-V10-AU1 및 또한, EGFP의 발현을 보여주고, 그리고 또한, 퓨로마이신-내성 세포가 임의의 다른 비특이적 구성 부분으로부터가 아닌 Rosa26 좌위로부터 퓨로마이신을 발현한다는 것을 예증하는, 도면 4c로부터 상기 세포주의 웨스턴 블롯 분석.
도면 6 (a-c)은 VZ/SVZ에서 생체내 dRMCE가 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, EP후 2 일에서 검출가능하고, 그리고 막-tdTomato 발현의 차후 제거로 2 주에서 안정된다는 것을 보여준다. a) EP후 2 일에, 세포는 TagBFP2를 발현하기 시작한다. 눈금자: 50μm; 삽도: 10μm. b) EP후 2 주에 아교발생 및 방사상 아교세포. 화살표는 VZ에서 희귀한 녹색-및-청색 이중 양성 세포를 표시한다. 눈금자: 100μm; 삽도: 20μm. c) tdTomato 및 EGFP에 대해 음성인 한 쌍의 TagBFP2+ 위성 아교세포의 높은-배율 공초점 이미지. 눈금자: 10μm.
도면 7 (a-c)는 Hras G12V 가 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 유전자-용량-의존성 차별적 표현형을 부여한다는 것을 보여준다. a) pBase-매개된 통합 후 더욱 밝은 EGPF-Hras G12V 세포는 인산화된 Rb1을 발현한다. 눈금자: 200μm. b) 도면 1c 및 도면 7c에 관련하여; 눈금자: 1mm. c) b)로부터 영역 1 및 2의 줌인 이미지는 인산화된-Rb1 발현이 청색 단독 세포와 주로 상관한다는 것을 보여준다. 눈금자: 50μm.
도면 8 (a-b)은 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 줄무늬체에서 Hras G12V -재조합된 mTmG 세포의 검사를 묘사한다. a) EP후 2 주는 tdTomato 카세트의 Cre-매개된 절제를 겪은 EGFP+ 세포 및 성공적인 dRMCE를 갖는 HrasG12V+ 세포 사이에 명백한 계통 분기를 보여준다. 눈금자: 100μm b) EP 혼합물에서 낮게는 10 ng/μl 재조합효소-발현 벡터가 생체내에서 dRMCE를 촉매작용할 수 있다. 눈금자: 100μm.
도면 9 (a-b)는 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 생체내 dRMCE에 대한 대조 전기천공 실험을 묘사한다. a) hyPBase-통합된 EGFP 리포터 플러스 다양한 공여자 벡터와 재조합효소로 VZ/SVZ에서 EP화된 세포의 계통 추적은 EP후 2 주까지 어떤 과형성도 보여주지 않는다. 눈금자: 100μm b) 반전된 loxP 배향정위를 갖는 공여자 벡터는 HrasG12V를 발현하는데 실패하고 과형성을 발생시키지 않는다. 눈금자: 100μm. 도면에서 서열 - 위쪽 서열 loxP: ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (서열 번호: 19); 아래쪽 서열 loxP: ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT (서열 번호: 20).
도면 10 (a-e)은 qPCR에 의한 Nf1, Pten 및 Trp53 mRNAs의 녹다운, 그리고 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 뉴런 계통에서 이들 돌연변이의 휴면을 묘사한다. a) EP후 3 개월에, TagBFP2 리포터에 묶인 멀티-miR-E를 발현하는 세포는 지배적으로 Pdgfra+ OPCs이다. 눈금자: 100μm. b) EP후 6 개월에 TagBFP2-멀티-miR-E를 안정되게 발현하는 후구 뉴런은 일탈적 형질전환의 징후를 전혀 보이지 않는다. 눈금자: 200μm c) mRNA 정량에 의한 멀티-miR-E 녹다운 효율. 생물학적 복제물이 이용되었다. d-e) Nf1, Trp53 및 Pten의 에피솜 Cas9-매개된 멀티플렉스 돌연변이는 piggyBac-전치된 EGFP+ 세포의 백색질 신경로에 인접하게 국부화된 Olig2+ 종양으로의 형질전환을 산출한다.
도면 11 (a-j)은 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 시험관내 및 생체내 면역조직화학에 의한 Pdgfra 및 V5-태깅된 Trp53 발현의 확증을 묘사한다. a) 이형접합성 mTmG mNSCs에서 dRMCE 후 도입유전자 발현의 시험관내 사정은 핵 EGFP의 Pdgfra, V5 (Trp53R270H) 및 P53과의 공동발현을 보여준다. 막 EGFP를 갖고 tdTomato 또는 도입유전자 발현이 없는 오염 mG 세포의 존재에 주의한다. 눈금자: 50μm. b) 핵 EGFP (H3f3a)와 Trp53 공동발현의 확증. 눈금자: 50μm. c) MADR G34R/Pdgfra/Trp53 및 Atrx의 CRISPR/Cas9-표적화를 유도하는 플라스미드의 합동된 발현은 종양 형성을 가속화시키지 않는다. d) Atrx는 K27M 종양에서 대다수의 EGFP+ 세포에서 발현된다. EGFP+ 세포의 작은 부분집합 (황색 화살표)은 Atrx 항원성을 상실하였다. e) EP후 100 일에 G34R 세포는 Atrx를 발현한다. f) CRISPR/Cas9 표적화는 EP화된 세포에서 Atrx의 고도로 효율적인 상실을 야기한다. g) EP후 120 일에 피질-침윤성 G34R 종양. EGFP+ 과형성 (황색 화살표)에서 배쪽으로 약화되는 종양에서 등쪽으로 높은 Olig2 발현에 주의한다. h) EP후 120 일에 K27M 종양은 지배적으로 피질하이다. i) Nf1 및 Trp53의 돌연변이로부터 유래된 Cas9-매개된 신경교종은 H3K27Me 과메틸화를 전시한다. i-1은 종양 변연부에서 염색 패턴 격차를 보여준다. j) 단일클론 항체는 H3f3a 도입유전자의 발현이 Rosa26H3f3a-K27M/Pdgfra/Trp53 종양 전역에서 일관된다는 것을 증명한다. *-증가된 대조를 위해 Cy5 파장으로부터 녹색으로 가성착색된 통로.
도면 12는 생체내 MADR 또는 MADR MAX에 순응하는 대안적 리포터 생쥐, 그리고 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 유전자-트랩 대립형질을 갖는 Ribotrap 및 IKMC 저장소 생쥐 라인으로 상기 방법의 확장을 묘사한다. 구성에서 mTmG 생쥐와 유사하고, 그리고 돌연변이체 계통 추적 연구를 달성하기 위한 생체내 MADR 또는 Ribotrap 이형접합체를 이용한 직각 RNA 단리와 양립성인 현존하는 CAG-기초된 리포터 생쥐가 있다. 추가적으로, 이러한 방법은 실례로서, 중요한 엑손 주변에서 loxP 및 FRT에 접하는 수천 개의 유전자-트랩 생쥐까지 확장될 수 있다. 이런 좌위에서 생체내 MADR은 1) 상기 좌위에서 이형접합성/동형접합성 무표지 세포의 계통 추적뿐만 아니라 2) 상기 좌위의 도입유전자로의 교환을 할 수 있게 할 것이다. 도면에서 서열 - 위쪽 패널: loxP 코어 GCATACAT (서열 번호: 12); 최소 FRT: GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC (서열 번호: 13); 두 번째 패널: 최소 FRT: GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC (서열 번호: 13); loxP 코어: ATAGTATGC (서열 번호: 14).
도면 13 (a-c)은 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 줄무늬체에서 HrasG12V-재조합된 mTmG 세포의 검사를 묘사한다. (A) EP후 2 주는 tdTomato 카세트의 Cre-매개된 절제를 겪은 EGFP+ 세포 및 성공적인 MADR을 갖는 HrasG12V+ 세포 사이에 분명한 계통 분기를 보여준다. 눈금자: 100μm. (B) EP 혼합물에서 낮게는 10 ng/μl 재조합효소-발현 벡터가 생체내에서 MADR을 촉매작용할 수 있다. 눈금자: 100μm. (C) pBase-매개된 통합 후 더욱 밝은 EGPF-HrasG12V 세포는 인산화된 Rb1을 발현한다. 눈금자: 200μm.
도면 14 (a-g)는 소아 GBM에서 관찰된 재발성 돌연변이를 활용하는 MADR 신경교종 모형의 산출이 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 인간 아형과 일치하는 표현형을 산출하고 변형 H3f3a PTMs에 대한 통찰력을 제공한다는 것을 보여준다. A) 복수 재발성 소아 신경교종 동인 돌연변이의 MADR을 위한 공여자 플라스미드의 계통도. B) EP후 100 일에 이형접합성 mTmG에서 대표적인 종양 형성. 핵 EGFP+ Rosa26H3f3a-K27M/Pdgfra/Trp53 세포는 큰 줄무늬체 종양을 형성한다. 삽도 B-1은 유의미한 피질성 침윤의 결여를 보여준다. C) 한배 새끼 Rosa26H3f3aG34R/Pdgfra/Trp53은 줄무늬체에서 신경교 과형성 및 복부 전뇌에서 조롱박 피질의 내측으로 EGFP+ 세포의 작은 덩어리를 전시한다. D) Rosa26H3f3aG34R/Pdgfra/Trp53 EGFP+ 종양 세포는 H3K27에서 과소메틸화된다. E) EGFP+ 종양 세포는 코어와 대비하여 종양 변연부에서 가변적 H3f3a 세린 31 인산화를 전시한다. F-G) 영역 E)의 줌인 이미지는 EGFP+ 핵 인산화된-세린 31 발현이 종양 변연부에서 더욱 높고, 그리고 코어 내에 전반적인 세포 밀도에서 증가에도 불구하고 코어에서 약화된다는 것을 보여준다.
도면 15 (a-h)는 생체내 MADR-통합된 Cas9 및 PCR-유래된 sgRNAs를 이용한 신체 모자이크의 신속한 산출이 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 신경교종 내에서 전환분화의 규문을 허용한다는 것을 보여준다. A) TagBFP2-V5 리포터 단백질 및 SpCas9의 MADR을 위한 플라스미드. B) 종양으로부터 정제된 tdTomato-/EGFP-신경교종 세포는 Nf1 및 Trp53에서 InDels를 전시한다. 도면에서 서열: Nfl1 엑손 42 AACTCCCTCGATGTGGCGGCTCATCTGCCC (서열 번호: 15); AACTCCCTCGAATGTGGCGGCTCATCTGCCC (서열 번호: 16); Trp53 엑손 2 TCTCCTGGCTCAGAGGGAGCTCGAGGCTG (서열 번호: 17); TCTCnnnnnnnAGAGGGAGCTCGAGGCTG (서열 번호 18). C) 동시-EP화된 PCR-유래된 sgRNAs와 함께 TagBFP2-V5 리포터 및 Cas9의 MADR 삽입은 3가지 재조합 계통의 유전자 표지화를 통해 식별가능한 고등급 신경교종을 산출한다. D) 신경교종 세포는 주로, 이질성의 작은 포켓을 갖는 Olig2+이다 (백색 화살표). E) 도면 15D에서 백색 화살표에 의해 표시된 영역에 집중하는 높은 배율 Olig2 및 tdTomato 이미지. F) CD44 중간엽 종양 마커에 대한 양성을 증명하는, 도면 15E으로부터 거의 인접한 섹션 및 영역에서 CD44 및 tdTomato 면역염색. G) 뇌의 Pdgfrb 면역염색은 대부분의 혈관주위세포가 비-종양 유래된다는 것을 보여준다 (즉, tdTomato+; E1). G2) tdTomato- 혈관주위세포의 클러스터가 구별된 영역에서 관찰될 수 있다. G3-5) G2로부터 단일 z 평면 및 이의 차후 확대는 tdTomato 및 Pdgfrb의 동시존재의 결여를 보여준다 (화살촉). (H) 뇌 혈관주위세포의 Des (데스민으로도 알려짐) 면역염색. H1) tdTomato와 동시존재하지 않는 Des+ 혈관주위세포의 클러스터. H2) F1에서 목격된 투사로부터 단일 z 평면. *-증가된 대조를 위해 Cy5 파장으로부터 녹색으로 가성착색된 통로
도면 16 (a-f)은 본 발명의 다양한 구체예에 따라서, MADR 신경교종에서 전환분화의 조사를 묘사한다. A) V5+ 종양-유래된 세포 개체군은 종양의 초점 영역에서 Tdtomato+ 혈관구조와 병렬로 발견될 수 있다. B) 큰 신경교종을 갖는 MADR 뇌의 Pecam 면역염색. C-D2) 희귀한 tdTomato- /Pecam1+ 모습이 관찰될 수 있지만 혈관구조까지 연결되지는 않는다. E) 도면 F2으로부터 패널에서 적색 신호의 과다노출은 tdTomato 및 Des 사이에 동시존재의 결여를 유사하게 증명한다. F) 종양의 대부분의 영역에서 Des 신호는 심지어 혈관과 명확하게 연관되지 않을 때에도, 혈관주위 패턴을 전시하고 tdTomato와 동시존재한다 (백색 화살표). *-증가된 대조를 위해 Cy5 파장으로부터 녹색으로 가성착색된 통로
발명의 상세한 설명
본원에서 인용된 모든 참고문헌은 마치 완전히 진술된 것처럼 전체적으로 참조로서 편입된다. 달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed, Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); 및 Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)은 당업자에게 본 출원에서 이용된 많은 용어에 일반적인 가이드를 제공한다.
당업자는 본 발명의 실시에 이용될 수 있는, 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 균등한 많은 방법과 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 설명된 방법과 재료에 결코 국한되지 않는다.
용어 "제어 요소"는 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공하는 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 유입 부위 ("IRES"), 인핸서 등을 집합적으로 지칭한다. 선별된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, 번역될 수 있기만 하면, 이들 제어 요소 모두가 항상 존재할 필요는 없다.
용어 "프로모터 영역"는 이의 일상적인 의미에서 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하기 위해 본원에서 이용되는데, 여기서 상기 조절 서열은 RNA 중합효소에 결합하고 하류 (3 '-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다.
"작동가능하게 연결된"은 이렇게 설명된 성분이 그들의 상용의 기능을 수행하도록 설정되는 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 요소는 코딩 서열의 발현을 산출할 수 있다. 제어 요소는 이들이 코딩 서열의 발현을 주도하는 기능을 하기만 하면, 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 따라서, 예로서, 번역되지 않지만 전사된 개재성 서열은 프로모터 서열 및 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 그리고 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 여전히 고려될 수 있다.
거의 300개의 재발성, 추정 암 동인 돌연변이 (이들 중에서 다수는 GOF 종양유전자이다)의 선입견 없는 확인으로, 이들 암 동인을 모형화할 수 있는 다루기 쉬운 생체내 플랫폼을 창출하는 것이 긴요하다. 종양 억제인자에서 기능 상실 (LOF) 돌연변이의 경우에, 대규모 녹아웃 (KO) 생쥐 컨소시엄은 현재, 유관한 GEMMs에 대한 즉각적인 접근을 제공하지만, 복수 KOs를 갖는 종양을 모형화하는 것은 독립적으로 재결합하여 결과를 복잡하게 만들 수 있는 많은 플록스트 대립형질을 필요로 할 것이다. 이것에 비추어, CRISPR/Cas9-기초된 연구는 현재, 생쥐에서 생체내에서 복수 KOs를 유도하는 능력을 증명하였다. GOF 돌연변이의 경우에, 하지만, 필요한 GEMMs의 완전한 카탈로그를 편집하는 것은 여전히 쉽지 않을 전망이다.
비-GEMM 모형의 CNV, 위치 가변성 및 삽입 돌연변이유발 문제에 집중하여, 우리는 형질감염된 세포 사이에서 균일한 유전자량을 담보할 수 있는 방법을 모색하였고, 그리고 따라서, dRMCE (또한, 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환에 의한 모자이크 분석 (MADR)으로서 본원에서 논의됨)에 주목하였는데, 이것은 효율적인 녹인 방법으로서 탐구되었다. 전통적으로, 이러한 방법은 항균성 클론 선택 및 양성 구성 부분, 전형적으로 생쥐 배아 줄기 세포 (mESCs)의 Southern 탐침을 필요하게 만든다. 적절한 안전 장치로, 우리는 성공적인 dRMCE가 재조합된 세포의 확정적인 유전자 표지화를 갖는 표준 재고 리포터 생쥐 Rosa26mTmG (mTmG)를 이용하여, 체세포에서 원지 촉매될 수 있다는 것을 증명한다 (도면 1a). 게다가, 우리는 환자-특이적 암 동인 돌연변이를 비롯한 GOF 및 LOF 돌연변이의 혼합물을 갖는 모자이크를 산출하는데 있어서 이러한 시스템의 유용성을 증명한다. 종양 모형화를 위한 비-GEMM 방법으로서, 이러한 절차는 환자-특이적 방식으로 전임상 약물 발견을 위한 우수하고 빠른 파이프라인으로서 역할을 할 수 있다.
Rosa26mTmG는 막 tdTomato를 구조성으로 발현하고 tdTomato 카세트의 Cre-매개된 절제 시에 EGFP 발현으로 전환하는, 폭넓게 이용되는 리포터 라인이다. mTmG에서 dRMCE를 수용하기 위해, 우리는 이용되지 않은 청색 형광 통로를 활용하였고, 그리고 loxP 및 FRT 부위에 의해 측면에서 접하는 TagBFP2뿐만 아니라 TagBFP2-태깅된 HrasG12V를 인코딩하는 프로모터-없는 공여자 플라스미드를 창출하였다 (도면 1d 및 도면 2a). mTmG 및 TagBFP2 플라스미드 둘 모두 최소 34-bp FRT를 내포하는데, 이것은 Flp-매개된 통합에 불응성이다. 간단히 말하면, 개방 해독틀 (ORF)은 전기화학적 형질감염에서 발생하는 것으로 알려져 있는, 통합되지 않은 에피솜 및 무작위로 통합된 전체-플라스미드로부터 가성 전사를 미연에 방지할 PGK 폴리아데닐화 신호 (pA) 및 삼합체화된 SV40 pA가 선행한다. ORF는 도입유전자 발현을 증가시키는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE) 및 전사를 효율적으로 종결하는 토끼 베타-글로빈 pA에 의해 이어진다 (도면 1a). 우리는 이형접합성 Rosa26WT/mTmG 생쥐 (mTmGHet)를 산출하였고, 그리고 차후에, 단일 mTmG 대립형질을 보유하는 생쥐 신경 줄기 세포주 (mNSC)를 확립하였다. TagBFP2 공여자 플라스미드 및 Flp-Cre 발현 벡터로 dRMCE는 3가지 가능한 결과를 발생시켰는데, 세포가 tdTomato+ 상태로 남아있거나, 또는 녹색 또는 청색으로 변하였다 (도면 1b,c 및 도면 3a). TagBFP2 또는 HrasG12V 플라스미드로 뉴클레오펙션 후 1 주에, FACS 분석은 HrasG12V 세포의 신속한 증식 및 또한, mNSCs에서 대략 1%에서 dRMCE의 근사 효율을 지시하였다 (도면 3b). 평균적으로, 청색 형광에 대해 양성인 세포 중에서 5%는 녹색 또는 적색 형광을 유지하였는데, 이것은 막 tdTomato의 상대적으로 느린 분해 동역학에 의해 설명될 수 있다 (도면 3b,c). 분류된 세포를 다른 주 동안 배양한 후, 우리는 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그리고 잔여 EGFP 또는 tdTomato 발현의 부재 및 또한, 정확한 HrasG12V 발현을 확증하였는데, 이것은 재조합된 Rosa26 좌위가 심지어 집합, 비클론 개체군 수준에서도 정확한 폴리펩티드를 산출한다는 것을 지시한다 (도면 3d).
GOF 단백질을 평가하는 것은 종종, 시험관내에서 달성되지만, 구조성 도입유전자 발현은 안정된 세포주 산출에 유해할 수 있다. 이러한 문제를 배제하기 위하여, 유도성 유전자 시스템, 예를 들면, TRE가 때때로 이용된다. 단일-대립형질 mTmGHet mNSCs의 유용성을 확대하기 위해, 우리는 rtTA-V10 및 TRE-Bi 요소를 내포하는 단일 dRMCE-양립성 플라스미드를 창출함으로써, 유도성 세포주 생산을 위한 파이프라인을 창출하는 것을 목적으로 하였다 (도면 4a). 차후에, 우리는 퓨로마이신 선별로 무색 TRE-Bi-EGFP 세포주를 산출하였고, 그리고 표준 시험관내 독스 (dox) 처리로 TRE의 충실성을 확증하였다 (도면 4b,c). 우리는 또한, 이중시스트론 TRE-Bi-Dll1/EGFP 공여자 벡터로 균일한 수준의 Notch 리간드 Dll1 발현을 발현하는 세포주를 산출하였는데, 그 이유는 우리가 CNV로 세포이하 분포에서 변화에 주목하였기 때문이다 (데이터 제시되지 않음; 도면 4d). 단지 퓨로마이신만을 발현하는 클로닝 중간 플라스미드를 이용하여, 우리는 또한, PCR 선별검사에 의해 Rosa26 좌위에서 정확한 재조합을 점검하였다 (도면 5a,b 및 표 1). dRMCE 후, tdTomato 카세트는 dRMCE 시에, 더 이상 CAG-프로모터의 하류에 체류하지 않는다. 하지만, PCR 선별검사는 일부 세포에서 EGFP 시스트론의 불변을 드러냈는데, EGFP의 발현은 상류 polyA 요소 및 CAG-프로모터로부터 거리에 의해 완화된다(도면 5b). 이것을 뒷받침하듯, 우리는 EGFP 자가형광을 관찰하지 못하였고, 그리고 이들 세포의 웨스턴 블롯은 독시사이클린 처리에서만 EGFP 발현을 보여주었다 (도면 4b 및 도면 5c).
TRE-Bi-EGFP 세포주에서 퓨로 (puro) 선별 후 EGFP 발현의 결여를 고려하여, 우리는 유사한 Dox-유도성 플라스미드를 이용하면, 상이한 에피토프 태그를 통해 직각 검출을 허용하는 4개의 상이한 "스파게티 몬스터" 형광 단백질 (SM_FPs)를 발현할 수 있을 것이라고 추론하였다. 우리는 복합적-항원성 XFPs로 MADR (MADR MAX)을 이용하여, 세포당 각 플라스미드의 하나 이상의 사본이 발현될 수 있는 지를 경험적으로 사정하였다 (도면 2g). 구체적으로, 세포당 이들 높은 신호 대 잡음 SM_FP 프로브 중에서 하나 이상의 발현이 면역형광에 의해 쉽게 검출가능할 것이다. 수백 개의 세포를 조사하는 것은 퓨로 (puro) 선별 및 Dox 첨가 후 사실상 모든 세포에서 SM_FPs의 존재를 전시하였다 (도면 4e). 하지만, 높은 배율에서, 우리는 면역형광에 의해, 하나 이상의 SM_FP를 발현하는 어떤 세포도 관찰하지 못하였는데 (도면 4f), 이것은 dRMCE 방법론이 유전자도입 요소의 단일 사본 삽입을 매개한다는 것을 지시하였다.
이러한 시험관내 시스템은 더욱 균질한, 유도성 안정된 세포주를 제공함으로써, loxP 및 Frt를 보유하는 임의의 동물로부터 유래된 다양한 일차 세포주에서 GOF 단백질 기능을 규문하는데 유익할 것이다. 이것에 대한 원리 증명으로서, 그리고 TRE-Bi 요소 - 이것은 상류 프로모터 또는 인핸서에 의해 잠재적으로 활성화될 수 있었다 - 의 3' 시스트론의 잠재적 누설의 유용성을 경험적으로 시험하기 위해, 우리는 또한, 이중시스트론 TRE-Bi-Dll1/EGFP 공여자 벡터로 Notch 신호전달 리간드, Dll1을 유도적으로 발현하는 세포주를 산출하였다 (도면 4d). 특히, Dox가 없으면 쉽게 검출가능한 리포터가 없고 극미한 수준 리간드만 존재하지만, 첨가될 때, EGFP 및 Dll1 둘 모두 모든 세포에 의해 사실상 유사한 수준에서 발현되었다 (도면 4d). (Dox의 부재에서 미세한 양의 리간드 발현은 mNSCs의 내인성 발현에 필적하였다). Notch 신호전달은 유전자-용량이 예민한 분자 경로의 한 가지 실례이고, 그리고 우리의 파이프라인은 이와 같은 경로를 연구하기 위해 목적될 수 있었다.
표 1. PCR 선별검사에 이용된 프라이머
서열 번호:
F1 GCAACGTGCTGGTTATTGTGC mtmg-cagF 1
F2 CTCAATCCAGCGGACCTTCC mtmg-wpreF 2
F3 AGCAAAGACCCCAACGAGAAG EGFP-F 3
F4 TGTCTGGATCCCCATCAAGC mtmg-sv40F 4
F5 ATGCCCTGGCTCACAAATAC rb glob pA F 5
F6 ACACAGGCATAGAGTGTC SV40pA-F 6
R1 GATGACGGCCATGTTGTTGTCC mtmg-tdtomatoR2 7
R2 TTTAACAGAGAGAAGTTCGTGGC pTV-R 8
R3 GGAGCGGGAGAAATGGATATG Rosa26-야생형-R 9
R4 CGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAG PGKpromR 10
R5 TGATCGCGCTTCTCGTTGGG EGFP653CSseq 11
생체내 dRMCE의 적용가능성을 조사하기 위해, 우리는 Flp-Cre 발현 벡터와 함께 TagBFP2 공여자 벡터로 출생후 mTmGHet 새끼의 VZ/SVZ를 신경 줄기/선조체 세포주로 EP화하였다 (도면 1d). 따라서, 우리는 EP 후 빠르면 2 일에 VZ를 따라서 재조합된 세포의 출현에 주목하였고, 그리고 이들 세포는 2 주까지 후구 뉴런 및 아교세포를 발생시켰다 (도면 1e 및 도면 6a-c). TagBFP+ 위성 아교세포의 공초점 분석은 이들 세포에서 tdTomato 및 EGFP 발현의 부재를 보여준다 (도면 6c). 우리는 VZ에서 지속적인 EGFP 발현을 갖는 일부 희귀한 TagBFP2+ 세포를 목격하였고, 그리고 이들 세포는 느린 단백질 처리 동역학을 갖는 뇌실막-계통 세포가 될 수 있었다 (도면 6b). HrasG12V로 EP화된 동형접합성 mTmG 중에서 4가지 모두 신경교종이 급속히 발달하고 3-4 개월 내에 이환상태에 도달하였다 (도면 2a-c). CAG-프로모터에 의해 주동된 동일한 종양유전자를 이용하여, 우리는 HrasG12V의 PB-EP가 100% 침투성 신경교종을 유발한다는 것을 앞서 밝혔다. 흥미롭게도, 우리의 동형접합성 mTmG 신경교종에서, 청색-단독 세포 (Rosa26HrasG12Vx2)는 청색 및 녹색 둘 모두를 발현하는 세포 (Rosa26HrasG12Vx1)보다 종양 횡단면의 더욱 큰 패치를 점유하였다 (도면 2b,c). 이전에, HrasG12V 사본수는 표현형 차이, 예를 들면, 성장 및 아폽토시스 비율을 부여하는 것으로 밝혀졌다. PB-EP를 이용하여, 우리는 또한, 더욱 밝은 EGFP-태깅된 HrasG12V 세포는 더욱 흐릿한 EGFP+ 세포보다 많은 인산화된 Rb1 (pRb1)을 발현한다는 것을 관찰한다 (도면 7a). 유사하게, HrasG12V로 EP화된 mTmG에서 대부분의 Rosa26HrasG12Vx2 세포는 pRb1을 발현하는 것으로 보이고, 반면 Rosa26HrasG12Vx1은 그렇지 않다 (도 7b,c). 본 데이터는 종양유전자의 사본수가 GEMMs를 이용하여 이전에 관찰된 바와 같이, 결과의 종양 개체군의 프로필을 유의미하게 변경할 수 있는 가능성을 지시한다.
하지만, 대부분의 TagBFP2+ 세포는 EP후 2 주까지 tdTomato 및 EGFP 발현의 부재를 전시하였다 (도면 6C). 생체내 재조합 효율에 대한 플라스미드 농도의 효과를 경험적으로 시험하기 위해, 우리는 재조합된 세포의 높은-민감성 검출을 위해 Flp-Cre 재조합효소-발현 플라스미드 및 MADR MAX 리포터 플라스미드의 농도를 변경하였다 (다시 말하면, 10개의 HA-태그를 갖는 스파게티-몬스터 리포터 플라스미드를 발현하였다) (도면 1f). MADR (및 따라서, MADR MAX) 반응이 이론적으로 비가역성이기 때문에, 우리는 EP후 2-일에 뇌를 조사하였다. 모든 DNA 혼합물은 비-MADR, 구조성 핵 TagBfp2 리포터를 내포하였다. 놀랍게도, 우리는 공여자 플라스미드 농도를 10 ng/μl까지 낮추는 것이 거의 100% MADR MAX 효율 및 EGFP 발현을 갖는 거의 제로의 Cre-재조합된 세포에 접근한다는 것을 확인하였다 (도면 1f). 한 가지 가능한 설명은 공여자 플라스미드, 따라서 또한, loxP 및 FRT 재조합 부위의 농도를 증가시키는 것이 이들 재조합효소에 대해 경쟁한다는 것이다. 대안으로, 유전자전위효소에서 목격되는 바와 같은 "과다생산 저해" 기전이 다른 가능성이다. 모든 차후 전기천공 혼합물은 나란히 비교를 위한 거의 동등한 숫자의 EGFP 세포 및 MADR 또는 MADR MAX 세포를 산출하기 위해, 0.5-1μg/μl의 플라스미드를 내포하였다.
HrasG12V를 포함하는 mTmGHet에서, 우리는 청색 재조합된 세포 (다시 말하면, 단일-사본 HrasG12V)의 종양형성 성장을 확인했지만, 단지 Cre-재조합만을 겪은 녹색 형제 세포 (다시 말하면, HrasG12V 없음)는 비정상적인 성장을 전혀 전시하지 않았다 (도면 8a). 이들 녹색 형제 세포는 MADM22에서 야생형 세포와 유사한 방식으로 유용한 대조 세포 개체군으로서 역할을 할 수 있었다. MADM 및 MASTR은 돌연변이체 세포의 엄격한, 초파리 (Drosophila)-유사 해독을 허용하지만, GOIs의 염색체 위치에 따른 데노보 GEMM 산출을 필요로 한다. 높은 증식 능력 때문에, 낮게는 10 ng/μl의 재조합효소 발현 벡터와 혼합된 HrasG12V가 공격적인 초기-개시 종양발생을 여전히 유발하였다 (도면 8b). 무작위로 통합된 또는 비-재조합된 에피솜으로부터 발현으로 인한 종양 형성을 배제하기 위해, 우리는 일련의 대조 전기천공을 수행하였다 (도면 9). 먼저, 형질도입된 세포의 계통을 표시하는 PB-EGFP 플라스미드와 합동된 공여자 HrasG12V의 농축된 혼합물 (~5 μg/μl)의 야생형 CD1 새끼 내로의 EP는 Flp 및 Cre 재조합효소의 존재와 상관없이 어떤 비정상적인 성장, 과형성, 또는 종양발생도 유발하지 않았다 (도면 9a). 이에 더하여, 우리는 mTmG 새끼를 반전된 loxP를 품는 HrasG12V로 EP화하였고, 그리고 면역염색에 의해 임의의 청색 재조합된 세포 또는 과형성을 검출하는데 실패하였는데, 이것은 생체내에서 dRMCE 재조합 반응의 특이성을 예증한다 (도면 9b). HrasG12V 공여자 플라스미드 및 Cre-재조합효소 단독의 여러 독립된 EPs는 EP후 2 주에 조사될 때 종양 형성을 산출하는데 실패하였는데, 이것은 Flp-절제가 효율적인 생체내 dRMCE 반응을 위한 극히 결정적인 단계이고, 그리고 Cre가 그것만으로는 지속된 도입유전자 통합에 불충분하다는 것을 지시한다 (데이터 제시되지 않음). Flp-절제가 비가역성 평형의 확립에 결정적이기 때문에, Flp-절제의 효율을 증가시키기 위해 FlpE를 FlpO로 대체하는 것이 본 발명의 다른 구체예이다.
MADM은 합동된 Trp53- 및 Nf1-LOF 돌연변이가 희소돌기아교세포 선조체 (OPCs)의 전악성 과다증식을 증진한다는 것을 보여주었다. 우리는 우리의 방법을 이용하여 유사한 발달 현상을 모방하는 것을 목적으로 하였다. 먼저, 우리는 TagBFP2 발현에 묶인 Nf1, Pten 및 Trp53에서 표적화된 3개의 인접한 검증된 miR-E-기초된 shRNAs를 품는 공여자 구조체를 창출하였다 (도면 2d). 우리는 이러한 멀티-miR-E 구조체를 시험하였고, 그리고 miR-E에 관한 본래 보고와 필적하는 대략 80%의 mRNA-수준 녹다운 효율을 관찰하였다 (도면 10b,c). MADM 조사 결과와 일관하게, 우리는 TagBFP2+/Pdgfra+ OPCs의 선택적 과도성장을 관찰하였는데, 이것은 Nf1 및 Trp53에 근거된 LOF 모형이 OPC-주동된 과형성을 유발한다는 이전 관찰 결과와 동조하였다 (도면 2e 및 도면 10a). 우리는 또한, OB 뉴런에서 3개 miR-Es의 발현이 이들의 형태 또는 겉보기 세포 유형을 무효화시키지 않는다는 것을 관찰하였는데, 이것 또한 세포 맥락이 이들 LOF 돌연변이의 형질전환 능력에 중요하다는 이전 연구와 일치하고, 여기서 이들은 뉴런 계통 세포에서 휴면이 된다 (도면 10b). 우리는 EP후 200 일에 어떤 악성도 검출하지 못했는데, 이것은 Trp53의 완전한 제거가 아마도 고도 침투성, 초기-개시 종양발생에 필요하다는 것을 지시한다 (도면 10c). 본 발명의 추가 구체예로서, 상기 시스템은 spCas9를 보유하는 공여자 플라스미드를 창출하고 이것을 종양 억제인자를 표적으로 하는 sgRNAs로 전달함으로써 변형될 수 있다.
생체내에서 GOF 및 LOF 세포의 복수 개체군을 독립적으로 계통 추적하는 우리의 MADR 시스템의 능력을 고려하여, 우리는 이것이 신경교 발달을 연구하는데 유용할지도 모른다고 추론하였다. 합동된 Trp53- 및 Nf1-LOF 돌연변이가 희소돌기아교세포 선조체 (OPCs)의 전악성 과다증식을 증진한다는 것은 MADM를 이용하여 우아하게 증명되었다. 우리는 우리의 방법을 이용하여 유사한 발달 현상을 모방하는 것을 목적으로 하였다. 먼저, 우리는 TagBFP2 발현에 묶인 Nf1, Pten 및 Trp53에서 표적화된 3개의 인접한 검증된 miR-E-기초된 shRNAs를 품는 공여자 구조체를 창출하였다 (도면 2H). 우리는 이러한 멀티-miR-E 구조체를 시험하였고, 그리고 최초 보고된 효율에 필적하는 대략 80%에서 mRNA-수준 녹다운 효율을 관찰하였다 (도면 2I). MADM 조사 결과와 일관하게, 우리는 TagBFP2+/Pdgfra+ OPCs의 선택적 과도성장을 관찰하였는데, 이것은 Nf1 및 Trp53에 근거된 LOF 모형이 OPC-주동된 과형성을 야기한다는 이전 관찰 결과와 동조한다 (도면 2J 및 도면 10a). 특히, miR-E를 내포하지 않는 형제 EGFP+ 개체군은 주로 별아교세포성 세포의 정량적으로 더욱 작은, 혼합된 개체군을 산출하였다 (도면 2J 및 데이터 제시되지 않음). 이들 유전적으로 규정된 (다시 말하면, EGFP+) 형제 세포는 MADM GEMM 시스템에서 야생형 세포와 유사한 방식으로 유용한 대조 세포 개체군으로서 역할을 할 수 있었다. MADM 및 MASTR은 돌연변이체 세포의 엄격한, 초파리 (Drosophila)-유사 해독을 허용하지만, GOIs의 염색체 위치에 따라 데노보 GEMM 산출을 필요로 한다. 우리는 또한, 3개 miR-Es의 발현이 OB 신경발생을 예방하지 못한다는 것을 관찰하였는데 (도면 10B), 이것은 Hras 및 Errb2를 이용한 우리의 이전 조사 결과에 역행하고, 증가된 Ras/MAPK 신호전달을 유발하는 GOF 및 LOF 돌연변이가 미묘하게 상이한 세포 운명 변경을 야기할 수 있다는 것을 암시한다. 동물의 소집단에서 조차도, 우리는 EP후 200 일에 어떤 악성도 검출하지 못하였는데, 이것은 Nf1, P53 및 Pten 중에서 임의의 한 가지, 2가지 또는 전부의 완전한 제거 - 녹다운보다는 - 가 아마도 고도 침투성, 초기-개시 종양발생에 필요하다는 것을 지시한다. 이것의 확증으로서, 우리는 이들 억제인자의 CRISPR/Cas9-기초된 녹아웃을 이용하였다. 특히, SpCas9 및 piggyBac-매개된 EGFP 표지화와 함께, Nf1, Trp53 및 Pten에 대항하여 sgRNAs의 조합을 EP화함으로써, 우리는 GEMM 신경교종 모형, MADM 신경교종 모형 및 자궁내 EP-기초된 CRISPR 모형과 일관하게, 백색질 연관된, 고등급, Olig2+ 종양의 형성에 주목하였다 (도면 10d-e). 그럼에도 불구하고, 우리의 miR-E 연구는 내부 "대조" 계통 (다시 말하면. EGFP+ Cre-재조합된 세포)를 제공하면서, 표적 유전자의 단일-사본, 안정된 녹다운 후 계통 추적을 수행하는데 있어서 MADR의 유용성을 보여준다.
생체내 MADR에 근거된 초점 신경교종 모형의 산출
바이러스 및 EP 종양 모형은 다양한 조직에서 암의 발달, 진화적 양상을 연구하는데 점점 더 이용되지만, 다양한 유전자 전달 방법에 문제가 있다. 우리는 우리의 방법이 추정 암 동인 유전자의 생체내, 자생 모형화에 최고 적합할 수 있다고 추론하였고, 그리고 원리 증명을 위해, 고도로-이용되는 활성화 종양유전자인 Hras G12V 를 선택하였다. 추정적으로 단일-사본 이형접합성 생쥐에서 성장 동역학의 조직학적 분석은 HrasG12V 세포가 EGFP+ 개체군과 비교할 때 급속히 과다증식된다는 것을 지시하였다 (도면 13A). 게다가, 우리는 mTmG 생쥐를 동형접합성에 교배함으로써 세포의 이형접합성 및 동형접합성 개체군을 구별할 수 있을 지도 모른다고 추론하였다. 구체적으로, 4가지 가능성이 재조합 또는 삽입 후 이론적으로 발생할 수 있었고, 그리고 각각은 유전자 마커의 상이한 조합을 가질 것이다 (도면 2B). P2 EP 후, Hras G12V 로 EP화된 모든 동형접합성 mTmG는 신경교종이 급속히 발달하였고, 그리고 3-4 개월 이내에 종말 이환상태에 도달하였다 (도면 2a; n=4). (CAG-프로모터에 의해 주동된 동일한 종양유전자를 이용하여, 우리는 Hras G12V 의 PB-EP가 100% 침투성 신경교종을 유발한다는 것을 앞서 밝혔다.) 동형접합성 mTmG 생쥐에서, MADR 반응은 10 ng/μl의 플라스미드를 이용할 때에도 고도로 효율적이었다 (도면 13B). 흥미롭게도, 우리의 동형접합성 mTmG 신경교종에서, 청색-단독 세포 (Rosa26 HrasG12Vx2 )는 청색 및 녹색 둘 모두를 발현하는 세포 (Rosa26 HrasG12Vx1 )보다 종양 횡단면의 더욱 큰 패치를 점유하였다 (도면 2c, 7b). 이전에, Hras G12V 사본수는 표현형 차이, 예를 들면, 성장 및 아폽토시스 비율을 부여하는 것으로 밝혀졌다. PB-EP를 이용하여, 우리는 또한, 더욱 밝은 EGFP-태깅된 Hras G12V 세포가 더욱 흐릿한 EGFP+ 세포보다 많은 인산화된 Rb1 (pRb1)을 발현한다는 것을 관찰한다 (도면 13C). 유사하게, Hras G12V 로 EP화된 mTmG 생쥐에서 추정적으로 동형접합성 Rosa26 HrasG12Vx2 세포 중에서 대부분은 pRb1을 발현하는 것으로 보이고, 반면 반접합성 Rosa26 HrasG12Vx1 은 그렇지 않다 (도면 7b-7c). 본 데이터는 종양유전자의 사본수가 GEMMs를 이용하여 이전에 관찰된 바와 같이, 결과의 종양 개체군의 프로필을 유의미하게 변경할 수 있는 가능성을 지시한다.
암의 생쥐 모형의 면에서 현재 충족되지 않은 요구는 "개인맞춤된" 종양 모형화의 더욱 높은 처리량 방법이다. 암에서 추정 동인 돌연변이에 관한 지식의 최근 급증으로, 이들 돌연변이를 생체내에서 조합 방식으로 신속하게 및 포괄적으로 모형화할 수 있는 플랫폼이 요구된다. 가령, 최근에, H3F3A, PDGFRA 및 TRP53은 소아 신경교종에서 재발성인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, H3F3A 돌연변이는 2개 잔기 - K27 및 G34에 존재한다. 특히, H3F3A에서 K27M 또는 G34R/V 돌연변이를 보유하는 결과의 환자 종양은 현저하게 상이한 전사체뿐만 아니라 임상적 행동을 전시한다. 특히, 환자 K27M 신경교종은 중심선을 따라서 군집을 이루고, 그리고 주로 대뇌 반구에 체류하는 G34R/V 신경교종보다 앞서 나타난다. 그럼에도 불구하고, 양쪽 부류의 H3F3A 신경교종은 TRP53 돌연변이를 전형적으로 품고, 그리고 PDGFRA 활성화 돌연변이를 전시할 수 있다. 생쥐에서 이들 소아 종양을 모형화하기 위해, 우리는 H3f3a 돌연변이 (EGFP에 태깅됨), 활성화된 Pdgfra (D842V) 및 돌연변이체 Trp53 (R270H)의 공동발현을 위한 카세트를 산출하였다 (도면 14). 먼저, 우리는 생체내 및 시험관내에서 면역조직화학에 의한 H3f3a, Pdgfra 및 Trp53의 적절한 발현을 점검하였고 모든 단백질의 일치하는 발현에 주목하였다 (도면 11A-B). 그 다음, 우리는 이들 플라스미드를 출생후 EP에 의해 한배 새끼 내로 도입하였다. 중요하게는, 이들 전극은 피질성 및 줄무늬체 VZs 둘 모두를 EP화하여 양쪽 선조체 구역으로부터 가능한 종양 형성을 허용하기 위해 청소되었다. 매혹적으로, 그리고 이들 종양의 임상적 표현과 외관상 일관하게, K27M-보유 한배 새끼는 P100까지 중심선 신경교종을 전시하였고 (도면 14B), 반면 유사하게-처리된 G34R-보유 한배 새끼는 주로, 확산성 신경교 과형성 및 매우 희귀한 작은 종양을 전시하였다 (도면 14C, 화살촉). G34R 돌연변이가 코딩 서열의 두 번째 절반에서 ATRX 돌연변이와 종종 함께 존재하기 때문에, 우리는 CRISPR/CAS9를 이용하여 이들 자연발생 돌연변이를 모방하는 InDels를 도입하였다. G34R-내포 공동발현 카세트와 함께, ATRX를 표적으로 하는 sgRNA로 SpCas9-발현 플라스미드의 동시도입 후, P100에서 종양 형성의 성향의 면에서 G34R 신경아교 세포의 행동에서 어떤 육안적 변화도 목격되지 않았다 (도면 11C). (Atrx의 c 말단을 인식하는 이전에-검증된 항체는 K27M 세포의 >90% 및 G34R MADR 세포의 100%가 전장 Atrx를 발현하고, 반면 Atrx의 CRISPR/Cas9-표적화를 갖는 G34R 세포의 >95%가 Atrx 항체 표지화를 보여주는데 실패한다는 것을 증명하였다 (도면 11D-E).) 특히, EP후 120 일에, G34R 종양은 줄무늬체 VZ의 동등한 표적화 (및 이들 세포 중에서 일부의 일치된 과형성)에도 불구하고, 피질 및 근원적인 뇌량에서 관찰되고 이들에 국부화되었다 (도면 11G). 흥미롭게도, Olig2 신호는 등면 영역에서 훨씬 두드러졌는데, 이것은 종양 및 과형성 사이에 세포 운명 불일치를 암시하였다 (도면 11 G 1 ). 이러한 동일한 120 일 시점에서, K27M 종양은 피질하 구조에 지배적으로 국부화되지만, 세포는 백색질 신경로에서 관찰될 수 있었고 미량의 세포가 더욱 깊은 피질층에서 관찰될 수 있었다 (도면 11H). 이들 조사 결과는 K27 및 G34 잔기가 강력한 Pdgfra 및 Trp53 돌연변이의 동시 존재에도 불구하고, 이들 신경교종 아형의 개시의 시간 및 위치를 유의미하게 조절하는데 충분하다는 것을 지시한다. 게다가, 체성 Atrx 돌연변이는 G34R 종양에서 종양 형성을 위한 속도 제한 단계인 것으로 보이지 않는다.
기계적으로, K27M 돌연변이는 이러한 잔기에서 과소메틸화를 야기하는 것으로 생각된다. 실제로, 종양 세포를 계통 추적하는 MADR의 내재성 능력을 고려하여, 우리는 K27Me 항체에 의한 K27M 돌연변이체 세포의 과소메틸화를 확증할 수 있었다 (도면 14D). (이것은 종양 성장의 단순한 인공물이 아니었는데, 그 이유는 Nf1/Trp53의 CRISPR/Cas9-매개된 녹아웃이 과메틸화된 신경교종의 형성을 야기하였기 때문이다 (도면 11I).) 최근에, K27 및 G34 사이에 있는 세린 31의 인산화 (종전에 phosphoSer31)는 Trp53-매개된 세포 주기 정지에 중요하고, 그리고 이것이 이수성 페일세이프의 단락을 야기할지도 모르는 것으로 밝혀졌다. 다시 한 번, 종양 세포를 계통 추적하는 우리의 능력을 이용하여, 우리는 phosphoSer31의 두드러진 패턴에 주목하였는데, 여기서 이것은 종양 변연부에서 발견되지만 코어에서는 발견되지 않았다 (도면 14E). 이것은 높은 배율 공초점 z 스택에 의해 확증되었다 (도면 14F-G). 게다가, H3f3a에 대한 단일클론 항체는 종양 전역에서 상기 단백질의 존재를 확증하였다 (도면 11J). 비록 이러한 염색 패턴이 종양 산포에서 잠재적 역할을 고도로 암시하긴 하지만, 이러한 인산화가 종양 동역학에 기능적으로 중요한 지를 조사하기 위해 추가 연구가 필요할 것이다. 종합하면, 생체내에서 이런 번역후 변화를 종양 세포 자율적인 방식으로 쉽게 및 분명하게 관찰하는 능력은 이런 저런 암에서 질환 병태생리의 장래 조사를 위한 큰 희망을 계속 품게 한다.
CRISPR/Cas9 유도된 MADR MAX 신경교종 모형을 계통 추적하는 것은 혈관주위세포 전환분화에 대한 종양을 드러낸다
최근에, CRISPR/Cas9는 EP를 이용한 생체내에서 유전자의 돌연변이에 고도로 유효한 것으로 증명되었다. 하지만, 이들 연구의 단점은 변형된 세포를 계통 추적하는 확정적인 방식이다. 이러한 문제를 다루기 위해, 우리는 세포를 동시에 표지하고 돌연변이시키기 위해 SM_BFP2-P2a-SpCas9-내포 공여자 플라스미드를 창출하여, 생체내에서 돌연변이체 세포의 충실한 추적을 실시가능하게 하였다 (도면 15A). 탠덤 miR-E 및 Nf1, Trp53과 Pten의 Cas9-매개된 녹아웃에서 우리의 전술한 조사 결과를 고려하여, 우리는 이들 동일한 PCR화된 sgRNAs를 이용하여 Nf1 및 Trp53을 표적으로 하였다. EP화된 세포에서 성공적인 표적화는 염기서열결정에 의해 종양 개체군 gDNA에서 확증되었다 (도면 15B). 대략 5 개월 시점에, 우리는 EP화된 동물에서 종말 이환상태를 관찰하였다. 병리학적 분석은 종양에서 괴사의 존재에 주로 기인하는, 다형성 아교모세포종의 진단을 야기하였다. 면역조직화학적으로, 우리는 종양이 혈관구조를 제외하고, TdTomato-표지화된 개체군을 거의 결여한다는 것을 관찰하였다 (도면 15C-C 1 ). 작은 EGFP 개체군이 본래 표적화 부위가 체류하는 것으로 예상되었던 곳에 근접하여 관찰되었다 (도면 15C, C 2 ; 화살촉). 하지만, 종양은 MADR MAX SM_BFP-V5 표지화된 세포에 의해 획정되었는데, 이들은 반구를 무성하게 덮었다 (도면 15C, C 3 ). 비록 신호를 결여하는 영역이 관찰되긴 하지만, 이러한 용적 중에서 대부분은 Olig2+ 개체군으로 채워졌다 (도면 15; 화살촉; 15E). Olig2가 전신경 신경교종 아형 (이들은 중간엽 진화에 선행하는 것으로 관찰하였다)의 마커이기 때문에, 우리는 중간엽 마커, CD44에 대한 염색에 의해 이것이 종양 진화의 부위일 수 있는 지를 사정하였다. 특히, CD44는 종양 전역에서 발견되지만, 이러한 Olig2-축소된 영역에서 농축되었다 (도면 15E-F 및 데이터 제시되지 않음). TdTomato 혈관구조의 융기 및 종양 세포 계통을 구별하는 SM_BFP-V5의 능력으로 인해, V5-태깅된 혈관주위 세포의 뚜렷한 개체군이 다른 개체군으로부터 두드러졌다 (도면 16A; 화살표). 유전자 마커를 갖는 버팀질로부터 종양 세포를 유전적으로 구별하는 우리의 능력과 함께 이들 세포의 위치 및 형태를 고려하여, 우리는 신경교종 세포의 전환분화에 관한 현재의 논란을 다시 논의하였다. 구체적으로, 여러 그룹은 신경교종 세포가 내피로 전환분화할 수 있다는 것을 지시하였다. 이것은 그 대신에, 혈관주위세포로 전환분화된다는 조사 결과와 배치되었다. 다른 그룹은 상당한 조사에도 불구하고 어느 한쪽에 대한 증거의 결여를 발견하였다. 내피 세포의 진실한 마커인 Pecam1의 TdTomato와의 동시존재를 조사할 때, 우리는 사실상 모든 Pecam1 + 세포가 동시표지화된다는 것을 확인하였는데, 이것은 혈관구조가 종양 유래되지 않는다는 것을 암시하였다 (도면 16B). 하지만, 우리는 극히 희귀한 Pecam1+/TdTomato- 신호에 주목하였는데, 이들 중에서 대부분은 작은 크기 (<5 μm) 및 정상적인 내피 세포의 크기인 소수의 프로필을 고려할 때, 조직파편인 것으로 보인다 (도면 16C-D). 하지만, 혈관-연관된 세포는 발견되지 않았고, 그리고 이들 추정 세포의 숫자는 체계적인 조사가 쉽지 않았다 (도면 16C-D). 반대로, 충분히 검증된 혈관주위세포 마커인 Pdgfrb 및 Des (데스민으로도 알려짐) 둘 모두를 이용하여, 우리는 TdTomato의 부재에서 어느 한쪽 혈관주위세포 마커에 대한 양성을 전시하는 전술한 Olig2-/Cd44+ 부위 내에서 및 주변에서 (도면 15D에서 화살촉에 의해 묘사된 영역에 거의 인접한 섹션에서) 구별된 위치를 관찰할 수 있었다 (도면 15G-H). TdTomato의 항체 증폭 및 TdTomato 신호를 이들 영역에서 인위적으로 과도하게 노출시킴에도 불구하고, 우리는 일부 혈관주위세포에서 TdTomato 및 Des의 동시존재를 관찰하지 못하였다 (도면 16E). 하지만, 종양의 대부분의 영역 - 특히, Olig2-농축된 영역 - 에서 이들 혈관주위세포 마커는 TdTomato 막과 엄격하게 동시존재하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 이러한 전환분화가 전신경 아형 지배된 영역에서는 광범위하지 않다는 것을 암시하였다 (도면 16F). 따라서, 생체내에서 복수 개체군의 분명한 유전자 표지화를 허용하는 우리의 신규한 자생 모형을 이용하여, 우리는 GBM에서 종양 세포의 혈관주위세포로의 초점 전환분화에 대한 증거를 제공한다. 이것은 전신경으로부터 중간엽 아형으로의 전환분화를 비롯하여, 신경교종 세포의 혈관주위세포로의 전환분화가 신경교종의 이질성 진화와 상관할 수 있다는 것을 암시한다.
추정 동인 돌연변이의 최근 급증으로, 생체내에서 이들 돌연변이를 조합 방식으로 신속하게 및 포괄적으로 모형화할 수 있는 플랫폼이 요구된다. 최근에, H3f3a, Pdgfra 및 Trp53은 소아 신경교종에서 재발성인 것으로 밝혀졌다. 우리는 이들 돌연변이의 상이한 조합을 보유하는 2개 공여자 플라스미드의 EP가 P50까지 증식성 과형성을 유발한다는 것을 증명한다 (도면 2f,g). 우리는 생체내 및 시험관내에서 면역조직화학에 의해 H3f3a, Pdgfra 및 Trp53의 발현을 점검하였다 (도면 2g 및 도면 11a,b).
우리는 생체내에서 dRMCE-매개된 체성 트랜스제네시스가 하나의 생쥐 라인을 이용하여 다양한 신체 모자이크를 창출하기 위한 고도로 견실한, 비용-효과적인 방법이라는 것을 증명하였다. 구체적으로, dRMCE는 최근에 시험관내에서 활용되었지만, 삽입의 상대적으로 낮은 효율에 시달리고, 따라서 클론 세포주의 항균성 선별 및 분자 생물학적 방법 (PCR, 서던 블롯 등)으로 개별 세포주의 엄격한 검증을 필요로 한다. 여기에서 우리는 세심한 플라스미드 설계에 의해, 성분 플라스미드 요소의 적정에 의해, 그리고 "안전한-착륙 지점" (가령, 본원에서 설명된 다양한 구체예에 대해 ROSA26 좌위)을 활용함으로써 RMCE로 생체내에서 도입유전자의 거의 90% 발현을 달성할 수 있다는 것을 증명한다. 이것은 단일 또는 이중 사본 도입유전자 발현의 일관된, 엄격한 및 손쉬운 조사를 허용한다. 그에 비해, 에피솜 및 트랜스포손 매개된 삽입은 종종, 소정의 도입유전자의 수십 개 또는 수백 개의 사본으로부터 과생리적 발현을 야기한다. 게다가, 에피솜 도입유전자는 더욱 종종, 증식하는 계통에서 희석될 것이고, 그리고 트랜스폰-기초된 방법은 유전자전위효소의 존재에서 카세트 "호핑"을 야기하여, 종양 억제인자, 세포 주기 유전자 등을 비롯한 내인성 유전자 기능을 잠재적으로 교란할 것이다. 게다가, 재조합효소 사건을 묘사하는 mt/mg 리포터의 이용을 통해, 플라스미드 성분을 적정함으로써 및 복수 공여자 플라스미드를 이용함으로써, 복수의 독립된 계통을 추적할 수 있다.
우리는 종양 돌연변이의 2가지 광범위한 방식 (GOF/LOF)을 유연하게 조합하는 능력을 증명하였다. 이러한 전략은 이중 재조합효소 부위를 품는 임의의 표준 재고 GEMM (가령, Ai14, R26-CAG-LF-mTFP1 및 IKMC 생쥐)와 함께 이용되어, 생체내에서 규정된 용량에서 GOF 및 LOF 단백질 기능의 확정적인 사정을 허용할 수 있다 (도면 12). 이러한 전략은 또한, 바이러스 벡터 및 다른 유전자 전달 방법과 함께, 다른 장기, 예를 들면, 폐, 가슴, 기타 등등까지 확장될 수 있다.
우리의 생체내 MADR 효율 실험은 공여자 구조체의 농도를 희석하는 것이 아마도, 플록스트 좌위 및 Cre-재조합효소를 갖는 이중-유전자도입 GEMMs에서 일어나는 단일-기질-기초된 재조합 반응을 모방한다는 것을 지시한다 (도면 1f). 우리는 종양 돌연변이의 2가지 광범위한 방식 (GOF/LOF)을 신속하게 및 유연하게 조합하는 잠재력을 증명하였다. 대체로, 우리는 생쥐에서 안정된, 규정된 사본수, 신체 모자이크현상을 EP로 산출하는 새로운 기술을 도입하였다. MADR의 내재성 특질은 다른 방법을 이용하여, 생체내 생쥐 유전자 조작을 위한 현존하는 방법과 우호적으로 비교되었다 (표 2). 앞으로 나아가서, 원하는 공여자 요소가 크기에서 충분히 작으면, 비-통합 바이러스 벡터가 이용되어, 표적화될 수 있는 조직의 숫자를 확대할 수 있다.
표 2.
방법 GEMM 표준 EP 전사-매개된 EP 바이러스 MADR
가공 및 산출을 위한 시간 수개월 *플라스미당 2 주 *플라스미당 2 주 >4-6주 *플라스미당 2 주
사본 수 녹인마다 1-2 고도로 가변적 고도로 가변적 가변적, 하지만 아마도 EP보다 덜할 수용자의 접합자에 따라 1-2
교배 조건 대립형질에 대해 더욱 복잡 필요하지 않음 필요하지 않음 RCAS/Txa에 대해서만 필요 표적화된 염색마다 1 라인
발현의 안정성 좌위 침묵에 따라 전반적으로 안정됨 희석 및/또는 침묵의 경향이 있음 침묵 및 삽입 효과의 경향이 있음 침묵 및 삽입 효과의 경향이 있음 좌위 침묵에 따라 전반적으로 안정됨
유상하중 표적화 구조체에 의해 제한됨* 플라스미드 제한에 의해 전형적으로 지배됨* 플라스미드 제한에 의해 전형적으로 지배됨* 바이러스 유상하중에 제한됨 플라스미드 제한에 의해 전형적으로 지배됨*
초점성 조절 요소에 의존한다 초점성은 전극 방향에 의존한다 초점성은 전극 방향에 의존한다 주입 부위로부터 비지향성 확산성 패턴 초점성은 전극 방향에 의존한다
*-BAC DNA가 이용될 수 있다
새로운 MADR EP 툴키트
트랜스포손, 예를 들면, PB 및 잠자는 미녀는 최근에 이들 기술을 활용하는 여러 보고서에서, 안정된 체성 유전자도입을 산출하기 위해 EP와 점점 더 조합으로 이용된다. 트랜스포손은 이들이 장기간 발달 연구 및 또한, 생체내 종양 산출을 허용하기 때문에, 극히 매력적인 도구이다. 우리의 새로운 방법은 트랜스포손 시스템의 2가지 주요 문제점: 무작위 유전체 삽입 및 사본수 가변성을 극복한다. Notch 신호전달은 유전자-용량-민감성 분자 경로의 한 가지 핵심 실례이다. 추가적으로, 여러 다른 세포-운명 결정인자가 그들의 발현 수준에 근거하여, 극적으로 차별적 표현형을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 가령, 신경교 선조체에서 높은 Nfia 발현은 이들의 별아교세포로의 분화에 우호적이고, 반면 낮은 발현은 희소돌기아교세포가 되는 세포에서 관찰되고, 그리고 다른 실례에서, 더욱 높은 Fezf2 발현은 Notch 신호전달 작동체를 상향조절함으로써 VZ/SVZ에서 NSC 무활동을 유도한다. 우리의 방법은 생체내에서 이런 경로를 신속하게 사정하는데 이용될 수 있다. 이러한 보고서에서 도시된 1개-사본 대 2개-사본 비교 패러다임을 이용하여, 이런 핵 인자는 자연 섹션내 대조 세포를 갖는 생쥐에서 조사될 수 있다. 우리의 생체내 MADR은 확장가능하고, 그리고 GEMM 가공과 비교할 때 상대적으로 저렴하다. 게다가, 출생후 EP 절차가 신속하고 (동물의 한배 새끼당 ~35 분) 침습성 수술을 필요로 하지 않는다는 사실을 고려하면, 이러한 방법은 많은 연구소에 의해 쉽게 채택될 수 있다.
현존하는 GEMMs까지 MADR의 확장가능성
이러한 전략은 이중 재조합효소 부위를 품는 임의의 표준 재고 GEMM (가령, Ai14, R26-CAG-LF-mTFP1, Ribotag 및 IKMC 생쥐)와 함께 이용되어, 생체내에서 규정된 용량에서 GOF 및 LOF 단백질 기능의 확정적인 사정을 허용할 수 있다 (도면 16). 관심되는 좌위 주변에서 loxP 및 FRT 부위를 이미 품고 있는 수천 개의 유전자도입 생쥐가 있다. Rosa26 mTmG 와 유사하게, Ai14는 전형적으로 재조합효소-발현 유전자도입 생쥐와 교배되는 다른 폭넓게 이용되는 리포터 생쥐 라인이다. 도면 16에서 지시된 바와 같이, 재조합효소 인식 부위를 적절하게 배향정위시킴으로써, Ai14 생쥐에서 이용을 위한 공여자 플라스미드가 창출될 수 있다. Ribotag는 Cre 발현-규정된 mRNA의 친화성 면역침전을 위해, Cre 재조합을 이용하여 태깅되지 않은 Rpl22 엑손 4를 HA-태깅된 변이체로 교환한다. MADR에서, 대체 태그가 이들 태그에 대한 순차적 면역침전을 이용한 동시적 직각 mRNA 정제를 허용하기 위해, 추가 요소와 함께 삽입될 수 있다. 이에 더하여, 스플라이스 수용자로 시작하고, 그리고 이러한 구조체를 이용하여 외래 시스-조절 환경 하에 도입유전자를 치환하는 효과를 조사하는 ORF가 창출될 수 있다 (도면 16). 동시에, 형광 리포터를 갖는 공여자 플라스미드는 loxP 및 FRT 부위를 갖는 중요한 좌위에 접하는 다양한 유전자도입 생쥐에서, Cre-발현 생쥐에 대한 필요 없이 초점으로부터 계통-추적을 할 수 있게 하기 위해 단순히 전기천공될 수 있다 (Flp 및 Cre로).
우리의 방법이 2개의 상이한 재조합효소를 필요로 하기 때문에, 재조합되는 세포의 유형을 제한하는 프로모터의 상이한 조합으로 이들 재조합효소의 발현을 또한 주동할 수 있다. 가령, 이러한 방법은 세포 유형-특이적 Flp/Cre 발현을 이용함으로써, 구별된 줄기 및 선조체 부분집합으로부터 발생하는 계통의 운명 추적을 비교하고 대조하는데 이용될 수 있다. 최종적으로, 큰-화물 세균 인공 염색체 (BAC)로 생체내 MADR이 있다. 형광 리포터 또는 재조합효소, 예를 들면, vCre 또는 sCRE의 발현을 주동하는 유전체 단편의 큰 덩어리를 품는 공여자 플라스미드가 각 단부에 부가된 loxP 및 FRT 부위로 창출될 수 있다. 이후, EP는 제한 희석에서 이러한 큰 단편을 vCre/sCre-활성화가능 리포터를 보유하는 추가 플라스미드와 합동으로 유전체 내로 전달할 수 있다. 이러한 유형의 연구는 GEMM-유사, 고차 계통 추적 연구를 효과적으로 할 수 있게 할 것이다.
차세대 염기서열결정은 종양발생에서 일어나는 유전체학적 변화 및 전사체학적 변화에 관한 우리의 이해를 기하급수적으로 증가시켰다. 하지만, 종양에서 재발성 체성 돌연변이의 카탈로그가 계속 증가함에 따라서, 부상하는 문제는 일과성 돌연변이로부터 종양-증진 동인 돌연변이를 분리하는 것이다. 게다가, 유사하게 조직학적으로 분류된 종양이 종종, 눈에 띄게 상이한 종양 표현형을 창출하는 이질적인 유전적 토대를 가질 수 있다는 것이 현재 점점 더 인지되고 있다 (가령, K27M 대 G34R 종양). GEMMS는 신경교종 발달에 관한 이해에 결정적이었다. 특히, 우아한 MADM 방법론은 종양 기원 세포 및 잠재적 치료법에 대한 독특한 통찰력을 제공하였다. 우리는 MADR을 소아 GBM의 신속한 '개인맞춤된' 모형화를 위한 플랫폼으로서 이용하기 위한 원리 증명을 보여준다. MADR GOF 트랜스제네시스 및 CRISPR/Cas9 LOF 조작을 합동함으로써, 작은 연구소도 대부분의 종양 유형에 대한 돌연변이의 스펙트럼 - 그리고 따라서, 가능한 조합 - 을 커버하는데 필요한 플라스미드 시약을 산출하는 것이 가능하다.
우리의 조사 결과는 이런 이유로, 생체내 MADR을 안정된 모자이크 분석을 위한 견실한 방법론으로서 확립하는데, 이것은 바이러스, GEMM, EP 및 트랜스포손-기초된 접근법에 내재하는 결점 중에서 다수를 극복한다. 추가적으로, 이러한 유전자 프레임워크는 이중 재조합효소 인식 부위로 가공된 생쥐의 수천 개의 변종에 적용할 수 있다. 따라서, 이들 도구는 발달 및 질환에서 유전자 기능의 효율적인, 더욱 높은 처리량 조사를 허용하는 것을 보장한다.
따라서, 본 발명의 다양한 구체예는 최소한 부분적으로, 이들 조사 결과에 기초된다.
공여자 벡터
본 발명의 다양한 구체예는 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 정지 요소; 상기 도입유전자 또는 RNA; 및 대합된 재조합효소 인식 부위를 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터를 제공한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 전사후 조절 요소를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 도입유전자 또는 RNA로부터 하류에 폴리아데닐화 신호를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 PGK 폴리아데닐화 신호 (pA); 삼합체화된 SV40pA; 도입유전자 또는 RNA; loxP; 풀립파아제 인식 표적 (FRT); 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE); 및 토끼 베타-글로빈 pA를 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예는 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 전사 정지 요소; 대합된 재조합효소 인식 부위; rtTA-V10; 상기 도입유전자 또는 RNA; 및 TRE-Bi를 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터를 제공한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 전사후 조절 요소를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 퓨로마이신을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 전사 정지 요소; loxP; rtTA-V10; 상기 도입유전자 또는 RNA; TRE-Bi; 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT)을 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 전사후 조절 요소를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 퓨로마이신을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예는 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 전사 정지 요소; 대합된 재조합효소 인식 부위; rtTA-V10; 상기 도입유전자 또는 RNA; 및 TRE-Bi-Dll1을 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터를 제공한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 전사후 조절 요소를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 퓨로마이신을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 전사 정지 요소; loxP; rtTA-V10; 상기 도입유전자 또는 RNA; TRE-Bi-Dll1; 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT)을 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 퓨로마이신을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다.
대합된 재조합효소 부위의 배향정위는 유전자도입 동물 내에 가공된 좌위에 의해 지배된다 (다시 말하면, 이들 재조합효소 부위는 도입유전자가 상류 프로모터의 '센스' 방향으로 삽입되면 재조합효소 부위의 외부 쌍을 정확하게 모방할 것이다). 따라서, 다양한 구체예에서, 대합된 재조합효소 인식 부위는 정확한 배향정위에 있다. 다양한 구체예에서, loxP는 반전된 배향정위에 있지 않다.
다양한 구체예에서, 대합된 재조합효소 인식 부위는 loxP 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT)이고, 그리고 재조합효소는 cre 및 flp이다. Flp의 실례는 flpE 및 FlpO를 포함한다.
재조합효소 (및 부위)의 다른 실례는 VCre (Vlox 및 유도체), SCre (Slox 및 유도체), Dre (Rox 및 유도체), 그리고 phiC31 (attb)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
다양한 구체예에서, RNA는 siRNA, shRNA, 또는 sgRNA이다.
다양한 구체예에서, 도입유전자 또는 RNA는 질환 연관된 돌연변이를 포함한다. 다양한 구체예에서, 도입유전자 또는 RNA는 기능 획득 (GOF) 돌연변이를 포함한다. 다양한 구체예에서, 도입유전자 또는 RNA는 기능 상실 (LOF) 돌연변이를 포함한다.
도입유전자의 실례는 Ras, H3f3a, Pdgfra, Trp53 점 돌연변이, Idh1을 비롯한 종양원성 기능 획득 돌연변이를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. RNAs (shRNA 및 sgRNA)의 실례는 종양 억제인자 표적, 예를 들면, Trp53, Nf1, Atrx, 또는 Pten을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
전사후 조절 요소의 실례는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (HPRE) 및 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
다양한 구체예에서, 상기 및 하기에서 설명된 프로모터-없는 공여자 벡터는 항균제를 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 퓨로마이신, 또는 진핵 대안 (카나마이신, 블라스티사이딘 등)을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 및 하기에서 설명된 프로모터-없는 공여자 벡터는 sgRNA와 대합될 때 DNA 개열, 유전자 활성화 (Crispra), 또는 유전자 억제 (Crispri)를 위한 독시사이클린-조절된 전이활성인자 또는 CRISPR/Cas 기초된 변이체 (가령, SpCas9 또는 Cpf1)를 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 및 하기에서 설명된 프로모터-없는 공여자 벡터는 하나 또는 그 이상의 스파게티 몬스터 형광 단백질 (SM_FPs)을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 SM_FPs는 각각 상이한 SM_FPs이다. 다양한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 SM_FPs는 4개의 상이한 SM_FPs이다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 하나 또는 그 이상의 에피토프 태그를 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 에피토프 태그. 에피토프 태그는 반복 또는 상이한 태그일 수 있다. 다양한 구체예에서, 에피토프 태그는 HA 태그, Myc 태그, V5 태그, 또는 Flag 태그이다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 큰-화물 세균 인공 염색체 (BAC)를 포함한다.
시스템
본 발명의 다양한 구체예는 생체내 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환에서 이용을 위한 시스템을 제공한다.
다양한 구체예에서, 상기 시스템은 본원에서 개시된 바와 같은 프로모터-없는 공여자 벡터; 그리고 대합된 재조합효소 인식 부위에 특이적인 재조합효소를 인코딩하는 2개의 유전자를 포함하는 하나의 발현 벡터를 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 시스템은 본원에서 개시된 바와 같은 프로모터-없는 공여자 벡터; 그리고 2개의 발현 벡터: 대합된 재조합효소 인식 부위 중에서 하나에 특이적인 첫 번째 재조합효소를 인코딩하는 첫 번째 유전자를 포함하는 첫 번째 발현 벡터 및 대합된 재조합효소 인식 부위 중에서 다른 하나에 특이적인 두 번째 재조합효소를 인코딩하는 두 번째 유전자를 포함하는 두 번째 발현 벡터를 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 시스템은 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 정지 요소, 상기 도입유전자 또는 RNA 및 대합된 재조합효소 인식 부위를 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터; 그리고 대합된 재조합효소 인식 부위에 특이적인 재조합효소를 인코딩하는 2개의 유전자를 포함하는 하나의 발현 벡터를 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 시스템은 도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 정지 요소, 상기 도입유전자 또는 RNA 및 대합된 재조합효소 인식 부위를 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터; 그리고 2개의 발현 벡터: 대합된 재조합효소 인식 부위 중에서 하나에 특이적인 첫 번째 재조합효소를 인코딩하는 첫 번째 유전자를 포함하는 첫 번째 발현 벡터 및 대합된 재조합효소 인식 부위 중에서 다른 하나에 특이적인 두 번째 재조합효소를 인코딩하는 두 번째 유전자를 포함하는 두 번째 발현 벡터를 포함한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 전사후 조절 요소를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 도입유전자 또는 RNA로부터 하류에 폴리아데닐화 신호를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 PGK 폴리아데닐화 신호 (pA); 삼합체화된 SV40pA; 도입유전자 또는 RNA; loxP; 풀립파아제 인식 표적 (FRT); 토끼 베타-글로빈 pA; 및 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함한다.
대합된 재조합효소 부위의 배향정위는 유전자도입 동물 내에 가공된 좌위에 의해 지배된다 (다시 말하면, 이들 재조합효소 부위는 도입유전자가 상류 프로모터의 '센스' 방향으로 삽입되면 재조합효소 부위의 외부 쌍을 정확하게 모방할 것이다). 따라서, 다양한 구체예에서, 대합된 재조합효소 인식 부위는 정확한 배향정위에 있다. 다양한 구체예에서, loxP는 반전된 배향정위에 있지 않다.
다양한 구체예에서, 대합된 재조합효소 인식 부위는 loxP 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT)이고, 그리고 재조합효소는 cre 및 flp이다. Flp의 실례는 flpE 및 FlpO를 포함한다.
재조합효소 (및 부위)의 다른 실례는 VCre (Vlox 및 유도체), SCre (Slox 및 유도체), Dre (Rox 및 유도체), 그리고 phiC31 (attb)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
다양한 구체예에서, RNA는 siRNA, shRNA, 또는 sgRNA이다.
다양한 구체예에서, 도입유전자 또는 RNA는 질환 연관된 돌연변이를 포함한다. 다양한 구체예에서, 도입유전자 또는 RNA는 기능 획득 (GOF) 돌연변이를 포함한다. 다양한 구체예에서, 도입유전자 또는 RNA는 기능 상실 (LOF) 돌연변이를 포함한다.
도입유전자의 실례는 Ras, H3f3a, Pdgfra, Trp53 점 돌연변이, Idh1을 비롯한 종양원성 기능 획득 돌연변이를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. RNAs (shRNA 및 sgRNA)의 실례는 종양 억제인자 표적, 예를 들면, Trp53, Nf1, Atrx, 또는 Pten을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
전사후 조절 요소의 실례는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (HPRE) 및 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
다양한 구체예에서, 상기 및 하기에서 설명된 프로모터-없는 공여자 벡터는 항균제를 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 퓨로마이신, 또는 진핵 대안 (카나마이신, 블라스티사이딘 등)을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 및 하기에서 설명된 프로모터-없는 공여자 벡터는 sgRNA와 대합될 때 DNA 개열, 유전자 활성화 (Crispra), 또는 유전자 억제 (Crispri)를 위한 독시사이클린-조절된 전이활성인자 또는 CRISPR/Cas 기초된 변이체 (가령, SpCas9 또는 Cpf1)를 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 및 하기에서 설명된 프로모터-없는 공여자 벡터는 하나 또는 그 이상의 스파게티 몬스터 형광 단백질 (SM_FPs)을 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 SM_FPs는 각각 상이한 SM_FPs이다. 다양한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 SM_FPs는 4개의 상이한 SM_FPs이다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 하나 또는 그 이상의 에피토프 태그를 인코딩하는 유전자를 더욱 포함한다. 가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 에피토프 태그. 에피토프 태그는 반복 또는 상이한 태그일 수 있다. 다양한 구체예에서, 에피토프 태그는 HA 태그, Myc 태그, V5 태그, 또는 Flag 태그이다.
다양한 구체예에서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 큰-화물 세균 인공 염색체 (BAC)를 포함한다.
동물 모형
본 발명의 다양한 구체예는 비인간 동물 모형 및 이러한 비인간 동물 모형을 산출하는 방법을 제공한다. 동물 모형은 암 동인 돌연변이 (가령, 기능 획득 종양유전자)를 모형화하는데 이용될 수 있다.
다양한 구체예에서, 비인간 동물 모형을 산출하는 것은 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환을 위한 시스템을 제공하고; 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환을 위한 시스템을 비인간 동물에게 투여하고, 그리고 상기 비인간 동물을 전기천공에 종속시키는 것을 포함한다.
비인간 동물 모형을 산출하기 위해 제공되고 이용되는, 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환을 위한 시스템은 본원에서 설명된 바와 같은 본 발명의 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환을 위한 시스템이다.
다양한 구체예에서, 상기 방법은 hypBase 및/또는 리포터 플라스미드를 투여하는 것을 더욱 포함한다.
이중 재조합효소-매개된 카세트 교환 전기천공을 위한 시스템은 시험이 요망되는 위치에 투여될 수 있다. 가령, 뇌를 연구하기 위한 실험의 경우에, 상기 시스템은 측 뇌실 내로 주입될 수 있고, 그리고 전기천공이 상기 위치에서 수행될 수 있다. 다른 실례에서, 척수를 연구하는 실험의 경우에, 상기 시스템은 예로서, 뇌척수액 내로, 또는 척수 내로 또는 이와 가깝게 주입될 수 있고, 그리고 전기천공이 척수에서 또는 이와 가깝게 행위될 수 있다.
다양한 구체예에서, 비인간 동물 모형은 본원에서 개시된 바와 같은 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환을 위한 시스템을 포함하고, 여기서 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환이 일어났다.
다양한 구체예에서, 비인간 동물은 생쥐이다. 다른 구체예에서, 비인간 동물은 쥐, 햄스터, 게르빌루스쥐, 돼지, 기니 피그, 토끼, 원숭이 (가령, 붉은털 원숭이), 개코원숭이, 침팬지, 양, 또는 개이다. 다양한 구체예에서, 비인간 동물은 유전적으로 가공된 생쥐이다. 다양한 구체예에서, 비인간 동물은 대합된 이중 재조합효소 부위를 갖는 유전적으로 가공된 생쥐이다. 다양한 구체예에서, 생쥐는 Rosa26mTmG (mTmG), Ai14, R26-CAG-LF-mTFP1 또는 IKMC 생쥐, 또는 유사한 대합된 이중 재조합효소 부위를 갖는 생쥐이다.
약물 선별검사
본 발명의 다양한 구체예는 약물 후보를 선별검사하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 비인간 동물 모형을 제공하고, 약물 후보를 투여하고, 그리고 비인간 동물 모형에 대한 약물 후보의 효과를 사정하는 것을 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 방법은 약물 후보가 비인간 동물 모형에게 유익한 결과를 제공할 때, 상기 약물 후보를 약물로서 선별하는 것을 더욱 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 약물 후보가 비인간 동물 모형에게 유익한 결과를 제공할 때, 상기 약물 후보를 약물로서 검증하는 것을 더욱 포함한다.
"유익한 결과"는 질환 상태의 심각도를 줄이거나 또는 완화하고, 질환 상태가 악화되는 것을 예방하고, 질환 상태를 치료하고, 그리고 환자의 수명 또는 기대 수명을 연장하는 것을 포함할 수 있지만, 이들에 결코 국한되지 않는다.
치료 방법
본 발명의 다양한 구체예는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환을 위한 시스템을 포함하는 세포를 제공하고, 그리고 상기 세포를 개체에 투여하는 것을 포함한다.
다양한 구체예에서, 세포는 줄기 세포이다.
다양한 구체예에서, 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환은 세포에서 일어났다.
세포를 개체에 투여하는 것은 질환 상태에 적절한 투여 루트에 의해 수행될 수 있다. "투여 루트"는 에어로졸, 코, 경구, 경점막, 경피 또는 비경구가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있다. "경피" 투여는 국소 크림 또는 연고를 이용하여, 또는 경피 패치에 의하여 달성될 수 있다. "비경구"는 안와내, 주입, 동맥내, 관절내, 심장내, 피내, 근육내, 복막내, 폐내, 척주내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 거미막하, 피막하, 피하, 경점막, 또는 경기관을 비롯하여, 주사와 일반적으로 연관된 투여 루트를 지칭한다. 비경구 루트를 통해, 조성물은 주입 또는 주사를 위한 용액 또는 현탁액의 형태, 또는 냉동건조된 분말일 수 있다.
경장 루트를 통해, 제약학적 조성물은 정제, 겔 캡슐, 당-코팅된 정제, 시럽, 현탁액, 용액, 분말, 과립, 유제, 마이크로스피어 또는 나노스피어, 또는 제어된 방출을 가능하게 하는 지질 소포 또는 중합체 소포의 형태일 수 있다. 비경구 루트를 통해, 조성물은 주입 또는 주사를 위한 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.
국소 루트를 통해, 본 발명에 따른 화합물에 근거된 제약학적 조성물은 피부 및 점막의 치료용으로 조제될 수 있고, 그리고 연고, 크림, 우유, 고약, 분말, 함침된 패드, 용액, 겔, 스프레이, 로션 또는 현탁액의 형태이다. 이들은 또한, 제어된 방출을 허용하는 마이크로스피어 또는 나노스피어 또는 지질 소포 또는 중합체 소포 또는 중합체 패치 및 하이드로겔의 형태일 수 있다. 이들 국소-루트 조성물은 임상적 징후에 따라, 무수성 형태 또는 수성 형태일 수 있다.
눈 루트를 통해, 이들은 안약의 형태일 수 있다.
다양한 구체예에서, 세포는 이식에 의해 투여된다. 치료는 질환, 예를 들면, 암, 신경변성 질환, 뇌졸중 또는 간질에서 성장 인자, 엑소솜 또는 펩티드 요법을 전달하기 위해, dRMCE 사건을 겪은 이식된 세포를 이용하는 것을 포함한다.
다양한 구체예에서, 세포는 이식되고 그리고 이후, 전기천공 또는 바이러스 형질도입에 의한 dRMCE를 위해 차후에 표적화된다.
실시예
다음 실시예는 청구된 발명을 더욱 효과적으로 예증하기 위해 제공되고, 그리고 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 특정한 물질이 언급된 한도에서, 이것은 단지 예시를 목적으로 하고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 독창력의 실시 없이, 그리고 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서, 동등한 수단 또는 반응물질을 개발할 수 있다.
실시예 1
클로닝
Flp-Cre 구조체는 Y. Voziyanov에 의해 관대하게 제공되었고, 그리고 dRMCE의 맥락에서 미리 검증되었다. 우리의 공여자 플라스미드는 표준 제한 절단 기술과 합동으로 인퓨젼 기술 (Clontech)을 이용하여, PGKneotpAlox2로부터 유래되었다. FRT 부위는 2개의 올리고를 어닐링하고 삽입물을 PGKneotpAlox2 내로 주입함으로써 창출되었다. 다른 공여자 플라스미드의 하류 산출은 현존하는 ORF를 제거하고, 그리고 인퓨젼 또는 결찰을 이용하여 새로운 카세트를 부가함으로써 행위되었다. PB-CAG-플라스미드는 앞서 설명되었다.
생쥐 및 전기천공
Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 생쥐는 Jackson Laboratory로부터 구입되었다. mTmG는 야생형 CD1 생쥐 (Charles River)와 교배되어 이형접합성 생쥐가 산출되었다. 모든 생쥐는 Cedars-Sinai Institutional Animal Care and Use Committee에 따라서 이용되었다. 출생후 측 뇌실 EPs는 앞서 설명된 바와 같이 수행되었다. P1-3 새끼는 ~5 분 동안 얼음 위에 배치되었다. 모든 DNA 혼합물은 달리 언급되지 않으면, Tris-EDTA 완충액에서 희석된 0.5-1 μg/μl의 Flp-Cre 발현 벡터, 공여자 플라스미드, hypBase, 또는 CAG-리포터 플라스미드를 내포하였다. 패스트 그린 염료가 혼합물에 첨가되었고 (10%v/v), 이것은 측 뇌실 내로 주사되었다. Platinum Tweezertrodes는 ECM 830 시스템 (Harvard Apparatus)으로부터 120 V의 5 펄스 (50ms; 950 ms에 의해 분리됨)를 전달하였다. 전도도를 증가시키기 위해 SignaGel이 적용되었다. 생쥐는 가열등 하에 가온되고 그들의 케이지로 복귀되었다.
조직 준비
마취 후, 생쥐 뇌가 단리되고 4℃에서 하룻밤 동안 4% PFA에서 고정되었다. 뇌는 4% 낮은 융점 아가로오스에서 임베드되고 비브라톰 (Leica)에서 70 μm로 절단되었다.
면역조직화학
면역조직화학은 앞서 설명된 바와 같은 표준 방법론을 이용하여 수행되었다. 모든 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch)는 1:500에서 이용되었다. 일차 항체에 관한 상세는 표 3에서 발견될 수 있다.
표 3. 연구에서 이용된 항체
Abcam 13970 닭 항-EGFP 1:5000
Abcam 95038 염소 항-V5 1:1000
Active Motif rb 항-H3f3a p531 1:500
Aves 닭 항-Myc 1:500
BD Pharmingen 쥐 항-PDGFRα 1:500
BD Pharmingen Rt 항-Pecam1 1:250
Calbiochem 양 항-p53 1:1000
Cell Signaling rb 항-H3K27Me 1:1000
Cell Signaling rb 항-Pdgfrb 1:500
Cell Signaling rb 항-des 1:500
Cell Signaling 3724 토끼 항-HA 1:2000
Cell Signaling 9308 토끼 항-pRb1 1:500
Clontech 9G9 생쥐 항-tetR 1:1000
Clontech 9G9 rb 항-dsred 1:1000
Dawen Cai (univ of Mich) 토끼 항-dsRed 1:1000
Dawen Cai (univ of Mich) 기니 피그 항-mKate2 1:500
Invitrogen 46-0705 생쥐 항-V5 1:1000
Kerafast 쥐 항-tdtomato 1:2000
R&D Systems 양 항-Dll1 1:500
R&D Systems Gt 항-Olig2 1:500
Revmab rb 항-H3f3a 1:100
Sigma 생쥐 항-Flag 1:2500
세포 배양 및 뉴클레오펙션
연구에서 이용된 생쥐 신경 줄기 세포주를 확립하기 위해 3개의 이형접합성 P0 mTmG 새끼 뇌가 분리되었다. 상기 세포주는 앞서 설명된 바와 같이 유지되었다. 세포는 비타민 A가 없는 B-27 (Life Technologies 12587-010), 글루타맥스 (Life Technologies 35050), 항균제-항진균제 (Life Technologies 15240), hEGFP (Sigma E9644), 헤파린 (Sigma H3393) 및 bFGF (Millipore GF003)로 보충된 Neurobasal®-A 배지 (Life Technologies 10888-022)를 내포하는 배지에서 성장되었다. 신경 줄기 세포 뉴클레오펙션은 제조업체의 권고 (Lonza AG)에 따라서 뉴클레오펙터 2b 장치 및 생쥐 신경 줄기 세포 키트를 이용하여 수행되었다. 뉴클레오펙션 혼합물은 10 ng/μl의 동등한 농도를 갖는 플라스미드를 내포하였다.
영상화 및 처리
모든 고정된 이미지는 Nikon A1R 레이저 공초점 도립 현미경에서 수집되었다. mNSCs의 라이브 이미지는 EVOS 디지털 형광 도립 현미경에서 획득되었다. 전뇌 이미지의 경우에, Nikon Elements의 자동화 스티칭 기능이 이용되었다. ND2 파일은 이후, ImageJ 내로 이입되어 Z-투사 이미지가 창출되었는데, 이들은 차후에, Adobe Photoshop CS6에서 편집되었다. Adobe Illustrator CS6이 최종 도면 생산에 이용되었다.
유세포분석법
세포는 앞서 설명된 바와 같이 수집되었다. 세포는 PBS에서 간단히 헹굼되고, 아쿠타아제 (Millipore)를 이용한 효소적 분리에 의해 제거되고, 3 분 동안 250g에서 펠렛화되고, 그리고 배지에서 재현탁되었다. FACS는 Beckman Coulter MoFlo에서 Cedars-Sinai 유세포분석법에서 행위되었다.
웨스턴 블롯
세포 펠렛은 Laemmli 완충액에서 재현탁되고 95℃에서 5 분 동안 끓여졌다. 단백질 농도는 ThermoScientific 나노드롭 2000에서 계측되었다. SDS-PAGE 분리 및 니트로셀룰로오스 막 위에 전달 후, 단백질은 표 3에서 열거된 항체를 이용하여 검출되고, 0.1% PBS-Tween에서 5% 우유에서 희석되었다. 모든 이차 항체 (Li-cor IRDye®)는 1 : 15000에서 이용되었다. 적외선 검출은 Li-Cor Odyssey® CLX 영상화 시스템에 의해 달성되었다.
독시사이클린 및 퓨로마이신 투여
독시사이클린 (Clontech 631311)은 100ng/ml의 최종 농도에서 배양 배지에 첨가되었다. 퓨로마이신 (Clontech 631305)은 1μg/ml에서 이용되었다.
멀티-miR-E 녹다운 효율 정량
우리는 FlEx-기초된 도입유전자 발현, 구체적으로 EGFP 카세트 (FlEx-EGFP)의 Cre-매개된 전도 및 활성화를 앞서 이용하였다. Nf1, Pten 및 Trp53을 표적으로 하는 우리의 멀티-miR-E를 시험하기 위해, 우리는 복수 miR-Es를 품는 CAG-주동된 FlEx-기초된 구조체 (FlEx-멀티-miR-E)를 만들었다. 출생후 mNSC 라인은 CD1 새끼 뇌를 분리하고, EGFP 또는 FlEx-멀티-miR-E 및 Cre-재조합효소 벡터로 형질감염시킴으로써 확립되었다. 형광 세포는 분류되고, 그리고 mRNA 추출 및 Nf1, Pten과 Trp53에 대한 qPCR 프로브를 이용한 SYBR-기초된 Fluidigm BioMark 동적 어레이에 종속되었다.
생체내 MADR 효율의 정량
각 조건에 대해, 2마리 새끼가 pCAG-TagBFP2-nls, pDonor-smFP-HA 및 Flp-2A-Cre로 전기천공되었다. 뇌는 EP후 2 일에 취해졌고, 그리고 각 뇌로부터 2개의 비-인접한 섹션이 HA-Tag 항체 및 EGFP로 염색되었다. 각 섹션에 대해, ~25 BFP+ 세포가 무작위로 선별되었고, 이들 사이에서 HA+ 및 BFP+ 세포 사이에서 EGFP+ 세포가 계수되었다. 비율은 각 군에 대한 4개 섹션에 걸쳐 평균화되었다.
U6-sgRNA 단편의 PCR-산출
농축된 sgRNAs를 만들기 위해, 짧은 후방 프라이머 및 울트라머 전방 프라이머 (IDT DNA)가 PCR 반응 및 차후 정제에서 합동되었다 (Ran et al., 2013). 100ng의 각 단편은 EP를 위해 플라스미드 DNA와 합동되었다.
뮤린 종양 세포에서 InDel 돌연변이의 염기서열결정
종양 세포의 순수한 개체군은 FACS에 의해 획득되었고, 그리고 유전체 DNA는 단리되었다 (Qiagen DNeasy). gRNA 표적 부위와 측면에서 접하는 프라이머를 이용하여, 우리는 NF1, Trp53 및 Pten에 대한 InDel 돌연변이를 내포하는 것으로 예상된 영역을 PCR 증폭하였다. PCR 증폭된 단편은 Thermo Fisher Zero Blunt TOPO 키트를 이용하여 국부 클로닝되고 One Shot MAX 효율 DH5-T1R 세포 내로 형질전환되었다.
본 발명의 다양한 구체예가 상세한 설명에서 전술된다. 이들 설명이 상기 구체예를 직접적으로 설명하긴 하지만, 당업자는 본원에서 도시되고 설명된 특정한 구체예에 대한 변형 및/또는 변이를 생각할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 설명의 범위에 들어가는 임의의 이런 변형 또는 변이 역시 그 안에 포함되는 것으로 의도된다. 구체적으로 언급되지 않으면, 본 명세서와 청구항에서 단어와 관용구는 당해 분야에서 당업자에게 일상적이고 익숙한 의미가 제공되는 것으로 본 발명자들에 의해 의도된다.
출원을 제출하는 시점에서 출원인에게 공지된 본 발명의 다양한 구체예의 전술한 설명이 제공되었고, 그리고 예시와 설명의 목적으로 의도된다. 본 설명은 완전한 것으로 의도되지 않을 뿐만 아니라 본 발명을 개시된 정밀한 형태까지 한정하는 것으로 의도되지 않고, 그리고 상기 교시에 비추어 많은 변형과 변이가 가능하다. 설명된 구체예는 본 발명의 원리 및 이의 실질적인 적용을 설명하는데 조력하고, 그리고 당업자가 다양한 구체예에서 및 예기된 특정 용도에 적합하도록 다양하게 변형하여 본 발명을 활용할 수 있게 하는데 조력한다. 이런 이유로, 본 발명은 발명을 실행하기 위해 개시된 특정 구체예에 한정되지 않는 것으로 의도된다.
본 발명의 특정 구체예가 도시되고 설명되긴 했지만, 본원에서 교시에 근거하여, 본 발명 및 이의 더욱 넓은 양상으로부터 벗어나지 않으면서 변화와 변형이 만들어질 수 있고, 이런 이유로, 첨부된 청구항이 모든 이런 변화와 변형이 본 발명의 진정한 사상과 범위 안에 있다는 점에서 이들을 범위 내에 포괄한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 전반적으로, 본원에서 이용된 용어는 일반적으로 "열린" 용어로서 의도되는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다 (가령, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 한정되지 않는" 것으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "최소한 갖는" 것으로 해석되어야 하고, 용어 "내포한다"는 "내포하지만 한정되지 않는" 것으로 해석되어야 하고, 기타 등등이다).
SEQUENCE LISTING <110> CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER BREUNIG, Joshua DANIELPOUR, Moise GI, Kim Bum <120> SYSTEMS AND METHODS FOR IN VIVO DUAL RECOMBINASE-MEDIATED CASSETTE EXCHANGE (dRMCE) AND DISEASE MODELS THEREOF <130> 065472-000508WO00 <150> 62/287,197 <151> 2016-01-26 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 gcaacgtgct ggttattgtg c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 ctcaatccag cggaccttcc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 agcaaagacc ccaacgagaa g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 tgtctggatc cccatcaagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 atgccctggc tcacaaatac 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 6 acacaggcat agagtgtc 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 7 gatgacggcc atgttgttgt cc 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 8 tttaacagag agaagttcgt ggc 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 9 ggagcgggag aaatggatat g 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 10 cgaaaggccc ggagatgagg aag 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 11 tgatcgcgct tctcgttggg 20 <210> 12 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 12 gcatacat 8 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 13 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 14 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 14 atagtatgc 9 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 15 aactccctcg atgtggcggc tcatctgccc 30 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 16 aactccctcg aatgtggcgg ctcatctgcc c 31 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 17 tctcctggct cagagggagc tcgaggctg 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (5)..(11) <223> n=other <400> 18 tctcnnnnnn nagagggagc tcgaggctg 29 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 19 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 20 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

Claims (21)

  1. 다음을 포함하는 시스템:
    아래를 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터:
    도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 정지 요소,
    상기 도입유전자 또는 RNA 및
    대합된 재조합효소 인식 부위; 그리고
    대합된 재조합효소 인식 부위에 특이적인 재조합효소를 인코딩하는 2개의 유전자를 포함하는 하나의 발현 벡터, 또는
    2개의 발현 벡터: 대합된 재조합효소 인식 부위 중에서 하나에 특이적인 첫 번째 재조합효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 첫 번째 발현 벡터 및 대합된 재조합효소 인식 부위 중에서 다른 하나에 특이적인 두 번째 재조합효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는 두 번째 발현 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 전사후 조절 요소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 청구항 1에 있어서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 도입유전자 또는 RNA로부터 하류에 폴리아데닐화 신호를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 청구항 1에 있어서, 프로모터-없는 공여자 벡터는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템:
    PGK 폴리아데닐화 신호 (pA);
    삼합체화된 SV40pA;
    도입유전자 또는 RNA;
    loxP 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT);
    토끼 베타-글로빈 pA; 그리고
    우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE).
  5. 청구항 1에 있어서, 대합된 재조합효소 인식 부위는 loxP 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT)이고, 그리고 재조합효소는 cre 및 flp인 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 청구항 1에 있어서, RNA는 siRNA인 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 청구항 1에 있어서, RNA는 shRNA인 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서, RNA는 sgRNA인 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 청구항 1에 있어서, 도입유전자 또는 RNA는 질환 연관된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 아래를 포함하는 프로모터-없는 공여자 벡터:
    도입유전자 또는 RNA로부터 상류에 폴리아데닐화 신호 또는 전사 정지 요소,
    상기 도입유전자 또는 RNA; 그리고
    대합된 재조합효소 인식 부위.
  11. 청구항 10에 있어서, 전사후 조절 요소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터-없는 공여자 벡터.
  12. 청구항 10에 있어서, 도입유전자 또는 RNA로부터 하류에 폴리아데닐화 신호를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터-없는 공여자 벡터.
  13. 청구항 10에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터-없는 공여자 벡터:
    PGK 폴리아데닐화 신호 (pA);
    삼합체화된 SV40pA;
    도입유전자 또는 RNA;
    loxP 및 풀립파아제 인식 표적 (FRT);
    토끼 베타-글로빈 pA; 그리고
    우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE).
  14. 청구항 1의 시스템을 포함하는 비인간 동물 모형.
  15. 청구항 14에 있어서, 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환이 일어난 것을 특징으로 하는 비인간 동물 모형.
  16. 청구항 14에 있어서, 동물은 생쥐인 것을 특징으로 하는 비인간 동물 모형.
  17. 청구항 14의 비인간 동물 모형을 생산하는 방법에 있어서,
    청구항 1의 시스템을 제공하고;
    상기 시스템을 비인간 동물에게 투여하고; 그리고
    상기 비인간 동물을 전기천공에 종속시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 약물 후보를 선별검사하는 방법에 있어서,
    청구항 14의 비인간 동물 모형을 제공하고;
    약물 후보를 투여하고; 그리고
    비인간 동물 모형에 대한 약물 후보의 효과를 사정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 있어서,
    청구항 1의 시스템을 포함하는 세포를 제공하고; 그리고
    상기 세포를 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 세포는 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 이중 재조합효소-매개된 카세트 교환은 세포에서 일어난 것을 특징으로 하는 방법.
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