JP2024063065A - インビボのデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換（ｄＲＭＣＥ）のためのシステム及び方法ならびにその疾患モデル - Google Patents

インビボのデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換（ｄＲＭＣＥ）のためのシステム及び方法ならびにその疾患モデル Download PDF

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Abstract

Figure 2024063065000001
【課題】導入遺伝子発現の一貫して正確な動物モデルを作製するための、ドナーベクター及びシステムを提供する。
【解決手段】導入遺伝子またはＲＮＡの上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写の終止エレメント、前記導入遺伝子またはＲＮＡ、及びペアになったリコンビナーゼ認識部位を含む、プロモーターのないドナーベクター；ならびに前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む、１つの発現ベクター、または２つの発現ベクターであって、第１の発現ベクターが、前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの１つに特異的な第１のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含み、第２の発現ベクターが、前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの他のものに特異的な第２のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含む、２つの発現ベクター、を含むシステムとする。
【選択図】図１２

Description

背景
本明細書におけるすべての出版物は、あたかも各々の個別の出版物または特許出願が参照によって援用されることが具体的かつ個別に指示されたかのように、それと同程度に参照によって援用される。以下の記載は、本発明の理解に有用であり得る情報を包含する。それは、本明細書において提供される情報のうちの任意のものが先行技術であるかもしくは本明細書で特許請求される発明に関連するという承認、または具体的もしくは黙示的に参照される任意の出版物が先行技術であるという承認ではない。
遺伝子操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）、特にコンディショナル体細胞モザイク性を可能にするものは、時間的及び組織特異的な様式でリバースジェネティクスを遂行するためのゴールドスタンダードであり続けている。ＧＥＭＭ生成は労力を要するプロセスであることを考慮すると、多くの代替の非ＧＥＭＭモデル（エレクトロポレーション媒介性（ＥＰ）送達及びウイルスによる遺伝子送達等）が、体細胞モザイク（腫瘍のモデル化等）を作成するより迅速な手段としてますます用いられている。両方の技法は、実質的には体中のどこでも標的とすることができる。テトラサイクリン調節系（ＴＲＥ）及びｓｈＲＮＡに加えて、近年ＥＰは、トランスポゾンを取り込んで（ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ－ＥＰ）等）、安定的で誘導可能な遺伝子導入及び腫瘍生成をインビボで可能にする。
提供するスピード及び柔軟性にもかかわらず、ＰＢ－ＥＰ及びウイルスによる方法は多くの不備を有する。ウイルスベクターは、ペイロードが限定され、免疫応答を刺激し、かつ複雑な調製に専門的技術を要し、ＰＢ－ＥＰ及びウイルスによる送達は両方とも、それらの予測不能なゲノム組み込みパターン、後続する挿入突然変異誘発、及びエピジェネティック導入遺伝子サイレンシングをこうむる。機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異を調べるために最も重要なことは、非ＧＥＭＭ技法は両方とも、多くの場合、導入遺伝子のコピー数変動（ＣＮＶ）または染色体位置変動によって引き起こされるクローン性の遺伝子型／表現型の変動をもたらし、一方ＧＥＭＭは、マウス操作の間に定量化される一定の遺伝子量及び接合性を確実にするということである。したがって、ＧＯＦタンパク質機能の非ＧＥＭＭベースの評価は、多くの場合、過剰発現の人為的な影響、意図しない細胞毒性、及び転写鎮圧のような超生理学的現象によって混乱する。
したがって、研究適用、疾患モデル化、薬物スクリーニング、及び治療法のためのこれらのタイプの動物モデル及びツールについての当技術分野における満たされていない必要性が依然として存在する。
例示的な実施形態は参照される図において説明される。本明細書において開示される実施形態及び図は制限するというより、むしろ例示的であると判断されることが意図される。
（図１－１）図１（ａ～ｆ）は、本発明の様々な実施形態に記載のヘテロ接合のｍＴｍＧ中のｄＲＭＣＥが、インビボ及びインビトロで３つの組換え系譜を生成することを示す。ａ）Ｆｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクターは、ｄＲＭＣＥドナーベクターの存在下において、Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧ対立遺伝子上での、Ｃｒｅ媒介性切り出しまたはｄＲＭＣＥのいずれかを触媒し、２つの別個の組換え産物をもたらす。ｂ）ヘテロ接合のＲｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧのｍＮＳＣのヌクレオフェクションは３つの可能な系譜（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋、ＥＧＦＰ＋、及びＴａｇＢＦＰ２＋）をもたらす。ｃ）オーバーラップしない蛍光色による代表的な細胞のライブ画像化。スケールバー：１００μｍ。ｄ）生後２日のヘテロ接合のＲｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧ仔マウス中の脳室帯（ＶＺ）／脳室下帯（ＳＶＺ）の細胞を標的とする、Ｆｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクター及びドナープラスミドのＤＮＡ混合物による、標準的な出生後エレクトロポレーションプロトコール。ｅ）出生後ＥＰはインビトロのヌクレオフェクション実験を再現し、ＥＰ後２週間までに嗅球神経新生及び線条体グリア新生をもたらす。スケールバー：１００μｍ。ｆ）異なる濃度のリコンビナーゼプラスミド及びドナープラスミドのＤＮＡ混合物は、様々な効率のＭＡＤＲ及びＣｒｅ切り出し組換え反応の両方をインビボでもたらし、インビボのｄＲＭＣＥ反応効率を修飾できることを例証する。
（図１－２）図１－１の説明を参照のこと。
（図２－１）図２（ａ～ｇ）は、本発明の様々な実施形態に記載のインビボのｄＲＭＣＥを使用する体細胞モザイクの迅速な生成を、自然発症腫瘍のモデル化のために使用できることを示す。ａ～ｂ）ホモ接合のＲｏｓａ２６ｍＴｍＧの生後２日の仔マウスにおけるＨｒａｓＧ１２Ｖがん遺伝子による出生後ＥＰは、２つの異なる腫瘍タイプ（青色のみのＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２、ならびに、青色及び緑色のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１）を産生する。ｃ）ＥＰ後３か月のホモ接合のｍＴｍＧにおける代表的な腫瘍形成。青色のみのＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２細胞は、青色及び緑色のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１よりも、腫瘍の大きなセクションを占める。スケールバー：２ｍｍ。ｄ～ｅ、ｊ）ＴａｇＢＦＰ２レポーターへ結合された、Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３に対するｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡのためのドナーコンストラクト、ならびにＴａｇＢＦＰ２＋細胞がＰｄｇｆｒａ＋であることを示す６か月齢の代表的なマウス矢状切片。スケールバー：２００μｍ及び２０μｍ。ｆ～ｇ）小児グリオーマ突然変異の２つの組み合わせをコードする２つのドナーコンストラクト、及びヘテロ接合のＲｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧにおける生後５０日の脳でのその後の過形成。スケールバー：２ｍｍ。ｉ）Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３に対するｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡのためのドナーコンストラクトは、ｑＰＣＲによって測定されるように、およそ８０％のｍＲＮＡレベルのノックダウン効率をもたらす。
（図２－２）図２－１の説明を参照のこと。
（図３）図３（ａ～ｄ）は、ＦＡＣＳ分析によるヘテロ接合のｍＴｍＧのｍＮＳＣにおけるｄＲＭＣＥ効率の測定、及び本発明の様々な実施形態に記載の非クローン性の集団レベルでの正確なタンパク質翻訳の確認を描写する。ａ）用いられたリコンビナーゼ発現プラスミドの概略図。ｂ）ＦＡＣＳ分析は、神経幹細胞における近似するｄＲＭＣＥ効率、及びそれらの触媒効率においてＦｌｐ２Ａ－ＣｒｅとＦｌｐ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅとの間に明らかな差はないことを示す。ｃ）選別された細胞はｔｄＴｏｍａｔｏまたはＥＧＦＰではなく、ＨｒａｓＧ１２Ｖを発現する。スケールバー：５０μｍ。ｄ）非クローン性の凝集細胞から正常な導入遺伝子が産生されること及びＦＡＣＳ陰性集団においてその産生が欠如していることを示すウエスタンブロット。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現の除去も観察される。
（図４－１）図４（ａ～ｇ）は、本発明の様々な実施形態に記載の遺伝子の過剰発現及びＧＯＦ突然変異を調べるために使用できる、ｄＲＭＣＥに適合性のある誘導可能ドナーコンストラクトを描写する。ａ）ｄＲＭＣＥに適合性のあるＴＲＥプラスミド。ｂ）ヘテロ接合のｍＴｍＧのｍＮＳＣはａ）のプラスミドによりヌクレオフェクションされ、ピューロマイシンにより処理され、無色の集団へと変わった。スケールバー：１０μｍ。ｃ）ｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１を構成的に発現する細胞株におけるＥＧＦＰ発現の誘導。スケールバー：５０μｍ。ｄ）集団規模の一様な発現分布のある、ドキシサイクリン処理に際してＤｌｌ１を発現するＴＲＥ細胞株。スケールバー：２０μｍ。（ｅ～ｇ）４つの別個のｄＲＭＣＥドナープラスミド（すべてはｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１を保有し、ＳＭ－ＦＰ－Ｆｌａｇ、ＳＭ－ＦＰ－Ｍｙｃ、ＳＭ－ＦＰ－ＨＡ、及びＳＭ－ＦＰ－Ｖ５を各々保有していた）を作成した後に、単一のＲｏｓａ２６対立遺伝子を保有するヘテロ接合のｍＴｍＧのｍＮＳＣを、すべての４つの前述のＳＭ－ＦＰバリアントプラスミドによりヌクレオフェクションし、ピューロマイシンにより処理し、ドキシサイクリンにより処理した。ＳＭ－ＦＰプローブの誘導は、ＳＭ－ＦＰシグナルのオーバーラップがないことを示し、各々の細胞がＲｏｓａ２６ ＣＡＧプロモーター制御下で１つのＳＭ－ＦＰバリアントを正確に有すること実証し、４つの色の釣り合いの取れた比は、４つのＳＭ－ＦＰドナープラスミドの各々が類似する効率で組換えられたことも示す。
（図４－２）図４－１の説明を参照のこと。
（図５）図５（ａ～ｃ）は、本発明の様々な実施形態に記載のＲｏｓａ２６ｍＴｍＧ遺伝子座でのｄＲＭＣＥ媒介性のｔｄＴｏｍａｔｏカセットの切り出し及びドナーカセットの組み込みを確認する、ＰＣＲスクリーニング及びウエスタンブロット分析を描写する。ａ）表示された部位でＰＣＲ分析を受けるプラスミド及び対立遺伝子の概略図。使用するプライマーを表１中にリストする。ｂ）ＰＣＲスクリーニング分析は、ｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１カセットがピューロマイシン処理へ耐性のある細胞中でＣＡＧプロモーターの下流に正確に組み込まれることを明らかにする。ｃ）ドキシサイクリン誘導に際して、ｒｔＴＡ－Ｖ１０－ＡＵ１及びさらにＥＧＦＰの発現を示す図４ｃからの細胞株のウエスタンブロット分析であり、ピューロマイシン耐性細胞が他の非特異的組み込み体ではなくＲｏｓａ２６遺伝子座からピューロマイシンを発現していたことも例証する。
（図６）図６（ａ～ｃ）は、脳室帯／脳室下帯におけるインビボのｄＲＭＣＥがＥＰ後２日で検出可能でありかつ２週間で安定的であり、本発明の様々な実施形態に記載の膜のｔｄＴｏｍａｔｏ発現が後続して除去されていることを示す。ａ）ＥＰ後２日で、細胞はＴａｇＢＦＰ２を発現し始める。スケールバー：５０μｍ；挿入図：１０μｍ。ｂ）ＥＰ後２週間のグリア新生及び放射状グリア。矢印は脳室帯での稀な緑色及び青色二重陽性細胞を示す。スケールバー：１００μｍ；挿入図：２０μｍ。ｃ）１ペアのＴａｇＢＦＰ２＋サテライトグリア（それはｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰについては陰性である）の高倍率共焦点イメージ。スケールバー：１０μｍ。
（図７）図７（ａ～ｃ）は、本発明の様々な実施形態に記載のＨｒａｓＧ１２Ｖが遺伝子量依存的な差次的表現型を付与することを示す。ａ）ｐＢａｓｅ媒介性組み込み後に、より明るいＥＧＰＦ－ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞はリン酸化Ｒｂ１を発現する。スケールバー：２００μｍ。ｂ）図１Ｃ及び図７Ｃに関連する。スケールバー：１ｍｍ。ｃ）ｂ）からの領域１及び２のズームイン画像は、リン酸化Ｒｂ１の発現が大部分は青色のみの細胞と相関することを示す。スケールバー：５０μｍ。
（図８）図８（ａ～ｂ）は、本発明の様々な実施形態に記載の線条体におけるＨｒａｓＧ１２Ｖ組換えｍＴｍＧ細胞の試験を描写する。ａ）ＥＰ後２週間で、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットのＣｒｅ媒介性切り出しを受けたＥＧＦＰ＋細胞と、ｄＲＭＣＥの成功したＨｒａｓＧ１２Ｖ＋細胞との間での、明瞭な系譜分岐が示される。スケールバー：１００μｍ。ｂ）ＥＰ混合物中で１０ｎｇ／μｌほどの低さのリコンビナーゼ発現ベクターで、インビボでのｄＲＭＣＥを触媒することができる。スケールバー：１００μｍ。
（図９）図９（ａ～ｂ）は、本発明の様々な実施形態に記載のインビボのｄＲＭＣＥのための対照エレクトロポレーション実験を描写する。ａ）ｈｙＰＢａｓｅ組み込みＥＧＦＰレポーター及び様々なドナーベクター、ならびにリコンビナーゼを用いてＥＰを行った（ＥＰ－ｅｄ）脳室帯／脳室下帯中の細胞の系譜の追跡は、ＥＰ後２週間までにいかなる過形成も示さない。スケールバー：１００μｍ。ｂ）逆向きのｌｏｘＰ方向性によるドナーベクターはＨｒａｓＧ１２Ｖを発現せず、過形成を産生しない。スケールバー：１００μｍ。図中の配列は、
上部の配列ｌｏｘＰ：
Figure 2024063065000002
；下部の配列ｌｏｘＰ：
Figure 2024063065000003
である。
（図１０－１）図１０（ａ～ｅ）は、本発明の様々な実施形態に記載のｑＰＣＲによるＮｆ１、Ｐｔｅｎ及びＴｒｐ５３のｍＲＮＡのノックダウン、ならびに神経細胞系譜におけるこれらの突然変異の休止を描写する。ａ）ＥＰ後３か月で、ＴａｇＢＦＰ２レポーターへ結合されたｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅを発現する細胞は、優先的にＰｄｇｆｒａ＋ ＯＰＣである。スケールバー：１００μｍ。ｂ）ＥＰ後６か月で安定的にＴａｇＢＦＰ２－ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅを発現する嗅球ニューロンは、異常な形質転換の徴候を示さない。スケールバー：２００μｍ。ｃ）ｍＲＮＡの定量化によるｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅノックダウン効率。生物学的反復を使用した。ｄ～ｅ）Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎのエピソーム性のＣａｓ９媒介性マルチプレックス突然変異は、ｐｉｇｇｙＢａｃ置き換えＥＧＦＰ＋細胞の、白質路の近くに局在化するＯｌｉｇ２＋腫瘍への形質転換をもたらす。
（図１０－２）図１０－１の説明を参照のこと。
（図１１－１）図１１（ａ～ｊ）は、本発明の様々な実施形態に記載のインビトロ及びインビボの免疫組織化学による、Ｐｄｇｆｒａ及びＶ５タグ付加Ｔｒｐ５３発現の確認を描写する。ａ）ヘテロ接合のｍＴｍＧのｍＮＳＣにおけるｄＲＭＣＥ後の導入遺伝子発現のインビトロでの査定は、Ｐｄｇｆｒａ、Ｖ５（Ｔｒｐ５３Ｒ２７０Ｈ）及びＰ５３との核ＥＧＦＰの共発現を示す。膜ＥＧＦＰのある混入ｍＧ細胞が存在すること、及びｔｄＴｏｍａｔｏまたは導入遺伝子発現がないことに注目されたい。スケールバー：５０μｍ。ｂ）Ｔｒｐ５３の核ＥＧＦＰ（Ｈ３ｆ３ａ）との共発現の確認。スケールバー：５０μｍ。ｃ）ＭＡＤＲ Ｇ３４Ｒ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３、及びＡｔｒｘのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化を誘導するプラスミドの組み合わせた発現は、腫瘍形成を加速しない。ｄ）ＡｔｒｘはＫ２７Ｍ腫瘍中の大多数のＥＧＦＰ＋細胞において発現される。ＥＧＦＰ＋細胞（黄色矢印）の少量のサブセットはＡｔｒｘ抗原性を失っていた。ｅ）ＥＰ後１００日でＧ３４Ｒ細胞はＡｔｒｘを発現する。ｆ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化はＥＰを行った細胞において高度に効率的なＡｔｒｘの喪失を導く。ｇ）ＥＰ後１２０日で皮質に浸潤するＧ３４Ｒ腫瘍。Ｏｌｉｇ２は腫瘍中の背側で高発現し、それはＥＧＦＰ＋の過形成の腹側では弱まった（黄色矢印）ことに注目されたい。ｈ）ＥＰ後１２０日でのＫ２７Ｍ腫瘍は優先的に皮質下にある。ｉ）Ｎｆ１及びＴｒｐ５３の突然変異に由来するＣａｓ９媒介性グリオーマは、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ高メチル化を示す。ｉ－１は、腫瘍の縁で染色パターンの不一致を示す。ｊ）モノクローナル抗体は、Ｈ３ｆ３ａ導入遺伝子の発現がＲｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａ－Ｋ２７Ｍ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３腫瘍の全体にわたって一貫していることを実証する。＊コントラスト増加のためにＣｙ５波長からの緑色に擬似着色したチャンネル。
（図１１－２）図１１－１の説明を参照のこと。
（図１１－３）図１１－１の説明を参照のこと。
（図１１－４）図１１－１の説明を参照のこと。
（図１２）インビボのＭＡＤＲまたはＭＡＤＲ ＭＡＸに適する代替のレポーターマウス、ならびに本発明の様々な実施形態に記載のＲｉｂｏｔｒａｐ、及び遺伝子トラップ対立遺伝子を備えたＩＫＭＣレポジトリマウス系統への方法の拡張を描写する。既存のＣＡＧベースのレポーターマウスが存在し、このマウスの構築はｍＴｍＧマウスの場合と類似しており、突然変異系譜追跡研究を達成するインビボのＭＡＤＲ、またはＲｉｂｏｔｒａｐヘテロ接合体を使用するオルソゴナルなＲＮＡ単離と適合性がある。加えて、この方法は、一例としてではあるが、重要なエクソンの周囲にｌｏｘＰ及びＦＲＴが隣接する何千もの遺伝子トラップマウスへ拡張することができる。かかる遺伝子座でのインビボのＭＡＤＲは、１）この遺伝子座でのヘテロ接合／ホモ接合のヌル細胞の系譜を追跡すること、に加えて、２）この遺伝子座を導入遺伝子とスワッピングすること、を可能にするだろう。図中の配列は、
上部のパネル：ｌｏｘＰコア：
ＧＣＡＴＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
；最小ＦＲＴ：
Figure 2024063065000004
；第２のパネル：最小ＦＲＴ：
Figure 2024063065000005
；ｌｏｘＰコア：
ＡＴＡＧＴＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
である。
（図１３）図１３（ａ～ｃ）は、本発明の様々な実施形態に記載の線条体におけるＨｒａｓＧ１２Ｖ組換えｍＴｍＧ細胞の試験を描写する。（Ａ）ＥＰ後２週間で、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットのＣｒｅ媒介性切り出しを受けたＥＧＦＰ＋細胞と、ＭＡＤＲの成功したＨｒａｓＧ１２Ｖ＋細胞との間での、明瞭な系譜分岐が示される。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）ＥＰ混合物中で１０ｎｇ／μｌほどの低さのリコンビナーゼ発現ベクターで、インビボでのＭＡＤＲを触媒することができる。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）ｐＢａｓｅ媒介性組み込み後に、より明るいＥＧＰＦ－ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞はリン酸化Ｒｂ１を発現する。スケールバー：２００μｍ。
（図１４）図１４（ａ～ｇ）は、小児ＧＢＭにおいて観察される再発性突然変異を利用するＭＡＤＲグリオーマモデルの生成がヒトサブタイプと一致する表現型をもたらすことを示し、本発明の様々な実施形態に記載の、改変Ｈ３ｆ３ａ ＰＴＭに対する洞察を与える。Ａ）複数の再発性小児グリオーマのドライバー変異のＭＡＤＲのためのドナープラスミドの概略図。Ｂ）ＥＰ後１００日のヘテロ接合のｍＴｍＧにおける代表的な腫瘍形成。核ＥＧＦＰ＋ Ｒｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａ－Ｋ２７Ｍ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３細胞は、大きな線条体腫瘍を形成する。挿入図Ｂ－１は、有意な皮質浸潤の欠如を示す。Ｃ）同腹仔Ｒｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａＧ３４Ｒ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３は、線条体におけるグリアの過形成、及び梨状皮質の内側の腹側前脳におけるＥＧＦＰ＋細胞の小さな塊を示す。Ｄ）Ｒｏｓａ２６Ｈ３ｆ３ａＧ３４Ｒ／Ｐｄｇｆｒａ／Ｔｒｐ５３ ＥＧＦＰ＋腫瘍細胞はＨ３Ｋ２７が低メチル化状態である。Ｅ）ＥＧＦＰ＋腫瘍細胞は、腫瘍の縁 対 中心部で可変的なＨ３ｆ３ａセリン３１のリン酸化を示す。Ｆ～Ｇ）領域Ｅ）のズームイン画像は、中心部において全体的な細胞密度が増加しているにもかかわらず、ＥＧＦＰ＋の核のリン酸化セリン３１の発現が、腫瘍の縁でより高く、中心部において弱まることを示す。
（図１５－１）図１５（ａ～ｈ）は、インビボのＭＡＤＲで取り込まれるＣａｓ９及びＰＣＲ由来ｓｇＲＮＡを使用する体細胞モザイクの迅速な生成が、本発明の様々な実施形態に記載のグリオーマ内の分化転換を調べることを可能にすることを示す。Ａ）ＴａｇＢＦＰ２－Ｖ５リポータータンパク質及びＳｐＣａｓ９のＭＡＤＲのためのプラスミド。Ｂ）ｔｄＴｏｍａｔｏ－／ＥＧＦＰ－腫瘍から精製されたグリオーマ細胞はＮｆ１及びＴｒｐ５３中でＩｎＤｅｌを示す。図中の配列：Ｎｆｌ１エクソン４２
Figure 2024063065000006
；Ｔｒｐ５３エクソン２
Figure 2024063065000007
。Ｃ）共ＥＰを行ったＰＣＲ由来ｓｇＲＮＡによる、ＴａｇＢＦＰ２－Ｖ５レポーター及びＣａｓ９のＭＡＤＲ挿入は、３つの組換え系譜の遺伝学的標識を介して観察可能な高異型度グリオーマをもたらす。Ｄ）グリオーマ細胞は、大部分がＯｌｉｇ２＋であり、不均一性の小さなポケット（白色矢印）を伴う。Ｅ）図１５Ｄ中の白色矢印によって表示された領域に注目する、高倍率のＯｌｉｇ２及びｔｄＴｏｍａｔｏの画像。Ｆ）ほぼ隣接する切片におけるＣＤ４４及びｔｄＴｏｍａｔｏの免疫染色ならびに図１５Ｅからの領域は、ＣＤ４４（間葉腫瘍マーカー）について陽性であることを実証する。Ｇ）脳のＰｄｇｆｒｂ免疫染色は、大部分の周皮細胞が非腫瘍由来（すなわちｔｄＴｏｍａｔｏ＋；Ｅ１）であることを実証する。Ｇ２）ｔｄＴｏｍａｔｏ－周皮細胞のクラスターは不連続の領域中で観察することができる。Ｇ３～５）Ｇ２からの単一のｚ平面及び後続するその拡大は、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＰｄｇｆｒｂの共局在化の欠如（矢頭）を実証する。（Ｈ）脳周皮細胞のＤｅｓ（すなわちデスミン）免疫染色。Ｈ１）ｔｄＴｏｍａｔｏと共局在しないＤｅｓ＋周皮細胞のクラスター。Ｈ２）Ｆ１中で観察された突起からの単一のｚ平面。＊コントラスト増加のためにＣｙ５波長からの緑色に擬似着色したチャンネル。
（図１５－２）図１５－１の説明を参照のこと。
（図１６－１）図１６（ａ～ｆ）は、本発明の様々な実施形態に記載のＭＡＤＲグリオーマにおける分化転換の調査を描写する。Ａ）Ｖ５＋腫瘍由来細胞集団は、腫瘍の病巣領域においてＴｄｔｏｍａｔｏ＋血管に並んで存在することが見出され得る。Ｂ）大きなグリオーマのあるＭＡＤＲ脳のＰｅｃａｍ免疫染色。Ｃ～Ｄ２）稀なｔｄＴｏｍａｔｏ－／Ｐｅｃａｍ１＋像は観察することができるが、血管と関連していない。Ｅ）図Ｆ２のパネルにおける赤色のシグナルの過剰露出から、同様にｔｄＴｏｍａｔｏとＤｅｓとの間の共局在化の欠如が実証される。Ｆ）腫瘍の大部分の領域におけるＤｅｓのシグナルは血管周囲のパターンを示し、血管と明確に関連しなかった場合であってもｔｄＴｏｍａｔｏと共局在する（白色矢印）。＊コントラスト増加のためにＣｙ５波長からの緑色に擬似着色したチャンネル。
（図１６－２）図１６－１の説明を参照のこと。
発明の説明
本明細書において引用されるすべての参照は、あたかも完全に説明されたかのように、それらの全体が参照によって援用される。特別に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ２００６）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ ２０１２）は、本出願中で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。
当業者は本明細書において記載されるものと類似するまたは等価な多くの方法及び材料を認識し、本発明の実践においてそれらを使用することができるだろう。実際、本発明は、記載される方法及び材料へ一切限定されてない。
「調節エレメント」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、及び同種のものを集合的に指し、それらはレシピエント細胞においてコーディング配列の複製、転写及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコーディング配列が適切な宿主細胞中で複製、転写、及び翻訳され得る限り、これらの調節エレメントのすべてが常に存在する必要があるわけではない。
「プロモーター領域」という用語は、通常の意味でＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すように本明細書において使用され、そこで、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合すること及び下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始させることが可能である遺伝子に由来する。
「作動可能に連結された」は、記載される構成要素がそれらの通例の機能を遂行するように構成される、エレメントのアレンジを指す。したがって、コーディング配列へ作動可能に連結された調節エレメントは、コーディング配列の発現を達成することができる。調節エレメントがコーディング配列の発現を指令するように機能する限り、調節エレメントはコーディング配列と隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが介在する転写配列はプロモーター配列の間に存在することができ、コーディング配列及びプロモーター配列は依然としてコーディング配列へ「作動可能に連結された」と見なすことができる。
およそ３００の再発性の推定上のがんドライバー変異の、バイアスのない同定により、その多くはＧＯＦがん遺伝子であり、これらのがんドライバーをモデル化することができる、扱いやすいインビボのプラットフォームを作成することは必須である。腫瘍抑制因子における機能喪失型（ＬＯＦ）突然変異のために、大規模ノックアウト（ＫＯ）マウスコンソーシアムは、現在妥当なＧＥＭＭへの即時アクセスを提供するが、複数のＫＯをともなう腫瘍のモデル化は、独立して組換えることができる多くのｆｌｏｘ対立遺伝子を要求し、結果を複雑にするだろう。この観点から、現在ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの研究は、マウスにおいてインビボで複数のＫＯを誘導する能力を実証している。しかしながら、ＧＯＦ突然変異については、必要なＧＥＭＭの網羅的なカタログの編纂は、気が遠くなるような見通しのままである。
非ＧＥＭＭモデルの、ＣＮＶ、位置変動、及び挿入突然変異誘発の問題に注目して、本発明は、トランスフェクションした細胞の中で一様な遺伝子量を確実にできる方法を捜し、したがって効率的なノックイン方法として探索されたｄＲＭＣＥ（デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換によるモザイク解析（ＭＡＤＲ）としても本明細書において論じられる）を目指した。慣習的には、この方法は、陽性組み込み体（典型的にはマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ））の抗生物質によるクローン選択及びサザンプロービングを必要とする。適切な保護手段を用いて、本発明は、組換えられた細胞に関する決定的な遺伝学的標識を備える既製のレポーターマウスＲｏｓａ２６ｍＴｍＧ（ｍＴｍＧ）を使用して、成功したｄＲＭＣＥが、体細胞中でインサイチューで触媒され得ることを実証する（図１ａ）。さらに、本発明は、ＧＯＦ突然変異及びＬＯＦ突然変異（患者特異的ながんドライバー変異が含まれる）の混合物によるモザイクの生成におけるこのシステムの有用性を実証する。腫瘍モデル化のための非ＧＥＭＭ方法として、この手順は、患者特異的な様式で前臨床薬物を探索するために優秀で迅速なパイプラインとして供することができる。
Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧは広く使用されるレポーター系統であり、これは膜ｔｄＴｏｍａｔｏを構成的に発現し、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットのＣｒｅ媒介性切り出しに際してＥＧＦＰ発現へスイッチする。ｍＴｍＧにおいてｄＲＭＣＥを適応させるために、本発明は、未使用の青色蛍光チャンネルを利用し、ｌｏｘＰ及びＦＲＴの部位が隣接し、ＴａｇＢＦＰ２をコードする、同様にＴａｇＢＦＰ２タグ付加ＨｒａｓＧ１２Ｖをコードする、プロモーターのないドナープラスミドを作成した（図１ｄ及び図２ａ）。ｍＴｍＧ及びＴａｇＢＦＰ２プラスミドの両方は、最小の３４ｂｐのＦＲＴ（それはＦｌｐ媒介性組み込みへ不応性である）を含有する。簡潔には、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）及び三量体化ＳＶ４０ ｐＡはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に先行し、それらは、組み込まれていないエピソーム及びランダムに組み込まれた全体のプラスミド（それは電気化学的トランスフェクションにより起こることが公知である）からの誤った転写を未然に食い止めるだろう。ウッドチャック肝炎ウイルス（それは導入遺伝子発現を増加させる）、転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びウサギβグロビンｐＡ（それは効率的に転写を終結させる）は、ＯＲＦに後続する（図１ａ）。本発明はヘテロ接合のＲｏｓａ２６ＷＴ／ｍＴｍＧマウス（ｍＴｍＧＨｅｔ）を生成し、後続して単一のｍＴｍＧ対立遺伝子を保有するマウス神経幹細胞株（ｍＮＳＣ）を確立した。ＴａｇＢＦＰ２ドナープラスミド及びＦｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクターによるｄＲＭＣＥは、３つの可能な結果（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋のままである細胞、または緑色もしくは青色になった細胞）を生じた（図１ｂ、ｃ及び図３ａ）。ＴａｇＢＦＰ２またはＨｒａｓＧ１２Ｖプラスミドのいずれかによるヌクレオフェクション１週間後に、ＦＡＣＳ分析から、ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞の急速増殖及びさらに約１％のｍＮＳＣにおけるｄＲＭＣＥのおよその効率が示された（図３ｂ）。平均で、青色蛍光について陽性細胞のうちの５％は緑色蛍光または赤色蛍光を保持していたが、それは膜ｔｄＴｏｍａｔｏの比較的遅い分解速度によって説明することができる（図３ｂ、ｃ）。選別した細胞をもう１週間培養した後に、ウエスタンブロットを遂行し、残存するＥＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏの発現の非存在及びさらに正確なＨｒａｓＧ１２Ｖ発現を確認し、これは、組換えられたＲｏｓａ２６遺伝子座が、凝集した非クローン性の集団レベルでさえ、正確なポリペプチドを生成することを示す（図３ｄ）。
ＧＯＦタンパク質の評価は多くの場合インビトロで達成されるが、構成的導入遺伝子発現は安定的な細胞株の生成に有害であり得る。この問題を回避するために、場合によっては誘導可能遺伝子系（ＴＲＥ等）を用いる。単一の対立遺伝子ｍＴｍＧＨｅｔのｍＮＳＣの有用性を発展させるために、本発明は、ｒｔＴＡ－Ｖ１０及びＴＲＥ－Ｂｉエレメントを含有する単一のｄＲＭＣＥに適合性のあるプラスミドの作成によって、誘導可能細胞株産生のためのパイプラインを作成することを目標とした（図４ａ）。後続して、ピューロマイシン選択により無色のＴＲＥ－Ｂｉ－ＥＧＦＰ細胞株を生成し、標準的なインビトロのドキシサイクリン処理によりＴＲＥの忠実度を確認した（図４ｂ、ｃ）。本発明はＣＮＶの細胞内分布の変化に注目したので、バイシストロン性ＴＲＥ－Ｂｉ－Ｄｌｌ１／ＥＧＦＰドナーベクターにより一様なレベルのノッチリガンドＤｌｌ１発現を示す細胞株も生成した（データ不掲載；図４ｄ）。ピューロマイシンのみを発現するクローニング中間体プラスミドを使用して、Ｒｏｓａ２６遺伝子座での正確な組換えについてもＰＣＲスクリーニングによってチェックした（図５ａ、ｂ及び表１）。ｄＲＭＣＥ後に、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットは、ｄＲＭＣＥに際してＣＡＧプロモーターの下流にもはや存在しない。しかしながら、ＰＣＲスクリーニングは、いくつかの細胞におけるＥＧＦＰシストロンの持続を明らかにしたが、ＥＧＦＰの発現は、上流のポリＡエレメント、及びＣＡＧプロモーターからの距離によって軽減される（図５ｂ）。これを支持して、ＥＧＦＰ自己蛍光は観察されず、これらの細胞のウエスタンブロットは、ドキシサイクリン処理でのみＥＧＦＰ発現を示した（図４ｂ及び図５ｃ）。
ＴＲＥ－Ｂｉ－ＥＧＦＰ細胞株におけるピューロマイシン選択後のＥＧＦＰ発現の欠如を考慮すると、類似のドキシサイクリン誘導可能プラスミドを使用して、４つの異なる「ｓｐａｇｈｅｔｔｉ ｍｏｎｓｔｅｒ」蛍光タンパク質（ＳＭ＿ＦＰ）（それらの異なるエピトープタグを介してオルソゴナルな検出を可能にする）を発現させることができることが推論された。本発明は、多重抗原性ＸＦＰによるＭＡＤＲ（ＭＡＤＲ ＭＡＸ）を使用して、１細胞あたり各々のプラスミドの２つ以上のコピーを発現できるかどうかを経験的に評価した（図２ｇ）。特に、１細胞あたりのこれらの高いシグナル対ノイズのＳＭ＿ＦＰプローブのより高い発現は、免疫蛍光法によって容易に検出可能だろう。何百もの細胞の試験から、ピューロマイシン選択及びドキシサイクリン添加後に実質的にはすべて細胞におけるＳＭ＿ＦＰの存在が示された（図４ｅ）。しかしながら、高倍率で、どの細胞も免疫蛍光法によって２つ以上のＳＭ＿ＦＰを発現していることが観察されず（図４ｆ）、ｄＲＭＣＥ方法論が遺伝子導入エレメントの単一コピーの挿入を媒介することを示した。
このインビトロのシステムは、より均一で誘導可能な安定的な細胞株を提供することによって、ｌｏｘＰ及びＦｒｔを保有する任意の動物に由来する様々な初代細胞株におけるＧＯＦタンパク質機能を調べるのに有益である。これについての原理証明として、及び、ＴＲＥ－Ｂｉエレメント（それは上流プロモーターまたはエンハンサーによって潜在的に活性化され得る）の３’シストロンの漏出性の可能性の有用性を経験的に試験するために、バイシストロン性ＴＲＥ－Ｂｉ－Ｄｌｌ１／ＥＧＦＰドナーベクターによりノッチシグナリングリガンド（Ｄｌｌ１）を誘導可能に発現する細胞株も生成した（図４ｄ）。顕著なことに、ドキシサイクリンなしで存在する容易に検出可能なレポーター及び微小レベルのリガンドはなかったが、添加された場合の、ＥＧＦＰ及びＤｌｌ１の両方はすべての細胞によって実質的には類似するレベルで発現された（図４ｄ）（ドキシサイクリンの非存在下における微小量のリガンド発現は、ｍＮＳＣの内在性発現と同等であった）。ノッチシグナリングは遺伝子用量に感受性のある分子経路の１つの例であり、これらのような経路の研究のために本発明のパイプラインを意図できるだろう。
（表１）ＰＣＲスクリーニングのために使用したプライマー
Figure 2024063065000008
インビボのｄＲＭＣＥの適用可能性を調査するために、出生後のｍＴｍＧＨｅｔ仔マウスの脳室帯／脳室下帯を裏打ちする神経幹細胞／前駆細胞の中へ、Ｆｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクターとＴａｇＢＦＰ２ドナーベクターを用いてＥＰを行った（図１ｄ）。その結果、早ければＥＰの２日後に脳室帯に沿って組換えられた細胞の出現が注目され、これらの細胞は２週間までに嗅球ニューロン及びグリアを生じた（図１ｅ及び図６ａ～ｃ）。ＴａｇＢＦＰ＋サテライトグリアの共焦点分析は、これらの細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰの発現の非存在を示す（図６ｃ）。脳室帯での、持続性のＥＧＦＰ発現のあるいくつかの稀なＴａｇＢＦＰ２＋細胞が示され、これらの細胞は、遅いタンパク質プロセシング動態の上衣細胞系譜の細胞であり得る（図６ｂ）。ＨｒａｓＧ１２Ｖを用いてＥＰを行ったホモ接合のｍＴｍＧの４匹はすべて、急速にグリオーマを発症し、３～４か月以内に死亡した（図２ａ～ｃ）。ＣＡＧプロモーターによって駆動される同じがん遺伝子を使用して、本発明者はＨｒａｓＧ１２ＶのＰＢ－ＥＰが１００％浸透するグリオーマをもたらすことを以前に示している。興味深いことには、このホモ接合のｍＴｍＧグリオーマにおいて、青色のみの細胞（Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２）は、青色及び緑色の両方を発現する細胞（Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１）よりも、腫瘍横断面のうちの大きなパッチを占めた（図２ｂ、ｃ）。以前に、ＨｒａｓＧ１２Ｖのコピー数は、表現型の差（増殖及びアポトーシスの率等）を付与することが示されている。本発明者は、ＰＢ－ＥＰを使用して、より明るいＥＧＦＰタグ付加ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞が、薄暗いＥＧＦＰ＋細胞よりも、リン酸化Ｒｂ１（ｐＲｂ１）を多く発現することも観察した（図７ａ）。同様に、ＨｒａｓＧ１２Ｖを用いてＥＰを行ったｍＴｍＧにおける大部分のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２細胞はｐＲｂ１を発現するが、Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１は発現しないように思われる（図７ｂ、ｃ）。このデータは、ＧＥＭＭを使用して以前に観察されたように、がん遺伝子のコピー数が、生じた腫瘍集団のプロファイルを有意に変更する可能性を示す。
しかしながら、大部分のＴａｇＢＦＰ２＋細胞は、ＥＰ後２週間までにｔｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰの発現の非存在を示した（図６Ｃ）。インビボの組換え効率に対するプラスミド濃度の効果を経験的に試験するために、組換えられた細胞の高感度検出のためにＦｌｐ－Ｃｒｅリコンビナーゼ発現プラスミド及びＭＡＤＲ ＭＡＸレポータープラスミド（すなわち１０のＨＡタグを備えたｓｐａｇｈｅｔｔｉ－ｍｏｎｓｔｅｒレポータープラスミドを発現する）の濃度を変動させた（図１ｆ）。ＭＡＤＲ（及びしたがってＭＡＤＲ ＭＡＸ）反応は理論的に不可逆的であるので、ＥＰ後２日の脳を検査した。すべてのＤＮＡ混合物は非ＭＡＤＲの構成的核ＴａｇＢｆｐ２レポーターを含有していた。意外にも、ドナープラスミド濃度を１０ｎｇ／μｌへ低下させることで、ＭＡＤＲ ＭＡＸ効率はおよそ１００％に近づき、ＥＧＦＰ発現のあるＣｒｅ組換え細胞はほとんど０であることが示された（図１ｆ）。可能な１つの説明は、ドナープラスミドの濃度を（したがってｌｏｘＰ及びＦＲＴの組換え部位の濃度も）増加させることが、リコンビナーゼについて競合するということである。あるいは、トランスポゼースで観察されるような「過剰生産阻害」メカニズムは、別の可能性である。すべての後続するエレクトロポレーション混合物は、並列比較について、ＥＧＦＰ細胞、及びＭＡＤＲ細胞またはＭＡＤＲ ＭＡＸ細胞のほぼ等価な数を生成するために、０．５～１μｇ／μｌのプラスミドを含有していた。
ＨｒａｓＧ１２ＶによるｍＴｍＧＨｅｔにおいて、青色の組換えられた細胞（すなわち単一コピーのＨｒａｓＧ１２Ｖ）の腫瘍形成性増殖が観察されたが、Ｃｒｅ組換えのみを受けた緑色の同胞細胞（すなわちＨｒａｓＧ１２Ｖなし）は、異常増殖を提示しなかった（図８ａ）。これらの緑色の同胞細胞はＭＡＤＭ２２における野生型細胞に似た様式で有用な対照細胞集団として供することができた。ＭＡＤＭ及びＭＡＳＴＲは、ショウジョウバエの様に突然変異細胞の正確な判読を可能にするが、目的の遺伝子の染色体位置に依存してＧＥＭＭ生成を新たに要求する。１０ｎｇ／μｌほどの低さのリコンビナーゼ発現ベクターと混合されたＨｒａｓＧ１２Ｖは、その高い増殖能に起因して、依然として侵襲性で早発性の腫瘍形成をもたらした（図８ｂ）。ランダムに組み込まれたエピソームまたは組換えられなかったエピソームからの発現に起因する腫瘍形成を除外するために、１シリーズの対照エレクトロポレーションを遂行した（図９）。最初に、形質導入細胞の系譜にマーキングするＰＢ－ＥＧＦＰプラスミドと組み合わせた、ドナーＨｒａｓＧ１２Ｖ（約５μｇ／μｌ）の濃縮した混合物の、野生型ＣＤ１仔マウスの中へのＥＰは、Ｆｌｐ及びＣｒｅリコンビナーゼの存在にかかわらず、異常増殖、過形成、または腫瘍形成をもたらさなかった（図９ａ）。加えて、逆向きのｌｏｘＰを保有するＨｒａｓＧ１２ＶによりｍＴｍＧ仔マウスにＥＰを行ったところ、いかなる青色の組換えられた細胞または過形成も免疫染色によって検出できず、インビボのｄＲＭＣＥ組換え反応の特異性を例証する（図９ｂ）。ＥＰ後２週間で検査した場合に、ＨｒａｓＧ１２Ｖドナープラスミド及びＣｒｅリコンビナーゼ単独の複数の独立したＥＰは、腫瘍形成を生じず、Ｆｌｐ切り出しは効率的なインビボのｄＲＭＣＥ反応についての非常に重要なステップであること及びＣｒｅは単独では持続的導入遺伝子組み込みのために不十分であることが示された（データ不掲載）。Ｆｌｐ切り出しが不可逆的平衡の確立に重要であるので、ＦｌｐＥをＦｌｐＯにより置き換えてＦｌｐ切り出しの効率を増加させることは、本発明の別の実施形態である。
ＭＡＤＭにより、組み合わせたＴｒｐ５３－ＬＯＦ及びＮｆ１－ＬＯＦの突然変異がオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の前悪性の過剰増殖を促進することが示されている。本発明者は、本発明の方法を使用して、類似する発生現象を模倣することを目的とした。最初に、本発明では、ＴａｇＢＦＰ２発現へ結合された、Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３を標的化する３つの連続した検証済みｍｉＲ－ＥベースのｓｈＲＮＡを保有するドナーコンストラクトを作成した（図２ｄ）。このｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅコンストラクトを試験したところ、約８０％のｍＲＮＡレベルのノックダウン効率が観察され、ｍｉＲ－Ｅについての原報に同等であった（図１０ｂ、ｃ）。ＭＡＤＭの所見に一致して、ＴａｇＢＦＰ２＋／Ｐｄｇｆｒａ＋ ＯＰＣの選択的過剰増殖が観察され、Ｎｆ１及びＴｒｐ５３に基づくＬＯＦモデルがＯＰＣ駆動性過形成をもたらすという以前の観察と合致した（図２ｅ及び図１０ａ）。嗅球（ＯＢ）ニューロンにおける３つのｍｉＲ－Ｅの発現が、それらの形態または明らかな細胞タイプを無効にしないことも観察され、細胞背景（ｃｏｎｔｅｘｔ）はこれらのＬＯＦ突然変異の形質転換能力のために重要であり、この細胞背景によって突然変異は神経細胞系譜細胞において休止するようになるという先行研究とも一致した（図１０ｂ）。ＥＰ後２００日で悪性腫瘍は検出されず、Ｔｒｐ５３の完全な消耗がおそらく高浸透度の早発腫瘍形成のために要求されることが示された（図１０ｃ）。本発明の追加の実施形態として、このシステムは、ｓｐＣａｓ９を保有し、腫瘍抑制因子を標的化するｓｇＲＮＡと共に送達される、ドナープラスミドの作成によって修飾され得る。
本発明のＭＡＤＲシステムがＧＯＦ細胞及びＬＯＦ細胞の複数の集団をインビボで独立して系譜追跡する能力を考慮すると、このシステムはグリアの発生の研究に有用であり得ることが推論された。組み合わせたＴｒｐ５３－ＬＯＦ及びＮｆ１－ＬＯＦの突然変異がオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の前悪性の過剰増殖を促進することは、ＭＡＤＭを使用してエレガントに実証された。本発明者は、本発明の方法を使用して、類似する発生現象を模倣することを目的とした。最初に、本発明では、ＴａｇＢＦＰ２発現へ結合された、Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３を標的化する３つの連続した検証済みｍｉＲ－ＥベースのｓｈＲＮＡを保有するドナーコンストラクトを作成した（図２Ｈ）。このｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅコンストラクトを試験したところ、約８０％のｍＲＮＡレベルのノックダウン効率が観察され、もともと報告された効率に同等であった（図２Ｉ）。ＭＡＤＭの所見に一致して、ＴａｇＢＦＰ２＋／Ｐｄｇｆｒａ＋ ＯＰＣの選択的過剰増殖が観察され、Ｎｆ１及びＴｒｐ５３に基づくＬＯＦモデルがＯＰＣ駆動性過形成をもたらすという以前の観察と合致した（図２Ｊ及び図１０ａ）。顕著なことに、同胞ＥＧＦＰ＋集団（それはｍｉＲ－Ｅを含有しない）は、ほとんど星状細胞の、定量的により小さな混合集団をもたらした（図２Ｊ及びデータ不掲載）。これらの遺伝的に定義された（すなわちＥＧＦＰ＋）同胞細胞は、ＭＡＤＭ ＧＥＭＭシステムにおける野生型細胞に似た様式で有用な対照細胞集団として供することができた。ＭＡＤＭ及びＭＡＳＴＲは、ショウジョウバエの様に突然変異細胞の正確な判読を可能にするが、目的の遺伝子の染色体位置に依存してＧＥＭＭ生成を新たに要求する。３つのｍｉＲ－Ｅの発現が嗅球神経新生を阻止しないとも観察され（図１０Ｂ）、このことはＨｒａｓ及びＥｒｒｂ２を使用する本発明者の以前の所見に反し、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナリングの増加をもたらすＧＯＦ及びＬＯＦの突然変異は、微細に異なる細胞運命の改変を導き得ることを示唆した。小さな集団の動物によるものとはいえ、ＥＰ後２００日で悪性腫瘍は検出されず、Ｎｆ１ Ｐ５３及びＰｔｅｎのうちのいずれか１つ、２つ、またはすべての完全な消耗（ノックダウンではなく）は、おそらく高浸透度の早発性腫瘍形成のために要求されることが示された。このことの確認として、これらの抑制因子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックアウトを使用した。顕著なことに、ＳｐＣａｓ９及びｐｉｇｇｙＢａｃ媒介性ＥＧＦＰ標識と一緒に、Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎに対するｓｇＲＮＡの組み合わせをＥＰすることによって、ＧＥＭＭグリオーマモデル、ＭＡＤＭグリオーマモデル、及び子宮内ＥＰベースのＣＲＩＳＰＲモデルに一致して、白質に結び付いた高異型度Ｏｌｉｇ２＋腫瘍の形成が示された（図１０ｄ～ｅ）。それにもかかわらず、本発明のｍｉＲ－Ｅ研究は、標的遺伝子の単一コピーの安定的なのノックダウン後に系譜の追跡を遂行する一方で、内部の「対照」系譜（すなわちＥＧＦＰ＋ Ｃｒｅ組換え細胞）を提供することにおける、ＭＡＤＲの有用性を実証する。
インビボのＭＡＤＲに基づく局所性グリオーマモデルの生成
ウイルスによる腫瘍モデル及びＥＰ腫瘍モデルは様々な組織におけるがんの発生進化的側面を研究するためにますます用いられているが、様々な遺伝子送達方法に関して問題がある。推定上のがんドライバー遺伝子のインビボの自然発症モデル化のためには本発明の方法が最も適すると推論し、原理証明のためにＨｒａｓＧ１２Ｖ（よく使用される活性化がん遺伝子）を選択した。推定上の単一コピーのヘテロ接合のマウスにおける増殖ダイナミックスの組織学的分析から、ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞は、ＥＧＦＰ＋集団と比較した場合に、急速に過剰増殖したということが示された（図１３Ａ）。さらに、本発明者は、ホモ接合性へｍＴｍＧマウスを繁殖させることによって、細胞のヘテロ接合集団及びホモ接合集団を識別でき得ると推論した。具体的には、理論的には４つの可能性が組換えまたは挿入後に生じ、各々は遺伝的マーカーの異なる組み合わせを有するだろう（図２Ｂ）。生後２日のＥＰ後に、ＨｒａｓＧ１２Ｖを用いてＥＰを行ったホモ接合のｍＴｍＧのすべては、急速にグリオーマを発症し、３～４か月以内に最終的に死亡した（図２ａ；ｎ＝４）（ＣＡＧプロモーターによって駆動される同じがん遺伝子を使用して、本発明者はＨｒａｓＧ１２ＶのＰＢ－ＥＰが１００％浸透するグリオーマをもたらすことを以前に示している）。ホモ接合のｍＴｍＧマウスにおいて、１０ｎｇ／μｌのプラスミドを使用する場合でさえ、ＭＡＤＲ反応は高度に効率的であった（図１３Ｂ）。興味深いことには、このホモ接合のｍＴｍＧグリオーマにおいて、青色のみの細胞（Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２）は、青色及び緑色の両方を発現する細胞（Ｒｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１）よりも、腫瘍横断面のうちの大きなパッチを占めた（図２ｃ、７ｂ）。以前に、ＨｒａｓＧ１２Ｖのコピー数は、表現型の差（増殖及びアポトーシスの率等）を付与することが示されている。本発明者は、ＰＢ－ＥＰを使用して、より明るいＥＧＦＰタグ付加ＨｒａｓＧ１２Ｖ細胞が、薄暗いＥＧＦＰ＋細胞よりも、リン酸化Ｒｂ１（ｐＲｂ１）を多く発現することも観察した（図１３Ｃ）。同様に、ＨｒａｓＧ１２Ｖを用いてＥＰを行ったｍＴｍＧマウスにおける大部分の推定上のホモ接合のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×２細胞はｐＲｂ１を発現するが、ヘミ接合のＲｏｓａ２６ＨｒａｓＧ１２Ｖ×１は発現しないように思われる（図７ｂ～７ｃ）。このデータは、ＧＥＭＭを使用して以前に観察されたように、がん遺伝子のコピー数が、生じた腫瘍集団のプロファイルを有意に変更する可能性を示す。
がんのマウスモデルに関しての現在の満たされていない必要性は、「個人化された」腫瘍モデル化のさらなるハイスループット法である。がんにおける推定上のドライバー変異に関する知識についての最近の急増により、コンビナトリアル様式でインビボのこれらの突然変異を迅速かつ包括的にモデル化できるプラットフォームについての必要性がある。例えば、最近、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＰＤＧＦＲＡ、及びＴＲＰ５３は小児グリオーマにおいて再発性であることが見出された。興味深いことには、Ｈ３Ｆ３Ａ突然変異は２つの残基（Ｋ２７及びＧ３４）中に存在した。顕著なことに、Ｈ３Ｆ３ＡにおけるＫ２７ＭまたはＧ３４Ｒ／Ｖ突然変異のいずれかを持つ結果の患者腫瘍は、臨床的挙動に加えて著しく異なるトランスクリプトームを示す。特に、患者Ｋ２７Ｍのグリオーマは正中線に沿ってクラスター化しＧ３４Ｒ／Ｖグリオーマよりも早期に出現し、その大部分は大脳半球中に存在する。それにもかかわらず、両方のクラスのＨ３Ｆ３Ａグリオーマは典型的にはＴＲＰ５３突然変異を保有し、ＰＤＧＦＲＡ活性化突然変異を示し得る。マウスにおいてこれらの小児腫瘍をモデル化するために、本発明者は、Ｈ３ｆ３ａ突然変異（ＥＧＦＰへタグ付加した）、活性化Ｐｄｇｆｒａ（Ｄ８４２Ｖ）、及び突然変異Ｔｒｐ５３（Ｒ２７０Ｈ）の共発現のためのカセットを生成した（図１４）。最初に、本発明者は、Ｈ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ、及びＴｒｐ５３の適切な発現についてインビボ及びインビトロで免疫組織化学によってチェックし、すべてのタンパク質の一致する発現を示した（図１１Ａ～Ｂ）。次に、出生後のＥＰによって同腹仔の中へこれらのプラスミドを導入した。重要なことには、電極を掃引して両方の皮質脳室帯及び線条体脳室帯の両方へＥＰ行って、両方の前駆細胞帯からの可能な腫瘍形成を起させた。興味深いことに、そして外見はこれらの腫瘍の臨床所見に一致して、Ｋ２７Ｍを持つ同腹仔は生後１００日までに正中線でのグリオーマを示したが（図１４Ｂ）、同様に処理されたＧ３４Ｒを持つ同腹仔の多くはびまん性のグリアの過形成及び非常に稀で小さな腫瘍を提示した（図１４Ｃ、矢頭）。Ｇ３４Ｒ突然変異は多くの場合、コーディング配列の後半のＡＴＲＸ突然変異と共に現れるので、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を使用して、これらの天然に存在する突然変異を模倣するＩｎＤｅｌを導入した。Ｇ３４Ｒを含有する共発現カセットと一緒に、ＡＴＲＸを標的化するｓｇＲＮＡと共にＳｐＣａｓ９を発現するプラスミドを共導入した後に、生後１００日で、肉眼的変化は、腫瘍形成についての傾向に関してＧ３４Ｒグリア細胞の挙動において観察されなかった（図１１Ｃ）（ＡｔｒｘのＣ末端を認識する以前に検証された抗体は、Ｋ２７Ｍ細胞の＞９０％及びＧ３４Ｒ ＭＡＤＲ細胞の１００％が全長Ａｔｒｘを発現する一方で、ＡｔｒｘのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化によるＧ３４Ｒ細胞の＞９５％がＡｔｒｘ抗体標識を示さないということを実証した（図１１Ｄ～Ｅ））。顕著なことに、ＥＰ後１２０日で、Ｇ３４Ｒ腫瘍が観察され、線条体脳室帯の等しい標的化にもかかわらず皮質及び下層にある脳梁へ局在した（及びこれらの細胞のうちのいくつかは過形成と一致した；図１１Ｇ）。興味深いことには、Ｏｌｉｇ２シグナルは背側領域において有意に顕著であり、腫瘍と過形成との間の細胞運命の食い違いを示唆した（図１１Ｇ１）。この同じ１２０日目のタイムポイントで、Ｋ２７Ｍ腫瘍は皮質下構造へ優先的に局在化したが、より深部の皮質層中の少量の細胞を備えた白質路において細胞を観察することができた（図１１Ｈ）。これらの所見は、Ｋ２７残基及びＧ３４残基が、強力なＰｄｇｆｒａ及びＴｒｐ５３の突然変異の一致する存在にもかかわらず、これらのグリオーマサブタイプの発症の時間及び所在位置を有意に調節するのに十分であることを示す。さらに、体細胞Ａｔｒｘ突然変異は、Ｇ３４Ｒ腫瘍における腫瘍形成のための律速ステップであるとは思われない。
機構的に、Ｋ２７Ｍ突然変異はこの残基で低メチル化を導くと考えられている。実際、ＭＡＤＲが腫瘍細胞の系譜を追跡する内因性の能力を考慮して、本発明者は、Ｋ２７Ｍｅ抗体によってＫ２７Ｍ突然変異細胞の低メチル化を確認することができた（図１４Ｄ）（これは、単純に、高メチル化されたグリオーマの形成を導くＮｆ１／Ｔｒｐ５３のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウトとしての腫瘍増殖の人為的な影響ではなかった（図１１Ｉ））。最近、Ｋ２７とＧ３４との間に位置するセリン３１のリン酸化（従来はリン酸化Ｓｅｒ３１）が、Ｔｒｐ５３媒介性細胞周期停止のために重要であり、これが異数性フェールセーフの短絡を導き得ることが見出された。再び腫瘍細胞の系譜を追跡する本発明の能力を使用して、リン酸化Ｓｅｒ３１の印象的なパターンが示され、それは腫瘍の中心部ではなく縁で見出された（図１４Ｅ）。これは高倍率の共焦点ｚスタックによって確認された（図１４Ｆ～Ｇ）。さらに、Ｈ３ｆ３ａに対するモノクローナル抗体により、腫瘍の全体にわたるタンパク質の存在が確認された（図１１Ｊ）。この染色パターンは、腫瘍播種における可能な役割について極めて示唆的であるが、このリン酸化が腫瘍ダイナミックスのために機能的に重要かどうかを調査するさらなる研究が必要だろう。総合すると、腫瘍細胞自律的な様式におけるかかる翻訳後変化を、インビボで容易かつ明確に観察する能力は、これら及び他のがんにおける疾患病理機構の将来の調査のために有望である。
系譜を追跡するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ＭＡＤＲ ＭＡＸグリオーマモデルは、腫瘍の周皮細胞への分化転換を明らかにする
最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＥＰを使用する遺伝子の突然変異についてインビボで高度に効率的なことが実証されている。しかしながら、これらの研究の欠点は、修飾された細胞の系譜を追跡する決定的な手法である。この問題に取り組むために、同時に細胞を標識し突然変異させる、ＳＭ＿ＢＦＰ２－Ｐ２ａ－ＳｐＣａｓ９含有ドナープラスミドを作成し、インビボでの突然変異細胞の正確な追跡を可能にした（図１５Ａ）。Ｎｆ１、Ｔｒｐ５３及びＰｔｅｎのタンデムｍｉＲ－Ｅ及びＣａｓ９媒介性ノックアウトによる本発明の前述の所見を考慮し、これらの同じＰＣＲを行った（ＰＣＲ－ｅｄ）ｓｇＲＮＡを使用して、Ｎｆ１及びＴｒｐ５３を標的化した。ＥＰを行った細胞において成功した標的化は、シーケンシングによって腫瘍集団のゲノムＤＮＡ中で確認された（図１５Ｂ）。大まかに５か月で、ＥＰを行った動物での最終的な死亡が観察された。病理学的分析により、主に腫瘍における壊死の存在に起因して、多形性グリオブラストーマの診断が導かれた。免疫組織化学的に、腫瘍では、血管を例外として、ＴｄＴｏｍａｔｏに標識された集団がほとんど無いことが観察された（図１５Ｃ～Ｃ１）。小さなＥＧＦＰ集団は、標的化部位が存在することが予想される付近で観察された（図１５Ｃ、Ｃ２；矢頭）。しかしながら、腫瘍は、ＭＡＤＲ ＭＡＸ ＳＭ＿ＢＦＰ－Ｖ５で標識された細胞によって区切られ、半球を超えて異常増殖した（図１５Ｃ、Ｃ３）。大部分のこの体積はＯｌｉｇ２＋集団により満たされていが、シグナルが欠如した領域が観察された（図１５；矢頭；１５Ｅ）。Ｏｌｉｇ２は、前神経性グリオーマサブタイプのマーカーであるので（本発明者及び他の者は間充織発達に先行することを観察している）、これが腫瘍発達の部位であるかどうかを、間充織マーカー（ＣＤ４４）についての染色によって評価した。とりわけ、ＣＤ４４は、腫瘍の全体にわたって見出されたがこのＯｌｉｇ２減退領域でエンリッチされていた（図１５Ｅ～Ｆ、データ不掲載）。ＴｄＴｏｍａｔｏの血管が顕著であること、及びＳＭ＿ＢＦＰ－Ｖ５が腫瘍細胞系譜を識別する能力に起因して、Ｖ５タグ付加血管周囲細胞の顕著な集団は他の集団から際立っていた（図１６Ａ；矢印）。腫瘍細胞と間質とを遺伝的マーカーにより遺伝的に識別する本発明の能力と一緒に、これらの細胞の所在位置及び形態を考慮して、グリオーマ細胞の分化転換に関する現在の論争を再考した。具体的には、複数のグループは、グリオーマ細胞が内皮細胞へと分化転換し得ることを示した。これは、その代りに周皮細胞への分化転換であるという所見によって争われた。他のグループは、かなりの調査にもかかわらずいずれについても証拠が欠如していることを見出している。Ｐｅｃａｍ１（内皮細胞の真のマーカー）のＴｄＴｏｍａｔｏとの共局在化の試験において、本発明者は、実質的にすべてのＰｅｃａｍ１＋細胞が共標識されていると示し、血管は腫瘍由来でないことを示唆した（図１６Ｂ）。しかしながら、非常に稀なＰｅｃａｍ１＋／ＴｄＴｏｍａｔｏ－シグナルが示され、小さなサイズ（＜５μｍ）であること及び正常な内皮細胞のサイズのプロファイルがほんのわずかのであることを考慮すると、その大部分は残骸であると思われる（図１６Ｃ～Ｄ）。しかしながら、管に結び付いた細胞は見出されず、これらの推定上の細胞数は体系的調査に適していなかった（図１６Ｃ～Ｄ）。反対に、十分に検証された周皮細胞マーカーであるＰｄｇｆｒｂ及びＤｅｓ（すなわちデスミン）の両方を使用して、本発明者は、前述のＯｌｉｇ２－／Ｃｄ４４＋部位で及びその周辺で、不連続な所在位置を観察することができ（図１５Ｄ中で矢頭によって描写された領域に大まかに隣接する切片において）、この不連続な所在位置はＴｄＴｏｍａｔｏの非存在下においてどちらの周皮細胞マーカーについても陽性を示した（図１５Ｇ～Ｈ）。ＴｄＴｏｍａｔｏの抗体増幅及びこれらの領域におけるＴｄＴｏｍａｔｏシグナルの人為的に過度な露出にもかかわらず、いくつかの周皮細胞においてＴｄＴｏｍａｔｏ及びＤｅｓの共局在化は観察されなかった（図１６Ｅ）。しかしながら、腫瘍の大部分の領域（特にＯｌｉｇ２エンリッチ領域）において、これらの周皮細胞マーカーは、ＴｄＴｏｍａｔｏ膜と厳密に共局在することが見出され、この分化転換が、前神経性サブタイプが優勢な領域中に広がっていないことを示唆した（図１６Ｆ）。したがって、本発明の新規の自然発症モデル（それはインビボで複数の集団の明確な遺伝学的標識を可能にする）を使用して、本発明者は、ＧＢＭにおける腫瘍細胞の周皮細胞への局所性分化転換についての証拠を提供する。これは、グリオーマ細胞の周皮細胞への分化転換がグリオーマの不均一な発達（前神経性サブタイプから間充織サブタイプのものが含まれる）と相関し得ることを示唆する。
推定上のドライバー変異が最近急増していることにより、コンビナトリアル様式でインビボのこれらの突然変異を迅速かつ包括的にモデル化できるプラットフォームについての必要性がある。最近、Ｈ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ、及びＴｒｐ５３は小児グリオーマにおいて再発性であることが見出された。本発明者は、これらの突然変異の異なる組み合わせを保有する２つのドナープラスミドのＥＰが、生後５０日までに増殖性過形成をもたらすことを実証した（図２ｆ、ｇ）。Ｈ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ及びＴｒｐ５３の発現についてインビボ及びインビトロで免疫組織化学によって、チェックした（図２ｇ及び図１１ａ、ｂ）。
本発明者は、インビボのｄＲＭＣＥ媒介性体細胞遺伝子導入が、１つのマウス系統を使用して、多数の体細胞モザイクを作成する高度に着実で費用効率の高い方法であることを実証した。特に、ｄＲＭＣＥは最近インビトロで利用されてきたが、比較的低い挿入効率に悩まされ、したがって、クローン細胞株の抗生物質選択及び分子生物学的方法（ＰＣＲ、サザンブロットなど）により個別の細胞株の正確な検証が要求される。本明細書において、本発明者は、注意深いプラスミドデザインによって、構成プラスミドエレメントのタイトレーションによって、及び「安全な着陸地点（ｓａｆｅ－ｌａｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」（例えば本明細書において記載される様々な実施形態のためのＲＯＳＡ２６遺伝子座）の利用によって、ＲＭＣＥによりインビボの導入遺伝子のおよそ９０％の発現を達成することができることを実証する。これは、単一コピーまたは２コピーの導入遺伝子発現の一貫して正確で容易な調査を可能にする。比較として、エピソーム及びトランスポゾン媒介性挿入は、多くの場合、何十または何百もの所与の導入遺伝子のコピーからの超生理学的発現を導く。さらに、エピソーム導入遺伝子は増殖系譜においてより頻繁に希釈され、トランスポゾンベースの方法は、トランスポゼースの存在下においてカセット「ホッピング」を引き起こし、内在性遺伝子機能（腫瘍抑制因子、細胞周期遺伝子などが含まれる）を破壊する可能性があるだろう。さらに、リコンビナーゼ事象を示すｍｔ／ｍｇレポーターの使用を介して、プラスミド構成物のタイトレーションによって、及び複数のドナープラスミドの使用によって、複数の独立した系譜を追跡することができる。
本発明者は、腫瘍突然変異の２つの広範囲のモード（ＧＯＦ／ＬＯＦ）を柔軟に組み合わせる能力を実証した。本ストラテジーは、デュアルリコンビナーゼ部位を保有する任意の既製のＧＥＭＭ（例えばＡｉ１４マウス、Ｒ２６－ＣＡＧ－ＬＦ－ｍＴＦＰ１マウス、及びＩＫＭＣマウス）と共に用いることができ、定義された供与量でインビボのＧＯＦタンパク質及びＬＯＦタンパク質の機能の決定的な査定を可能にする（図１２）。このストラテジーは、ウイルスベクター及び他の遺伝子送達方法と併用して、他の器官（肺、乳房、及びさらに多くのもの等）へも拡張され得る。
本発明のインビボのＭＡＤＲ効率実験は、ドナーコンストラクトの濃度の希釈が、おそらく単一基質ベースの組換え反応（それはｆｌｏｘ遺伝子座及びＣｒｅリコンビナーゼによる二重遺伝子導入ＧＥＭＭにおいて起こる）を模倣することを示す（図１ｆ）。本発明者は、迅速にかつ柔軟に腫瘍突然変異の２つの広範囲のモード（ＧＯＦ／ＬＯＦ）を組み合わせることが可能であることを実証した。全体として見れば、本発明者は、ＥＰによりマウスにおいて安定的な定義されたコピー数の体細胞モザイク性を産生する新しい技法を導入した。ＭＡＤＲの固有の特色を、他の方法を使用するインビボのマウス遺伝子操作のための既存の方法と有利に比較した（表２）。今後は、所望されるドナーエレメントのサイズが十分に小さいならば、組み込まれないウイルスベクターを使用し、標的化できる組織の数の増やすことができる。
（表２）
Figure 2024063065000009
新しいＭＡＤＲ ＥＰツールキット
トランスポゾン（ＰＢ及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ等）はＥＰと組み合わせてますます使用されて、近年これらの技法を利用する複数の報告により安定的な体細胞遺伝子導入体が産生される。トランスポゾンは長期的な発生的研究及びさらにインビボの腫瘍生成を可能にするので、非常に魅力的なツールである。本発明の新しい方法はトランスポゾン系の２つの大きな問題：ランダムなゲノム挿入及びコピー数変動を克服する。ノッチシグナリングは、遺伝子用量感受性のある分子経路の１つの重要な例である。加えて、他の複数の細胞運命決定要素は、それらの発現レベルに基づいて劇的に差次的な表現型をもたらすことが示されている。例えば、グリア前駆細胞におけるＮｆｉａの高発現はアストロサイトへの分化を促進する一方で、低発現はオリゴデンドロサイトになる細胞において観察され、別の例において、より高いＦｅｚｆ２発現は、ノッチシグナリングエフェクターのアップレギュレートによって脳室帯／脳室下帯におけるＮＳＣ休止を誘導する。本発明の方法は迅速にインビボでかかる経路を査定するために使用することができる。本明細書において示される１コピーｖｓ２コピーの比較パラダイムを使用して、かかる核内因子は、天然の切片内の対照細胞により１匹のマウスにおいて調査することができる。ＧＥＭＭ操作と比較した場合に、本発明のインビボのＭＡＤＲは拡張可能であり、比較的低価格である。さらに、出生後のＥＰ手順が迅速であり（動物の１腹仔あたり約３５分）、侵襲手術を要求しないという事実を考慮すると、本方法論は容易に多くの研究室によって採択され得る。
既存のＧＥＭＭへのＭＡＤＲの拡張性
本ストラテジーは、デュアルリコンビナーゼ部位を保有する任意の既製のＧＥＭＭ（例えばＡｉ１４マウス、Ｒ２６－ＣＡＧ－ＬＦ－ｍＴＦＰ１マウス、Ｒｉｂｏｔａｇマウス、及びＩＫＭＣマウス）と共に用いることができ、定義された供与量でのインビボのＧＯＦタンパク質及びＬＯＦタンパク質機能の決定的な査定を可能にする（図１６）。目的の遺伝子座の周囲にｌｏｘＰ及びＦＲＴの部位を既に保有する何千もの遺伝子導入マウスがある。Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧと同様に、Ａｉ１４は別の広く用いられるレポーターマウス系統であり、それは典型的にはリコンビナーゼ発現遺伝子導入マウスと交配繁殖される。図１６中で図示されるように適切にリコンビナーゼ認識部位を配向させることによって、ドナープラスミドをＡｉ１４マウスにおける使用のために作成することができる。ＲｉｂｏｔａｇはＣｒｅ組換えを使用して、Ｃｒｅ発現に定義されたｍＲＮＡの親和性免疫沈降のために、タグ付加していないＲｐｌ２２エクソン４をＨＡタグ付加バリアントとスワップする。ＭＡＤＲにより、代替タグは、タグについての連続的な免疫沈降を使用する同時のオルソゴナルなｍＲＮＡの精製を可能にするように、追加のエレメントを挿入することができる。加えて、スプライスアクセプターにより開始するＯＲＦを作成し、このコンストラクトを使用して、外来のシス調節環境下で導入遺伝子を置換する効果を調査することができる（図１６）。同時に、蛍光レポーターを備えたドナープラスミドは単純にエレクトロポレーションして（Ｆｌｐ及びＣｒｅと共に）、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位が重要な遺伝子座に隣接する様々な遺伝子導入マウスにおいて、Ｃｒｅ発現マウスについての必要性なしに、焦点からの系譜追跡を可能にすることができる。
本発明の方法が２つの異なるリコンビナーゼを要求するので、組換えられる細胞のタイプを制限するように、異なる組み合わせのプロモーターによりこれらのリコンビナーゼの発現を駆動することもできる。例えば、本方法を使用して、細胞タイプに特異的なＦｌｐ／Ｃｒｅ発現の使用によって、不連続の幹細胞及び前駆細胞のサブセットから生じる系譜の予定運命図を比較及び対比させることができる。最終的に、大積載のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）によるインビボのＭＡＤＲがある。蛍光レポーターまたはリコンビナーゼ（ｖＣｒｅまたはｓＣＲＥ等）の発現を駆動するゲノム断片の大きなかたまりを保有するドナープラスミドは、各々の末端上に追加のｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位を備えて作成することができる。次いで、ＥＰは、ｖＣｒｅ／ｓＣｒｅ活性化可能なレポーターを保有する追加のプラスミドと組み合わせて、限界希釈でこの大きな断片をゲノムの中へ送達することができる。このタイプの研究は、ＧＥＭＭ様の高次の系譜追跡研究を実質的に可能にするだろう。
次世代シーケンシングは、腫瘍形成において起こるゲノム及びトランスクリプトームの変化についての我々の理解を指数関数的に増加させてきた。しかしながら、増加し続ける腫瘍における再発性の体細胞突然変異のカタログにより、パッセンジャー突然変異から腫瘍促進性ドライバー変異を分離するという新たな問題が生じる。さらに、類似の組織学的分類の腫瘍が、多くの場合、顕著に異なる腫瘍表現型を生じる異なる遺伝的素因を有し得ることは、ますます現在認識される（例えばＫ２７Ｍ腫瘍ｖｓＧ３４Ｒ腫瘍）。ＧＥＭＭはグリオーマ発生の理解のために重要なものであった。特に、洗練されたＭＡＤＭ方法論は、腫瘍細胞の起源に対するユニークな洞察及び可能性のある治療を提供してきた。本発明者は、小児ＧＢＭの迅速な「個人化された」モデル化のためのプラットフォームとしてＭＡＤＲを使用することについての原理証明を示す。ＭＡＤＲ ＧＯＦ遺伝子導入及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＯＦ操作を組み合わせることによって、小さな研究室が、大部分の腫瘍タイプのための突然変異のスペクトル（及びしたがって可能な組み合わせ）をカバーするのに必要なプラスミド試薬を生成することは可能である。
したがって、我々の所見は、安定的なモザイク解析のための着実な方法論としてのインビボのＭＡＤＲを確立し、それはウイルスによるアプローチ、ＧＥＭＭアプローチ、ＥＰアプローチ、及びトランスポゾンベースのアプローチにおける固有の欠点の多くを克服する。加えて、この遺伝学的フレームワークは、デュアルリコンビナーゼ認識部位を備えて操作された何千ものマウスの系統へ適応可能である。したがって、これらのツールは、発生及び疾患における遺伝子機能の、効率的なさらなるハイスループット調査を可能にすることを見込める。
したがって、本発明の様々な実施形態は、これらの所見に少なくとも部分的に基づいている。
ドナーベクター
本発明の様々な実施形態は、導入遺伝子またはＲＮＡの上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写終止エレメントと；導入遺伝子またはＲＮＡと；ペアになったリコンビナーゼ認識部位と、を含む、プロモーターのないドナーベクターを提供する。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、転写後調節エレメントをさらに含む。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、導入遺伝子またはＲＮＡの下流にポリアデニル化シグナルをさらに含む。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）と；三量体化ＳＶ４０ｐＡと；導入遺伝子またはＲＮＡと；ｌｏｘＰと；フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と；ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と；ウサギβ－グロビンｐＡと、を含む。
本発明の様々な実施形態は、導入遺伝子またはＲＮＡから上流の転写終止エレメントと；ペアになったリコンビナーゼ認識部位と；ｒｔＴＡ－Ｖ１０と；導入遺伝子またはＲＮＡと；ＴＲＥ－Ｂｉと、を含む、プロモーターのないドナーベクターを提供する。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、転写後調節エレメントをさらに含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ピューロマイシンをコードする遺伝子をさらに含む。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、導入遺伝子またはＲＮＡから上流の転写終止エレメントと；ｌｏｘＰと；ｒｔＴＡ－Ｖ１０と；導入遺伝子またはＲＮＡと；ＴＲＥ－Ｂｉと；フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と、を含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、転写後調節エレメントをさらに含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ピューロマイシンをコードする遺伝子をさらに含む。
本発明の様々な実施形態は、導入遺伝子またはＲＮＡから上流の転写終止エレメントと；ペアになったリコンビナーゼ認識部位と；ｒｔＴＡ－Ｖ１０と；導入遺伝子またはＲＮＡと；ＴＲＥ－Ｂｉ－Ｄｌｌ１と、を含む、プロモーターのないドナーベクターを提供する。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、転写後調節エレメントをさらに含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ピューロマイシンをコードする遺伝子をさらに含む。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、導入遺伝子またはＲＮＡから上流の転写終止エレメントと；ｌｏｘＰと；ｒｔＴＡ－Ｖ１０と；導入遺伝子またはＲＮＡと；ＴＲＥ－Ｂｉ－Ｄｌｌ１と；フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と、を含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ピューロマイシンをコードする遺伝子をさらに含む。
ペアになったリコンビナーゼ部位の方向性は、遺伝子導入動物における操作される遺伝子座によって指示される（すなわち、導入遺伝子が上流プロモーターの「センス」方向で挿入されることになっているならば、リコンビナーゼ部位は外側のペアのリコンビナーゼ部位を正確に模倣するだろう）。したがって、様々な実施形態において、ペアになったリコンビナーゼ認識部位は正確な方向性で存在する。様々な実施形態において、ｌｏｘＰは逆方向で存在しない。
様々な実施形態において、ペアになったリコンビナーゼ認識部位はｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、リコンビナーゼはｃｒｅ及びｆｌｐである。Ｆｌｐの例としてはｆｌｐＥ及びｆｌｐＯが挙げられる。
リコンビナーゼ（及び部位）の他の例としては、ＶＣｒｅ（Ｖｌｏｘ及び誘導体）、ＳＣｒｅ（Ｓｌｏｘ及び誘導体）、Ｄｒｅ（Ｒｏｘ及び誘導体）、及びｐｈｉＣ３１（ａｔｔｂ）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な実施形態において、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡである。
様々な実施形態において、導入遺伝子またはＲＮＡは、疾患関連突然変異を含む。様々な実施形態において、導入遺伝子またはＲＮＡは、機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異を含む。様々な実施形態において、導入遺伝子またはＲＮＡは、機能喪失型（ＬＯＦ）突然変異を含む。
導入遺伝子の例としては発癌性機能獲得型突然変異が挙げられるがこれらに限定されず、これらには、Ｒａｓ、Ｈ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｔｒｐ５３点突然変異（Ｉｄｈ１）が含まれる。ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）の例としては、腫瘍抑制因子標的（Ｔｒｐ５３、Ｎｆ１、Ａｔｒｘ、またはＰｔｅｎ等）が挙げられるがこれらに限定されない。
転写後調節エレメントの例としては、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な実施形態において、上及び下で記載されるプロモーターのないドナーベクターは、抗生物質をコードする遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ピューロマイシン、または真核生物代替物（カナマイシン及びブラストサイジンなど）をコードする遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、上及び下で記載されるプロモーターのないドナーベクターは、ドキシサイクリン調節性トランス活性化因子、またはｓｇＲＮＡとペアにした場合に、ＤＮＡ切断、遺伝子活性化（Ｃｒｉｓｐｒａ）、もしくは遺伝子抑制（Ｃｒｉｓｐｒｉ）のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのバリアント（例えばＳｐＣａｓ９またはＣｐｆ１）、をコードする遺伝子をさらに含む。
様々な実施形態において、上及び下で記載されるプロモーターのないドナーベクターは、１つまたは複数のｓｐａｇｈｅｔｔｉ ｍｏｎｓｔｅｒ蛍光タンパク質（ＳＭ＿ＦＰ）をコードする遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、１つまたは複数のＳＭ＿ＦＰは各々異なるＳＭ＿ＦＰである。様々な実施形態において、１つまたは複数のＳＭ＿ＦＰは４つの異なるＳＭ＿ＦＰである。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、１つまたは複数のエピトープタグをコードする遺伝子をさらに含む。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のエピトープタグである。エピトープタグは反復または異なるタグであり得る。様々な実施形態において、エピトープタグは、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、またはＦｌａｇタグである。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、大積載のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）を含む。
システム
本発明の様々な実施形態は、インビボのデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換における使用のためのシステムを提供する。
様々な実施形態において、システムは、
本明細書において開示されるようなプロモーターのないドナーベクターと；
ペアになったリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む、１つの発現ベクターと
を含む。
様々な実施形態において、システムは、
本明細書において開示されるようなプロモーターのないドナーベクターと；
２つの発現ベクターであって、
第１の発現ベクターは、ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの１つに特異的な第１のリコンビナーゼをコードする第１の遺伝子を含み、
第２の発現ベクターは、ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの他のものに特異的な第２のリコンビナーゼをコードする第２の遺伝子を含む、２つの発現ベクターと
を含む。
様々な実施形態において、システムは、
導入遺伝子またはＲＮＡの上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写の終止エレメント、
導入遺伝子またはＲＮＡ、及び
ペアになったリコンビナーゼ認識部位
を含む、プロモーターのないドナーベクターと；
ペアになったリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む、１つの発現ベクターと
を含む。
様々な実施形態において、システムは、
導入遺伝子またはＲＮＡの上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写の終止エレメント、
導入遺伝子またはＲＮＡ、及び
ペアになったリコンビナーゼ認識部位
を含む、プロモーターのないドナーベクターと；
２つの発現ベクターであって、
第１の発現ベクターは、ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの１つに特異的な第１のリコンビナーゼをコードする第１の遺伝子を含み、
第２の発現ベクターは、ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの他のものに特異的な第２のリコンビナーゼをコードする第２の遺伝子を含む、２つの発現ベクターと
を含む。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、転写後調節エレメントをさらに含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、導入遺伝子またはＲＮＡの下流にポリアデニル化シグナルをさらに含む。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）と；三量体化ＳＶ４０ｐＡと；導入遺伝子またはＲＮＡと；ｌｏｘＰと；フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と；ウサギβ－グロビンｐＡと；ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、を含む。
ペアになったリコンビナーゼ部位の方向性は、遺伝子導入動物における操作される遺伝子座によって指示される（すなわち、導入遺伝子が上流プロモーターの「センス」方向で挿入されることになっているならば、リコンビナーゼ部位は外側のペアのリコンビナーゼ部位を正確に模倣するだろう）。したがって、様々な実施形態において、ペアになったリコンビナーゼ認識部位は正確な方向性で存在する。様々な実施形態において、ｌｏｘＰは逆方向で存在しない。
様々な実施形態において、ペアになったリコンビナーゼ認識部位はｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、リコンビナーゼはｃｒｅ及びｆｌｐである。Ｆｌｐの例としてはｆｌｐＥ及びｆｌｐＯが挙げられる。
リコンビナーゼ（及び部位）の他の例としては、ＶＣｒｅ（Ｖｌｏｘ及び誘導体）、ＳＣｒｅ（Ｓｌｏｘ及び誘導体）、Ｄｒｅ（Ｒｏｘ及び誘導体）、及びｐｈｉＣ３１（ａｔｔｂ）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な実施形態において、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡである。
様々な実施形態において、導入遺伝子またはＲＮＡは、疾患関連突然変異を含む。様々な実施形態において、導入遺伝子またはＲＮＡは、機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異を含む。様々な実施形態において、導入遺伝子またはＲＮＡは、機能喪失型（ＬＯＦ）突然変異を含む。
導入遺伝子の例としては発癌性機能獲得型突然変異が挙げられるがこれらに限定されず、これらには、Ｒａｓ、Ｈ３ｆ３ａ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｔｒｐ５３点突然変異（Ｉｄｈ１）が含まれる。ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）の例としては、腫瘍抑制因子標的（Ｔｒｐ５３、Ｎｆ１、Ａｔｒｘ、またはＰｔｅｎ等）が挙げられるがこれらに限定されない。
転写後調節エレメントの例としては、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。
様々な実施形態において、上及び下で記載されるプロモーターのないドナーベクターは、抗生物質をコードする遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、ピューロマイシン、または真核生物代替物（カナマイシン及びブラストサイジンなど）をコードする遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、上及び下で記載されるプロモーターのないドナーベクターは、ドキシサイクリン調節性トランス活性化因子、またはｓｇＲＮＡとペアにした場合に、ＤＮＡ切断、遺伝子活性化（Ｃｒｉｓｐｒａ）、もしくは遺伝子抑制（Ｃｒｉｓｐｒｉ）のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのバリアント（例えばＳｐＣａｓ９またはＣｐｆ１）、をコードする遺伝子をさらに含む。
様々な実施形態において、上及び下で記載されるプロモーターのないドナーベクターは、１つまたは複数のｓｐａｇｈｅｔｔｉ ｍｏｎｓｔｅｒ蛍光タンパク質（ＳＭ＿ＦＰ）をコードする遺伝子をさらに含む。様々な実施形態において、１つまたは複数のＳＭ＿ＦＰは各々異なるＳＭ＿ＦＰである。様々な実施形態において、１つまたは複数のＳＭ＿ＦＰは４つの異なるＳＭ＿ＦＰである。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、１つまたは複数のエピトープタグをコードする遺伝子をさらに含む。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のエピトープタグである。エピトープタグは反復または異なるタグであり得る。様々な実施形態において、エピトープタグは、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、またはＦｌａｇタグである。
様々な実施形態において、プロモーターのないドナーベクターは、大積載のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）を含む。
動物モデル
本発明の様々な実施形態は、非ヒト動物モデル、及び非ヒト動物モデルを生成する方法を提供する。動物モデルを使用して、がんドライバー変異（例えば機能獲得型がん遺伝子）をモデル化することができる。
様々な実施形態において、非ヒト動物モデルの生成は、デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換のためのシステムを提供することと；デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換のためのシステムを非ヒト動物へ投与することと、非ヒト動物にエレクトロポレーションを行うこと、を含む。
非ヒト動物モデルの生成に提供及び使用されるデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換のためのシステムは、本明細書において記載されるような本発明のデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換のためのシステムである。
様々な実施形態において、この方法は、ｈｙｐＢａｓｅ及び／またはレポータープラスミドを投与することをさらに含む。
デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換エレクトロポレーションのためのシステムは、試験が所望される所在位置へ投与され得る。例えば、脳を研究する実験では、このシステムは側脳室の中へ注入することができ、エレクトロポレーションをその所在位置で遂行することができる。別の例において、脊髄を研究する実験については、このシステムは例えば脳脊髄液の中へ、または脊髄の中もしくはその近くに注入することができ、エレクトロポレーションは脊髄でまたはその近くで行うことができる。
様々な実施形態において、非ヒト動物モデルは、本明細書において開示されるようなデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換のためのシステムを含み、そこで、デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換が起こっていた。
様々な実施形態において、非ヒト動物はマウスである。他の実施形態において、非ヒト動物は、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、モルモット、ウサギ、サル（例えばアカゲザル）、ヒヒ、チンパンジー、ヒツジ、またはイヌである。様々な実施形態において、非ヒト動物は遺伝子操作マウスである。様々な実施形態において、非ヒト動物は、ペアになったデュアルリコンビナーゼ部位を備えた遺伝子操作マウスである。様々な実施形態において、マウスは、Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧ（ｍＴｍＧ）マウス、Ａｉ１４マウス、Ｒ２６－ＣＡＧ－ＬＦ－ｍＴＦＰ１マウスもしくはＩＫＭＣマウスまたは類似するペアになったデュアルリコンビナーゼ部位を備えたマウスである。
薬物スクリーニング
本発明の様々な実施形態は、本発明の非ヒト動物モデルを提供することと、薬物候補を投与することと、非ヒト動物モデルに対する薬物候補の効果を査定することと、を含む、薬物候補をスクリーニングする方法を提供する。
様々な実施形態において、この方法は、薬物候補が非ヒト動物モデルへ有益な結果を提供する場合に薬物候補を薬物として選択することをさらに含む。様々な実施形態において、この方法は、薬物候補が非ヒト動物モデルへ有益な結果を提供する場合に薬物候補を薬物として検証することをさらに含む。
「有益な結果」には、疾患病態の重症度を軽減または緩和すること、疾患病態が悪化するのを予防すること、疾患病態を治癒させること、及び患者の寿命または平均余命を長くすること、が含まれ得るがこれらに一切限定されない。
治療の方法
本発明の様々な実施形態は、本発明のデュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換のためのシステムを含む細胞を提供することと、細胞を対象へ投与することと、を含む、対象における疾患または病態を治療する方法を提供する。
様々な実施形態において、細胞は幹細胞である。
様々な実施形態において、デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換が、細胞において起こっていた。
細胞の対象への投与は、疾患病態のために適切な投与ルートによって遂行され得る。「投与ルート」は当技術分野において公知の任意の投与経路を指し、これらには、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、または非経口が含まれるがこれらに限定されない。「経皮」投与は、局所用のクリームもしくは軟膏を使用してまたは経皮パッチを用いて達成され得る。「非経口的である」は一般的には注入と関連する投与ルートを指し、それらには、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管が含まれる。非経口ルートで、組成物は、点滴もしくは注入のための溶液もしくは懸濁物の形態、または凍結乾燥された粉末としての形態であり得る。
腸ルートで、医薬組成物は、錠、ゲル、カプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁物、溶液、粉末、顆粒、エマルション、マイクロスフェアもしくはナノスフェア、または制御放出を可能にする脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であり得る。非経口ルートで、組成物は、点滴または注入のための溶液または懸濁物の形態であり得る。
局所ルートで、本発明に記載の化合物に基づく医薬組成物は、皮膚及び粘膜の治療のために製剤化され得、軟膏、クリーム、乳液、膏薬、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローションまたは懸濁物の形態である。それらは、制御放出を可能にする、マイクロスフェアもしくはナノスフェアまたは脂質小胞もしくはポリマー小胞またはポリマーパッチ及びハイドロゲルの形態でもあり得る。これらの局所ルートの組成物は、臨床徴候に依存して、無水形態または水性形態のいずれかでありえる。
眼ルートで、それらは点眼剤の形態であり得る。
様々な実施形態において、細胞は移植によって投与される。治療は、疾患（がん、神経変性疾患、卒中、または癲癇等）において、増殖因子療法、エクソソーム療法、またはペプチド療法を送達するために、ｄＲＭＣＥ事象と共に移植細胞を使用することを含む。
様々な実施形態において、細胞を移植し、後続して、エレクトロポレーションまたはウイルスによる形質導入によってｄＲＭＣＥのために標的化する。
以下の実施例は特許請求された発明をより良く説明するために提供され、本発明の範囲を限定すると解釈するべきでない。具体的な材料が言及される範囲で、それは単に例示の目的のためのものであり、本発明を限定することは意図しない。当業者は、発明能力の訓練なしに、及び本発明の範囲から逸脱することなしに、等価な手段または反応物を開発することができる。
実施例１
クローニング
Ｆｌｐ－Ｃｒｅコンストラクトは、Ｙ．Ｖｏｚｉｙａｎｏｖによって惜しみなく提供され、ｄＲＭＣＥのコンテキスト中で検証された。本発明のドナープラスミドは、標準的な制限消化技法と組み合わせたＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＰＧＫｎｅｏｔｐＡｌｏｘ２から導かれた。ＦＲＴ部位は、２つのオリゴをアニールし、ＰＧＫｎｅｏｔｐＡｌｏｘ２の中へ挿入物をインフュージョンすることによって作成した。他のドナープラスミドの下流の生成は、既存のＯＲＦを除去しＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎまたはライゲーションを使用して、新しいカセットを追加することによって行った。ＰＢ－ＣＡＧプラスミドは以前に記載された。
マウス及びエレクトロポレーション
Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ－ｔｄＴｏｍａｔｏ，－ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ｍＴｍＧを野生型ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）と交配させて、ヘテロ接合のマウスを生成した。すべてのマウスは、Ｃｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉ研究機関内動物実験委員会に従って使用した。出生後の側脳室ＥＰは、以前に記載されるように実行した。生後１日～３日の仔マウスを約５分間氷上に置いた。すべてのＤＮＡ混合物は、トリス－ＥＤＴＡバッファー中で希釈された、０．５～１μｇ／μｌのＦｌｐ－Ｃｒｅ発現ベクター、ドナープラスミド、ｈｙｐＢａｓｅ、またはＣＡＧレポータープラスミドを、特別に示さない限り含有した。ファストグリーン色素を混合物へ添加し（１０％ｖ／ｖ）、それを側脳室の中へ注入した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔｗｅｅｚｅｒｔｒｏｄｅｓは、ＥＣＭ ８３０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）からの１２０Ｖの５パルス（５０ミリ秒；９５０ミリ秒で分離される）を送達した。ＳｉｇｎａＧｅｌを適用してコンダクタンスを増加させた。マウスを加熱ランプ下で暖め、ケージへ戻した。
組織調製
麻酔後に、マウス脳を単離し、４℃で一晩、４％のＰＦＡ中で固定した。脳を４％の低融点アガロース中に包埋し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）で７０μｍの切片にした。
免疫組織化学
免疫組織化学は以前に記載されるように標準的方法論を用いて遂行した。すべての二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は１：５００で使用した。一次抗体についての詳細は表３に見出すことができる。
（表３）研究において使用される抗体
Figure 2024063065000010
細胞培養及びヌクレオフェクション
３匹のヘテロ接合の生後０日のｍＴｍＧ仔マウス脳を分離して、本研究において使用するマウス神経幹細胞株を確立した。以前に記載されるように細胞株を維持した。ビタミンＡ不含有Ｂ－２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２５８７－０１０）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３５０５０）、抗生物質－抗真菌剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １５２４０）、ｈＥＧＦＰ（Ｓｉｇｍａ Ｅ９６４４）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｈ３３９３）、及びｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧＦ００３）を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）－Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １０８８８－０２２）を含有する培地中で、細胞を増殖させた。神経幹細胞ヌクレオフェクションは、製造者の推奨（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）に従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂデバイス及びマウス神経幹細胞キットを使用して遂行した。ヌクレオフェクション混合物は、１０ｎｇ／μｌの等しい濃度のプラスミドを含有していた。
画像化及びプロセシング
すべての固定画像は、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒの倒立レーザー共焦点顕微鏡で収集した。ｍＮＳＣのライブ画像はＥＶＯＳのデジタル蛍光倒立顕微鏡で得た。全脳画像のために、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓの自動化スティッチング機能を使用した。次いでＮＤ２ファイルをＩｍａｇｅＪの中へインポートしてＺ投影画像を作成し、後続してそれをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６で編集した。Ａｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ＣＳ６を最終的な図の制作のために使用した。
フローサイトメトリー
以前に記載されるように細胞を収集した。細胞をＰＢＳ中で短時間リンスし、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する酵素による解離によって取り出し、２５０ｇで３分間ペレット化し、培地中で再懸濁した。ＦＡＣＳは、Ｃｅｄａｒｓ－ＳｉｎａｉフローサイトメトリーにおいてＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭｏＦｌｏで行った。
ウエスタンブロット
細胞ペレットをＬａｅｍｍｌｉバッファー中で再懸濁し、９５℃で５分間煮沸した。タンパク質濃度をＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００で測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離及びニトロセルロース膜上への転写後に、０．１％ ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の５％ 脱脂乳中で希釈した、表３でリストされた抗体を使用して、タンパク質を検出した。すべての二次抗体（Ｌｉ－ｃｏｒ ＩＲＤｙｅ（登録商標））は１：１５０００で使用した。赤外線検出はＬｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬＸ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによって達成した。
ドキシサイクリン及びピューロマイシンの投与
ドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６３１３１１）を１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で培養培地へ添加した。ピューロマイシン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６３１３０５）を１μｇ／ｍｌで使用した。
ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅノックダウン効率定量化
本発明者は、ＦｌＥｘベースの導入遺伝子発現（特にＥＧＦＰカセット（ＦｌＥｘ－ＥＧＦＰ）のＣｒｅ媒介性の逆位及び活性化）を以前に使用した。Ｎｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＴｒｐ５３を標的化する本発明のｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅを試験するために、多重ｍｉＲ－Ｅｓ（ＦｌＥｘ－ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅ）を保有するＣＡＧ駆動性ＦｌＥｘベースのコンストラクトを製作した。出生後のｍＮＳＣ株をＣＤ１仔マウス脳の分離によって確立し、ＥＧＦＰまたはＦｌＥｘ－ｍｕｌｔｉ－ｍｉＲ－Ｅ及びＣｒｅリコンビナーゼベクターをトランスフェクションした。蛍光細胞を選別し、ｍＲＮＡの抽出、ならびにＮｆ１、Ｐｔｅｎ及びＴｒｐ５３についてのｑＰＣＲプローブを使用するＳＹＢＲベースのＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋダイナミックアレイを行った。
インビボのＭＡＤＲ効率の定量化
各々の条件について、２匹の仔マウスにｐＣＡＧ－ＴａｇＢＦＰ２－ｎｌｓ、ｐＤｏｎｏｒ－ｓｍＦＰ－ＨＡ、及びＦｌｐ－２Ａ－Ｃｒｅをエレクトロポレーションした。脳をＥＰ後２日に得て、各々の脳からの２つの隣接しない切片をＨＡタグ抗体及びＥＧＦＰにより染色した。各々の切片について、約２５のＢＦＰ＋細胞をランダムに選択し、その中で、ＢＦＰ＋細胞中の、ＨＡ＋細胞及びＥＧＦＰ＋細胞をカウントした。各々の群について４つの切片にわたって、割合を平均化した。
Ｕ６－ｓｇＲＮＡ断片のＰＣＲ生成
短いリバースプライマー及びｕｌｔｒａｍｅｒフォワードプライマー（ＩＤＴ ＤＮＡ）をＰＣＲ反応及び後続する精製において組み合わせて、濃縮したｓｇＲＮＡを製作した（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。１００ｎｇの各々の断片をＥＰのためにプラスミドＤＮＡと組み合わせた。
マウス腫瘍細胞におけるＩｎＤｅｌ突然変異のシーケンシング
腫瘍細胞の純粋な集団をＦＡＣＳによって得て、ゲノムＤＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ）。ｇＲＮＡ標的部位に隣接するプライマーを使用して、ＮＦ１、Ｔｒｐ５３、及びＰｔｅｎについてのＩｎＤｅｌ突然変異を含有すると予想される領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅断片をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯキットを使用してｔｏｐｏクローニングし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５－Ｔ１Ｒ細胞の中に形質転換した。
本発明の様々な実施形態は、発明を実施するための形態において上述される。これらの記載は上の実施形態を直接的に記載するが、当業者が本明細書において示され記載される具体的な実施形態への修飾及び／または変動を想像し得ることは、理解される。本記載の範囲内にある任意のかかる修飾または変動は、その中に同様に包含されることが意図される。具体的に示されない限り、明細書及び請求項における単語及び語句は、当業者にとって通常の習慣的な意味が与えられることは、本発明者の意図である。
本出願の申請の時点で本出願人に既知の発明の様々な実施形態の先の記載は提示されており、例示及び記載のために意図される。本記載は、網羅的であるとか、開示された正確な形態へ本発明を限定することは意図せず、多くの修飾及び変動は上述の教示に照らして可能である。記載された実施形態は、本発明の原則及びその実践的な適用について説明し、当業者が、様々な実施形態において、及び企図された特定の使用に適するような様々な修飾により、本発明を利用することを可能にする役目を果たす。したがって、本発明は、本発明の実行のために開示される特定の実施形態へ限定されることは意図しない。
本発明の特定の実施形態が示され記述されてきたが、本発明及びそのより広義の態様から逸脱せずに、変化及び修飾を、本明細書における教示に基づいて行えることは、当業者に明らかであり、したがって添付の請求項は、本発明の真の趣旨及び範囲内にあるようなそれらの範囲内のすべてのかかる変化及び修飾を包含するべきである。一般に、本明細書において使用される用語が「非制限的な」用語として一般的には意図されることは当業者によって理解されるだろう（例えば「含まれること」という用語は「が含まれるがこれらに限定されないこと」と解釈されるべきであり、「有すること」という用語は「少なくとも有すること」と解釈されるべきであり、「含まれる」という用語は「含まれるがこれらに限定されない」と解釈されるべきである、など）。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER
<120> SYSTEMS AND METHODS FOR IN VIVO DUAL RECOMBINASE-MEDIATED
CASSETTE EXCHANGE (dRMCE) AND DISEASE MODELS THEREOF
<150> US 62/287,197
<151> 2016-01-26
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 4
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 7
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<223> synthetic construct
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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tgatcgcgct tctcgttggg 20

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gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34

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<220>
<223> synthetic construct
<400> 14
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<220>
<223> synthetic construct
<400> 15
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<220>
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<222> (5)..(11)
<223> n=other
<400> 18
tctcnnnnnn nagagggagc tcgaggctg 29

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<212> DNA
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<220>
<223> synthetic construct
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ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 20
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

Claims (21)

  1. 以下を含む、システム：
    導入遺伝子またはＲＮＡの上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写の終止エレメント、
    前記導入遺伝子またはＲＮＡ、及び
    ペアになったリコンビナーゼ認識部位
    を含む、プロモーターのないドナーベクター；ならびに
    前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位に特異的なリコンビナーゼをコードする２つの遺伝子を含む、１つの発現ベクター、または
    ２つの発現ベクターであって、
    第１の発現ベクターが、前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの１つに特異的な第１のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含み、
    第２の発現ベクターが、前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位のうちの他のものに特異的な第２のリコンビナーゼをコードする１つの遺伝子を含む、２つの発現ベクター。
  2. 前記プロモーターのないドナーベクターが、転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記プロモーターのないドナーベクターが、前記導入遺伝子またはＲＮＡの下流にポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記プロモーターのないドナーベクターが、
    ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）と；
    三量体化ＳＶ４０ｐＡと；
    前記導入遺伝子またはＲＮＡと；
    ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と；
    ウサギβ－グロビンｐＡと；
    ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  5. 前記ペアになったリコンビナーゼ認識部位がｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）であり、前記リコンビナーゼがｃｒｅ及びｆｌｐである、請求項１に記載のシステム。
  6. 前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１に記載のシステム。
  7. 前記ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１に記載のシステム。
  8. 前記ＲＮＡがｓｇＲＮＡである、請求項１に記載のシステム。
  9. 前記導入遺伝子またはＲＮＡが疾患関連突然変異を含む、請求項１に記載のシステム。
  10. 導入遺伝子またはＲＮＡの上流の、ポリアデニル化シグナルまたは転写終止エレメントと；
    前記導入遺伝子またはＲＮＡと；
    ペアになったリコンビナーゼ認識部位と
    を含む、プロモーターのないドナーベクター。
  11. 転写後調節エレメントをさらに含む、
    請求項１０に記載の、プロモーターのないドナーベクター。
  12. 前記導入遺伝子またはＲＮＡの下流に、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、
    請求項１０に記載の、プロモーターのないドナーベクター。
  13. ＰＧＫポリアデニル化シグナル（ｐＡ）と；
    三量体化ＳＶ４０ｐＡと；
    導入遺伝子またはＲＮＡと；
    ｌｏｘＰ及びフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と；
    ウサギβ－グロビンｐＡと；
    ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と
    を含む、
    請求項１０に記載の、プロモーターのないドナーベクター。
  14. 請求項１に記載のシステムを含む、非ヒト動物モデル。
  15. デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換が起こっている、請求項１４に記載の非ヒト動物モデル。
  16. 前記動物がマウスである、請求項１４に記載の非ヒト動物モデル。
  17. 請求項１に記載のシステムを提供する段階と；
    前記システムを非ヒト動物へ投与する段階と；
    前記非ヒト動物にエレクトロポレーションを行う段階と
    を含む、請求項１４に記載の非ヒト動物モデルを産生する方法。
  18. 請求項１４に記載の非ヒト動物モデルを提供する段階と；
    薬物候補を投与する段階と；
    前記非ヒト動物モデルに対する前記薬物候補の効果を査定する段階と
    を含む、前記薬物候補をスクリーニングする方法。
  19. 請求項１に記載のシステムを含む細胞を提供する段階と；
    前記細胞を対象へ投与する段階と
    を含む、前記対象における疾患または病態を治療する方法。
  20. 前記細胞が幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. デュアルリコンビナーゼ媒介性カセット交換が前記細胞において起こっている、請求項１９に記載の方法。
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