ES2777217T3 - Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias - Google Patents

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Abstract

Una composición que se produce de forma no natural o modificada para la expresión en una célula, que comprende: un único polinucleótido que comprende secuencias para la expresión de dos o más guías del sistema CRISPR-Cas9 de un solo promotor, en donde cada una de las guías del sistema es un ARN quimérico (ARNqui) y comprende de 5' a 3' una secuencia guía que se hibrida con una diana de ADN en un locus de interés, una secuencia tracr mate y una secuencia tracr, y en donde la secuencia tracr de un primer ARNqui está enlazada a la secuencia guía de un segundo ARNqui por una secuencia de enlazador.

Description

DESCRIPCIÓN
Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias
SOLICITUDES RELACIONADAS
Las solicitudes anteriores, y todos los documentos citados en ellas o durante su tramitación ("documentos citados en la solicitud") y todos los documentos citados o referenciados en los documentos citados en la solicitud, y todos los documentos citados o referenciados en esta memoria ("documentos citados en esta memoria"), y todos los documentos citados o referenciados en los documentos citados en esta memoria, junto con cualesquiera instrucciones, descripciones, especificaciones de producto y hojas de producto para cualquier producto mencionado en esta memoria, pueden emplearse en la práctica de la invención.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere, en general, a la entrega, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones utilizados para el control de la expresión génica que implica la fijación como objetivo de secuencias, tales como la perturbación del genoma o la edición génica, que se relacionan con las Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) y sus componentes.
DECLARACIÓN SOBRE LA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la Distinción NIH Pioneer (1DP1MH100706) otorgada por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Avances recientes en las técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis han acelerado significativamente la capacidad de catalogar y mapear factores genéticos asociados con una amplia gama de funciones biológicas y enfermedades. Se necesitan tecnologías precisas de fijación como objetivo del genoma para permitir la modificación inversa sistemática de las variaciones genéticas causales al permitir la perturbación selectiva de elementos genéticos individuales, así como para avanzar en aplicaciones biológicas, biotecnológicas y médicas sintéticas. Aunque las técnicas de edición del genoma, tales como los dedos de zinc de diseño, los efectores similares a los activadores de la transcripción (TALEs) o las meganucleasas migratorias están disponibles para producir perturbaciones específicas del genoma, sigue existiendo la necesidad de nuevas tecnologías de modificación del genoma que sean asequibles, fáciles de configurar y ampliables y susceptible de fijar como objetivo múltiples posiciones dentro del genoma eucariota.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Y DE LA DIVULGACIÓN
El sistema CRISPR-Cas no requiere la generación de proteínas personalizadas para fijar como objetivo secuencias específicas, sino que una molécula de ARN corta puede programar una sola enzima Cas para reconocer una diana de ADN específica. Añadir el sistema CRISPR-Cas al repertorio de técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis puede simplificar significativamente la metodología y acelerar la capacidad de catalogar y mapear factores genéticos asociados con una gama diversa de funciones biológicas y enfermedades. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera efectiva para la edición del genoma sin efectos nocivos, es fundamental comprender los aspectos de la modificación y la optimización de estas herramientas de modificación del genoma, que son aspectos de la invención reivindicada.
Existe una necesidad apremiante de sistemas y técnicas alternativos y robustos para la fijación como objetivo de secuencias con una amplia gama de aplicaciones. Los aspectos de esta invención abordan esta necesidad y proporcionan ventajas relacionadas. Un complejo CRISPR ilustrativo comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro del polinucleótido diana. La secuencia guía está vinculada a una secuencia de tracr mate, que a su vez se híbrida con una secuencia de tracr.
En un aspecto, la divulgación se refiere a métodos para utilizar uno o más elementos de un sistema CRISPR. La composición de CRISPR de la invención proporciona medios eficaces para modificar un polinucleótido diana. La composición de CRISPR de la invención tiene una amplia variedad de utilidades que incluyen modificar (p. ej., eliminar, insertar, translocar, inactivar, activar) un polinucleótido diana en una multiplicidad de tipos de células. Como tal, la composición de CRISPR de la invención tiene un amplio espectro de aplicaciones en, p. ej., la edición de genes o genomas, la terapia génica, el descubrimiento de fármacos, la detección de fármacos, el diagnóstico de enfermedades y el pronóstico. Un complejo CRISPR ilustrativo comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro del polinucleótido diana. La secuencia guía está vinculada a una secuencia de tracr mate, que a su vez se hibrida con una secuencia de tracr.
Aspectos de la divulgación se refieren a enzimas Cas9 que tienen una especificidad para la diana mejorada en un sistema CRISPR-Cas9 que tiene ARN guías que tienen una actividad óptima, son de menor longitud que las enzimas Cas9 de tipo salvaje y las moléculas de ácido nucleico que codifican, y las enzimas Cas9 quiméricas, así como a métodos de mejorar la especificidad objetivo de una enzima Cas9 o de diseñar un sistema CRISPR-Cas9 que comprende diseñar o preparar ARNs guía que tengan una actividad óptima y/o seleccionar o preparar una enzima Cas9 que tenga un tamaño o longitud menor que la Cas9 de tipo salvaje, en donde se avanza en el empaquetamiento de un ácido nucleico que codifica el mismo en un vector de suministro, ya que hay menos codificación para el mismo en el vector de suministro que para Cas9 de tipo salvaje y/o la generación de enzimas Cas9 quiméricas.
También se proporcionan usos de las secuencias, vectores, enzimas o sistemas actuales, en medicina. También se proporcionan usos del mismo en la edición de genes o genomas.
En un aspecto adicional de la invención, una enzima Cas9 puede comprender una o más mutaciones y puede utilizarse como una proteína genérica de unión al ADN con o sin la fusión a un dominio funcional. Las mutaciones pueden ser mutaciones introducidas artificialmente o mutaciones de ganancia o pérdida de función. Las mutaciones pueden incluir, pero no se limitan a mutaciones en uno de los dominios catalíticos (D10 y H840). Se han caracterizado mutaciones adicionales. En un aspecto de la divulgación, el dominio de activación transcripcional puede ser VP64. Otros aspectos de la divulgación se refieren a la enzima Cas 9 mutada que se fusiona con dominios que incluyen, pero que no se limitan a un represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histonas, una metiltransferasa de ADN, un criptocromo, un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio químicamente inducible/controlable.
En una realización adicional, la divulgación proporciona métodos para generar tracrARN mutante y secuencias de repetición directa o secuencias guía quiméricas mutantes que permiten potenciar el comportamiento de estos ARN en las células. Aspectos de la divulgación también proporcionan la selección de dichas secuencias.
Aspectos de la invención también proporcionan métodos para simplificar la clonación y el suministro de componentes del complejo CRISPR. En la realización preferida de la invención, un promotor adecuado, tal como el promotor U6, se amplifica con un oligo de ADN y se añade al ARN guía. El producto de PCR resultante se puede transfectar en células para impulsar la expresión del ARN guía. Aspectos de la divulgación también se refieren al ARN guía que se transcribe in vitro o se solicita de una compañía de síntesis y se transfecta directamente.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para mejorar la actividad utilizando una polimerasa más activa. En una realización preferida, la expresión de ARN guías bajo el control del promotor T7 es impulsada por la expresión de la polimerasa T7 en la célula. En una realización ventajosa, la célula es una célula eucariota. En una realización preferida, la célula es una célula humana. En una realización más preferida, la célula humana es una célula específica para el paciente.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para reducir la toxicidad de enzimas Cas. En determinados aspectos, la enzima Cas es cualquier Cas9 tal como se describe en esta memoria, por ejemplo, cualquier Cas9 bacteriana natural así como quimeras, mutantes, homólogos u ortólogos. En una realización preferida, la Cas9 se suministra a la célula en forma de ARNm. Esto permite la expresión transitoria de la enzima, reduciendo con ello la toxicidad. En otra realización preferida, la divulgación también proporciona métodos para expresar Cas9 bajo el control de un promotor inducible de las construcciones utilizadas en el mismo.
En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para mejorar las aplicaciones in vivo del sistema CRISPR-Cas. En la realización preferida, la enzima Cas es Cas9 de tipo salvaje o cualquiera de las versiones modificadas descritas en esta memoria, incluyendo cualquier Cas9 bacteriano de origen natural, así como quimeras, mutantes, homólogos u ortólogos. Un aspecto ventajoso de la divulgación proporciona la selección de homólogos de Cas9 que se empaquetan fácilmente en vectores virales para la administración. Ortólogos de Cas9 suelen compartir la organización general de 3-4 dominios RuvC y un dominio HNH. El dominio RuvC más 5’ escinde la cadena no complementaria, y el dominio HNH escinde la cadena complementaria. Todas las anotaciones hacen referencia a la secuencia guía.
El residuo catalítico en el dominio RuvC 5’ se identifica mediante la comparación de homología de la Cas9 de interés con otros ortólogos de Cas9 (de S.pyogenes tipo II CRISPR locus, S.thermophilus CRISPR locus 1, S.thermophilus CRISPR locus 3 y Franciscilla novicida CRISPR locus tipo II), y el residuo Asp conservado se muta a alanina para convertir Cas9 en una enzima melladora de cadena complementaria. De manera similar, los residuos His y Asn conservados en los dominios HNH se mutan a Alanina para convertir Cas9 en una enzima melladora de cadena no complementaria.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima CRISPR de tipo I o III, preferiblemente una enzima CRISPR de tipo II. Esta enzima CRISPR tipo II puede ser cualquier enzima Cas. Una enzima Cas puede identificarse como Cas9, ya que esto puede referirse a la clase general de enzimas que comparten homología con la nucleasa más grande con múltiples dominios de nucleasa del sistema CRISPR de tipo II. Lo más preferiblemente, la enzima Cas9 es o se deriva de, spCas9 o saCas9. Por derivado, las solicitantes quieren dar a entender que la enzima derivada se basa en gran medida, en el sentido de tener un alto grado de homología de secuencia con una enzima de tipo salvaje, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera tal como se describe en esta memoria.
Se apreciará que los términos Cas y enzima CRISPR se utilizan generalmente en esta memoria de manera indistinta, a menos que sea evidente de otra manera. Como se mencionó anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en esta memoria se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR tipo II en Streptococcus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchos más Cas9 de otras especies de microbios, tales como SpCas9, SaCas9, StlCas9, etcétera. Ejemplos adicionales se proporcionan en esta memoria.
En esta memoria se proporciona un ejemplo de una secuencia optimizada en codones, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos), véase la secuencia optimizada en codones humana SaCas9. Si bien esto es preferido, se apreciará que son posibles otros ejemplos y que se conoce la optimización en codones para una especie huésped.
En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona métodos para potenciar la función de Cas9 generando proteínas Cas9 quiméricas. Estos métodos pueden comprender fusionar fragmentos N-terminales de un homólogo Cas9 con fragmentos C-terminales de otro homólogo Cas9. Estos métodos también permiten la selección de nuevas propiedades que muestran las proteínas quiméricas.
Se apreciará que en los presentes métodos, en donde el organismo es un animal o una planta, la modificación puede ocurrir ex vivo o in vitro, por ejemplo en un cultivo celular y en algunos casos no in vivo. En otras realizaciones, puede ocurrir in vivo.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende: I.una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleótidos puede comprender: (a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, (b) una primera secuencia tracr mate, (c) una primera secuencia tracr, (d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, (e) una segunda secuencia tracr mate y (f) una segunda secuencia tracr, y II.una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear, en donde (a), (b), (c), (d), (e) y (f) pueden disponerse en una orientación 5’ a 3’, en donde la secuencia de polinucleótidos puede comprender una secuencia de enlace entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, por lo que la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem, en donde cuando se transcribe, la primera y la segunda secuencia tracr pueden hibridarse con la primera y segunda secuencia tracr, respectivamente y la primera y la segunda secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencias diana respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR puede comprender la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia objetivo, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida con la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR puede comprender la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia tracr mate que se hibrida con la segunda secuencia tracr, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana induciendo una ruptura de la doble cadena, modificando así el organismo o el organismo no humano.
La invención también se refiere a un método de modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprenden I.un primer elemento regulador operativamente unido a (a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, (b) una primera secuencia tracr mate, (c) una primera secuencia tracr, (d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, (e) una segunda secuencia tracr mate y (f) una segunda secuencia tracr, y en donde una secuencia de enlazador está presente entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, por lo que la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem, y II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y en donde los componentes I y II están ubicados en el mismo o diferentes vectores del sistema, cuando se transcribe, una primera secuencia tracr mate se hibrida con una primera secuencia tracr y la primera y la segunda secuencia guía dirigen la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencias diana, respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida a la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida a la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia traer mate que se híbrida a la segunda secuencia traer, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana, induciendo una ruptura de doble cadena, modificando así al organismo o al organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de la diana. En algunos casos, la segunda tracr puede hibridarse con la primera tracr-mate.
La invención se refiere también a una composición que se produce de forma no natural o modificada para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende I.una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende: (a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, (b) una primera secuencia tracr mate, (c) una primera secuencia tracr, (d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, (e) una segunda secuencia tracr mate y (f) una segunda secuencia tracr, y Il.una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear, en donde (a), (b), (c), (d), (e) y (f) pueden disponerse en una orientación 5’ a 3’, en donde la secuencia de polinucleótidos puede comprender una secuencia de enlazador entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, por lo que la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem, en donde cuando se transcriben, la primera y la segunda secuencia tracr mate se hibridan con la primera y segunda secuencia tracr, respectivamente y la primera y la segunda secuencia guía dirigen la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencias diana respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida con la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia tracr mate que se hibrida con la segunda secuencia tracr, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana, induciendo una ruptura de la doble cadena, modificando así el organismo o el organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de la diana.
En realizaciones de los métodos y composiciones de la invención, la modificación del organismo o del organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de la diana puede comprender inducir una microdeleción, en donde la microdeleción puede comprender la deleción de una secuencia entre las primera y segunda secuencias diana. En realizaciones de la invención, la secuencia de enlazador puede comprender al menos 5 nucleótidos, o al menos 10 nucleótidos o al menos 20 nucleótidos. En una realización ventajosa, la secuencia enlazadora tiene 8 o 12 nucleótidos. En otras realizaciones, la primera o segunda secuencia guía, la primera o segunda secuencia tracr y/o la primera o segunda secuencia tracr mate están modificadas, en donde la modificación comprende primera o segunda secuencia tracr optimizada y/o primera o segunda secuencia guía optimizada y/o estructura de pliegue conjunto de la primera o segunda secuencia tracr y/o primera o segunda secuencia o secuencias tracr mate,respectivamente y/o estructuras secundarias estabilizadoras (horquillas) de la primera o segunda secuencia tracr y/o primera o segunda secuencia tracr con una región reducida de apareamiento de bases y/o elementos de ARN fusionados de la primera o segunda secuencia tracr.
En realizaciones adicionales de los métodos y composiciones de la invención, cualquiera o la totalidad de la secuencia de polinucleótidos que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia tracr mate o la primera y la segunda secuencia trac, es/son ARN. La invención también comprende los polinucleótidos que codifican la secuencia que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia tracr mate o la primera y la segunda secuencia tracr, es / son ARN y se administra(n) a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola de genes. En una realización adicional, la primera y segunda secuencia tracr mate comparten el 100% de identidad y/o la primera y segunda secuencia tracr comparten el 100% de identidad. En una realización preferida, la enzima CRISPR es una enzima Cas9, p.ej., SpCas9. No es necesariamente el caso para una identidad del 100% entre la primera y la segunda secuencia tracr: Muchos de los armazones alterados tienen cambios en las secuencias DR/TracR, así como en las horquillas distales. También es posible tener tándems que impliquen armazones alternativos que tengan distintas secuencias DR/TRACR.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende: I.una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende: (a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, (b) una primera secuencia tracr mate, (c) una primera secuencia tracr, (d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, (e) una segunda secuencia tracr mate y (f) una segunda secuencia tracr, y II.una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y que comprende una o más mutaciones, en donde (a), (b), (c), (d), (e) y (f) pueden disponerse en una orientación 5’ a 3’, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de enlazador entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, por lo que la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem, en donde cuando se transcribe, la primera y la segunda secuencia tracr pueden hibridarse con la primera y segunda secuencia tracr, respectivamente y la primera y la segunda secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencias diana respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida con la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia tracr mate que se hibrida con la segunda secuencia tracr, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana induciendo una ruptura de la doble cadena, modificando así el organismo o el organismo no humano.
La invención se refiere a un método de modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprenden I.un primer elemento regulador operativamente enlazado a (a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, (b) una primera secuencia tracr mate, (c) una primera secuencia tracr, (d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, (e) una segunda secuencia tracr mate y (f) una segunda secuencia tracr, y en donde una secuencia de enlazador está presente entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, por lo que la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem, y II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y en donde los componentes I y II están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, cuando se transcribe, una primera secuencia tracr mate se hibrida con una primera secuencia tracr y la primera y la segunda secuencia guía dirigen la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencias diana, respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida a la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida a la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia tracr mate que se hibrida con la segunda secuencia tracr, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana, induciendo una ruptura de doble cadena, modificando con ello al organismo o al organismo no humano. En una realización de la invención, el uno o más de los vectores virales se administran a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola génica. En algunos casos, la segunda tracr puede hibridarse con la primera tracr-mate.
La invención se refiere también a una composición que se produce de forma no natural o modificada para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende: I.una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende: (a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, (b) una primera secuencia tracr mate, (c) una primera secuencia tracr, (d) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, (e) una segunda secuencia tracr mate y (f) una segunda secuencia tracr, y II.una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y que comprende una o más mutaciones, en donde (a), (b), (c), (d), (e) y (f) pueden disponerse en una orientación 5’ a 3’, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende una secuencia de enlazador entre la primera secuencia tracr y la segunda secuencia guía, por lo que la primera secuencia guía y la segunda secuencia guía están en tándem, en donde cuando se transcribe, la primera y la segunda secuencia tracr mate se hibridan con la primera y segunda secuencia tracr, respectivamente, y la primera y la segunda secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a la primera y segunda secuencias diana, respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida con la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia tracr mate que se hibrida con la segunda secuencia tracr, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana induciendo una ruptura de la doble cadena, para modificar el organismo o el organismo no humano.
En realizaciones de los métodos y composiciones de la invención, la primera secuencia guía que dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía que dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana produce un colgante 5'. En algunas realizaciones, el saliente 5’ es a lo sumo de 200 pares de bases, o a lo sumo de 100 pares de bases, o a lo sumo de 50 pares de bases o al menos 26 pares de bases o al menos 30 pares de bases. En una realización preferida, el colgante 5’ es de 34-50 pares de bases. La invención comprende cualquiera o la totalidad de la secuencia de polinucleótidos que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia tracr o la primera y la segunda secuencia de tracr, es/son ARN. En una realización de la invención, la primera y segunda secuencia tracr mate comparten el 100% de identidad y/o la primera y segunda secuencia tracr comparten el 100% de identidad. No es necesariamente el caso para una identidad del 100% entre la primera y la segunda secuencia tracr: Muchos de los armazones alterados tienen cambios en las secuencias DR/TracR, así como en las horquillas distales. También es posible tener tándems que impliquen armazones alternativos que tengan distintas secuencias DR/TRACR. En una realización preferida, la enzima CRISPR es una enzima Cas9, p.ej., SpCas9. En una realización adicional, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, en donde la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización preferida, la enzima CRISPR tiene la mutación D10A. En aún otra realización, la modificación comprende una primera o segunda secuencia tracr optimizada y/o una primera o segunda secuencia de guía optimizada y/o una estructura plegada conjuntamente de la primera o segunda secuencia tracr y/o la primera o segunda secuencia(s) tracr mate respectivamente y/o estructuras secundarias estabilizadoras (horquillas) de la primera o segunda secuencia tracr y/o primera o segunda secuencia tracr con una región reducida de apareamiento de bases y/o elementos de ARN fusionados de primera o segunda secuencia tracr. En realizaciones de la invención, la secuencia de enlazador puede comprender al menos 5 nucleótidos, o al menos 10 nucleótidos o al menos 20 nucleótidos. En una realización ventajosa, la secuencia enlazadora tiene 8 o 12 nucleótidos.
En otros aspectos de los métodos y las composiciones de la invención, más de dos secuencias guía pueden estar en tándem. La expresión "ARN guía único en tándem" o "ARNtgs" se utiliza para referirse a uno o más ARN guía únicos (ARNgs) conectados por una o más secuencias enlazadoras. En una realización preferida, dos secuencias guía están en tándem en la secuencia de polinucleótidos. Un aspecto clave de la invención es la utilización de un único promotor o elemento operable para impulsar la expresión de más de un ARN guía.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende:
suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende:
A) -
I. una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota,
(b) una secuencia tracr mate, y
(c) una secuencia tracr, y
II. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear,
en donde (a), (b) y (c) están dispuestos en una orientación de 5‘ a 3’,
en donde, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN
o
(B)
I.polinucleótidos que comprenden:
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y
(b) al menos una o más secuencias de traer mate,
II. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR, y
III. una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia tracr,
en donde, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN.
Cualquiera o la totalidad de la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR, secuencia guía, secuencia tracr mate o secuencia tracr, puede ser ARN. Los polinucleótidos que codifican la secuencia que codifica una enzima CRISPR, la secuencia guía, la secuencia tracr mate o la secuencia tracr pueden ser ARN y se suministran a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola de genes.
Se apreciará que cuando se hace referencia a un polinucleótido, que es ARN y se dice que 'comprende' una característica tal como una secuencia tracr, la secuencia de ARN incluye la característica. En los casos en los que el polinucleótido es ADN y se dice que comprende una característica tal como una secuencia tracr, la secuencia de ADN es o puede transcribirse en el ARN de la característica en cuestión En los casos en los que la característica es una proteína, tal como la enzima CRISPR, la secuencia de ADN o ARN a la que se hace referencia es, o puede ser traducida (y en el caso de ADN transcrita primero).
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método de modificar un organismo, p.ej., mamífero que incluye un mamífero u organismo humano o no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vector viral o plasmídico que comprende uno o más vectores virales o plasmídicos que codifican operativamente una composición para su expresión, en donde la composición comprende (A) una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprende I.un primer elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia tracr mate y (c) una secuencia tracr, y II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear (u opcionalmente al menos una o más secuencias de localización nuclear, ya que algunas realizaciones pueden implicar ningún NLS), en donde (a), (b) y (c) están dispuestos en una orientación de 5' a 3', en donde los componentes I y II están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, en donde cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr, o (B) una composición que no se produce de forma natural o modificada que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprenden I.un primer elemento regulador operativamente enlazado a (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y (b) al menos una o más secuencias tracr mate, II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de la enzima que codifica una enzima CRISPR, y III.un tercer elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia tracr, en donde los componentes I, II y III están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr.
Preferiblemente, el vector es un vector viral, tal como vectores virales lenti- o baculo- o preferiblemente adenoviral/adeno-asociados, pero se conocen y se proporcionan otros medios de suministro (tales como sistemas de levadura, microvesículas, pistolas de genes/medios para unir vectores a nanopartículas de oro). En algunas realizaciones, uno o más de los vectores virales o plasmídicos pueden suministrarse a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola de genes.
Por manipulación de una secuencia diana, las solicitantes también se refieren a la manipulación epigenética de una secuencia diana. Esto puede ser del estado de cromatina de una secuencia diana, tal como por modificación del estado de metilación de la secuencia diana (es decir, adición o separación de metilación o de patrones de metilación o islas CpG), modificación de histonas, aumentando o reduciendo de la accesibilidad a la secuencia diana, o fomentando o reduciendo el plegamiento 3D.
Se apreciará que cuando se hace referencia a un método para modificar un organismo o mamífero, incluyendo un mamífero u organismo humano o no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, esto puede aplicarse al organismo (o mamífero) como un todo o solo a una sola célula o población de células de ese organismo (si el organismo es multicelular). En el caso de los seres humanos, por ejemplo, las solicitantes prevén, entre otras cosas, una sola célula o una población de células y éstas pueden modificarse preferiblemente ex vivo y luego re-introducirse. En este caso, puede ser necesaria una biopsia u otra muestra de tejido o fluido biológico. Las células madre también son particularmente preferidas a este respecto. Pero, por supuesto, también se prevén realizaciones in vivo.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método para tratar o inhibir una afección provocada por un defecto en una secuencia diana en un locus genómico de interés en un sujeto (p.ej., mamífero o ser humano) o un sujeto no humano (p.ej., mamífero) en necesidad del mismo, que comprende modificar el sujeto o un sujeto no humano mediante la manipulación de la secuencia diana y en el que la afección es susceptible al tratamiento o inhibición mediante la manipulación de la secuencia diana que comprende proporcionar tratamiento, que comprende: administrar una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vectores AAV que comprende uno o más vectores AAV, que comprende codificar operativamente una composición para su expresión, en el que la secuencia diana es manipulada por la composición cuando se expresa, en el que la composición comprende: (A) una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprende I.un primer elemento regulador operativamente enlazado con una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia tracr mate y (c) una secuencia tracr, y II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado con una secuencia codificante de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear (u opcionalmente al menos una o más secuencias de localización nuclear, ya que algunas realizaciones pueden implicar ningún NLS), en donde (a), (b) y (c) están dispuestos en una orientación de 5' a 3', en donde los componentes I y II están ubicados en los mismos o en diferentes vectores del sistema, en donde cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr, o (B) una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprenden I.un primer elemento regulador operativamente enlazado a (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y (b) al menos una o más secuencias tracr mate, II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de la enzima que codifica una enzima CRISPR, y III.un tercer elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia tracr, en donde los componentes I, II y III están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr.
Algunos métodos de la invención pueden incluir inducir la expresión. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es un eucariota o un eucariota no humano o un animal no humano o un mamífero no humano. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es una planta. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es un mamífero no humano. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto son algas. En algunos métodos de la invención, el vector viral es un AAV. En algunos métodos de la invención, la enzima CRISPR es un Cas9. En algunos métodos de la invención, la expresión de la secuencia guía está bajo el control del promotor T7 y es impulsada por la expresión de la polimerasa T7.
Por manipulación de una secuencia diana, las solicitantes también se refieren a la manipulación epigenética de una secuencia diana. Esto puede ser del estado de cromatina de una secuencia diana, tal como por modificación del estado de metilación de la secuencia diana (es decir, adición o separación de metilación o de patrones de metilación o islas CpG), modificación de histonas, aumentando o reduciendo de la accesibilidad a la secuencia diana, o fomentando o reduciendo el plegamiento 3D.
Se apreciará que cuando se hace referencia a un método para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, esto puede aplicarse al organismo como un todo o solo a una sola célula o población de células de ese organismo (si el organismo es multicelular). En el caso de los seres humanos, por ejemplo, las solicitantes prevén, entre otras cosas, una sola célula o una población de células y éstas pueden modificarse preferiblemente ex vivo y luego re-introducirse. En este caso, puede ser necesaria una biopsia u otra muestra de tejido o fluido biológico. Las células madre también son particularmente preferidas a este respecto. Pero, por supuesto, también se prevén realizaciones in vivo.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método para tratar o inhibir una afección provocada por un defecto en una secuencia diana en un locus genómico de interés en un sujeto o un sujeto no humano en necesidad del mismo, que comprende modificar el sujeto o un sujeto no humano mediante la manipulación de la secuencia diana y en el que la afección es susceptible al tratamiento o inhibición mediante la manipulación de la secuencia diana que comprende proporcionar tratamiento, que comprende: suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vectores AAV que comprende uno o más vectores AAV, que comprende codificar operativamente una composición para su expresión, en el que la secuencia diana es manipulada por la composición cuando se expresa, en el que la composición comprende: (A) una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprende I.un primer elemento regulador operativamente enlazado con una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia tracr mate y (c) una secuencia tracr, y II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado con una secuencia codificante de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear (u opcionalmente al menos una o más secuencias de localización nuclear, ya que algunas realizaciones pueden implicar ningún NLS), en donde (a), (b) y (c) están dispuestos en una orientación de 5' a 3', en donde los componentes I y II están ubicados en los mismos o en diferentes vectores del sistema, en donde cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr, o (B) una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprenden I.un primer elemento regulador operativamente enlazado a (a) una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y (b) al menos una o más secuencias tracr mate, II.un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de la enzima que codifica una enzima CRISPR, y III.un tercer elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia tracr, en donde los componentes I, II y III están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr.
Algunos métodos de la invención pueden incluir inducir la expresión. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es un eucariota o un eucariota no humano o un animal no humano. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es una planta. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto es un mamífero no humano. En algunos métodos de la invención, el organismo o sujeto son algas. En algunos métodos de la invención, el vector viral es un AAV. En algunos métodos de la invención, la enzima CRISPR es un Cas9. En algunos métodos de la invención, la expresión de la secuencia guía está bajo el control del promotor T7 y es impulsada por la expresión de la polimerasa T7.
La invención, en algunas realizaciones, se refiere a un método para suministrar una enzima CRISPR que comprende suministrar a un ARNm celular que codifica la enzima CRISPR. En algunos de estos métodos, la enzima CRISPR es un Cas9.
La invención, en algunas realizaciones, se refiere a un método para preparar el AAV de la invención, que comprende transfectar plásmido(s) que contiene(n) o consiste(n) esencialmente en molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) el AAV en células infectadas con AAV y suministra AAV rep y/o cap obligatoria para la replicación y el empaquetamiento del AAV. En algunas realizaciones, el AAV rep y/o cap obligatorios para la replicación y el empaquetamiento del AAV se suministran mediante transfección de las células con plásmido(s) o virus helper. En algunas realizaciones, el virus helper es un poxvirus, adenovirus, virus herpes o baculovirus. En algunas realizaciones, el poxvirus es un virus vaccinia. En algunas realizaciones, las células son células de mamífero. Y en algunas realizaciones, las células son células de insecto y el virus helper es baculovirus.
En las plantas, los patógenos son a menudo específicos para el huésped. Por ejemplo, Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici provoca la marchitez del tomate pero ataca solo al tomate y F.oxysporum f dianthii Puccinia graminis f.sp.tritici ataca solo al trigo Las plantas tienen defensas existentes e inducidas para resistir a la mayoría de los patógenos. Las mutaciones y los eventos de recombinación entre las generaciones de plantas conducen a una variabilidad genética que da lugar a la susceptibilidad, especialmente a medida que los patógenos se reproducen con más frecuencia que las plantas. En las plantas puede haber resistencia no huésped, p.ej., el huésped y el patógeno son incompatibles. También puede haber Resistencia Horizontal, p.ej., resistencia parcial contra todas las razas de un patógeno, típicamente controlada por muchos genes, y Resistencia Vertical, p.ej., resistencia completa a algunas razas de un patógeno pero no a otras razas, típicamente controlada por unos pocos genes. En un nivel gen por gen, las plantas y los patógenos evolucionan juntos, y los cambios genéticos en un equilibrio cambian en otro. Por consiguiente, utilizando la Variabilidad Natural, los obtentores combinan los genes más útiles para obtener Rendimiento, Calidad, Uniformidad, Dureza y Resistencia. Las fuentes de genes de resistencia incluyen Variedades nativas o extrañas, Variedades de Herencia, Familiares de Plantas Silvestres y Mutaciones Inducidas, p.ej., el tratamiento de material vegetal con agentes mutagénicos. Utilizando la presente invención, los obtentores vegetales reciben una nueva herramienta para inducir mutaciones. Por consiguiente, un experto en la técnica puede analizar el genoma de fuentes de genes de resistencia, y en Variedades que tienen características o rasgos deseados, emplear la presente invención para inducir el aumento de genes de resistencia, con más precisión que los agentes mutagénicos anteriores y, por lo tanto, acelerar y mejorar los programas de cultivos vegetales.
La invención comprende, además, una composición de la invención para uso en medicina. En algunas realizaciones, la invención comprende una composición de acuerdo con la invención para uso en un método de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de una composición de la invención en la edición de genes o genomas ex vivo. En determinadas realizaciones, la invención comprende el uso de una composición de la invención en la fabricación de un medicamento para la edición de genes o genomas ex vivo o para el uso en un método de acuerdo con la invención. La invención comprende en algunas realizaciones una composición de la invención, en donde la secuencia diana está flanqueada en su extremo 3‘ por un motivo 5' (en donde N es cualquier Nucleótido), especialmente en que la Cas9 es (o se deriva de) Cas9 de S.pyogenes o S.aureus Por ejemplo, un PAM adecuado es 5'-NRG o 5'-NNGRR para las enzimas SpCas9 o SaCas9 (o enzimas derivadas), respectivamente, tal como se menciona más adelante.
Se apreciará que SpCas9 o SaCas9 son aquellas de o derivadas de Cas9 de S.pyogenes or S.aureus.
Aspectos de la invención se refieren a mejorar la especificidad de una enzima CRISPR, p.ej.Cas9, a genes mediados que fijan como objetivo y reducen la probabilidad de modificación fuera de diana por la enzima CRISPR, p.ej., Cas9. La invención, en algunas realizaciones, se refiere a un método para modificar un organismo o un organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de diana mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende:
I. una primera secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la primera secuencia de polinucleótidos comprende:
(a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana,
(b) una primera secuencia tracr mate, y
(c) una primera secuencia tracr.
II. una segunda secuencia de polinucleótidos de ARNqui del sistema CRISPR-Cas, en donde la segunda secuencia de polinucleótidos comprende:
(a) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana,
(b) una segunda secuencia tracr mate, y
(c) una segunda secuencia tracr, y
III. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y que comprende una o más mutaciones, en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación de 5' a 3', en donde cuando se transcribe, la primera y la segunda secuencia tracr mate se hibridan con la primera y segunda secuencia tracr, respectivamente, y la primera y la segunda secuencia de guía dirige la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISPR a las secuencias diana primera y segunda, respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana, y (2) la primera secuencia tracr mate que se hibrida con la primera secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la segunda secuencia tracr mate que se hibrida con la segunda secuencia tracr mate, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana, induciendo una ruptura de la doble cadena, modificando con ello el organismo o el organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de diana.
En algunos métodos de la invención, cualquiera o la totalidad de la secuencia de polinucleótidos que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia tracr o la primera y la segunda secuencia tracr, es/son ARN. En realizaciones adicionales de la invención, los polinucleótidos que codifican la secuencia que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia tracr mate o la primera y la segunda secuencia tracr, es/son ARN y se suministran a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola de genes. En determinadas realizaciones de la invención, la primera y segunda secuencia tracr mate comparten el 100% de identidad y/o la primera y segunda secuencia tracr comparten el 100% de identidad. No es necesariamente el caso para una identidad del 100% entre la primera y la segunda secuencia tracr: Muchos de los armazones alterados tienen cambios en las secuencias DR/TracR, así como en las horquillas distales. También es posible tener tándems que impliquen armazones alternativos que tengan distintas secuencias DR/TRACR. En realizaciones preferidas, la enzima CRISPR es una enzima Cas9, p.ej., SpCas9. En un aspecto de la invención, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, en donde la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización muy preferida, la enzima CRISPR tiene la mutación D10A.
En métodos preferidos de la invención, la primera secuencia guía que dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía que dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana resulta en un colgante 5'. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ tiene a lo sumo 200 pares de bases, preferiblemente a lo sumo 100 pares de bases, o más preferiblemente a lo sumo 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ es al menos de 26 pares de bases, preferiblemente al menos de 30 pares de bases, o más preferiblemente al menos de 34-50 pares de bases.
La divulgación, en algunas realizaciones, comprende un método para modificar un organismo o un organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de diana mediante la manipulación de una primera y una segunda secuencia diana en cadenas opuestas de un dúplex de ADN en un locus genómico de interés en una célula, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende uno o más vectores que comprenden:
I. un primer elemento regulador operativamente enlazado a
(a) una primera secuencia guía capaz de hibridarse con la primera secuencia diana, y
(b) al menos una o más secuencias de tracr mate,
II. un segundo elemento regulador operativamente enlazado a
(a) una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con la segunda secuencia diana, y
(b) al menos una o más secuencias de tracr mate,
III. un tercer elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR, y
IV. un cuarto elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia tracr,
en donde los componentes I, II, III y IV están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la primera y la segunda secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un primer y un segundo complejo CRISpR a las secuencias diana primera y segunda, respectivamente, en donde el primer complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la primera secuencia guía que se hibrida con la primera secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr, en donde el segundo complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la segunda secuencia guía que se hibrida con la segunda secuencia diana, y (2) la secuencia mate tracr que se hibrida con la secuencia tracr, en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR es ADN o ARN, y en donde la primera secuencia guía dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana, induciendo una ruptura de la doble cadena, modificando con ello el organismo o el organismo no humano con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de diana.
En algunos métodos de la invención, cualquiera o la totalidad de la secuencia de polinucleótidos que codifica la enzima CRISPR, la primera y la segunda secuencia guía, la primera y la segunda secuencia tracr o la primera y la segunda secuencia tracr, es/son ARN. En realizaciones adicionales de la invención, la primera y segunda secuencia tracr mate comparten el 100% de identidad y/o la primera y segunda secuencia tracr comparten el 100% de identidad. No es necesariamente el caso para una identidad del 100% entre la primera y la segunda secuencia tracr: Muchos de los armazones alterados tienen cambios en las secuencias DR/TracR, así como en las horquillas distales. También es posible tener tándems que impliquen armazones alternativos que tengan distintas secuencias DR/TRACR. En realizaciones preferidas, la enzima CRISPR es una enzima Cas9, p.ej., SpCas9. En un aspecto de la invención, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, en donde la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A. En una realización muy preferida, la enzima CRISPR tiene la mutación D10A. En una realización adicional de la invención, el uno o más de los vectores virales se suministran a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola de genes.
En métodos preferidos de la invención, la primera secuencia guía que dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía que dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana resulta en un colgante 5'. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ tiene a lo sumo 200 pares de bases, preferiblemente a lo sumo 100 pares de bases, o más preferiblemente a lo sumo 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ tes al menos de 26 pares de bases, preferiblemente al menos de 30 pares de bases, o más preferiblemente al menos de 34-50 pares de bases.
La invención, en algunas realizaciones, se refiere a un método para modificar un locus genómico de interés con una reducción en la probabilidad de modificaciones fuera de diana mediante la introducción en una célula que contiene y expresa una molécula de ADN de doble cadena que codifica el producto génico, un sistema CRISPR-Cas modificado, que se produce de forma no natural que comprende una proteína Cas que tiene una o más mutaciones y dos ARN guía que fijan como objetivo una primera cadena y una segunda cadena de la molécula de ADN respectivamente, con lo que los ARN guía fijan como objetivo a la molécula de ADN que codifica el producto génico y la proteína Cas mella cada una de la primera cadena y la segunda cadena de la molécula de ADN que codifica el producto génico, con lo que se altera la expresión del producto génico; y, en donde la proteína Cas y los dos ARN guía no se producen de forma natural juntos.
En métodos preferidos de la invención, la proteína Cas que mella cada una de la primera cadena y la segunda cadena de la molécula de ADN que codifica el producto génico da como resultado un colgante 5'. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ tiene a lo sumo 200 pares de bases, preferiblemente a lo sumo 100 pares de bases, o más preferiblemente a lo sumo 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ tes al menos de 26 pares de bases, preferiblemente al menos de 30 pares de bases, o más preferiblemente al menos de 34-50 pares de bases.
Realizaciones de la invención también comprenden los ARN guía que comprenden una secuencia guía fusionada a una secuencia tracr mate y una secuencia tracr. En un aspecto de la invención, la proteína Cas está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, en donde puede ser una célula de mamífero o una célula humana. En realizaciones adicionales de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR-Cas de tipo II, p.ej., una proteína Cas 9. En una realización muy preferida, la proteína Cas es una proteína Cas9, p.ej., SpCas9. En aspectos de la invención, la proteína Cas tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en D10A, E762A, H840A, N854A, N863a y D986A. En una realización muy preferida, la proteína Cas tiene la mutación D10A.
Aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o la introducción adicional de un polinucleótido molde en la molécula de ADN que codifica el producto génico o la eliminación de una secuencia intermedia precisamente al permitir que los dos colgantes 5’ se vuelvan a asociar y se unan o se altere la actividad o la función del producto génico o se incremente la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína.
La invención se refiere también a un sistema CRISPR-Cas modificado, que se produce de forma no natural que comprende una proteína Cas que tiene una o más mutaciones y dos ARN guía que fijan como objetivo una primera cadena y una segunda cadena, respectivamente, de una molécula de ADN de doble cadena que codifica un producto génico en una célula, con lo cual los ARN guía fijan como objetivo la molécula de ADN que codifica el producto génico y la proteína Cas mella cada una de la primera cadena y la segunda cadena de la molécula de ADN que codifica el producto génico, con lo que se altera la expresión del producto génico; y en donde la proteína Cas y los dos ARN guía no se producen juntos de forma natural.
En aspectos de la invención, los ARN guía pueden comprender una secuencia guía fusionada a una secuencia tracr mate y una secuencia tracr. En una realización de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR-Cas de tipo II. En un aspecto de la invención, la proteína Cas está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, en donde puede ser una célula de mamífero o una célula humana. En realizaciones adicionales de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR-Cas de tipo II, p.ej., una proteína Cas 9. En una realización muy preferida, la proteína Cas es una proteína Cas9, p.ej., SpCas9. En aspectos de la invención, la proteína Cas tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en d 10A, E762A, H840A, N854a , N863A y D986A. En una realización muy preferida, la proteína Cas tiene la mutación D10A.
Aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o la introducción adicional de un polinucleótido molde en la molécula de ADN que codifica el producto génico o la eliminación de una secuencia intermedia precisamente al permitir que los dos colgantes 5’ se vuelvan a asociar y se unan o se altere la actividad o la función del producto génico o se incremente la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína.
La invención también se refiere a un sistema de vector modificado, que no se produce de forma natural, que comprende uno o más vectores que comprenden:
a) un primer elemento regulador operativamente enlazado a cada uno de los dos ARN guía del sistema CRISPR-Cas que fijan como objetivo una primera cadena y una segunda cadena, respectivamente, de una molécula de ADN de doble cadena que codifica un producto génico,
b) un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una proteína Cas,
en donde los componentes (a) y (b) están ubicados en los mismos o diferentes vectores del sistema, con lo que los ARN guía fijan como objetivo la molécula de ADN que codifica el producto génico y la proteína Cas mella cada una de la primera cadena y la segunda cadena de la molécula de ADN que codifican el producto génico, con lo que se altera la expresión del producto génico; y, en donde la proteína Cas y los dos ARN guía no se producen juntos de forma natural.
En aspectos de la invención, los ARN guía pueden comprender una secuencia guía fusionada a una secuencia tracr mate y una secuencia tracr. En una realización de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR-Cas de tipo II. En un aspecto de la invención, la proteína Cas está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, en donde puede ser una célula de mamífero o una célula humana. En realizaciones adicionales de la invención, la proteína Cas es una proteína CRISPR-Cas de tipo II, p.ej., una proteína Cas 9. En una realización muy preferida, la proteína Cas es una proteína Cas9, p.ej., SpCas9. En aspectos de la invención, la proteína Cas tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en d 10A, E762A, H840A, N854a , N863A y D986A. En una realización muy preferida, la proteína Cas tiene la mutación D10A.
Aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o la introducción adicional de un polinucleótido molde en la molécula de ADN que codifica el producto génico o la eliminación de una secuencia intermedia precisamente al permitir que los dos colgantes 5’ se vuelvan a asociar y se unan o se altere la actividad o la función del producto génico o se incremente la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína. En realizaciones preferidas de la invención, los vectores del sistema son vectores virales. En una realización adicional, los vectores del sistema se suministran a través de nanopartículas, exosomas, microvesículas o una pistola de genes.
En un aspecto, la invención proporciona un método para modificar un polinucleótido diana en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión de dicho polinucleótido diana modificando con ello el polinucleótido diana, en donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro de dicha polinucleótido diana, en donde dicha secuencia guía está enlazada a una secuencia tracr mate que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos cadenas en la ubicación de la secuencia diana por dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado una transcripción disminuida de un gen diana. En algunas realizaciones, el método comprende, además, reparar dicho polinucleótido diana escindido por recombinación homóloga con un polinucleótido molde exógeno, en donde dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido diana. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácidos en una proteína expresada a partir de un gen que comprende la secuencia diana. En algunas realizaciones, el método comprende, además, suministrar uno o más vectores a dicha célula eucariota, en donde el uno o más vectores impulsan la expresión de uno o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía enlazada a la secuencia de tracr mate y la secuencia tracr. En algunas realizaciones, dichos vectores se suministran a la célula eucariota en un sujeto En algunas realizaciones, dicha modificación tiene lugar en dicha célula eucariota en un cultivo celular. En algunas realizaciones, el método comprende, además, aislar dicha célula eucariota de un sujeto antes de dicha modificación. En algunas realizaciones, el método comprende, además, devolver dicha célula eucariota y/o células derivadas de la misma a dicho sujeto.
En un aspecto, la invención proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de manera que dicha unión de como resultado una expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido, en donde dicha secuencia guía está enlazada a una secuencia tracr mate que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. En algunas realizaciones, el método comprende, además, suministrar uno o más vectores a dichas células eucariotas, en donde el uno o más vectores impulsan la expresión de uno o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía enlazada a la secuencia tracr mate y la secuencia tracr.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para generar una célula eucariota modelo que comprende un gen de enfermedad mutado. En algunas realizaciones, un gen de enfermedad es cualquier gen asociado con un aumento en el riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende (a) introducir uno o más vectores en una célula eucariota, en donde el uno o más vectores impulsan la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía enlazada a una secuencia tracr mate y una secuencia tracr; y (b) permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido diana para efectuar la escisión del polinucleótido diana dentro de dicho gen de la enfermedad, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se híbrida con la secuencia diana dentro del polinucleótido diana y (2) la secuencia traer mate que se hibrida con la secuencia tracr, generando con ello una célula eucariota modelo que comprende un gen de enfermedad mutado. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos cadenas en la ubicación de la secuencia diana por dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado una transcripción disminuida de un gen diana. En algunas realizaciones, el método comprende, además, reparar dicho polinucleótido diana escindido por recombinación homóloga con un polinucleótido molde exógeno, en donde dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido diana. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácidos en una proteína expresada a partir de un gen que comprende la secuencia diana.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para seleccionar una o más células procariotas mediante la introducción de una o más mutaciones en un gen en la una o más células procariotas, comprendiendo el método: introducir uno o más vectores en la o las células procariotas, en donde el uno o más vectores impulsan la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía enlazada a una secuencia tracr mate, una secuencia tracr y un molde de edición; en donde el molde de edición comprende la una o más mutaciones que eliminan la escisión de la enzima CRISPR; permitiendo la recombinación homóloga del molde de edición con el polinucleótido diana en la o las células a seleccionar; permitiendo que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido diana para efectuar la escisión del polinucleótido diana dentro de dicho gen, en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana dentro del polinucleótido diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr, en la que la unión del complejo CRISPR al polinucleótido diana induce la muerte celular, permitiendo así una o más células procariotas en las que se han introducido una o más mutaciones seleccionado. En una realización preferida, la enzima CRISPR es Cas9. En otro aspecto de la divulgación, la célula a seleccionar puede ser una célula eucariota. Aspectos de la divulgación permiten la selección de celdas específicas sin requerir un marcador de selección o un procedimiento de dos etapas que puede incluir un sistema de contra-selección.
En un aspecto, la invención proporciona métodos para modificar un polinucleótido diana en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión de dicho polinucleótido diana modificando con ello el polinucleótido diana, en donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro de dicha polinucleótido diana, en donde dicha secuencia guía está enlazada a una secuencia tracr mate que a su vez se hibrida con una secuencia tracr.
En otras realizaciones, la invención proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. El método comprende aumentar o disminuir la expresión de un polinucleótido diana al utilizar un complejo CRISPR que se une al polinucleótido.
En los casos en los que se desee, para efectuar la modificación de la expresión en una célula, se administran a una célula uno o más vectores que comprenden una secuencia tracr, una secuencia guía unida a la secuencia tracr mate, una secuencia que codifica una enzima CRISPR. En algunos métodos, el uno o más vectores comprenden un elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzimas que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear; y un elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia tracr mate y uno o más sitios de inserción para insertar una secuencia guía aguas arriba de la secuencia tracr mate. Cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una célula. Típicamente, el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr.
En algunos métodos, un polinucleótido diana puede ser inactivado para efectuar la modificación de la expresión en una célula. Por ejemplo, tras la unión de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una célula, el polinucleótido diana es inactivado de modo que la secuencia no se transcribe, la proteína codificada no se produce o la secuencia no funciona como lo hace la secuencia de tipo salvaje. Por ejemplo, una proteína o secuencia codificante de microARN puede ser inactivada de manera que no se produzca la proteína.
En determinadas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A y/o la una o más mutaciones está en un dominio RuvCl o HNH de la enzima CRISPR o es una mutación como se discutió de otra manera en esta memoria. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR tiene una o más mutaciones en un dominio catalítico, en donde cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y en donde la enzima comprende, además, un dominio funcional. En algunas realizaciones, un dominio de activación transcripcional es VP64. En algunas realizaciones, un dominio de represión de la transcripción es KRAB. En algunas realizaciones, un dominio de represión de la transcripción es SID o concatámeros de SID (es decir, SID4X). En algunas realizaciones, se proporciona una enzima modificadora epigenética. En algunas realizaciones, se proporciona un dominio de activación, que puede ser el dominio de activación P65.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima CRISPR de tipo I o III, preferiblemente una enzima CRISPR de tipo II. Esta enzima CRISPR tipo II puede ser cualquier enzima Cas. Una enzima Cas puede identificarse como Cas9, ya que esto puede referirse a la clase general de enzimas que comparten homología con la nucleasa más grande con múltiples dominios de nucleasa del sistema CRISPR de tipo II. Lo más preferiblemente, la enzima Cas9 es o se deriva de, spCas9 o saCas9. Por derivado, las solicitantes quieren dar a entender que la enzima derivada se basa en gran medida, en el sentido de tener un alto grado de homología de secuencia con una enzima de tipo salvaje, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera tal como se describe en esta memoria.
Se apreciará que los términos Cas y enzima CRISPR se utilizan generalmente en esta memoria de manera indistinta, a menos que sea evidente de otra manera. Como se mencionó anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en esta memoria se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR tipo II en Streptococcus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchos más Cas9 de otras especies de microbios, tales como SpCas9, SaCa9, StlCas9, etcétera.
En esta memoria se proporciona un ejemplo de una secuencia optimizada en codones, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos), véase la secuencia optimizada en codones humana SaCas9. Si bien esto es preferido, se apreciará que son posibles otros ejemplos y que se conoce la optimización en codones para una especie huésped.
Preferiblemente, el suministro está en forma de un vector que puede ser un vector viral, tal como un vector lenti- o baculo- o preferiblemente adeno-viral/adeno-asociado, pero se conocen y se proporcionan otros medios de suministro (tales como sistemas de levadura, microvesículas, pistolas de genes/medios para unir vectores a nanopartículas de oro). Un vector puede significar no solo un sistema viral o de levadura (por ejemplo, en los casos en los que los ácidos nucleicos de interés pueden estar operativamente unidos y bajo el control (en términos de expresión, tal como proporcionar finalmente un ARN procesado) un promotor), pero también suministra directamente ácidos nucleicos a una célula huésped. Si bien en los métodos de esta memoria el vector puede ser un vector viral y éste es ventajosamente un AAV, se pueden emplear otros vectores virales que los discutidos en esta memoria. Por ejemplo, los baculovirus pueden utilizarse para la expresión en células de insectos. Estas células de insectos pueden, a su vez, ser útiles para producir grandes cantidades de vectores adicionales, tales como vectores AAV adaptados para el suministro de la presente invención. También se contempla un método para suministrar la presente enzima CRISPR que comprende suministrar a un ARNm celular que codifica la enzima CRISPR. Se apreciará que la enzima CRISPR está truncada, compuesta por menos de mil aminoácidos o por menos de cuatro mil aminoácidos, es una nucleasa o nickasa, está optimizada en codones, comprende una o más mutaciones y/o comprende una enzima CRISPR quimérica, u otras opciones como las comentadas en esta memoria. Se prefieren los vectores virales AAV.
En determinadas realizaciones, la secuencia diana está flanqueada o es seguida, en su extremo 3', por un PAM adecuado para la enzima CRISPR, típicamente una Cas y, en particular, una Cas9.
Por ejemplo, un PAM adecuado es 5'-NRG o 5'-NNGRR para las enzimas SpCas9 o SaCas9 (o enzimas derivadas), respectivamente.
Se apreciará que SpCas9 o SaCas9 son aquellas de o derivadas de Cas9 de S.pyogenes or S.aureus.
Se observa que en esta divulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o los párrafos, términos tales como "comprende", "comprendido", la expresión "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU.; p.ej., pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que expresiones tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU., p.ej., permiten elementos que no se mencionan explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o nueva de la invención.
Estas y otras realizaciones se describen o son obvias y están abarcadas por la siguiente Descripción Detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características nuevas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que recoge realizaciones modo de empleo, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los cuales:
La Figura 1 muestra un modelo esquemático del sistema CRISPR. La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarillo) es fijada como objetivo al ADN genómico por un ARN guía sintético (ARNgs) que consiste en una secuencia guía de 20 nt (azul) y un armazón (rojo). Los pares de bases de la secuencia de guía con el diana de ADN (azul), directamente aguas arriba de un motivo adyacente al protoespaciador 5'-NGG (PAM; magenta), y Cas9 media en una ruptura de la doble cadena (DSB) ~ 3 pb aguas arriba de la PAM (triángulo rojo).
La Figura 2A-F muestra un ensayo de representación esquemática llevado a cabo para evaluar la especificidad de escisión de Cas9 a partir de Streptococcuspyogenes.. Los emparejamientos erróneos de pares de bases individuales entre la secuencia de ARN guía y el ADN diana se mapean frente a la eficacia de escisión en %.
La Figura 3A-F es un árbol filogenético circular de genes Cas.
La Figura 4A-F muestra el análisis filogenético lineal que revela cinco familias de Cas9, incluidos tres grupos de Cas9 grandes ( ~ 1400 aminoácidos) y dos de Cas9 pequeños ( ~ 1100 aminoácidos).
La Figura 5 muestra un gráfico que representa la distribución de longitud de ortólogos de Cas9.
La Figura 6A-M muestra secuencias en donde los puntos de mutación están ubicados dentro del gen SpCas9.
La Figura 7A muestra el mapa de vector de Cas9 Condicional, que fija como objetivo Rosa26.
La Figura 7B muestra el mapa de vector de Cas9 Constitutivo, que fija como objetivo Rosa26.
La Figura 8 muestra un esquema de los elementos importantes en las construcciones Constitutivas y Condicionales de Cas9.
La Figura 9 muestra el suministro y los datos de expresión de Cas9 de cerebro de ratón in vivo.
La Figura 10 muestra el suministro de ARN de Cas9 y ARN quimérico a las células (A) Suministro de un informador de GFP como ADN o ARNm a células Neuro-2A. (B) Suministro de Cas9 y ARN quimérico contra el gen Icam2 como ARN da como resultado el corte para uno de los dos espaciadores testados. (C) Suministro de Cas9 y ARN quimérico contra el gen F7 como ARN da como resultado el corte para uno de los dos espaciadores testados.
La Figura 11 muestra cómo la reparación de la ruptura de la doble cadena de ADN (DSB) fomenta la edición de genes. En la vía de unión de extremos no homólogos propensos a errores (NHEJ), los extremos de una DSB se procesan mediante maquinarias de reparación de ADN endógeno y se vuelven a unir, lo que puede dar como resultado mutaciones de inserción/deleción aleatoria (indel) en el sitio de unión. Las mutaciones Indel que se producen dentro de la región codificante de un gen pueden dar como resultado un cambio de marco y un codón de parada prematuro, conduciendo a la inactivación del gen Alternativamente, se puede suministrar un molde de reparación en forma de plásmido u oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla (ODNss) para aprovechar la vía de reparación dirigida por homología (HDR), que permite una alta fidelidad y una edición precisa.
La Figura 12A-C muestra los resultados anticipados para HDR en células HEK y HUES9. (a) Se puede utilizar un plásmido de fijación como objetivo o un ODNss (sentido o antisentido) con brazos de homología para editar la secuencia en un locus genómico diana escindido por Cas9 (triángulo rojo). Para evaluar la eficiencia de HDR, los autores de la invención introdujeron un sitio HindIII (barra roja) en el locus diana, que se amplificó por PCR con cebadores que se reasocian fuera de la región de homología. La digestión del producto de PCR con HindIII revela la aparición de eventos HDR (b) ODNss, orientados en la dirección sentido o antisentido (s o a) en relación con el locus de interés, se pueden utilizar en combinación con Cas9 para lograr una edición mediada por HDR eficiente en el locus diana. Se recomienda una región de homología mínima de 40 pb, y preferiblemente 90 pb, a cada lado de la modificación (barra roja). (c) Se muestra un ejemplo del efecto de ODNss en HDR en el locus EMX1 utilizando tanto Cas9 de tipo salvaje como la nickasa de Cas9 (D10A). Cada uno de los ODNss contiene brazos de homología de 90 pb que flanquean una inserción de 12 pb de dos sitios de restricción.
La Figura 13A-C muestra la estrategia de reparación para la mutación delta F508 de Fibrosis Quística.
La Figura 14A-B muestra (a) un esquema de la expansión repetida de GAA en el intrón 1 de FXN y (b) un esquema de la estrategia adoptada para escindir la región de expansión de GAA utilizando el sistema CRISPR/Cas.
La Figura 15 muestra un rastreo para la fijación como objetivo, mediada por SpCas9 eficiente, de loci de genes Tetl-3 y Dnmtl, 3a y 3b. El ensayo Surveyor en el ADN de células N2A transfectadas demuestra una escisión eficiente del ADN mediante el uso de diferentes ARNg.
La Figura 16 muestra una estrategia de fijación como objetivo de genoma multiplex utilizando un sistema de 2 vectores en un sistema de suministro AAV1 / 2. Tetl-3 y Dnmtl, 3a y 3b ARNg bajo el control del promotor U6. GFP-KASH bajo el control del promotor de sinapsina humana. Los lados de restricción muestran una estrategia simple de reemplazo de ARNg por subclonación. Se muestra SpCas9 marcado con HA flanqueado por dos señales de localización nuclear (NLS). Ambos vectores son suministrados al cerebro por el virus AAV1 / 2 en una relación 1:1.
La Figura 17 muestra la verificación de la funcionalidad de vector de fijación como objetivo de DNMT multiplex n° 1 utilizando el ensayo Surveyor. Células N2A se co-transfectaron con el vector de fijación como objetivo de DNMT n.° 1 (+) y el vector de codificación de SpCas9 para testar la escisión mediada por SpCas9 de loci de la familia de genes de DNMT.El ARNg solo (-) es control negativo. Las células se cosecharon para la purificación de ADN y el procesamiento aguas abajo 48 h después de la transfección.
La Figura 18 muestra la verificación de la funcionalidad de vector de fijación como objetivo de DNMT múltiple n° 2 utilizando el ensayo Surveyor. Células N2A se co-transfectaron con el vector de fijación como objetivo de DNMT n.° 1 (+) y el vector de codificación de SpCas9 para testar la escisión mediada por SpCas9 de loci de la familia de genes de DNMT.El ARNg solo (-) es control negativo. Las células se cosecharon para la purificación de ADN y el procesamiento aguas abajo 48 h después de la transfección.
La Figura 19 muestra una visión general esquemática de promotores cortos y las versiones cortas de poliA utilizadas para la expresión de HA-SpCas9 in vivo. Los tamaños de la región de codificación de L-ITR a R-ITR se muestran a la derecha.
La Figura 20 muestra una visión general esquemática de promotores cortos y las versiones cortas de poliA utilizadas para la expresión de HA-SaCas9 in vivo. Los tamaños de la región de codificación de L-ITR a R-ITR se muestran a la derecha.
La Figura 21 muestra la expresión de SpCas9 y SaCas9 en células N2A. Transferencia Western representativa de las versiones SpCas9 y SaCas9 marcadas con HA bajo el control de diferentes promotores cortos y con secuencias cortas o poliA (spA). Tubulina es el control de carga.mCherry (mCh) es un control de transfección. Las células se cosecharon y se procesaron adicionalmente para la transferencia Western 48 h después de la transfección.
La Figura 22 muestra un rastreo para la fijación como objetivo, mediada por SaCas9 eficiente, del locus del gen Tetl-3. El ensayo Surveyor en el ADN de células N2A transfectadas demuestra una escisión eficiente del ADN utilizando diferentes ARNg con una secuencia NNGGGT PUM. Las células transfectadas con GFP y las células que expresan solo SaCas9 son controles.
La Figura 23 muestra la expresión de HA-SaCas9 en el cerebro de ratón. A los animales se inyectaron en circunvoluciones dentadas con virus que impulsaban la expresión de HA-SaCas9 bajo el control del promotor de Sinapsina humano. Los animales fueron sacrificados 2 semanas después de la cirugía. La etiqueta HA se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal de conejo C29F4 (Señalización Celular). Núcleos de células teñidos de azul con tinción DAPI.
La Figura 24 muestra la expresión de SpCas9 y SaCas9 en neuronas primarias corticales en cultivo 7 días después de la transducción. Transferencia Western representativa de las versiones SpCas9 y SaCas9 marcadas con HA bajo el control de diferentes promotores y con secuencias bgh o poliA (spA) cortas. Tubulina es el control de carga.
La Figura 25 muestra la tinción LIVE/DEAD de neuronas corticales primarias 7 días después de la transducción con partículas de AAV1 que portan SpCas9 con diferentes promotores y construcciones de ARNg multiplex (ejemplo mostrado en el último panel para DNMT). Las neuronas después de la transducción con AAV se compararon con las neuronas no transducidas de control. Los núcleos rojos indican células muertas permeabilizadas (segunda línea de paneles). Las células vivas están marcadas en color verde (tercera línea de paneles).
La Figura 26 muestra la tinción LIVE/DEAD de neuronas corticales primarias 7 días después de la transducción con partículas de AAV1 que portan SaCas9 con diferentes promotores. Los núcleos rojos indican células muertas permeabilizadas (segunda línea de paneles). Las células vivas están marcadas en color verde (tercera línea de paneles).
La Figura 27 muestra la comparación de la morfología de neuronas después de la transducción con el virus AAV1 que porta los multiplexes SpCas9 y ARNg para los loci de genes TET y DNMT. Las neuronas sin transducción se muestran como un control.
La Figura 28 muestra la verificación de la funcionalidad del vector n° 1 que fija como objetivo DNMT multiplex utilizando el ensayo Surveyor en neuronas corticales primarias Células se co-transfectaron con el vector de fijación como objetivo de DNMT n.° 1 y los vector de SpCas9 con diferentes promotores para testar la escisión mediada por SpCas9 de loci de la familia de genes de DNMT.
La Figura 29 muestra la eficiencia in vivo de la escisión de SpCas9 en el cerebro. A los ratones se les inyectó el virus AAV1/2 que porta loci de genes de la familia DNMT que fijan como objetivo ARNg multiplex junto con virus SpCas9 bajo el control de 2 promotores diferentes: Mecp2 de ratón y Maplb de rata Dos semanas después de la inyección, se extrajo tejido del cerebro y los núcleos se prepararon y se clasificaron utilizando FACS, en base a la expresión de GFP impulsada por el promotor Sinapsina de la construcción de ARNg multiplex. Después de la extracción de ADNg se realizó el ensayo Surveyor. indica núcleos positivos para GFP y - núcleos negativos para GFP, control, del mismo animal. Los números en el gel indican la eficacia evaluada de SpCas9.
La Figura 30 muestra la purificación de núcleos celulares marcados con GFP-KASH a partir de neuronas del hipocampo. La membrana nuclear externa (ONM) de la membrana nuclear celular está marcada con una fusión de GFP y el dominio transmembrana de la proteína KASH. Fuerte expresión de GFP en el cerebro después de una semana de cirugía estereotáctica e inyección de AAV1/2. Etapa de centrifugación en gradiente de densidad para purificar los núcleos celulares del cerebro intacto. Se muestran núcleos purificados. La tinción con cromatina mediante Tinción Ruby de Vybrant® DyeCycle™ se muestra en rojo, los núcleos marcados con GFP son verdes. Perfil representativo de FACS de núcleos de células GFP y GFP-(Magenta: Vybrant® DyeCycle ™ Ruby Stain, Verde: GFP)
La Figura 31 muestra la eficiencia de la escisión de SpCas9 en el cerebro de ratón. A los ratones se les inyectó el virus AAV1/2 que porta loci de genes de la familia TET que fijan como objetivo ARNg multiplex junto con virus SpCas9 bajo el control de 2 promotores diferentes: Mecp2 de ratón y Maplb de rata. Tres semanas después de la inyección, se extrajo tejido del cerebro y los núcleos se prepararon y se clasificaron utilizando FACS, en base a la expresión de GFP impulsada por el promotor Sinapsina de la construcción de ARNg multiplex. Después de la extracción de ADNg se realizó el ensayo Surveyor. indica núcleos positivos para GFP y - núcleos negativos para GFP, control, del mismo animal. Los números en el gel indican la eficacia evaluada de SpCas9.
La Figura 32 muestra la expresión de GFP-KASH en neuronas corticales en cultivo. Las neuronas se transdujeron con virus AAV1 que portaba construcciones de ARNg multiplex que fijan como objetivo loci de genes TET. La señal más fuerte se localiza alrededor de los núcleos de las células debido a la localización del dominio KASH.
La Figura 33 muestra (arriba) una lista de espacios (como lo indica el patrón de disposición para dos secuencias PAM) entre pares de ARN guía. Solo los pares de ARN guía que satisfacen los patrones 1, 2, 3, 4 exhiben indeles cuando se utilizan con nickasa SpCas9 (D10A) (abajo). Las imágenes de gel que muestran esa combinación de SpCas9(D10A) con pares de ARN guía que satisfacen los patrones 1,2, 3, 4 condujeron a la formación de indeles en el sitio diana.
La Figura 34 muestra una lista de secuencias de cebador inverso U6 utilizadas para generar casetes de expresión de ARN de guía U6. Cada uno de los cebadores necesita ser emparejado con el cebador directo U6 "gcactgagggcctatttcccatgattc" para generar amplicones que contienen U6 y el a Rn guía deseado.
La Figura 35 muestra un mapa de secuencia genómica del locus Emxl humano que muestra las ubicaciones de los 24 patrones enumerados en la Figura 33.
La Figura 36 muestra (a la derecha) una imagen de gel que indica la formación de indeles en el sitio diana cuando están presentes colgantes 5’ variables después de la escisión por la nickasa Cas9 fijada como objetivo por diferentes pares de ARN guía. en (izquierda) una tabla que indica los números de pistas del gel a la derecha y diversos parámetros, incluida la identificación de los pares de ARN guía utilizados y la longitud del colgante 5’ presente después de la escisión por la nickasa Cas9.
La Figura 37 muestra un mapa de secuencia genómica del locus Emxl humano que muestra las ubicaciones de los diferentes pares de ARN guía que dan como resultado los patrones de gel de la Figura 36 (derecha) y que se describen adicionalmente en el Ejemplo 30.
La Figura 38A-D muestra (A) Optimización del armazón de ARNgs para la estabilidad adicional; Se indican las arquitecturas A y B. (B) un esquema que ilustra un ARNgs en tándem (2 ARNgs conectados por un enlazador) impulsado por un único promotor U6 (C) una figura de gel que indica que los ARNtsg están diseñados para fijar como objetivo una región de EMX1 de modo que, cuando se co-transfecta en células HEK con wt Cas9, media una microdeleción genómica. Aquí, los dianas flanquean el último exón de EMX1.Los ARNtsg se sintetizan con el armazón A o B personalizado que difieren del armazón ARNgs wt (como se indicó arriba). Un único ARNtsg que codifica 2 espaciadores, con arquitectura A o B, cuando se suministra conjuntamente con Cas9 wt, media un nivel similar de microdeleción genómica como dos ARNgs wt suministrados conjuntamente con Cas9 wt. (D) una figura de gel en que, alternativamente, los ARNtgs están diseñados para fijar como objetivo una región de EMX1, de modo que, cuando se co-transfecta en células HEK con D10A Cas9, media un indel tal como se describió previamente en experimentos de doble nickasa. Los espaciadores se eligen de modo que los dianas de la izquierda y la derecha se compensen con al menos 0 o 4 pb de no solapamiento entre los dianas de 20 pb, y los cortes resultantes de D10A generarían colgantes 5'. La imagen de gel muestra el ensayo SURVEYOR que mide indeles de D10A Cas9 co-transfectados con un solo ARNtgs que codifica 2 espaciadores o dos ARNgs separados, en que el primero puede mediar en un nivel de indeles similar al último.
La Figura 39A-C muestra (A) el diseño del vector lentiviral en tándem. (B) las secuencias del armazón para LentiCRISPR. (C) una imagen esquemática y de gel que indica que los ARN guía en tándem construidos de armazones modificados se procesan de manera más eficiente en unidades individuales.
La Figura 40A-B muestra que los ARNgs emparejados inducen indeles mediante doble muesca con la nickasa Cas9n (A) Ilustra esquemáticamente la rotura de la doble cadena de ADN utilizando un par de nickasas Cas9 D10A (Cas9n). Dos ARNgs fijan como objetivo Cas9n para mellar ambas cadenas de ADN. La mutación D10A hace que Cas9 sea capaz de escindir solo la cadena de ADN que es complementaria al ARNgs. La distancia de desplazamiento se refiere a la longitud de ADN entre los extremos más cercanos de los ARNgs emparejados, en este caso 4 pb. (B) Imagen de gel representativa que muestra un indel mediado por Cas9n en el locus EMX1 del genoma humano, tal como se detecta utilizando el ensayo de nucleasa SURVEYOR con una banda de 650 pb que representa la diana genómica no modificada y bandas de alrededor de 300 pb que indican la presencia de indeles.
La Figura 41A-B. muestra que la doble muesca es capaz de inducir indeles (A) Gráficos que muestran la frecuencia de indeles correspondiente a las distancias de desplazamiento de ARNgsRev.más Corto
indicadas a través de tres genes humanos diferentes: EMX1, DYRK1A, GRIN2B. (B) Como un ejemplo, secuencia del locus EMX1 humano fijada como objetivo por Cas9n.Los sitios diana de ARNgs y los PAM se indican mediante barras azules y magentas, respectivamente. Debajo, secuencias seleccionadas que muestran indeles representativos.
La Figura 42A-C muestra que la estrategia de doble muesca es capaz de facilitar la recombinación homóloga (A) Esquema que ilustra HDR fijado como objetivo a través de un molde de oligodesoxinucleótido de cadena sencilla (ODNss) en un DSB creado por un par de Cas9n. La recombinación con éxito en el sitio DSB introduce un sitio de restricción HindIII. (B) Gel de ensayo de digestión por restricción que muestra la inserción con éxito de sitios de escisión HindIII por HDR facilitado por doble muesca en células HEK 293FT. Las bandas superiores son moldes no modificados; las bandas inferiores son producto de escisión HindIII. (C) Doble muesca potencia HDR en células HUES62. Frecuencias HDR determinadas mediante secuenciación profunda. (n = 3; las barras de error muestran la media ± e.t.)
La Figura 43 muestra la caracterización del doble espacio entre muescas para recombinación homóloga. Esquema que ilustra HDR con molde ODNss (se muestra en azul, sitio HindIII introducido en rojo). Las puntas de flecha rojas indican el sitio de unión del ARNgs respectivo con barras negras correspondientes a los supuestos colgantes resultantes de la actividad de muesca emparejada. Los paneles a la derecha muestran la eficacia de la recombinación con los pares de ARNgs indicados, la longitud y el tipo de colgante, y las distancias de desplazamiento entre ARNgs emparejados.
La Figura 44A-D muestra que la doble muesca reduce la actividad no específica en sitios conocidos fuera de diana. (A) Esquema que muestra el locus EMX1 humano diana y los sitios diana de ARNgs. Los sitios genómicos fuera de diana para el ARNgs correcto se enumeran a continuación. Los sitios fuera de diana se identificaron previamente como se describe en Hsu et al 48. (B) Geles de SURVEYOR que muestran modificaciones en el sitio diana por Cas9n con dos ARNgs, así como por Cas9 de tipo salvaje con ARNgs individual. Los indeles en 5 fuera de diana solo se observaron para Cas9 de tipo salvaje con ARNgs 1. (C) Los niveles de modificación fuera de diana se cuantifican utilizando secuenciación profunda en los cinco loci fuera de diana. (D) Comparación de especificidad de Cas9n y Cas9 de tipo salvaje. La relación de especificidad se calcula tomando la relación de las tasas de modificación dentro de diana y fuera de diana. (n = 3; las barras de error muestran la media ± e.t.)
La Figura 45A-B muestra la mutagénesis racional de la arquitectura de ARNgs. (A) Esquema de la arquitectura quimérica de ARNgs con codificación de secuencia guía de 20 pb para la especificidad de la diana. Las diferentes regiones del ARNgs interrogadas por mutagénesis se nombran y resaltan arriba. (B) Descripción de las mutaciones realizadas y la actividad del indel correspondiente en el locus EMX1 humano
La Figura 46 muestra la horquilla distal y la estabilización de DDR retiene una actividad del indel comparable. Esquema que muestra la secuencia de tres arquitecturas de armazones alternativas destinadas a la estabilización de las horquillas con cambios de pares de bases designados en negro. La actividad inductora de indel de los armazones correspondientes en comparación con la arquitectura sp85 de tipo salvaje se muestra a la derecha.
La Figura 47A-C muestra que los ARN guía en tándem impulsados por U6 pueden dirigir eficazmente dos loci genómicos. (A) Esquema que ilustra un ARNgs en tándem (2 ARNgs conectados por un enlazador) impulsado por un único promotor U6. Las imágenes de los geles PAGE de ensayos SURVEYOR demuestran que los ARNtsg que utilizan armazones de ARN modificados administrados con la nickasa Cas9n o Cas9 de tipo salvaje pueden inducir indeles genómicos o microdeleciones (B y C, respectivamente) con frecuencias comparables al suministro conjunto de dos ARNgs independientes
La Figura 48 muestra la optimización de la longitud y estructura del enlazador de ARNgs en tándem. Cuantificación en gel de intensidades de banda a partir de la amplificación por PCR de los loci diana EMX1 humanos comparando la abundancia relativa de ADN de tipo salvaje y modificado con enlazadores en tándem variables de 0, 4, 8, 12, 16 pares de bases, media repetición directa o repetición directa completa (enumerados en el panel inferior).
La Figura 49A-C muestra que los ARN guía en tándem se procesan eficientemente solo en la primera posición. (A) Esquema que muestra los armazones de ARN guía en tándem que codifican EMX1.3 o EMX63 en la primera o segunda posición con la posición de la sonda Emxl.3 Northern en rojo. (B) Análisis de transferencia Northern que examina el procesamiento de ARNgs en tándem en células. (C) Ensayo SURVEYOR que examina la actividad de ARNgs independiente dirigida a dos loci genómicos, DYRK1A y GRIN2B. Las tres pistas de la izquierda en ambos paneles son ARNtgs que fijan como objetivo a DYRK1A en la primera posición y a GRIN2B en la segunda posición. Por el contrario, las tres pistas de la derecha apuntan a GRIN2B primero y luego a DYRK1A segundo.
La Figura 50A-C muestra la optimización de los emparejamientos de armazones de ARNtsg. (A) Esquema del diseño de armazón en tándem con el primer espaciador que fija como objetivo a Grin2B utilizando el Armazón A y el segundo espaciador que fija como objetivo a Cas9 utilizando el Armazón B en un plásmido que expresa Cas9-T2A-GFP. (B) Controles individuales de la guía U6 muestran tanto un aumento en el porcentaje de células GFP negativas como una disminución en la intensidad de fluorescencia media de la fracción positiva. (C) matriz 12x12 de emparejamientos de armazones en tándem y resultados de análisis posteriores por citometría de flujo.
La Figura 51 muestra que pares en tándem entre andamios divergentes mejoran la segunda actividad del espaciador. Alineamiento de la secuencia de los armazones de ARNgs utilizados en el estudio previo al armazón sp85
La Figura 52 muestra diferentes truncamientos del promotor bidireccional U6 y la actividad de microdeleción asociada y la cuantificación de la actividad inductora de indeles que procede de cada lado del promotor bidireccional.
La Figura 53 muestra una secuencia del informador bidireccional más pequeño U6-8 / U6-1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
También con respecto a la información general sobre los sistemas CRISPR-Cas, se hace mención a:
^ Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F.Science 15 feb.;339(6121):819-23 (2013);
^ RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol 31 marzo;(3):233-9 (2013)
^ One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Múltiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng a W., Zhang F., JaenischR. Cell 9 mayo;153(4):910-8 (2013);
^ Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic States. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church Gm , Zhang F.Nature. 22 agosto 2013;500(7463):472-6.doi: 10.1038/Nature12466. Epub 23 agosto 2013;
^ Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F.Cell 28 agosto.pii: S0092-8674(13)01015-5. (2013J;
^ DNAtargeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F.Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013);
^ Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F.Nature Protocols Nov;8(11):2281-308. (2013);
^ Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F.Science 12 diciembre. (2013).
[Epub anates de la impresión]
^ Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O.Cell 27 febrero. (2014). 156(5):935-49; ^ Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB., Cheng AW., Trevino AE., Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol.(2014) 20 abril.doi 10.1038/nbt.2889, y
^ Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu et al, Cell 157, 1262-1278 (5 junio, 2014) (Hsu 2014),
cada uno de los cuales se comenta brevemente a continuación:
■ Cong et a/.modificaron sistemas CRISPR/Cas de tipo II parra uso en células eucariotas basados tanto en Cas9 de Streptococcus thermophilus como en Cas9 de Streptoccocus pyogenes y demostraron que las nucleasas Cas9 pueden ser dirigidas por ARN cortos para inducir la escisión precisa del ADN en células humanas y de ratón. Su estudio demostró, además, que Cas9, convertida en una enzima melladora, puede utilizarse para facilitar la reparación dirigida por homología en células eucariotas con actividad mutagénica mínima. Adicionalmente, su estudio demostró que múltiples secuencias guía pueden codificarse en una sola matriz CRISPR para permitir la edición simultánea de varios sitios loci genómicos endógenos dentro del genoma de mamíferos, lo que demuestra una fácil programabilidad y una amplia aplicabilidad de la tecnología de nucleasa guiada por ARN. Esta capacidad de utilizar ARN para programar la escisión de ADN específica para la secuencia en las células definió una nueva clase de herramientas de modificación del genoma. Estos estudios demostraron, además, que otros loci de CRISPR pueden ser trasplantables a células de mamíferos y también pueden mediar en la escisión del genoma de mamíferos. Es importante destacar que se puede prever que varios aspectos del sistema CRISPR/Cas se pueden mejorar adicionalmente para aumentar su eficiencia y versatilidad.
■ Jiang et a/.utilizaron la endonucleasa Cas9 agrupada, regularmente espaciada, asociada a repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) complejada con ARN duales para introducir mutaciones precisas en los genomas de Streptococcus pneumoniae y Escherichia coli. El enfoque se basó en la escisión dirigida por el ARN dual:Cas9 en el sitio genómico fijado como objetivo para matar las células no mutadas y evitar la necesidad de marcadores seleccionables o sistemas de contra-selección. El estudio informó la reprogramación de la especificidad de ARN dual:Cas9 al cambiar la secuencia de ARN CRISPR corto (ARNcr) para realizar cambios de uno o varios nucleótidos en moldes de edición. El estudio demostró que el uso simultáneo de dos ARNcr permitió la mutagénesis múltiple. Además, cuando el enfoque se utilizó en combinación con la recombinación, en S.pneumoniae, casi el 100% de las células que se recuperaron utilizando el enfoque descrito contenían la mutación deseada, y en E.coli, el 65% que se recuperó contenía la mutación.
■ Konermann et al. abordaron la necesidad en la técnica de tecnologías versátiles y robustas que permitan la modulación óptica y química de dominios de unión a ADN basados en la enzima CRISPR Cas9 y también Efectores tipo Activador Transcripcional.
■ Como se discutió en la presente memoria descriptiva, la nucleasa Cas9 del sistema microbiano CRISPR-Cas fija como objetivo loci genómicos específicos mediante una secuencia guía de 20 nt, que puede tolerar determinados emparejamientos erróneos con la diana de ADN y, con ello, fomentar la mutagénesis no deseada fuera de diana. Para abordar esto, Ran et a/.describieron un enfoque que combinaba un mutante de nickasa Cas9 con ARN guía emparejado para introducir roturas de doble cadena fijadas como objetivo. Debido a que las mellas individuales en el genoma se reparan con alta fidelidad, se requiere el mellado simultáneo via ARN guía apropiadamente desplazado para roturas de doble cadena y se extiende el número de bases específicamente reconocidas para la escisión diana. Los autores demostraron que el uso de muescas emparejadas puede reducir la actividad fuera de diana entre 50 y 1.500 veces en las líneas celulares y facilitar la inactivación de genes en los cigotos de ratón sin sacrificar la eficiencia de escisión en la diana. Esta estrategia versátil permite una amplia diversidad de aplicaciones de edición del genoma que requieren una alta especificidad.
■ Hsu et al. caracterizaron la especificidad de fijación como objetivo de SpCas9 en células humanas para informar la selección de sitios diana y evitar efectos fuera de diana. El estudio evaluó > 700 variantes de ARN guía y niveles de mutación de indeles inducida por SpCas9 a > 100 loci genómicos fuera de diana predichos en células 293t y 293FT. Los autores afirman que SpCas9 tolera emparejamientos erróneos entre el ARN guía y el ADN diana en diferentes posiciones de una manera dependiente de la secuencia, sensible al número, la posición y la distribución de emparejamientos erróneos. Los autores demostraron, además, que la escisión mediada por SpCas9 no se ve afectada por la metilación del ADN y que la dosis de SpCas9 y ARNgs se puede ajustar para minimizar la modificación fuera de diana. Adicionalmente, para facilitar las aplicaciones de modificación del genoma de mamíferos, los autores informaron que proporcionaron una herramienta de software basada en la web para guiar la selección y validación de secuencias diana, así como análisis fuera de diana.
■ Ran et a/.describieron un conjunto de herramientas para la edición del genoma mediada por Cas9 via la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR) en células de mamíferos, así como la generación de líneas celulares modificadas para estudios funcionales posteriores. Para minimizar la escisión fuera de diana, los autores describieron, además, una estrategia de doble muesca utilizando el mutante de la nickasa Cas9 con ARN guía emparejado. El protocolo proporcionado por los autores derivó de manera experimental pautas para la selección de sitios diana, la evaluación de la eficiencia de escisión y el análisis de la actividad fuera de diana. Los estudios demostraron que comenzando con el diseño diana, las modificaciones genéticas se pueden lograr en tan solo 1-2 semanas, y las líneas celulares clonales modificadas se pueden derivar en el espacio de 2-3 semanas.
■ Shalem et a/.describieron una nueva forma de interrogar la función del gen a escala de todo el genoma. Sus estudios demostraron que el suministro de una genoteca inactivada CRISPR-Cas9 (GeCKO) a escala del genoma fijó como objetivo a 18.080 genes con 64.751 secuencias guía únicas que permitieron el rastreo de selección tanto negativa como positiva en células humanas. Primero, los autores mostraron el uso de la genoteca de GeCKO para identificar genes esenciales para la viabilidad celular en el cáncer y las células madre pluripotentes. Luego, en un modelo de melanoma, los autores rastrearon los genes cuya pérdida está implicada en la resistencia a vemurafenib, un agente terapéutico que inhibe la proteína quinasa BRAF mutante. Sus estudios demostraron que los candidatos de más alto rango incluían genes NF1 y MED12 previamente validados, así como nuevos aciertos NF2, CUL3, TADA2B y TADA1. Los autores observaron un alto nivel de consistencia entre los ARN guía independientes que fijan como objetivo al mismo gen y una alta tasa de confirmación de aciertos, y así demostraron la promesa del rastreo a escala del genoma con Cas9.
■ Nishimasu et a/.informaron sobre la estructura cristalina de Cas9 de Streptococcus pyogenes en complejo con ARNgs y su ADN diana a una resolución de 2,5 A°. La estructura reveló una arquitectura bilobulada compuesta de lóbulos de reconocimiento de dianas y nucleasas, que acomoda el heterodúplex ARNgs: ADN en un surco cargado positivamente en su interfaz. Si bien el lóbulo de reconocimiento es esencial para unir ARNgs y ADN, el lóbulo de nucleasa contiene los dominios de nucleasa HNH y RuvC, que están colocados adecuadamente para la escisión de las cadenas complementarias y no complementarias del ADN diana, respectivamente. El lóbulo de la nucleasa también contiene un dominio carboxilo terminal responsable de la interacción con el motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Esta estructura de alta resolución y los análisis funcionales que lo acompañan han revelado el mecanismo molecular de la fijación como objetivo del ADN guiado por ARN por Cas9, allanando así el camino para el diseño racional de nuevas y versátiles tecnologías de edición del genoma.
■ Wu et a/.mapearon sitios de unión de todo el genoma de un Cas9 catalíticamente inactivo (dCas9) de Streptococcus pyogenes cargado con ARN de guía única (ARNgs) en células madre embrionarias de ratón (mESC). Los autores demostraron que cada uno de los cuatro ARNgs testados fija como objetivo dCas9 entre diez y miles de sitios genómicos, frecuentemente caracterizados por una región de siembra de 5 nucleótidos en el ARNgs y un motivo NGG adyacente al protoespaciador (PAM). La inaccesibilidad de la cromatina disminuye la unión de dCas9 a otros sitios con secuencias de siembra coincidentes; así, el 70% de los sitios fuera de diana están asociados con genes. Los autores demostraron que la secuenciación fijada como objetivo de 295 sitios de unión a dCas9 en mESC transfectadas con Cas9 catalíticamente activo identificó solo un sitio mutado por encima de los niveles de fondo. Los autores propusieron un modelo de dos estados para la unión y escisión de Cas9, en el que una coincidencia de siembra desencadena la unión, pero se requiere un emparejamiento extenso con el ADN diana para la escisión.
■ Hsu 2014 es un artículo de revisión que comenta en general la historia de CRISPR-Cas9 desde el yogur hasta la edición del genoma, incluida la detección genética de células, que se encuentra en la información, los datos y los hallazgos de las aplicaciones en el linaje de esta memoria descriptiva presentada antes del 5 de junio, 2014. Las enseñanzas generales de Hsu 2014 no implican modelos específicos, animales de la presente memoria descriptiva.
La invención se refiere a la modificación y la optimización de sistemas, métodos y composiciones utilizados para el control de la expresión génica que implica la fijación como objetivo de secuencias, tales como la perturbación del genoma o la edición génica, que se relacionan con el sistema CRISPR-Cas y sus componentes. En realizaciones ventajosas, la enzima Cas es Cas9.
Una ventaja de los métodos actuales es que el sistema CRISPR evita la unión fuera de diana y sus efectos secundarios resultantes. Esto se logra utilizando sistemas dispuestos para tener un alto grado de especificidad para la secuencia para el ADN diana.
La optimización de Cas9 se puede utilizar para potenciar la función o para desarrollar nuevas funciones, se pueden generar proteínas quiméricas de Cas9. Ejemplos que las solicitantes han generado se proporcionan en el Ejemplo 6. Proteínas Cas9 quiméricas se pueden hacer combinando fragmentos de diferentes homólogos de Cas9. Por ejemplo, dos ejemplos de proteínas Cas9 quiméricas de las Cas9 descritas en esta memoria. Por ejemplo, las solicitantes fusionaron el extremo N de StlCas9 (el fragmento de esta proteína está en negrita) con el extremo C de SpCas9. El beneficio de hacer Cas9 quiméricas incluye cualquiera o todos de:
toxicidad reducida;
expresión mejorada en células eucariotas;
especificidad potenciada;
peso molecular reducido de la proteína, hace que la proteína sea más pequeña al combinar los dominios más pequeños de diferentes homólogos de Cas9; y/o
alterando el requisito de secuencia PAM.
La Cas9 puede utilizarse como una proteína genérica de unión al ADN. Por ejemplo, y como se muestra en el Ejemplo 7, las solicitantes utilizaron Cas9 como una proteína genérica de unión al ADN mediante la mutación de los dos dominios catalíticos (D10 y H840) responsables de escindir las dos cadenas de la diana de ADN. Con el fin de regular al alza la transcripción génica en un lugar diana, las solicitantes fusionaron el dominio de activación transcripcional (VP64) a Cas9. Se conocen otros dominios de activación transcripcional. Tal como se muestra en el Ejemplo 11, es posible la activación transcripcional. Tal como también se muestra en el Ejemplo 11, la represión génica (en este caso del gen beta-catenina) es posible utilizando un represor Cas9 (dominio de unión al ADN) que se une a la secuencia del gen diana, reprimiendo así su actividad.
También se proporcionan animales transgénicos. Ejemplos preferidos incluyen animales que comprenden Cas9, en términos de polinucleótidos que codifican Cas9 o la propia proteína. Se prefieren ratones, ratas y conejos. Para generar ratones transgénicos con las construcciones, tal como se ejemplifica en esta memoria, se puede inyectar ADN lineal puro en el pronúcleo de un cigoto de una hembra pseudo gestante, p.ej., una hembra CB56. Los fundadores pueden entonces ser identificados, genotipados y retrocruzados con ratones CB57. Las construcciones se pueden entonces clonar y verificar opcionalmente, por ejemplo, mediante secuenciación de Sanger. Se prevén inactivaciones en las que, por ejemplo, uno o más genes se inactivan en un modelo. Sin embargo, también se prevén activaciones (solas o en combinación). Se generó un ejemplo de ratón de activación Cas9 y esto se ejemplifica, pero se prefieren activaciones Cas9. Para generar ratones con activaciones Cas9, se puede fijar como objetivo a las mismas construcciones constitutivas y condicionales al locus Rosa26, tal como se describe en esta memoria (Figuras 7A-B y 8).
Utilidad del ratón Cas9 condicional: las solicitantes han demostrado en células 293 que la construcción de expresión condicional de Cas9 se puede activar mediante la co-expresión con Cre. Las solicitantes también demuestran que las mESC R1 correctamente fijadas como objetivo pueden tener Cas9 activo cuando se expresa Cre. Debido a que Cas9 es seguido por la secuencia de escisión del péptido P2A y luego EGFP, las solicitantes identifican con éxito la expresión observando EGFP. Las solicitantes han demostrado la activación de Cas9 en mESC. Este mismo concepto es lo que hace que el ratón Cas9 condicional sea tan útil. Las solicitantes pueden cruzar su ratón Cas9 condicional con un ratón que exprese ubicuamente Cre (línea ACTB-Cre) y pueden llegar a un ratón que exprese Cas9 en cada una de las células. Solo debería tomar solo el suministro de ARN quimérico para inducir la edición del genoma en ratones embrionarios o adultos. Curiosamente, si el ratón condicional Cas9 se cruza con un ratón que expresa Cre bajo un promotor específico para el tejido, solo debería haber Cas9 en los tejidos que también expresan Cre. Este enfoque puede utilizarse para editar el genoma solo en tejidos precisos mediante el suministro de ARN quimérico al mismo tejido.
Tal como se mencionó anteriormente, también se proporcionan animales transgénicos, al igual que plantas transgénicas, especialmente cultivos y algas. El transgénico puede ser útil en aplicaciones fuera de proporcionar un modelo de enfermedad. Estos pueden incluir alimentos para la producción de alimentos a través de la expresión de, por ejemplo, niveles más altos de proteínas, hidratos de carbono, nutrientes o vitaminas que los que normalmente se verían en el tipo salvaje. A este respecto, se prefieren plantas transgénicas, especialmente legumbres y tubérculos, y animales, especialmente mamíferos tales como ganado (vacas, ovejas, cabras y cerdos), pero también aves e insectos comestibles.
Las algas transgénicas u otras plantas, tales como la colza, pueden ser particularmente útiles en la producción de aceites vegetales o biocombustibles, tales como los alcoholes (especialmente metanol y etanol), por ejemplo. Estos pueden ser diseñados para expresar o sobre-expresar altos niveles de aceite o alcoholes para su uso en las industrias del petróleo o de los biocombustibles.
En términos de suministro in vivo, el AAV es ventajoso frente a otros vectores virales por un par de razones:
° Baja toxicidad (esto puede deberse a que el método de purificación no requiere ultracentrifugación de partículas celulares que pueden activar la respuesta inmune)
° Baja probabilidad de provocar mutagénesis insercional porque no se integra en el genoma del huésped.
El AAV tiene un límite de empaquetamiento de 4,5 o 4,75 Kb. Esto significa que Cas9, así como un promotor y un terminador de la transcripción tienen todos que encajar en el mismo vector viral. Las construcciones de más de 4,5 o 4,75 Kb conducirán a una producción de virus significativamente reducida. SpCas9 es bastante grande, el gen en sí mismo tiene más de 4,1 Kb, lo que dificulta su empaquetamiento en el AAV. Por lo tanto, realizaciones de la invención incluyen la utilización de homólogos de Cas9 que son más cortos. Por ejemplo:
Figure imgf000025_0001
Estas especies son, por lo tanto, en general, especies Cas9 preferidas. Las solicitantes han mostrado el suministro y los datos de expresión de Cas9 de cerebro de ratón in vivo.
Se prefieren dos formas de empaquetar moléculas de ácido nucleico que codifican Cas9, p.ej., ADN, en vectores virales para mediar en la modificación del genoma in vivo:
Para lograr la inactivación de genes mediada por NHEJ:
Vector de virus único:
Vector que contiene dos o más casetes de expresión:
Promotor-Cas9 que codifica la molécula de ácido nucleico -terminador
Promotor-ARNg1-terminador
Promotor-ARNg2-terminador
Promotor-ARNg (N)-terminator (hasta el límite de tamaño del vector)
Vector de virus doble:
Vector 1 que contiene un casete de expresión para impulsar la expresión de Cas9
Promotor-Cas9 que codifica molécula de ácido nucleico -terminador
Vector 2 que contiene uno o más casetes de expresión para impulsar la expresión de uno o más ARN guía Promotor-ARNg1-terminador
Promotor-ARNg (N) -terminator (hasta el límite de tamaño del vector)
Para mediar en la reparación dirigida por homología. Además de los enfoques de vector de virus simple y doble arriba descritos, se utiliza un vector adicional para suministrar un molde de reparación directa de homología.
El promotor utilizado para impulsar la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica Cas9 puede incluir: El AAV ITR puede servir como un promotor: esto es ventajoso para eliminar la necesidad de un elemento promotor adicional (que puede ocupar espacio en el vector). El espacio adicional liberado se puede utilizar para impulsar la expresión de elementos adicionales (ARNg, etc.). Además, la actividad ITR es relativamente más débil, por lo que puede utilizarse para reducir la toxicidad debido a la sobreexpresión de Cas9.
Para la expresión ubicua, puede utilizar promotores: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadenas pesadas o ligeras de ferritina, etc.
Para la expresión en el cerebro, puede utilizar promotores: Sinapsina I para todas las neuronas, CaMKIIalfa para neuronas excitadoras, GAD67 o GAD65 o VGAT para neuronas GABAérgicas, etc.
Para la expresión en el hígado, puede utilizar promotor de Albúmina
Para la expresión pulmonar, puede utilizar SP-B
Para las células endoteliales, puede utilizar ICAM
Para las células hematopoyéticas, puede utilizar IFNbeta o CD45
Para los osteoblastos puede utilizar OG-2
El promotor utilizado para impulsar el ARN guía puede incluir:
Promotores Pol III, tales como U6 o H1
Uso del promotor Pol II y casetes intrónicos para expresar ARNg
En cuanto al AAV, el AAV puede ser AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos. Se puede seleccionar el AAV del AAV con respecto a las células que han de ser fijadas como objetivo; p.ej., uno puede seleccionar los serotipos 1, 2, 5 de AAV o una cápside híbrida AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos para fijar como objetivo células del cerebro o neuronales; y se puede seleccionar AAV4 para fijar como objetivo al tejido cardíaco. AAV8 es útil para el suministro al hígado. Los promotores y vectores anteriores se prefieren individualmente.
El suministro de ARN también es un método útil de suministro in vivo. La Figura 9 muestra el suministro y los datos de expresión de Cas9 en cerebro de ratón in vivo. Es posible administrar Cas9 y ARNg (y, por ejemplo, molde de reparación de HR) en las células utilizando liposomas o nanopartículas. Por lo tanto, el suministro de la enzima CRISPR, tal como una Cas9 y/o el suministro de los ARN de la presente divulgación puede estar en forma de ARN y a través de microvesículas, liposomas o nanopartículas. Por ejemplo, ARNm y ARNg de Cas9 se pueden empaquetar en partículas liposomales para el suministro in vivo. Reactivos de transfección liposomal, tales como Invivofectamine de Life Technologies y otros reactivos en el mercado, pueden suministrar moléculas de ARN al hígado de manera efectiva.
Potenciar la eficiencia de NHEJ o HR también es útil para el suministro. Se prefiere que la eficiencia de NHEJ se potencie co-expresando enzimas de procesamiento final tales como Trex2 (Dumitrache et al. Genetics. Agosto de 2011; 188(4): 787-797). Se prefiere que la eficiencia de la HR aumente inhibiendo transitoriamente las maquinarias de NHEJ tales como Ku70 y Ku86. La eficiencia de HR también puede aumentarse co-expresando enzimas de recombinación homólogas procariotas o eucariotas, tales como RecBCD, RecA.
Diversos medios de suministro se describen en esta memoria, y se discuten adicionalmente en esta sección.
Suministro viral: la enzima CRISPR, por ejemplo, una Cas9, y/o cualquiera de los presentes ARN, por ejemplo, un ARN guía, puede suministrarse utilizando virus adeno-asociados (AAV), lentivirus, adenovirus u otros tipos de vectores virales, o combinaciones de los mismos. Cas9 y uno o más ARN guía se pueden empaquetar en uno o más vectores virales. En algunas realizaciones, el vector viral se suministra al tejido de interés, por ejemplo, mediante una inyección intramuscular, mientras que otras veces el suministro viral se realiza por vía intravenosa, transdérmica, intranasal, oral, mucosa u otros métodos de suministro. Un suministro de este tipo puede ser a través de una dosis única o dosis múltiples. Un experto en la materia entiende que la dosis real a administrar en esta memoria puede variar mucho dependiendo de una diversidad de factores, tales como el vector elegido, la célula, el organismo o el tejido diana, el estado general del sujeto a tratar, el grado de transformación/modificación buscado, la ruta de administración, el modo de administración, el tipo de transformación/modificación buscado, etc.
Una dosis de este tipo puede contener además, por ejemplo, un portador (agua, solución salina, etanol, glicerol, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, etc.), un diluyente, un portador farmacéuticamente aceptable (p.ej., solución salina tamponada con fosfato), un excipiente farmacéuticamente aceptable y/u otros compuestos conocidos en la técnica. Una formulación de dosificación de este tipo es fácilmente comprobable por un experto en la técnica. La dosificación puede contener, además, una o más sales farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, una sal de ácido mineral tal como un hidrocloruro, un hidrobromuro, un fosfato, un sulfato, etc.; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, etc.Adicionalmente, también pueden estar presentes en esta memoria sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH, geles o materiales gelificantes, saborizantes, colorantes, microesferas, polímeros, agentes de suspensión, etc. Además, uno o más de otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes, humectantes, agentes de suspensión, tensioactivos, antioxidantes, agentes antiaglomerantes, cargas, agentes quelantes, agentes de recubrimiento, estabilizadores químicos, etc. también pueden estar presentes, especialmente si la forma de dosificación es una forma reconstituible. Ingredientes ilustrativos adecuados incluyen celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, polisorbato 80, alcohol feniletilico, clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etil vanilina, glicerol, fenol, paraclorofenol, gelatina, albúmina y una combinación de los mismos. Una discusión exhaustiva de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
En una realización de esta memoria, el suministro se realiza a través de un adenovirus, que puede estar en una sola dosis de refuerzo que contiene al menos 1 x 105 partículas (a las que también se alude como unidades de partículas, up) de vector adenoviral. En una realización de esta memoria, la dosis es preferiblemente de al menos aproximadamente 1 x 106 partículas (por ejemplo, aproximadamente 1 x 106-1 x 1012 partículas), más preferiblemente al menos aproximadamente 1 x 107 partículas, más preferiblemente al menos aproximadamente 1 x 108 partículas (p.ej., aproximadamente 1 x 108-1 x 1011 partículas o aproximadamente 1 x 108-1 x 1012 partículas), y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 1 x 100 partículas (p.ej., aproximadamente 1 x 109-1 x 1010 partículas o aproximadamente 1 x 109-1 x 1012 partículas), o incluso al menos aproximadamente 1 x 1010 partículas (p.ej., aproximadamente 1 x 1010-1 x 1012 partículas) del vector adenoviral. Alternativamente, la dosis comprende no más de aproximadamente 1 x 1014 partículas, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 1013 partículas, incluso más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 1012 partículas, incluso más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 1011 partículas, y lo más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 1010 partículas (p.ej., no más de aproximadamente 1 x 109 partículas). Por lo tanto, la dosis puede contener una dosis única de vector adenoviral con, por ejemplo, aproximadamente 1 x 106 unidades de partículas (up), aproximadamente 2 x 106 up, aproximadamente 4 x 106 up, aproximadamente 1 x 107 up, aproximadamente 2 x 107 up, aproximadamente 4 x 107 up, aproximadamente 1 x 108 up, aproximadamente 2 x 108 up, aproximadamente 4 x 108 up, aproximadamente 1 x 109 up, aproximadamente 2 x 109 up, aproximadamente 4 x 109 up, aproximadamente 1 x 1010 up, aproximadamente 2 x 1010 up, aproximadamente 4 x 1010 up, aproximadamente 1 x 1011 up, aproximadamente 2 x 1011 up, aproximadamente 4 x 1011 up, aproximadamente 1 x 1012 up, aproximadamente 2 x 1012 up o aproximadamente 4 x 1012 up de vector adenoviral. Véanse, por ejemplo, los vectores adenovirales en la Patente de EE.UU.N28.454.972 B2 expedida a Nabel, et.al., concedida el 4 de junio de 2013; y las dosificaciones en la col.29, líneas 36-58 de la misma. En una realización de esta memoria, el adenovirus se administra a través de múltiples dosis.
En una realización de esta memoria, el suministro es a través de un AAV. Se cree que una dosis terapéuticamente efectiva para el suministro in vivo del AAV a un ser humano está en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml de solución salina que contiene de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1010 AAV funcional/ml de solución. La dosis puede ajustarse para equilibrar el beneficio terapéutico frente a cualquier efecto secundario. En una realización en esta memoria, la dosis de AAV está generalmente en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 1 x 105 a 1 x 1050 genomas de AAV, de aproximadamente 1 x 108 a 1 x 1020 genomas de AAV, de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1016genomas, o aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 1 x 1016 genomas de AAV. Una dosis humana puede ser de aproximadamente 1 x 1013 genomas de AAV. Concentraciones de este tipo pueden administrarse de aproximadamente 0,001 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50 ml, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 ml de una solución portadora. Un experto ordinario en la técnica puede establecer fácilmente otras dosis efectivas mediante ensayos de rutina que establecen curvas de respuesta a la dosis. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU.N2 8.404.658 B2 expedida a Haijar, et.al., concedida el 26 de marzo de 2013 en la col.27, líneas 45-60.
En una realización de esta memoria, el suministro es a través de un plásmido. En composiciones de plásmidos de este tipo, la dosificación debe ser una cantidad suficiente de plásmido para provocar una respuesta. Por ejemplo, cantidades adecuadas de ADN plasmídico en composiciones plasmídicas pueden ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 mg o de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 10 pg.
Las dosis en esta memoria se basan en un individuo medio de 70 kg. La frecuencia de administración está dentro del ámbito del practicante médico o veterinario (p.ej., médico, veterinario) o científico experto en la técnica. Un ratón utilizado en experimentos se considera típicamente de 20 g, y un experto en la técnica puede extrapolar dosis de un ratón de 20 g a un individuo de 70 kg.
Cas9 y uno o más ARN guía pueden suministrarse utilizando virus adeno-asociados (AAV), lentivirus, adenovirus u otros tipos de plásmidos o vectores virales, utilizando formulaciones y dosis de, por ejemplo, las patentes de EE.UU.N2s.8.454.972 (formulaciones, dosis para adenovirus) , 8.404.658 (formulaciones, dosis para AAV) y 5.846.946 (formulaciones, dosis para plásmidos de ADN) y de ensayos clínicos y publicaciones sobre ensayos clínicos que implican lentivirus, AAV y adenovirus. Por ejemplo, para AAV, la vía de administración, la formulación y la dosis pueden ser como en la Patente de EE.UU.N28.454.972 y como en ensayos clínicos que implican AAV. Para adenovirus, la vía de administración, la formulación y la dosis pueden ser como en la Patente de EE.UU.N28.404.658 y como en ensayos clínicos que implican adenovirus. Para el suministro de plásmidos, la vía de administración, la formulación y la dosis pueden ser como en la Patente de EE.UU.N25.846.946 y como en ensayos clínicos que implican plásmidos. Las dosis pueden basarse o extrapolarse a un individuo medio de 70 kg, y pueden ajustarse para pacientes, sujetos, mamíferos de diferentes pesos y especies. La frecuencia de administración está dentro del ámbito del practicante médico o veterinario (p.ej., médico, veterinario), dependiendo de factores habituales, que incluyen la edad, el sexo, el estado general de salud, otros estados del paciente o sujeto y el estado particular o síntomas que se abordan.
Los vectores virales pueden inyectarse en el tejido de interés. Para la modificación del genoma específico del tipo celular, la expresión de Cas9 puede ser impulsada por un promotor específico del tipo celular. Por ejemplo, la expresión específica del hígado podría utilizar el promotor de Albúmina y la expresión específica para la neurona podría utilizar el promotor de Sinapsina I.
Suministro de ARN: La enzima CRISPR, por ejemplo, una Cas9, y/o cualquiera de los presentes ARN, por ejemplo, un ARN guía, también puede suministrarse en forma de ARN. El ARNm de Cas9 se puede generar utilizando la transcripción in vitro. Por ejemplo, el ARNm de Cas9 se puede sintetizar utilizando un casete de PCR que contiene los siguientes elementos: secuencia T7_promotor-kozak (GCCACC) -Cas9-3‘ UTR de la cola beta globina-poliA (una cadena de 120 o más adeninas). El casete se puede utilizar para la transcripción por la polimerasa T7. Los ARN guía también se pueden transcribir utilizando la transcripción in vitro de un casete que contiene la secuencia de ARN guía T7_promotor-GG-
Para potenciar la expresión y reducir la toxicidad, la enzima CRISPR y/o el ARN guía pueden modificarse utilizando pseudo-U o 5-metil-C.
El ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía pueden suministrarse simultáneamente utilizando nanopartículas o envolturas lipídicas.
Por ejemplo, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ ("In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 6 jun 2011;8(3):774-87.doi: 10.1021/mpl00390w. Epub 1 de abril de 2011) describe nanopartículas estructuradas de núcleo-cubierta biodegradables con un núcleo de poli(p-amino éster) (PBAE) envuelto por una cubierta de bicapa de fosfolípidos. Estos fueron desarrollados para el suministro in vivo de ARNm. El componente PBAE sensible al pH se eligió para fomentar la interrupción del endosoma, mientras que la capa de la superficie lipídica se seleccionó para minimizar la toxicidad del núcleo de policatión. Por lo tanto, estos son preferidos para suministrar ARN de la presente divulgación.
Además, Michael S D Kormann et al.("Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volumen:29, Páginas: 154-157 (2011) Publicado en línea el 09 de enero de 2011) describe el uso de envolturas lipídicas para suministrar ARN. El uso de envolturas lipídicas también se prefiere en la presente divulgación.
Métodos de suministro de ARNm son especialmente prometedores para el suministro al hígado actualmente.
El ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía también pueden suministrarse por separado. El ARNm de la enzima CRISPR puede administrarse antes del ARN guía para dar tiempo a que se exprese la enzima CRISPR. El ARNm de la enzima CRISPR puede administrarse 1-12 horas (preferiblemente alrededor de 2-6 horas) antes de la administración del ARN guía.
Alternativamente, el ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía se pueden administrar juntos. Ventajosamente, una segunda dosis de refuerzo de ARN guía puede administrarse 1-12 horas (preferiblemente alrededor de 2-6 horas) después de la administración inicial del ARNm de la enzima CRISPR ARN guía.
Administraciones adicionales de ARNm de la enzima CRISPR y/o ARN guía podrían ser útiles para lograr los niveles más eficientes de modificación del genoma.
Para minimizar la toxicidad y el efecto fuera de diana, será importante controlar la concentración del ARNm de la enzima CRISPR y el ARN guía suministrado. Concentraciones óptimas de ARNm de la enzima CRISPR y ARN guía se pueden determinar testando diferentes concentraciones en un modelo celular o animal y utilizando una secuenciación profunda para analizar el grado de modificación en potenciales loci genómicos fuera de diana Por ejemplo, para la secuencia guía que fija como objetivo 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’ en el gen EMX1 del genoma humano, la secuenciación profunda se puede utilizar para evaluar el nivel de modificación en los siguientes dos loci fuera de diana, 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' y 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'. La concentración que proporciona el nivel más alto de modificación en diana al tiempo que se minimiza o con una reducción en la probabilidad del nivel de modificación fuera de diana se debe elegir para el suministro in vivo.
Alternativamente, para minimizar el nivel de toxicidad y el efecto fuera de diana, el ARNm de la enzima CRISPR nickasa (por ejemplo, Cas9 de S.pyogenes con la mutación D10A) puede suministrarse con un par de ARN guía que fijan como objetivo un sitio de interés. Los dos ARN guía necesitan estar espaciados de la siguiente manera. Secuencias de guía en rojo (subrayado simple) y azul (subrayado doble) respectivamente (estos ejemplos se basan en el requisito de PAM para Cas9 de Streptococcus pyogenes.
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(continuación)
Figure imgf000030_0001
interrogatorios adicionales del sistema han dado a las solicitantes evidencia del colgante 5’ (véase, p.ej., Ran et al., Cell.12 sep.2013; 154 (6): 1380-9). Las solicitantes han identificado además parámetros que se relacionan con la escisión eficiente por el mutante de la nickasa Cas9 cuando se combina con dos ARN guía y estos parámetros incluyen, pero no se limitan a, la longitud del colgante 5'. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ tiene a lo sumo 200 pares de bases, preferiblemente a lo sumo 100 pares de bases, o más preferiblemente a lo sumo 50 pares de bases. En realizaciones de la invención, el colgante 5’ es al menos de 26 pares de bases, preferiblemente al menos de 30 pares de bases, o más preferiblemente al menos de 34-50 pares de bases o de 1 -34 pares de bases. En otros métodos preferidos de la invención, la primera secuencia guía que dirige la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía que dirige la escisión de otra cadena cerca de la segunda secuencia diana resulta en un corte romo o un colgante 3'. En realizaciones de la invención, el colgante 3’ tiene a lo sumo de 150, 100 o 25 pares de bases, o al menos de 15, 10 o 1 pares de base. En realizaciones preferidas, el colgante 3’ es de 1 -100 pares de bases.
Aspectos de la invención se refieren a la disminución de la expresión del producto génico o la introducción adicional de un polinucleótido molde en la molécula de ADN que codifica el producto génico o la eliminación de una secuencia intermedia precisamente al permitir que los dos colgantes 5’ se vuelvan a asociar y se unan o se altere la actividad o la función del producto génico o se incremente la expresión del producto génico. En una realización de la invención, el producto génico es una proteína.
Solo los pares de ARNgs que crean colgantes 5’ con un solapamiento de menos de 8 pb entre las secuencias de guía (desplazamiento mayor que -8 pb) eran capaces de mediar en la formación detectable del indel. De manera importante, cada una de las guías utilizada en estos ensayos es capaz de inducir eficientemente indeles cuando se empareja con Cas9 de tipo salvaje, lo que indica que las posiciones relativas de los pares de guía son los parámetros más importantes para predecir la actividad de doble muesca.
Dado que Cas9n y Cas9H840A mellan cadenas opuestas de ADN, la sustitución de Cas9n con Cas9H840A con un par de ARNgs dados debería dar como resultado la inversión del tipo de colgante. Por ejemplo, un par de ARNgs que generarán un colgante 5’ con Cas9n debería generar, en principio, el colgante 3' correspondiente. Por lo tanto, pares de ARNgs que conducen a la generación de un colgante 3’ con Cas9n podrían utilizarse con Cas9H840A para generar un colgante 5'. inesperadamente, las solicitantes testaron Cas9H840A con un conjunto de pares de ARNgs diseñados para generar colgantes tanto 5’ como 3' (intervalo de compensación de -278 a 58 pb), pero fueron incapaces de observar la formación de indeles. Es posible que se necesite más trabajo para identificar las reglas de diseño necesarias para el emparejamiento de ARNgs para permitir la doble muesca por parte de Cas9H840A.
Opciones de administración adicionales para el cerebro incluyen la encapsulación de la enzima CRISPR y el ARN guía en forma de ADN o ARN en liposomas y la conjugación con caballos de Troya moleculares para el suministro de la barrera trans-hematoencefálica (BBB). Se ha demostrado que los caballos de Troya moleculares son efectivos para suministrar vectores de expresión B-gal en el cerebro de primates no humanos. Se puede utilizar este mismo enfoque para suministrar vectores que contienen enzimas CRISPR y ARN guía. Por ejemplo, Xia CF y Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology." Mol Pharm. mayo-junio de 2009;6(3):747-51.doi: 10.1021/Mp800194) describe cómo el suministro de ARN interferente corto (ARNic) a células en cultivo, e in vivo, es posible con el uso combinado de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para el receptor y la tecnología de avidina-biotina. Los autores también informan que debido a que el enlace entre el mAb diana y el ARNic es estable con la tecnología avidina-biotina, y los efectos de ARNi en sitios distantes tales como el cerebro se observan in vivo después de una administración intravenosa del ARNic fijado como objetivo.
Zhang Y, Schlachetzki F, Pardridge WM. ("Global non-viral gene transfer to the primate brain following intravenous administration." Mol Ther. 7 de enero de 2003;7(1):11-8.) describen cómo se encapsularon plásmidos de expresión que codifican informadores tales como la luciferasa en el interior de un "virus artificial"compuesto por un inmunoliposoma pegilado de 85 nm, que fue fijado como objetivo al cerebro del mono rhesus in vivo con un anticuerpo monoclonal (MAb) para el receptor de insulina humana (HIR). El MAb HIR permite que el liposoma que porta el gen exógeno experimente transcitosis a través de la barrera hematoencefálica y endocitosis a través de la membrana plasmática neuronal después de inyección intravenosa. El nivel de expresión del gen de la luciferasa en el cerebro fue 50 veces mayor en el mono rhesus en comparación con la rata. La expresión neuronal generalizada del gen betagalactosidasa en el cerebro de primates se demostró tanto por histoquímica como por microscopía confocal. Los autores indican que este enfoque hace factibles los transgénicos reversibles para adultos en 24 horas. Por consiguiente, se prefiere el uso de inmunoliposoma. Estos pueden utilizarse junto con anticuerpos para fijar como objetivo tejidos específicos o proteínas de la superficie celular.
También se prefieren otros medios de suministro o ARN, tales como a través de nanopartículas (Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R y Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112-3118, 2010) o exosomas (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R.y Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21,2010, PMID: 20059641). De hecho, se ha demostrado que los exosomas son particularmente útiles en el suministro de ARNic, un sistema con algunos paralelos al sistema CRISPR. Por ejemplo, El-Andaloussi S, et al.("Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo." Nat Protoc. 7 diciembre de 2012(12):2112-26.doi 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 15 de noviembre) describe cómo los exosomas son herramientas prometedoras para el suministro de fármacos a través de diferentes barreras biológicas y puede aprovecharse para el suministro de ARNic in vitro e in vivo. Su enfoque es generar exosomas fijados como objetivo a través de la transfección de un vector de expresión, que comprende una proteína exosómica fusionada con un ligando peptídico. Los exosomas se purifican y luego se caracterizan a partir del sobrenadante celular transfectado, luego el ARNic se carga en los exosomas.
Se prefiere la deleción fijada como objetivo de genes. Ejemplos se ejemplifican en el Ejemplo 12. Se prefieren, por lo tanto, genes implicados en la biosíntesis de colesterol, la biosíntesis de ácidos grasos y otros trastornos metabólicos, genes que codifican proteínas mal plegadas implicadas en enfermedades amiloides y otras enfermedades, oncogenes que conducen a la transformación celular, genes virales latentes, y genes que conducen a trastornos negativos dominantes, entre otros trastornos. Como se ejemplifica aquí, las solicitantes prefieren el suministro de genes de un sistema CRISPR-Cas al tejido del hígado, cerebro, ocular, epitelial, hematopoyético u otro tejido de un sujeto o un paciente que lo necesite, que padece trastornos metabólicos, amiloidosis y enfermedades relacionadas con la agregación de proteínas, transformación celular derivada de mutaciones genéticas y translocaciones, efectos negativos dominantes de mutaciones génicas, infecciones virales latentes y otros síntomas relacionados, utilizando el sistema de suministro viral o de nanopartículas.
Las aplicaciones terapéuticas del sistema CRISPR-Cas incluyen glaucoma, amiloidosis y enfermedad de Huntington. Estos se ejemplifican en el Ejemplo 14 y las características descritas allí se prefieren solas o en combinación.
Como ejemplo, la infección crónica por VIH-1 puede tratarse o prevenirse. Con el fin de lograr esto, se puede generar ARN guía de CRISPR-Cas que fijan como objetivo a la gran mayoría del genoma del VIH-1, teniendo en cuenta al mismo tiempo variantes de la cepa del VIH-1 para una cobertura y efectividad máximas. Se puede lograr el suministro del sistema CRISPR-Cas mediante una infección adenoviral convencional o mediada por lentivirales del sistema inmunitario del huésped. Dependiendo del enfoque, las células inmunes del huésped podrían a) aislarse, transducirse con CRISPR-Cas, seleccionarse y re-introducirse en el huésped o b) transducirse in vivo mediante el suministro sistémico del sistema CRISPR-Cas. El primer enfoque permite la generación de una población inmune resistente, mientras que el segundo tiene más probabilidades de fijar como objetivo a los depósitos virales latentes dentro del huésped. Esto se discute con mayor detalle en la sección de Ejemplos.
También se prevé que la presente divulgación genere una colección de células de genes inactivados. Cada una de las células puede tener un solo gen inactivado. Esto se ejemplifica en el Ejemplo 17.
Se puede hacer una colección de células ES, en donde cada una de las células tiene un solo gen inactivado, y toda la colección de células ES tendrá cada uno de los genes inactivados. Esta colección es útil para el rastreo de la función génica en procesos celulares, así como en enfermedades. Para hacer esta colección de células, se puede integrar Cas9 impulsada por un promotor inducible (p.ej., promotor inducible por doxiciclina) en la célula ES. Además, se puede integrar un único ARN guía que fija como objetivo un gen específico en la célula ES. Para hacer la colección de células ES, simplemente se puede mezclar células ES con una genoteca que codifica los ARN guía que fijan como objetivo a cada uno de los genes en el genoma humano. Primero se puede introducir un único sitio BxB1 attB en el locus AAVS1 de la célula ES humana. Luego se puede utilizar la integrasa BxB1 para facilitar la integración de genes de ARN guía individuales en el sitio BxB1 attB en el locus AAVS1. Para facilitar la integración, cada uno de los genes de ARN guía puede estar contenido en un plásmido que porta un único sitio attP. De esta manera, BxB1 recombinará el sitio attB en el genoma con el sitio attP en el plásmido que contiene ARN guía. Para generar la colección de células, se puede tomar la colección de células que tienen ARN guía únicos integrados e inducen la expresión de Cas9. Después de la inducción, Cas9 media en la ruptura de la doble cadena en los sitios especificados por el ARN guía.
La administración crónica de productos terapéuticos proteicos puede provocar respuestas inmunes inaceptables a la proteína específica. La inmunogenicidad de los fármacos proteicos se puede atribuir a unos pocos epítopos de linfocitos T helper (HTL) inmunodominantes. La reducción de la afinidad de unión a MHC de estos epítopos HTL contenidos en estas proteínas puede generar fármacos con una inmunogenicidad más baja (Tangri S, et al.("Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity" J Immunol.15 marzo de 2005;174(6):3187-96.) En la presente divulgación, la inmunogenicidad de la enzima CRISPR en particular puede reducirse siguiendo el enfoque expuesto por primera vez en Tangri et al con respecto a la eritropoyetina y posteriormente desarrollado. Por consiguiente, la evolución dirigida o el diseño racional pueden utilizarse para reducir la inmunogenicidad de la enzima CRISPR (por ejemplo, una Cas9) en la especie huésped (humana u otra especie).
En el Ejemplo 28, las solicitantes utilizaron 3 ARN guía de interés y fueron capaces de visualizar la escisión eficaz del ADN in vivo que se produce solo en un pequeño subconjunto de células. Esencialmente, lo que las solicitantes han demostrado aquí es la escisión fijada como objetivo in vivo. En particular, esto proporciona una prueba de concepto de que también se puede lograr la fijación como objetivo específica en organismos superiores tales como los mamíferos. También destaca el aspecto multiplex, debido a que múltiples secuencias guía (es decir, dianas separadas) pueden utilizarse simultáneamente (en el sentido de co-suministro). En otras palabras, las solicitantes utilizaron un enfoque múltiple, con varias secuencias diferentes fijadas como objetivo al mismo tiempo, pero de forma independiente.
En el Ejemplo 29 se proporciona un ejemplo adecuado de un protocolo para producir AAV, un vector preferido a ser utilizado en la invención.
Los trastornos por repetición de trinucleótidos son afecciones preferidas a tratar. Éstos también se ejemplifican en esta memoria.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método de terapia génica para el tratamiento de un sujeto que tiene una mutación en el gen CFTR y comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una partícula de terapia génica CRISPR-Cas, opcionalmente a través de un portador farmacéutico biocompatible, a las células de un sujeto. Preferiblemente, el ADN diana comprende la mutación deltaF508. En general, se prefiere que la mutación se repare al tipo salvaje. En este caso, la mutación es una deleción de los tres nucleótidos que comprenden el codón para fenilalanina (F) en la posición 508. Por consiguiente, la reparación en este caso requiere la reintroducción en el mutante del codón que falta.
Para implementar esta Estrategia de Reparación Génica, se prefiere que se introduzca un sistema de vector de adenovirus/AAV en la célula huésped, en células o en el paciente. Preferiblemente, el sistema comprende una Cas9 (o nickasa Cas9) y el ARN guía junto con un sistema de vector de adenovirus/AAV que comprende el molde de reparación de homología que contiene el residuo F508. Esto puede introducirse en el sujeto a través de uno de los métodos de suministro discutidos anteriormente. El sistema CRISPR-Cas puede ser guiado por el ARN guía quimérico CFTRdelta 508. Se dirige a un sitio específico del locus genómico CFTR para ser mellado o escindido. Después de la escisión, el molde de reparación se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga, corrigiendo la deleción que da como resultado una fibrosis quística o provoca síntomas relacionados con la fibrosis quística. Esta estrategia para dirigir el suministro y proporcionar la introducción sistémica de sistemas CRISPR con los ARN guía apropiados puede emplearse para fijar como objetivo mutaciones genéticas para editar o manipular de otra manera genes que provocan enfermedades y trastornos metabólicos, hepáticos, renales y proteicos tales como los de la T abla B.
Para un ejemplo de ARN guía quimérico CFTRdelta508, véase el Ejemplo que demuestra la transferencia de genes o el suministro de genes de un sistema CRISPR-Cas en las vías respiratorias del sujeto o un paciente que lo necesite, que padece fibrosis quística o síntomas relacionados con fibrosis quística (CF), utilizando partículas de virus adenoasociados (AAV). En particular, ejemplifican una estrategia de reparación para la mutación delta F508 de Fibrosis Quística. Este tipo de estrategia debería aplicarse en todos los organismos. Con referencia particular a la CF, pacientes adecuados pueden incluir: seres humanos, humanos no primates, caninos, felinos, bovinos, equinos y otros animales domésticos. En este caso, las solicitantes utilizaron un sistema CRISPR-Cas que comprende una enzima Cas9 para fijar como objetivo deltaF508 u otras mutaciones inductoras de CFTR.
Los sujetos tratados en este caso reciben una cantidad farmacéuticamente efectiva de sistema de vector de AAV en aerosol por pulmón administrado endobronquialmente mientras respira espontáneamente. Como tal, se prefiere el suministro en aerosol para el suministro de AAV en general. Se puede utilizar un adenovirus o una partícula de AAV para el suministro. Construcciones de genes adecuadas, cada una operativamente enlazada a una o más secuencias reguladoras, pueden clonarse en el vector de suministro. En este caso, se proporcionan las siguientes construcciones como ejemplos: promotor Cbh o EFla para el promotor Cas9, U6 o H1 para el ARN guía quimérico): una disposición preferida es utilizar una guía quimérica que fija como objetivo CFTRdelta508, un molde de reparación para la mutación deltaF508 y una enzima Cas9 optimizada en codones (las Cas9 preferidas son aquellas con actividad nucleasa o nickasa) con opcionalmente una o más señales o secuencias de localización nuclear (NLS), p.ej., dos (2) NLS. También se prevén construcciones sin NLS.
Con el fin de identificar el sitio diana de Cas9, las solicitantes analizaron el locus genómico CFTR humano e identificaron el sitio diana de Cas9. Preferiblemente, en general y en este caso de CF, el PAM puede contener un motivo NGG o NNAGAAW.
Por consiguiente, en el caso de la CF, el presente método comprende la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende
suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende un sistema de vector viral que comprende uno o más vectores virales que codifican operativamente una composición para su expresión, en donde la composición comprende:
una composición que se produce de forma no natural o modificada, que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende
(a) una secuencia guía capaz de hibridarse con la secuencia diana de CF en una célula de mamífero adecuada,
(b) una secuencia tracr mate, y
(c) una secuencia tracr, y
II. un segundo elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear,
en donde (a), (b) y (c) están dispuestos en una orientación de 5‘ a 3’,
en donde los componentes I y II están ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema,
en donde, cuando se transcribe, la secuencia tracr mate se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia tracr mate que se hibrida con la secuencia tracr. Con respecto a la CF, las secuencias de ADN diana preferidas comprenden la mutación CFTRdelta508. Un PAM preferido se describe anteriormente. Una enzima CRISPR preferida es cualquier Cas (descrito en esta memoria, pero particularmente la descrita en el Ejemplo 16).
Alternativas a la CF incluyen cualquier trastorno genético y ejemplos de estos son bien conocidos. Otro método o uso preferido de la invención es para corregir defectos en los genes EMP2A y EMP2B que se han identificado como asociados con la enfermedad de Lafora.
En algunas realizaciones, una "secuencia guía" puede ser distinta del "ARN guía". Una secuencia guía puede referirse a una secuencia de aprox.20 pb, dentro del ARN guía, que especifica el sitio diana.
En algunas realizaciones, la Cas9 es (o se deriva de) la SpCas9. En estas realizaciones, las mutaciones preferidas están en cualquiera o en todas o en las posiciones 10, 762, 840, 854, 863 y/o 986 de SpCas9 o posiciones correspondientes en otras Cas9 (que pueden determinarse, por ejemplo, mediante herramientas de comparación de secuencias estándar. En particular, se prefiere cualquiera o todas las siguientes mutaciones en SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y/o D986A; así como también se prevé la sustitución conservadora para cualquiera de los aminoácidos de reemplazo. También se prefieren la misma (o sustituciones conservadoras de estos mutaciones) en las posiciones correspondientes en otros Cas9s. Se prefieren particularmente D10 y H840 en SpCas9. Sin embargo, en otras Cas9s, también se prefieren residuos correspondientes a SpCas9 D10 y H840. Estos son ventajosos, ya que proporcionan actividad de nickasa.
Será fácilmente evidente que un huésped de otras enfermedades puede tratarse de manera similar. En esta memoria se proporcionan algunos ejemplos de enfermedades genéticas provocadas por mutaciones, pero se conocen muchas más. La estrategia anterior se puede aplicar a estas enfermedades.
La invención utiliza ácidos nucleicos para unir secuencias de ADN diana. Esto es ventajoso, ya que los ácidos nucleicos son mucho más fáciles y baratos de producir y la especificidad se puede variar de acuerdo con la longitud del tramo donde se busca la homología. No se requiere el posicionamiento 3-D complejo de múltiples dedos, por ejemplo.
Los términos "polinucleótido", "nucleótido", las expresiones "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y el término "oligonucleótido" se utilizan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definido(s) a partir del análisis de enlace, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN interferente corto (ARNic), ARN de horquilla corta (ARNhc), micro-ARN (miARN), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. El término también abarca estructuras de tipo ácido nucleico con cadenas principales sintéticas, véanse, p.ej., los documentos WO 97/03211; WO 96/39154. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si está presente, se pueden impartir modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos.
Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización tal como mediante conjugación con un componente marcador.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "tipo salvaje" es una expresión de la técnica entendido por personas expertas y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica tal como se produce en la naturaleza, a diferencia de las formas mutantes o variantes.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "variante" debe entenderse como la exhibición de cualidades que tiene un patrón que se desvía de lo que se produce en la naturaleza.
La expresión "no natural" o el término "modificada" se utilizan indistintamente e indican la participación de la mano del hombre. Los términos y expresiones, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que están naturalmente asociados en la naturaleza y como se encuentran en la naturaleza.
La "complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico de formar enlace(s) hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante el apareamiento de bases tradicional de Watson-Crick u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces hidrógeno (p.ej., apareamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (p.ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10, siendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementario). "Perfectamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico se unirán por hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. "Sustancialmente complementario", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100% en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "condiciones rigurosas" para la hibridación se refieren a condiciones en las que un ácido nucleico que tiene complementariedad con una secuencia diana se hibrida predominantemente con la secuencia diana y sustancialmente no se hibrida con secuencias no diana. Las condiciones rigurosas dependen generalmente de la secuencia y varían dependiendo de un cierto número de factores. En general, cuanto más larga sea la secuencia, más alta será la temperatura a la que la secuencia se hibrida específicamente con su secuencia diana. Ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas se describen en detalle en Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Capítulo Segundo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y. En los casos en los que se haga referencia a una secuencia de polinucleótidos, entonces también se prevén secuencias complementarias o parcialmente complementarias. Éstas son preferiblemente capaces de hibridarse con la secuencia de referencia en condiciones altamente rigurosas. Generalmente, con el fin de maximizar la tasa de hibridación, se seleccionan condiciones de hibridación de rigurosidad relativamente baja: aproximadamente 20 a 25° C inferior a la del punto de fusión térmico (Tm). El (Tm) es la temperatura a la que el 50% de la secuencia diana específica se hibrida con una sonda perfectamente complementaria en solución a una fuerza iónica y pH definidos. Generalmente, con el fin de requerir al menos aproximadamente 85% de complementariedad de nucleótidos de las secuencias hibridadas, las condiciones de lavado altamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 a 15° C inferiores a la Tm. Con el fin de requerir al menos aproximadamente 70% de complementariedad de nucleótidos de las secuencias hibridadas, las condiciones de lavado moderadamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 15 a 30° C inferiores a la Tm. Las condiciones de lavado altamente permisivas (astringencia muy baja) pueden ser tan bajas como 50° C por debajo de la Tm, permitiendo un alto nivel de emparejamientos erróneos entre las secuencias hibridadas. Los expertos en la técnica reconocerán que otros parámetros físicos y químicos en las etapas de hibridación y lavado también pueden alterarse para afectar al resultado de una señal de hibridación detectable a partir de un nivel específico de homología entre las secuencias diana y de sonda. Condiciones altamente estrictas preferidas comprenden incubación en formamida al 50%, 5 x SSC y SDS al 1% a 42° C, o incubación en 5 x SSC y SDS al 1% a 65° C, con lavado en 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 65° C.
La "hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante enlaces hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede producirse mediante el apareamiento de bases de Watson Crick, la unión de Hoogstein o cualquier otra manera de secuencia específica. El complejo puede comprender dos cadenas que forman una estructura dúplex, tres o más cadenas que forman un complejo de cadenas múltiples, una cadena auto-hibridante simple o cualquier combinación de éstas. Una reacción de hibridación puede constituir una etapa en un proceso más extenso tal como el inicio de una PCR o la escisión de un polinucleótido por una enzima. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se denomina "complemento" de la secuencia dada.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "locus genómico" o el término "locus" (loci en plural) es la ubicación específica de un gen o secuencia de ADN en un cromosoma. Un "gen" se refiere a tramos de ADN o ARN que codifican un polipéptido o una cadena de ARN que tiene un papel funcional que desempeñar en un organismo y, por lo tanto, es la unidad molecular de la herencia en los organismos vivos. Para los fines de esta invención, se puede considerar que los genes incluyen regiones que regulan la producción del producto génico, ya sea que estas secuencias reguladoras sean adyacentes o no a las secuencias de codificación y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a secuencias de promotor, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción, tales como sitios de unión a ribosomas y sitios de entrada al ribosoma interno, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos límite, orígenes de replicación, sitios de unión a matriz y regiones de control de locus.
Tal como se utiliza en esta memoria, "expresión de un locus genómico" o "expresión génica" es el proceso mediante el cual la información de un gen se utiliza en la síntesis de un producto génico funcional. Los productos de la expresión génica son a menudo proteínas, pero en genes que no codifican proteínas tales como los genes de ARNr o genes de ARNt, el producto es ARN funcional. El proceso de expresión génica es utilizado por todos los seres vivos conocidos - eucariotas (incluidos los organismos multicelulares), procariotas (bacterias y arqueas) y virus para generar productos funcionales para sobrevivir. Tal como se utiliza en esta memoria, la "expresión" de un gen o ácido nucleico abarca no solo la expresión del gen celular, sino también la transcripción y traducción de ácido o ácidos nucleicos en sistemas de clonación y en cualquier otro contexto. Tal como se utiliza en esta memoria, "expresión" también se refiere al proceso mediante el cual se transcribe un polinucleótido de un molde de ADN (tal como en un ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso mediante el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Las transcripciones y los polipéptidos codificados pueden denominarse colectivamente "producto génico". Si el polinucleótido se deriva del ADN genómico, la expresión puede incluir el corte del ARNm en una célula eucariota.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación tal como la conjugación con un componente de marcaje. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "dominio" o la expresión "dominio de proteína" se refiere a una parte de una secuencia de proteína que puede existir y funcionar independientemente del resto de la cadena de proteína.
Tal como se describe en aspectos de la invención, la identidad de secuencia está relacionada con la homología de secuencia. Las comparaciones de homología se pueden realizar a simple vista, o más habitualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje (%) de homología entre dos o más secuencias y también pueden calcular la identidad de secuencia compartida por dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. En algunas realizaciones preferidas, la región de protección de los dTALEs descritos en esta memoria tiene secuencias que son al menos un 95% idénticas o comparten identidad con las secuencias de aminoácidos de la región de protección proporcionadas en esta memoria.
Las homologías de secuencia pueden ser generadas por cualquiera de un cierto número de programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo BLAST o FASTA, etc. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limita al paquete BLa St (véase Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J.Mol.Biol., 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit.
El porcentaje (%) de homología de secuencia se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia está alineada con la otra secuencia y cada uno de los aminoácidos o nucleótidos en una secuencia se compara directamente con el aminoácido o nucleótido correspondiente en la otra secuencia, un residuo en un momento. Esto se denomina una alineación "sin huecos". Típicamente, alineamientos sin huecos de este tipo se realizan solo en un número relativamente corto de residuos.
Aunque este es un método muy simple y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias idéntico, una inserción o deleción puede hacer que los siguientes residuos de aminoácidos se desalineen, lo que podría resultar en potencia en una gran reducción en el % de homología cuando se realiza un alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que tengan en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la homología general o la puntuación de identidad. Esto se logra insertando "huecos" en el alineamiento de la secuencia para tratar de maximizar la homología o identidad local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada uno de los huecos que se producen en el alineamiento, de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con la menor cantidad de huecos posible - lo que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas - puede lograr una puntuación más alta que uno con muchos huecos. Los "costes de hueco de afinidad" generalmente se utilizan para cobrar un costo relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada residuo subsiguiente en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más utilizado. Las penalizaciones por grandes huecos pueden, por supuesto, producir alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores predeterminados cuando se utiliza dicho software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de huecos predeterminada para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo del % de homología máximo, por lo tanto, requiere primero la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limita al paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed.- Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J.Mol.Biol.403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, llamada BLAST 2 Sequences también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett.1999174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett.1999 177 (1): 187-8 y el sitio web de información del Centro Nacional de Biotecnología en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud).
Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí no se basa típicamente en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, generalmente se utiliza una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparación por pares en función de la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62 - la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se proporciona (véase el manual del usuario para obtener más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores públicos predeterminados para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz predeterminada tal como BLOSUM62.
Alternativamente, los porcentajes de homologías pueden calcularse utilizando la función de alineamiento múltiple en DNASIS™ (Software Hitachi), basada en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. Típicamente, el software hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de aminoácidos se pueden realizar sobre la base de la similitud en las propiedades de los aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y, por lo tanto, es útil agrupar aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar en función de las propiedades de sus cadenas laterales solo. Sin embargo, también es más útil incluir datos de mutación. Es probable que los conjuntos de aminoácidos derivados de este modo se conserven por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en forma de diagrama de Venn (Livingstone C.D.y Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation'' Comput. Appl.Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol.119; 205-218). Se pueden hacer sustituciones conservadoras, por ejemplo, de acuerdo con la tabla que figura a continuación que describe una agrupación de aminoácidos del diagrama de Venn generalmente aceptada.
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Realizaciones de la invención incluyen secuencias (tanto polinucleótido como polipéptido) que pueden comprender una sustitución homóloga (la sustitución y el reemplazo se utilizan ambos en esta memoria para dar a entender el intercambio de un residuo de aminoácido o nucleótido existente, con un residuo o nucleótido alternativo) que puede ocurrir, es decir, sustitución similar en el caso de aminoácidos tales como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc.La sustitución no homóloga también puede producirse, es decir, de una clase de residuo a otra o, alternativamente implicando, la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (en lo sucesivo denominada Z), ácido diaminobutírico ornitina (en adelante denominada B), norleucina ornitina (en adelante denominada O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre cualquiera de dos residuos de aminoácidos de la secuencia, incluidos grupos alquilo, tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácidos, tales como residuos de glicina o p-alanina. Los expertos en la materia pueden comprender una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente carbono a está en el átomo de nitrógeno del residuo en lugar del carbono a. Procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y ADN recombinante, que están dentro de la habilidad de la técnica. Véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M.Ausubel, et al.eds., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds.(1995)), Harlow y Lane, eds.(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed.(1987))
En un aspecto, la divulgación proporciona vectores que se utilizan en la modificación y optimización de sistemas CRISPR-Cas.
Tal como se utiliza en esta memoria, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN para lograr la replicación del segmento insertado. Generalmente, un vector es capaz de replicarse cuando está asociado con los elementos de control adecuados. En general, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido enlazado. Vectores incluyen, pero no se limitan a moléculas de ácido nucleico que son de cadena sencilla, de doble cadena o parcialmente de doble cadena; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (p.ej., circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tales como por técnicas de clonación molecular estándar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus están presentes en el vector para empaquetarse en un virus (p.ej., retrovirus, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus, adenovirus defectuosos en la replicación y virus adeno-asociados (AAV)). Los vectores virales también incluyen polinucleótidos transportados por un virus para la transfección en una célula huésped. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p.ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (p.ej., vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, con ello, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados operativamente. A este tipo de vectores se le alude en esta memoria como "vectores de expresión". Vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos.
Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse en función de las células huésped que se utilizarán para la expresión, que está operativamente enlazada a la secuencia de ácido nucleico que se ha de expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazado operativamente" pretende dar a entender que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada al elemento o elementos reguladores de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p.ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). Con respecto a los métodos de recombinación y clonación, se hace referencia a la solicitud de patente de EE.UU.10/815.730, publicada el 2 de septiembre de 2004 como Us 2004-0171156 A1.
Aspectos de la invención se refieren a vectores para ARN quimérico y Cas9. Se prefieren vectores de expresión bicistrónicos para ARN quimérico y Cas9. En general y particularmente en esta realización, Cas9 es impulsada preferiblemente por el promotor CBh. El ARN quimérico puede ser impulsado preferiblemente por un promotor U6. De manera ideal, los dos se combinan. El ARN guía quimérico consiste típicamente en una secuencia guía de 20 pb (Ns) y esta puede unirse a la secuencia tracr (que va desde la primera "U" de la cadena inferior hasta el extremo del transcrito). La secuencia tracr puede truncarse en diversas posiciones tal como se indica. Las secuencias guía y tracr están separadas por la secuencia tracr-mate, que puede ser GUUUUAGAGCUA. Ésta puede ser seguida por la secuencia de bucle GAAA tal como se muestra. Ambas son ejemplos preferidos. Las solicitantes han demostrado indeles mediados por Cas9 en los loci EMX1 y PVALB humanos mediante ensayos SURVEYOR. Los ARNqui se indican mediante su designación "+ n", y ARNcr se refiere a un ARN híbrido en el que las secuencias guía y tracr se expresan como transcritos separados. A lo largo de esta solicitud, el ARN quimérico también puede denominarse guía única o ARN guía sintético (ARNgs). El bucle es preferiblemente GAAA, pero no está limitado a esta secuencia o, de hecho, a solo 4 pb de longitud. De hecho, las secuencias de formación de bucle preferidas para uso en estructuras de horquilla son de cuatro nucleótidos de longitud, y lo más preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, pueden utilizarse secuencias de bucle más largas o más cortas, al igual que secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete de nucleótidos (por ejemplo, AAA) y un nucleótido adicional (por ejemplo, C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de bucles incluyen CAAA y AAAG.
En una realización, el promotor U6 puede ser un promotor bidireccional. La Figura 52 representa paneles de datos: el primero muestra diferentes truncamientos del promotor U6 bidireccional y la actividad de microdeleción asociada y el segundo cuantifica la actividad inductora de indeles que sale de cada lado del promotor bidireccional. La Figura 52 representa aún otro medio más por el cual es posible administrar dos ARNgs independientes a partir de un único promotor U6 que es independiente y complementario del enfoque de ARNgs en tándem. El aumento en el tamaño del promotor U6 es mínimo, lo que hace que esto sea susceptible y atractivo para aplicaciones de suministro in vivo/AAV en donde el tamaño del vector representa una restricción significativa. La secuencia del informador bidireccional más pequeño U6-8/U6-1 que conserva una buena función en ambas direcciones, que consiste en unir de extremo a extremo el promotor U6-1 en la dirección hacia delante y una versión truncada del promotor U6-8 en la dirección inversa (véase la Figura 53). Adicionalmente, esto puede abordar el problema de que el primer espaciador tiende a funcionar significativamente mejor que el segundo en la iteración actual de la arquitectura de ARNgs en tándem, ya que el procesamiento de ARNgs independiente no tiene que ocurrir con el enfoque BiU6. Véase, p.ej., el documento WO2005035718 para una divulgación adicional sobre promotores bidireccionales.
La expresión "elemento regulador" pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES) y otros elementos de control de la expresión (p.ej., señales de terminación de la transcripción, tales como señales de poliadenilación y secuencias de poli-U). Elementos reguladores de este tipo se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990). Elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en determinadas células huésped (p.ej., secuencias reguladoras específicas para el tejido). Un promotor específico para el tejido puede dirigir la expresión principalmente en un tejido de interés deseado, tal como músculo, neurona, hueso, piel, sangre, órganos específicos (p.ej., hígado, páncreas) o tipos de células particulares (p.ej., linfocitos). Elementos reguladores también pueden dirigir la expresión de una manera dependiente del tiempo, tal como de una manera dependiente del ciclo celular o de la fase de desarrollo, que puede o no ser específica para el tejido o tipo celular. En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más promotores pol III (p.ej., 1,2, 3, 4, 5 o más promotores pol I), uno o más promotores pol II (p.ej., 1,2, 3, 4, 5 o más promotores pol II), uno o más promotores pol I (p.ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más promotores pol I), o combinaciones de los mismos. Ejemplos de promotores pol III incluyen, pero no se limitan a promotores U6 y H1. Ejemplos de promotores pol II incluyen, pero no se limitan al promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retrovírico (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, p.ej., Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor EF1 a. La expresión "elemento regulador" también abarca elementos potenciadores, tales como w Pr E; potenciadores de CMV; el segmento R-U5’ en LTR de HTLV-I (Mol.Cell.Biol., Vol.8 (1), págs.466-472, 1988); potenciador de SV40; y la secuencia intrónica entre los exones 2 y 3 de la p-globina de conejo (Proc.Natl.Acad.Sci.USA., Vol.78(3), págs.1527-31, 1981). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión deseado, etc.Se puede introducir un vector en las células huésped para producir con ello transcritos, proteínas o péptidos, incluidas proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en esta memoria (p.ej., transcritos agrupados de repeticiones palindrómicas cortas intercaladas regularmente (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes de las mismas, proteínas de fusión de los mismos, etc.). Con respecto a las secuencias reguladoras, se hace mención a la solicitud de patente de EE.UU.10/491.026. Con respecto a los promotores, se hace mención a la publicación PCT WO 2011/028929 y a la solicitud de EE.UU.12/511.940.
Los vectores pueden diseñarse para la expresión de transcritos de CRISPR (p.ej., transcritos de ácido nucleico, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los transcritos de CRISPR se pueden expresar en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Células huésped adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.
Los vectores se pueden introducir y propagar en una célula procariota o procariótica. En algunas realizaciones, se utiliza un procariota para amplificar copias de un vector para introducirlo en una célula eucariota o como un vector intermedio en la producción de un vector para introducirlo en una célula eucariota (p.ej., amplificar un plásmido como parte de un sistema de empaquetamiento de un vector viral). En algunas realizaciones, se utiliza un procariota para amplificar copias de un vector y expresar uno o más ácidos nucleicos, tal como para proporcionar una fuente de una o más proteínas para el suministro a una célula huésped u organismo huésped. La expresión de proteínas en procariotas se realiza con mayor frecuencia en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Vectores de fusión añaden un cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, tal como al extremo amino de la proteína recombinante. Vectores de fusión de este tipo pueden servir para uno o más propósitos, tales como: (i) para aumentar la expresión de proteína recombinante; (ii) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Enzimas de este tipo, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Ejemplos de vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión S- transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.
Ejemplos de vectores de expresión de E. coli no fusionables inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990) 60-89).
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para la expresión en la levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J.6: 229-234), pMFa (Kuijan y Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pjRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
En algunas realizaciones, un vector impulsa la expresión de proteínas en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p.ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1983. Mol.Cell.Biol.3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170: 31 -39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero utilizando un vector de expresión en mamíferos. Ejemplos de vectores de expresión en mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J.6: 187-195). Cuando se utiliza en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus simio 40 y otros descritos en esta memoria y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, véanse, por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
En algunas realizaciones, el vector de expresión en mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (p.ej., se utilizan elementos reguladores específicos para el tejido para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos para el tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de promotores específicos para el tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico para el hígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos para linfoides (Calame y Eaton, 1988. Adv. Immunol.43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J.8: 729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específicos para neuronas (p.ej., el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 5473-5477), promotores específicos para páncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), y promotores específicos para glándulas mamarias (p.ej., promotor de suero lácteo; Pat.de EE.UU. N° 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea N° 264.166). También están abarcados promotores regulados por el desarrollo, p.ej., los promotores de hox murino (Kessel y Gruss, 1990. Science 249: 374-379) y el promotor de afetoproteína (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). Con respecto a estos vectores procariotas y eucariotas, se hace mención a la Patente de EE.UU.6.750.059. Otras realizaciones de la invención pueden referirse al uso de vectores virales, con respecto a los cuales se hace mención a la solicitud de patente de EE.UU.13/092,085. Elementos reguladores específicos para tejidos son conocidos en la técnica y, a este respecto, se hace mención a la Patente de EE.UU.7.776.321.
En algunas realizaciones, un elemento regulador está operativamente enlazado a uno o más elementos de un sistema CRISPR con el fin de impulsar la expresión de uno o más elementos del sistema CRISPR. En general, los CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), también conocidas como SPIDR (Repeticiones Directas Intercaladas ESPaciadoras), constituyen una familia de loci de ADN que habitualmente son específicos para una especie bacteriana particular. El locus CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones cortas de secuencia intercaladas (SSR) que fueron reconocidas en E.coli (Ishino et al., J.Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; y Nakata et al., J.Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]), y genes asociados. Se han identificado SSR intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al., Mol.Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg.Infect Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim.Biophys.Acta 1307:26-30 [1996]; y Mojica et al., Mol.Microbiol., 17:85-93 [1995]). Los loci CRIs Pr difieren típicamente de otros SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (s Rs R) (Janssen et al., OMICS J.Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; y Mojica et al., Mol.Microbiol., 36:244-246 [2000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que se producen en grupos que están regularmente separados por secuencias intermedias únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Aunque las secuencias repetidas están altamente conservadas entre las cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras difieren típicamente de una cepa a otra (van Embden et al., J.Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas (Véase, p.ej., Jansen et al., Mol.Microbiol., 43: 1565-1575 [2002]; y Mojica et al., [2005]) que incluyen, pero no se limitan a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
En general, el "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirección de la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluidas las secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR de activación trans) (p.ej.,ARNtracr o un ARNtracr parcial activa), una secuencia tracr-mate (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (a la que también se alude como "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. En realizaciones de la invención, las expresiones secuencia guía y ARN guía se utilizan indistintamente. En algunas realizaciones, uno 0 más elementos de un sistema CRISPR se deriva de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que fomentan la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia diana (al que también se alude como protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia para la cual una secuencia guía está diseñada para tener complementariedad, en que la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía fomenta la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia diana se ubica en el núcleo o citoplasma de una célula.
En algunas realizaciones, las repeticiones directas pueden identificarse in silico al buscar motivos repetitivos que cumplan alguno o todos los siguientes criterios:
1.encontrados en una ventana de 2 Kb de secuencia genómica que flanquea el locus CRISPR tipo II;
2.abarcan de 20 a 50 pb; y
3.interespaciados de 20 a 50 pb.
En algunas realizaciones, se pueden utilizar 2 de estos criterios, por ejemplo 1 y 2, 2 y 3, o 1 y 3. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los 3 criterios.
En algunas realizaciones, el ARNtracr candidato puede predecirse posteriormente mediante secuencias que cumplen alguno o todos los siguientes criterios:
1. homología de secuencia con repeticiones directas (búsqueda de motivos en Geneious con emparejamientos erróneos de hasta 18 pb);
2. presencia de un terminador transcripcional independiente de Rho predicho en la dirección de la transcripción; y
3. estructura secundaria estable de horquilla entre ARNtracr y repetición directa.
En algunas realizaciones, se pueden utilizar 2 de estos criterios, por ejemplo 1 y 2, 2 y 3, o 1 y 3. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los 3 criterios.
En algunas realizaciones, los diseños de ARN guía quiméricos sintéticos (ARNgs) pueden incorporar al menos 12 pb de estructura dúplex entre la repetición directa y el ARNtracr.
En realizaciones preferidas de la invención, el sistema CRISPR es un sistema CRISPR de tipo II y la enzima Cas es Cas9, que cataliza la escisión del ADN. La acción enzimática de Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes o cualquier Cas9 estrechamente relacionado genera roturas de la doble cadena en las secuencias del sitio diana que se hibridan con 20 nucleótidos de la secuencia guía y que tienen una secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM) (ejemplos incluyen NGG/NRG o un PAM que se puede determinar como se describe en esta memoria) después de los 20 nucleótidos de la secuencia diana. La actividad CRISPR a través de Cas9 para el reconocimiento y la escisión de ADN específico para el sitio se define por la secuencia guía, la secuencia tracr que se hibrida en parte con la secuencia guía y la secuencia PAM. Se describen más aspectos del sistema CRISPR en Karginov y Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defence in bacteria and archaea, Mole Cell 15 de enero de 2010; 37(1): 7.
El locus CRISPR tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contiene un grupo de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como dos elementos de ARN no codificantes, ARNtracr y un conjunto característico de secuencias repetitivas (repeticiones directas) intercaladas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente de 30 pb cada uno). En este sistema, se genera la ruptura de la doble cadena de ADN fijado como objetivo (DSB) en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). Primero, dos ARN no codificantes, la matriz pre-ARNcr y el ARNtracr se transcriben del locus CRISPR. Segundo, el ARNtracr se hibrida con las repeticiones directas de pre-ARNcr, que luego se procesa en ARNcr maduros que contienen secuencias de espaciadores individuales. Tercero, el complejo ARNcr: ARNtracr maduro dirige Cas9 a la diana de ADN que consiste en el protoespaciador y el PAM correspondiente mediante la formación de heteroduplex entre la región espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador. Finalmente, Cas9 media en la escisión del ADN diana aguas arriba de PAM para crear un DSB dentro del protoespaciador (Figura 2A). La Figura 2B demuestra la localización nuclear del codón Cas9 optimizado. Para fomentar una iniciación transcripcional precisa, se seleccionó el promotor U6 basado en ARN polimerasa III para impulsar la expresión de ARNtracr (Figura 2C). De manera similar, se desarrolló una construcción basada en el promotor U6 para expresar una matriz de pre-ARNcr que consiste en un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (DR, también abarcadas por la expresión "secuencias tracr-mate"; Figura 2C). El espaciador inicial se diseñó para fijar como objetivo un sitio diana de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia de motivo CRISPR (PAM) de 3 pb que satisface el motivo de reconocimiento NGG de Cas9) en el locus EMX1 humano (Figura 2C ), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
Típicamente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia guía hibridada con una secuencia diana y formando un complejo con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o ambas cadenas en o cerca de (p.ej., dentro de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases de) la secuencia diana. Sin desear estar limitado por la teoría, la secuencia tracr, que puede comprender o consistir en la totalidad o una parte de una secuencia tracr de tipo salvaje (p.ej., aproximadamente o más de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 o más nucleótidos de una secuencia tracr de tipo salvaje), también pueden formar parte de un complejo CRISPR, tal como por hibridación a lo largo de al menos una parte de la secuencia de tracr a toda o una parte de una secuencia de tracr mate que está operativamente enlazada a la secuencia guía. En algunas realizaciones, uno o más vectores que impulsan la expresión de uno o más elementos de un sistema CRISPR se introducen en una célula huésped de tal manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR forma directamente un complejo CRISPR en uno o más sitios diana. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía enlazada a una secuencia tracr-mate, y una secuencia tracr podrían estar operativamente enlazadas a elementos reguladores separados en vectores separados. Alternativamente, dos o más de los elementos expresados a partir de los mismos o diferentes elementos reguladores, se pueden combinar en un solo vector, con uno o más vectores adicionales que proporcionan cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. Elementos del sistema CRISPR que se combinan en un solo vector pueden estar dispuestos en cualquier orientación adecuada, tal como un elemento ubicado en 5’ con respecto a ("aguas arriba" de) o 3' con respecto a ("aguas abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificante de un elemento puede ubicarse en la misma cadena o en una cadena opuesta de la secuencia codificante de un segundo elemento, y orientarse en la misma dirección o en una dirección opuesta. En algunas realizaciones, un único promotor impulsa la expresión de un transcrito que codifica una enzima CRISPR y una o más de la secuencia guía, la secuencia tracr mate (opcionalmente enlazada operativamente a la secuencia guía) y una secuencia tracr incorporada dentro de una o más secuencias de intrones (p.ej., cada uno en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón, o todos en un solo intrón). En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, la secuencia guía, la secuencia tracr mate y la secuencia tracr están operativamente enlazadas y son expresadas desde el mismo promotor.
En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más sitios de inserción, tales como una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción (a la que también se alude como un "sitio de clonación"). En algunas realizaciones, uno o más sitios de inserción (p.ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de inserción) están ubicados aguas arriba y/o aguas abajo de uno o más elementos de la secuencia de uno o más vectores. En algunas realizaciones, un vector comprende un sitio de inserción aguas arriba de una secuencia tracr y opcionalmente aguas abajo de un elemento regulador enlazado operativamente a la secuencia tracr mate, de modo que después de la inserción de una secuencia guía en el sitio de inserción y tras la expresión, la secuencia guía dirige la unión específica de secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un vector comprende dos o más sitios de inserción, estando ubicado cada uno de los sitios de inserción entre dos secuencias tracr mate para permitir la inserción de una secuencia guía en cada sitio. En una disposición de este tipo, las dos o más secuencias guía pueden comprender dos o más copias de una única secuencia guía, dos o más secuencias guía diferentes, o combinaciones de éstas. Cuando se utilizan múltiples secuencias guía diferentes, se puede utilizar una construcción de expresión única para fijar como objetivo la actividad de CRISPR a múltiples secuencias diana diferentes correspondientes dentro de una célula. Por ejemplo, un solo vector puede comprender aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más secuencias guía. En algunas realizaciones, se pueden proporcionar aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más vectores que contienen la secuencia guía, y se pueden suministrar opcionalmente a una célula.
En algunas realizaciones, un vector comprende un elemento regulador operativamente enlazado a una secuencia codificante de enzima que codifica una enzima CRISPR, tal como una proteína Cas. Ejemplos no limitantes de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, sus homólogos o versiones modificadas de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR no modificada tiene actividad de escisión de ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas en la ubicación de una secuencia diana, tal como dentro de la secuencia diana y/o dentro del complemento de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, o más pares de bases del primer o último nucleótido de una secuencia diana. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que está mutada con respecto a una enzima de tipo salvaje correspondiente, de modo que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de un polinucleótido diana que contiene una secuencia diana. Por ejemplo, una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S.pyogenes convierte a Cas9 de una nucleasa que escinde ambas cadenas en una nickasa (escinde una sola cadena). Otros ejemplos de mutaciones que hacen de Cas9 una nickasa incluyen, sin limitación, H840A, N854A y N863A. Como un ejemplo adicional, dos o más dominios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III o el dominio HNH) pueden mutar para producir una Cas9 mutada que carece sustancialmente de toda la actividad de escisión del ADN. En algunas realizaciones, una mutación D10A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN cuando la actividad de escisión de ADN de la enzima mutada es inferior a aproximadamente 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o menos con respecto a su forma no mutada.
Una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de SpCas9 se diseñó para convertir la nucleasa en una nickasa (SpCas9n) (véase, p.ej., Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acis Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 109:E2579), de modo que el ADN genómico mellado se somete a la reparación dirigida por homología de alta fidelidad (HDR). El ensayo Surveyor confirmó que SpCas9n no genera indeles en la diana del protoespaciador EMX1. La coexpresión del ARNcr quimérico dirigido a EMX1 (que también tiene el componente ARNtracr) con SpCas9 produjo indeles en el sitio diana, mientras que la coexpresión con SpCas9n no (n = 3). Además, la secuenciación de 327 amplicones no detectó indel alguno inducido por SpCas9n. Se seleccionó el mismo locus para testar la HR mediada por CRISPR co-transfectando células HEK 293FT con el ARN quimérico que fija como objetivo EMX1, hSpCas9 o hSpCas9n, así como un molde de HR para introducir un par de sitios de restricción (HindIII y NheI) cerca del protoespaciador.
Ortólogos preferidos se describen en esta memoria. Una enzima Cas puede identificarse como Cas9, ya que esto puede referirse a la clase general de enzimas que comparten homología con la nucleasa más grande con múltiples dominios de nucleasa del sistema CRISPR de tipo II. Lo más preferiblemente, la enzima Cas9 es o se deriva de, spCas9 o saCas9. Por derivado, las solicitantes quieren dar a entender que la enzima derivada se basa en gran medida, en el sentido de tener un alto grado de homología de secuencia con una enzima de tipo salvaje, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera tal como se describe en esta memoria.
Se apreciará que los términos Cas y enzima CRISPR se utilizan generalmente en esta memoria de manera indistinta, a menos que sea evidente de otra manera. Como se mencionó anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en esta memoria se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR tipo II en Streptococcus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchos más Cas9 de otras especies de microbios, tales como SpCas9, SaCa9, St1Cas9, etcétera.
En esta memoria se proporciona un ejemplo de una secuencia optimizada en codones, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos), véase la secuencia optimizada en codones humana SaCas9. Si bien esto es preferido, se apreciará que son posibles otros ejemplos y que se conoce la optimización en codones para una especie huésped.
En algunas realizaciones, una secuencia codificante de enzimas que codifica una enzima CRISPR está optimizada en codones para la expresión en células particulares, tales como células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser las de un organismo particular o derivarse de él, tal como un mamífero, incluidos, pero no limitados a ser humano, ratón, rata, conejo, perro o mamífero o primate no humano. En algunas realizaciones, pueden excluirse los procedimientos para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos y/o los procedimientos para modificar la identidad genética de los animales que pueden causarles sufrimiento sin ningún beneficio médico sustancial para el hombre o el animal, y también los animales resultantes de procedimientos de este tipo.
En general, la optimización de codones se refiere a un procedimiento de modificación de una secuencia de ácidos nucleicos para potenciar la expresión en las células huésped de interés mediante el remplazo de al menos un codón (p.ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15,20, 25, 50 o más codones) de la secuencia nativa por codones que se utilizan con mayor frecuencia o lo más frecuentemente en los genes de esa célula huésped, al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoácidos nativa. Diversas especies exhiben un sesgo particular para determinados de un aminoácido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) a menudo se correlaciona con la eficiencia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se están traduciendo y de disponibilidad de moléculas de transferencia de ARN (ARNt) particulares. El predominio de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones utilizados con mayor frecuencia en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes se pueden adaptar para una expresión génica óptima en un organismo dado en base a la optimización de codones. Tablas de uso de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la "Codon Usage Database" disponible en www.kazusa.orjp/codon/ (visitada el 9 de julio de 2002), y estas tablas se pueden adaptar en un cierto número de maneras. Véase Nakamura, Y., et al."Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res.28:292 (2000). También están disponibles algoritmos informáticos para la optimización en codoners de una secuencia particular para la expresión en una célula huésped particular, tal como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o más codones (p.ej., 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más, o todos los codones) en una secuencia que codifica una enzima CRISPR corresponden al codón más frecuentemente utilizado para un aminoácido particular.
En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que comprende una o más secuencias de localización nuclear (NLS), tales como aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende aproximadamente o más de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en o cerca del extremo amino, aproximadamente o más de aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en o cerca del extremo carboxi, o una combinación de estos (p.ej., uno o más NLS en el extremo amino y uno o más NLS en el extremo carboxi). Cuando está presente más de un NLS, cada uno puede seleccionarse independientemente de los demás, de modo que un único NLS puede estar presente en más de una copia y/o en combinación con uno o más otros NLS presentes en una o más copias. En una realización preferida de la invención, la enzima CRISPR comprende a lo sumo 6 NLS. En algunas realizaciones, un NLS se considera que está cerca del extremo N o C cuando el aminoácido más cercano del NLS está dentro de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica del extremo N o C. Ejemplos no limitantes de NLS incluyen una secuencia NLS derivada de: el NLS del antígeno T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoácidos PKKKRKV; el NLS de nucleoplasmina (p.ej., el NLS bipartito de nucleoplasmina con la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK); el NLS c-myc que tiene la secuencia de aminoácidos PAAKRVKLD o RQRRNELKRSP; el NLS hRNPA1 M9 que tiene la secuencia NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; la secuencia RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV del dominio IBB de importina-alfa; las secuencias VSRKRPRP y PPKKARED de la proteína T de mioma; la secuencia POPKKKPL de p53 humano; la secuencia SALIKKKKKMAP del ratón c-abl iV; las secuencias DRLRR y PKQKKRK del virus de la gripe NS1; la secuencia RKLKKKIKKL del antígeno delta del virus de la hepatitis; la secuencia REKKKFLKRR de la proteína Mx1 de ratón; la secuencia KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK de la polimerasa de poli (ADP-ribosa) humana; y la secuencia RKCLQAGMNLEARKTKK de los receptores de hormonas esteroides (humanos) glucocorticoides.
En general, uno o más NLS tienen la fuerza suficiente para impulsar la acumulación de la enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariótica. En general, la fuerza de la actividad de localización nuclear puede derivar del número de NLS en la enzima CRISPR, de los NLS particulares utilizados o de una combinación de estos factores. La detección de la acumulación en el núcleo puede realizarse mediante cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, un marcador detectable puede fusionarse con la enzima CRISPR, de modo que se pueda visualizar la ubicación dentro de una célula tal como en combinación con un medio para detectar la ubicación del núcleo (p.ej., una tinción específica para el núcleo tal como DAPI). Los núcleos celulares también pueden aislarse de las células, cuyo contenido puede analizarse luego mediante cualquier procedimiento adecuado para detectar proteínas, tales como inmunohistoquímica, transferencia Western o ensayo de actividad enzimática. La acumulación en el núcleo también se puede determinar indirectamente, tal como, mediante un ensayo para determinar el efecto de la formación del complejo CRISPR (p.ej., ensayo para la escisión o mutación del ADN en la secuencia diana, o ensayo para determinar la actividad de expresión genética alterada afectada por la formación del complejo CRISPR y/o actividad de la enzima CRISPR), en comparación con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR, o expuesto a una enzima CRISPR que carece de uno o más NLS.
En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos diana para hibridarse con la secuencia diana y la unión directa específica para la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinea de manera óptima utilizando un algoritmo de alineamiento adecuado, es aproximadamente o más de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más. El alineamiento óptimo se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la Transformación Burrows-Wheeler (p.ej., el Alineador Burrows Wheeler) , ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponible en www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia guía es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, o menor nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana puede evaluarse mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo CRISPR, incluida la secuencia guía a testar, pueden proporcionarse a una célula huésped que tenga la secuencia diana correspondiente, tal como mediante transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de una evaluación de la escisión preferencial dentro de la secuencia diana, tal como por el ensayo Surveyor como se describe en esta memoria. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótidos diana puede evaluarse en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia diana, componentes de un complejo CRISPR, incluida la secuencia guía a testar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo, y comparando la unión o tasa de escisión en la secuencia diana entre el ensayo y las reacciones de la secuencia de la guía de control. Son posibles otros ensayos, y se les ocurrirán a los expertos en la técnica.
Se puede seleccionar una secuencia guía para fijar como objetivo cualquier secuencia diana. En algunas realizaciones, la secuencia diana es una secuencia dentro de un genoma de una célula. Secuencias diana ilustrativas incluyen aquellas que son únicas en el genoma diana. Por ejemplo, para la Cas9 de S.pyogenes, una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG , en que NNNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparición en el genoma. Una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de S.pyogenesde la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG, en que NNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparición en el genoma. Para la Cas9 de CRISPR1 de S.thermophilus, una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW, en que NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A, G, T o C; X puede ser cualquier cosa; y W es A o T; ) tiene una sola aparición en el genoma. Una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana para la Cas9 de CRISPR1 Cas9 de S.thermophilus de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW, en que NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A, G, T o C; X puede ser cualquier cosa; y W es A o T) tiene una sola aparición en el genoma. Para la Cas9 de S.pyogenes una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG, en que NNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparición en el genoma. Una secuencia diana única en un genoma puede incluir un sitio diana de Cas9 de S.pyogenes de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG , en que NNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparición en el genoma. En cada una de estas secuencias, "M" puede ser A, G, T o C, y no es necesario considerarlo para identificar una secuencia como única.
En algunas realizaciones, se selecciona una secuencia guía para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. En algunas realizaciones, aproximadamente o menos de aproximadamente 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, o menos de los nucleótidos de la secuencia guía participan en el apareamiento de bases auto-complementario cuando están plegados de manera óptima. El plegamiento óptimo puede determinarse mediante cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado. Algunos programas se basan en el cálculo de la energía libre mínima de Gibbs. Un ejemplo de uno de estos algoritmos es mFold tal como lo describen Zuker y Stiegler (Nucleic Acids Res.9 (1981), 133-148). Otro ejemplo de algoritmo de plegamiento es el servidor web en línea RNAfold, desarrollado en el Instituto de Química Teórica de la Universidad de Viena, utilizando el algoritmo de predicción de estructura centroide (véase, p.ej., A.R.Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; y PA Carr y GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12) 1151 -62).
En general, una secuencia tracr mate incluye cualquier secuencia que tenga suficiente complementariedad con una secuencia tracr para fomentar uno o más de: (1) escisión de una secuencia guía flanqueada por secuencias tracr mate en una célula que contiene la secuencia tracr correspondiente; y (2) formación de un complejo CRISPR en una secuencia diana, en donde el complejo CRISPR comprende la secuencia tracr mate hibridada con la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad se refiere al alineamiento óptimo de la secuencia tracr mate y la secuencia traer, a lo largo de la longitud de la más corta de las dos secuencias. El alineamiento óptimo puede determinarse mediante cualquier algoritmo de alineamiento adecuado, y puede explicar además las estructuras secundarias, tales como la auto-complementariedad dentro de la secuencia tracr o la secuencia tracr mate. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia tracr mate a lo largo de la longitud de la más corta de las dos cuando está alineada óptimamente es aproximadamente o más de aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y la secuencia tracr mate están contenidas dentro de una única transcripción, de modo que la hibridación entre las dos produce un transcrito que tiene una estructura secundaria tal como una horquilla. En una realización de la invención, el transcrito o la secuencia de polinucleótidos transcrita tiene al menos dos o más horquillas. En realizaciones preferidas, el transcrito tiene dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realización adicional de la invención, el transcrito tiene a lo sumo cinco horquillas. En una estructura de horquilla, la parte de la secuencia 5‘ de la "N" final y aguas arriba del bucle corresponde a la secuencia tracr mate, y la parte de la secuencia 3' del bucle corresponde a la secuencia tracr.Ejemplos adicionales no limitantes de polinucleótidos individuales que comprenden una secuencia guía, una secuencia tracr mate y una secuencia tracr son los siguientes (enumerados de 5' a 3'), en que "N" representa una base de una secuencia guía, el primer bloque de letras minúsculas representa la secuencia tracr mate, y el segundo bloque de letras minúsculas representa la secuencia tracr, y la secuencia de poli-T final representa el terminador de la transcripción: (1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacacc ctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNN NNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcag ggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNN NNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcag ggtgtTTTTTT; (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNN NNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc TTTTTT; (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT; y (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTT TTTTTT. En algunas realizaciones, las secuencias (1) a (3) se utilizan en combinación con Cas9 de CRISPR1 de S.thermophilus. En algunas realizaciones, las secuencias (4) a (6) se utilizan en combinación con Cas9 de CRISPR1 de S.pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es un transcrito separado de un transcrito que comprende la secuencia tracr mate.
En algunas realizaciones, también se proporciona un molde de recombinación. Un molde de recombinación puede ser un componente de otro vector tal como se describe en esta memoria, contenido en un vector separado o proporcionado como un polinucleótido separado. En algunas realizaciones, un molde de recombinación está diseñada para servir como un molde en recombinación homóloga, tal como dentro o cerca de una secuencia diana mellada o escindida por una enzima CRISPR como parte de un complejo CRISPR. Un polinucleótido molde puede tener cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleótido molde es complementario a una parte de un polinucleótido que comprende la secuencia diana. Cuando se alinea de manera óptima, un polinucleótido molde puede superponerse con uno o más nucleótidos de una secuencia diana (p.ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 o más nucleótidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia molde y un polinucleótido que comprende una secuencia diana se alinean de manera óptima, el nucleótido más cercano del polinucleótido molde está dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, o más nucleótidos de la secuencia diana.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteínas heterólogas (p.ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios, además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión enzimática CRISPR puede comprender cualquier secuencia de proteína adicional, y opcionalmente una secuencia de enlazador entre cualquiera de los dos dominios. Ejemplos de dominios de proteínas que pueden fusionarse con una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopo, secuencias de genes informadores y dominios de proteínas que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad de factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad de escisión de ARN y actividad de unión a ácido nucleico. Ejemplos no limitantes de etiquetas de epítopo incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tiorredoxina (Trx). Ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a glutatión-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP) y proteínas auto-fluorescentes, incluida la proteína fluorescente azul (BFP). Una enzima CRISPR puede fusionarse con una secuencia génica que codifica una proteína o un fragmento de una proteína que se une a moléculas de ADN o a otras moléculas celulares, incluidas, pero no limitadas a la proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones del dominio de unión a ADN de Lex A (DBD), fusiones del dominio de unión a ADN GAL4 y fusiones de proteína del virus del herpes simple (HSV) BP16. Dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CRISPR se describen en el documento US20110059502. En algunas realizaciones, se utiliza una enzima CRISPR etiquetada para identificar la ubicación de una secuencia diana.
En algunas realizaciones, una enzima CRISPR puede formar un componente de un sistema inducible. La naturaleza inducible del sistema permitiría el control espacio-temporal de la edición génica o la expresión génica utilizando una forma de energía. La forma de energía puede incluir, pero no se limita a radiación electromagnética, energía sonora, energía química y energía térmica. Ejemplos de sistemas inducibles incluyen promotores inducibles por tetraciclina (Tet-activado o Tet-desactivado), sistemas de activación de transcripción de dos híbridos de molécula pequeña (FKBP, ABA, etc.) o sistemas inducibles por luz (Fitocromo, dominios de LOV o criptocromo). En una realización, la enzima CRISPR puede ser parte de un Efector Transcripcional Inducible por Luz (LITE) para dirigir cambios en la actividad transcripcional de una manera específica para la secuencia. Los componentes de una luz pueden incluir una enzima CRISPR, un heterodímero criptocromo sensible a la luz (p.ej., de Arabidopsis thaliana) y un dominio de activación/represión transcripcional. Se proporcionan ejemplos adicionales de proteínas de unión a ADN inducibles y métodos para su uso en los documentos u S 61/736465 y Us 61/721.283.
En algunos aspectos, la invención se refiere a métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tales como o uno o más vectores tal como se describe en esta memoria, uno o más transcritos de los mismos y/o una o proteínas transcritas a partir de los mismos, a una célula huésped. En algunos aspectos, la invención proporciona, además, células producidas por este tipo de métodos, y animales que comprenden o producen a partir de este tipo de células. En algunas realizaciones, una enzima CRISPR en combinación con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía se suministra a una célula. Métodos convencionales de transferencia de genes basados en virus y no virus se pueden utilizar para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos o tejidos diana. Métodos de este tipo pueden utilizarse para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema CRISPR a células en cultivo, o en un organismo huésped. Sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (p.ej., un transcrito de un vector descrito en esta memoria), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro tal como un liposoma. Sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después del suministro a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31 -44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bohm (eds) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
Métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípidos:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por agentes. La lipofección se describe, p.ej., en las Pat.de EE.UU. N°s 5.049.386, 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (p.ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de reconocimiento de receptor de polinucleótidos incluyen los de Felgner, documentos WO 91/17424; WO 91/16024. El suministro puede ser a células (p.ej., administración in vitro o ex vivo) o a tejidos diana (p.ej., administración in vivo).
La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluidos liposomas fijados como objetivo tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la técnica (véase, p.ej., Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem.5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem.5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.52:4817-4820 (1992); Pat.de EE.UU. N2s 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).
El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos aprovecha los procesos altamente evolucionados para fijar como objetivo un virus a células específicas en el cuerpo y traficar la carga viral hacia el núcleo. Vectores virales pueden administrarse directamente a pacientes (in vivo) o pueden utilizarse para tratar células in vitro, y las células modificadas pueden administrarse opcionalmente a pacientes (ex vivo). Sistemas convencionales basados en virus podrían incluir vectores retrovirales, lentivirus, adenovirales, adeno-asociados y del virus herpes simplex para la transferencia de genes. La integración en el genoma del huésped es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adeno-asociados, lo que a menudo resulta en la expresión a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.
El tropismo de un retrovirus puede alterarse incorporando proteínas de envoltura extrañas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen altos títulos virales. La selección de un sistema de transferencia génica retroviral dependería, por lo tanto, del tejido diana. Los vectores retrovirales están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas de acción cis son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que luego se utilizan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones (véase, p.ej., Buchscher et al., J.Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J.Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J.Virol.
63:2374-2378 (1989); Miller et al., J.Virol. 65:2220-2224 (1991); documento PCT/US94/05700).
En aplicaciones en donde se prefiere la expresión transitoria, se pueden utilizar sistemas basados en adenovirus. Vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con este tipo de vectores se han obtenido un título y niveles de expresión altos. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple.
Vectores de virus adeno-asociados ("AAV") también pueden utilizarse para transducir células con ácidos nucleicos diana, p.ej., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, p.ej., West et al., Virology 160:38-47 (1987); Pat.de EE.UU. No.4,797,368; documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J.Clin.Invest.94:1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en un cierto número de publicaciones, incluyendo la Pat.de EE.UU. N° 5,173,414; Tratschin et al., Mol.Cell.Biol.5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol.Cell.Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J.Virol. 63:03822-3828 (1989).
Las células de empaquetamiento se utilizan típicamente para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Células de este tipo incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en la terapia génica son generados habitualmente por el productor de una línea celular que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped, siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión para que se expresen el o los polinucleótidos. Las funciones virales que faltan son típicamente suministradas en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV utilizados en terapia génica poseen típicamente secuencias de ITR del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma del huésped. El ADN viral está empaquetado en una línea celular, que contiene un plásmido helper que codifica los otros genes de AAV, a saber, rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también puede infectarse con adenovirus como un helper. El virus helper fomenta la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido helper. El plásmido helper no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, p.ej., un tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.
Por consiguiente, el AAV se considera un candidato ideal para su uso como vector transductor. Vectores de transducción de AAV de este tipo pueden comprender suficientes funciones de acción cis para replicarse en presencia de funciones helper de adenovirus o virus herpes o poxvirus (p.ej., virus vaccinia) proporcionadas en trans. El AAV recombinante (rAAV) se puede utilizar para transportar genes exógenos a células de una diversidad de linajes. En estos vectores, los genes cap y/o rep de AAV se eliminan del genoma viral y se reemplazan por un segmento de ADN de elección. Vectores de AAV actuales pueden alojar hasta 4300 bases de ADN insertado.
Existen varias formas de producir rAAV, y la invención se refiere a rAAV y a métodos para preparar rAAV. Por ejemplo, el o los plásmidos que contienen o consisten esencialmente en la construcción deseada son transfectados en células infectadas con AAV. Además, un segundo plásmido helper o adicional se co-transfecta a estas células para proporcionar los genes rep y/o cap de AAV que son obligatorios para la replicación y el empaquetamiento de la construcción viral recombinante. En estas condiciones, las proteínas rep y/o cap de AAV actúan en trans para estimular la replicación y el empaquetamiento de la construcción rAAV. Dos a tres días después de la transfección, se cosecha rAAV. Tradicionalmente, el rAAV se cosecha de las células junto con el adenovirus. El adenovirus contaminante se inactiva por tratamiento térmico. En el contexto de la presente invención, rAAV se cosecha ventajosamente no de las células propiamente dichas, sino del sobrenadante celular. Por consiguiente, en un aspecto inicial, la invención se refiere a la preparación de rAAV, y además de lo anterior, rAAV puede prepararse mediante un método que comprende o consiste esencialmente en: infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno que incluye ADN para la expresión, y virus helper (p.ej., adenovirus, virus herpes, poxvirus tal como el virus vaccinia) en donde el rAAV carece de cap y/o rep funcionales (y el virus helper (p.ej., adenovirus, virus herpes, poxvirus tal como el virus vaccinia) proporciona la función cap y/o rev de la que carece el rAAV); o infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno que incluye ADN para la expresión, en donde el recombinante carece de cap y/o rep funcional, y transfectar dichas células con un plásmido que suministra la función cap y/o rep de la que carece el rAAV; o infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno que incluye ADN para la expresión, en donde el recombinante carece de cap y/o rep funcional, en donde dichas células suministran la función cap y/o rep de la que carece el recombinante; o transfectar las células susceptibles con un AAV que carece de cap y/o rep funcional y plásmidos para insertar ADN exógeno en el recombinante de modo que el recombinante exprese el ADN exógeno y para suministrar funciones rep y/o cap por medio de las cuales la transfección resulta en un rAAV que contiene el ADN exógeno, incluido el ADN para la expresión que carece de un cap y/o rep funcional.
El rAAV puede ser de un AAV tal como se describe en esta memoria, y ventajosamente puede ser un rAAV1, rAAV2, AAV5 o rAAV que tiene una cápside híbrida que puede comprender AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos. Se puede seleccionar el AAV del rAAV con respecto a las células a ser fijadas como objetivo por el rAAV; p.ej., se puede seleccionar los serotipos 1, 2, 5 de AAV o una cápside híbrida AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos para fijar como objetivo células del cerebro o neuronales; y se puede seleccionar AAV4 para fijar como objetivo el tejido cardíaco.
Además de las células 293, otras células que pueden utilizarse en la práctica de la invención y la infectividad relativa de determinados serotipos de AAV in vitro en cuanto a estas células (véase Grimm, D.et al, 82: 5887-5911 (2008)) son las siguientes:
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La invención se refiere a rAAV que contiene o consiste esencialmente en una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un sistema CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), p.ej., una pluralidad de casetes que comprenden o consisten en un primer casete que comprende o consiste esencialmente en un promotor, un molécula de ácido nucleico que codifica una proteína (Cas) asociada a CRISPR (proteínas de nucleasa o helicasa putativas), p.ej., Cas9 y un terminador, y dos, o más, ventajosamente hasta el límite de tamaño de empaquetamiento del vector, p.ej., en total ( incluyendo el primer casete) cinco, casetes que comprenden o consisten esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN guía (ARNg) y un terminador (p.ej., cada casete representado esquemáticamente como Promotor-ARNg1-terminador, Promotor-ARNg2-terminador... Promotor-ARNg(N) -terminator (en que N es un número que se puede insertar que está en un límite superior del límite de tamaño de empaquetado del vector), o dos o más rAAV individuales, conteniendo cada uno uno o más de un casete de un sistema CRISPR, p.ej., un primer rAAV que contiene el primer casete que comprende o consiste esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica Cas, p.ej., Cas9 y un terminador, y un segundo rAAV que contiene una pluralidad , cuatro, casetes que comprenden o consisten esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN guía (ARNg) y un terminador (p.ej., cada uno de los casetes representado esquemáticamente como Promotor-ARNg1-terminador, Promotor-ARNg2-terminador... Promotor-ARNg(N) -terminador (en que N es un número que se puede insertar que está en un límite superior del límite de tamaño de empaquetamiento del vector). Dado que rAAV es un virus de ADN, las moléculas de ácido nucleico en la discusión en esta memoria en relación con AAV o rAAV son ventajosamente ADN. El promotor es en algunas realizaciones ventajosamente promotor de Sinapsina I humana (hSyn).
Los expertos en la técnica conocen métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a las células. Véase, por ejemplo, el documento US20030087817.
En algunas realizaciones, una célula huésped se transfecta transitoria o no transitoriamente con uno o más vectores descritos en esta memoria. En algunas realizaciones, una célula se transfecta como se produce de forma natural en un sujeto. En algunas realizaciones, una célula que se transfecta se toma de un sujeto. En algunas realizaciones, la célula se deriva de células tomadas de un sujeto, tal como una línea celular. En la técnica se conoce una amplia diversidad de líneas celulares para el cultivo de tejidos. Ejemplos de líneas celulares incluyen, pero no se limitan a C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1 R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 epitelial de riñón de modo, BALB/ 3T3 fibroblasto de embrión de ratón, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 fibroblastos fetales humanos; 10.1 fibroblastos de ratón, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, líneas celulares OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 cells, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, línea celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, y variedades transgénicas de las mismas. Las líneas celulares están disponibles de una diversidad de fuentes conocidas por los expertos en la técnica (véase, p.ej., American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Virginia)). En algunas realizaciones, una célula transfectada con uno o más vectores descritos en esta memoria se utiliza para establecer una nueva línea celular que comprende una o más secuencias derivadas de vectores. En algunas realizaciones, una célula transfectada transitoriamente con los componentes de un sistema CRISPR tal como se describe en esta memoria (tal como por transfección transitoria de uno o más vectores, o transfección con ARN), y modificada a través de la actividad de un complejo CRISPR, se utiliza para establecer una nueva línea celular que comprende células que contienen la modificación pero que carecen de cualquier otra secuencia exógena. En algunas realizaciones, las células transfectadas transitoriamente o no transitoriamente con uno o más vectores descritos en esta memoria, o las líneas celulares derivadas de este tipo de células se utilizan para evaluar uno o más compuestos de prueba.
En algunas realizaciones, uno o más vectores descritos en esta memoria se utilizan para producir un animal transgénico no humano o una planta transgénica. En algunas realizaciones, el animal transgénico es un mamífero, tal como un ratón, rata o conejo. Métodos para producir plantas y animales transgénicos son conocidos en la técnica, y generalmente comienzan con un método de transfección celular, tal como se describe en esta memoria.
Con los recientes avances en genómica de cultivos, la capacidad de utilizar sistemas CRISPR-Cas para realizar una edición y manipulación de genes eficiente y rentable permitirá la selección y comparación rápidas de manipulaciones genéticas simples y multiplexadas para transformar genomas de este tipo para una producción mejorada y rasgos potenciados. A este respecto, se hace referencia a las patentes y publicaciones de EE.UU.: Patente de EE.UU.N2 6.603.061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; Patente de EE.UU.N27.868.149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof y documento US 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits, todos los contenidos y la divulgación de cada uno de los cuales se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad. En la práctica de la invención, los contenidos y la divulgación de Morrell et al "Crop genomics: advances and applications" Nat Rev Genet.29 diciembre de 2011 29;13(2):85-96. En una realización ventajosa de la invención, el sistema CRISPR/Cas9 se utiliza para modificar microalgas. El que el sistema CRISPR-Cas puede emplearse en sistemas de plantas también se proporciona en el manuscrito "Efficient Genome Editing in Plants using a CRISPR/Cas System", por Feng et al. enviado para su publicación a Nature Biotechnology en julio de 2013, en donde se demuestra que los complejos de CRISPR/Cas modificados pueden utilizarse para crear roturas de doble cadena en sitios específicos del genoma de la planta para lograr modificaciones específicas del genoma en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. Por consiguiente, la referencia en esta memoria a células animales también puede aplicarse, mutatis mutandis, a células vegetales, a menos que sea evidente de otra manera.
En un aspecto, la invención proporciona métodos para modificar un polinucleótido diana en una célula eucariótica, que puede ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el método comprende tomar muestras de una célula o población de células de un animal humano o no humano o planta (incluyendo microalgas), y modificar la célula o las células. El cultivo puede ocurrir en cualquier fase ex vivo. La célula o las células pueden incluso re-introducirse en el animal no humano o planta (incluidas las microalgas). Para las células re-introducidas, se prefiere particularmente que las células sean células madre.
En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido diana para efectuar la escisión de dicho polinucleótido diana modificando con ello el polinucleótido diana, en donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro de dicha polinucleótido diana, en donde dicha secuencia guía está enlazada a una secuencia tracr mate que a su vez se hibrida con una secuencia tracr.
En un aspecto, la invención proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de manera que dicha unión de como resultado una expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en donde el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro de dicho polinucleótido, en donde dicha secuencia guía está enlazada a una secuencia tracr mate que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. Consideraciones y condiciones similares se aplican como anteriormente para los métodos de modificar un polinucleótido diana. De hecho, estas opciones de muestreo, cultivo y re-introducción se aplican a todos los aspectos de la presente invención.
De hecho, en cualquier aspecto de la invención, el complejo CRISPR puede comprender una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia diana, en donde dicha secuencia guía puede estar enlazada a una secuencia tracr mate que a su vez puede hibridarse con una secuencia tracr. Consideraciones y condiciones similares se aplican como anteriormente para los métodos de modificar un polinucleótido diana.
En un aspecto, la invención se refiere a kits que contienen uno o más de los elementos descritos en los métodos y las composiciones anteriores Los elementos pueden proporcionarse individualmente o en combinaciones, y pueden proporcionarse en cualquier recipiente adecuado, tal como un vial, una botella o un tubo. En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones en uno o más idiomas, por ejemplo en más de un idioma.
En algunas realizaciones, un kit comprende uno o más reactivos para su uso en un procedimiento que utiliza uno o más de los elementos descritos en esta memoria. Los reactivos se pueden proporcionar en cualquier recipiente adecuado. Por ejemplo, un kit puede proporcionar uno o más tampones de reacción o almacenamiento. Los reactivos se pueden proporcionar en una forma que se pueda utilizar en un ensayo particular, o en una forma que requiera la adición de uno o más componentes antes de su uso (p.ej., en forma concentrada o liofilizada). Un tampón puede ser cualquier tampón, incluidos, pero no limitados a un tampón carbonato de sodio, un tampón bicarbonato de sodio, un tampón borato, un tampón Tris, un tampón MOPS, un tampón HEPES y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón es alcalino. En algunas realizaciones, el tampón tiene un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más oligonucleótidos correspondientes a una secuencia guía para inserción en un vector con el fin de unir operativamente la secuencia guía y un elemento regulador. En algunas realizaciones, el kit comprende un polinucleótido molde de recombinación homólogo.
En un aspecto, la invención se refiere a métodos para utilizar uno o más elementos de un sistema CRISPR. El complejo CRISPR de la divulgación proporciona medios eficaces para modificar un polinucleótido diana. El complejo CRISPR de la divulgación tiene una amplia variedad de utilidades que incluyen modificar (p.ej., eliminar, insertar, translocar, inactivar, activar) un polinucleótido diana en una multiplicidad de tipos de células. Como tal, el complejo CRISPR de la divulgación tiene un amplio espectro de aplicaciones en, p.ej., la terapia génica, el rastreo de fármacos, el diagnóstico de enfermedades y el pronóstico. Un complejo CRISPR ilustrativo comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia diana dentro del polinucleótido diana. La secuencia guía está vinculada a una secuencia de tracr mate, que a su vez se hibrida con una secuencia de tracr.
En una realización, esta invención se refiere a un método para escindir un polinucleótido diana. El método comprende modificar un polinucleótido diana utilizando un complejo CRISPR que se une al polinucleótido diana y efectúa la escisión de dicho polinucleótido diana. Típicamente, el complejo CRISPR de la divulgación, cuando se introduce en una célula, crea una rotura (p.ej., una rotura de cadena sencilla o de cadena doble) en la secuencia del genoma. Por ejemplo, el método puede utilizarse para escindir un gen de enfermedad en una célula.
La rotura creada por el complejo CRISPR puede repararse mediante procesos de reparación tales como la vía de unión final no homóloga (NHEJ) propensa a errores o la reparación dirigida por homología (HDR) de alta fidelidad (Figura 11). Durante este proceso de reparación, se puede introducir un molde de polinucleótidos exógenos en la secuencia del genoma. En algunos métodos, el proceso HDR se utiliza para modificar la secuencia del genoma. Por ejemplo, un molde de polinucleótido exógeno que comprende una secuencia a integrar flanqueada por una secuencia aguas arriba y una secuencia aguas abajo se introduce en una célula. Las secuencias aguas arriba y aguas abajo comparten similitud de secuencia con cualquier lado del sitio de integración en el cromosoma.
En los casos en los que se desee, un polinucleótido donante puede ser ADN, p.ej., un plásmido de ADN, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un vector viral, un fragmento lineal de ADN, un fragmento de PCR, un ácido nucleico desnudo o un ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro tal como un liposoma o un poloxámero.
El molde de polinucleótido exógeno comprende una secuencia a integrar (p.ej., un gen mutado). La secuencia para la integración puede ser una secuencia endógena o exógena a la célula. Ejemplos de una secuencia a integrar incluyen polinucleótidos que codifican una proteína o un ARN no codificante (p.ej., un microARN). Por lo tanto, la secuencia para la integración puede estar operativamente vinculada a una secuencia o secuencias de control apropiadas. Alternativamente, la secuencia a integrar puede proporcionar una función reguladora.
Las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el molde de polinucleótidos exógenos se seleccionan para fomentar la recombinación entre la secuencia cromosómica de interés y el polinucleótido donante. La secuencia aguas arriba es una secuencia de ácido nucleico que comparte similitud de secuencia con la secuencia del genoma aguas arriba del sitio fijado como objetivo para la integración. De manera similar, la secuencia aguas abajo es una secuencia de ácido nucleico que comparte similitud de secuencia con la secuencia cromosómica aguas abajo del sitio de integración fijado como objetivo. Las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el molde de polinucleótidos exógenos pueden tener una identidad de secuencia del 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% con la secuencia del genoma fijado como objetivo. Preferiblemente, las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el molde de polinucleótidos exógenos pueden tener una identidad de secuencia de aproximadamente el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la secuencia del genoma fijado como objetivo. En algunos métodos, las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el molde de polinucleótidos exógenos tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 99% o 100% con la secuencia del genoma fijada como objetivo.
Una secuencia aguas arriba o aguas abajo puede comprender de aproximadamente 20 pb a aproximadamente 2500 pb, por ejemplo, aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 o 2500 pb. En algunos métodos, la secuencia ilustrativa aguas arriba o aguas abajo tiene aproximadamente 200 pb a aproximadamente 2000 pb, aproximadamente 600 pb a aproximadamente 1000 pb, o más particularmente aproximadamente 700 pb a aproximadamente 1000 pb.
En algunos métodos, el molde de polinucleótido exógeno puede comprender, además, un marcador. Un marcador de este tipo puede facilitar el rastreo de integraciones fijadas como objetivo. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen sitios de restricción, proteínas fluorescentes o marcadores seleccionables. El molde de polinucleótidos exógenos a utilizar en la invención puede construirse utilizando técnicas recombinantes (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001 y Ausubel et al., 1996).
En un método ilustrativo para modificar un polinucleótido diana mediante la integración de un molde de polinucleótido exógeno, el complejo CRISPR introduce una rotura de doble cadena en la secuencia del genoma, la rotura se repara mediante recombinación homóloga mediante un molde de polinucleótido exógeno de modo que el molde se integre en el genoma. La presencia de una rotura de doble cadena facilita la integración del molde.
En otras realizaciones, la invención proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. El método comprende aumentar o disminuir la expresión de un polinucleótido diana al utilizar un complejo CRISPR que se une al polinucleótido.
En algunos métodos, un polinucleótido diana puede ser inactivado para efectuar la modificación de la expresión en una célula. Por ejemplo, tras la unión de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una célula, el polinucleótido diana es inactivado de modo que la secuencia no se transcribe, la proteína codificada no se produce o la secuencia no funciona como lo hace la secuencia de tipo salvaje. Por ejemplo, una proteína o secuencia codificante de microARN puede ser inactivada de manera que no se produzca la proteína.
En algunos métodos, una secuencia de control puede desactivarse de modo que ya no funcione como una secuencia de control. Tal como se utiliza en esta memoria, "secuencia de control" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que efectúa la transcripción, traducción o accesibilidad de una secuencia de ácido nucleico. Ejemplos de una secuencia de control que incluyen un promotor, un terminador de la transcripción y un potenciador son secuencias de control.
La secuencia diana inactivada puede incluir una mutación por deleción (es decir, deleción de uno o más nucleótidos), una mutación por inserción (es decir, inserción de uno o más nucleótidos) o una mutación sin sentido (es decir, la sustitución de un solo nucleótido por otro nucleótido).que se introduce un codón de parada). En algunos métodos, la inactivación de una secuencia diana da como resultado la "inactivación" de la secuencia diana.
Se puede utilizar un método de la invención para crear una planta, un animal o una célula que se puede utilizar como un modelo de enfermedad. Tal como se utiliza en esta memoria, "enfermedad" se refiere a una enfermedad, trastorno o indicación en un sujeto. Por ejemplo, un método de la invención puede utilizarse para crear un animal o célula que comprende una modificación en una o más secuencias de ácidos nucleicos asociadas con una enfermedad, o una planta, animal o célula en la que está alterada la expresión de uno o más secuencias de ácidos nucleicos asociadas con una enfermedad. Una secuencia de ácidos nucleicos de este tipo puede codificar una secuencia de proteína asociada a la enfermedad o puede ser una secuencia de control asociada a la enfermedad. Por consiguiente, se entiende que en realizaciones de la invención, una planta, sujeto, paciente, organismo o célula puede ser un sujeto, paciente, organismo o célula no humano. Por lo tanto, la invención proporciona una planta, animal o célula, producida por los presentes métodos, o una progenie de los mismos. La progenie puede ser un clon de la planta o animal producido, o puede ser el resultado de la reproducción sexual al cruzarse con otros individuos de la misma especie para introgresar otros rasgos deseables en su descendencia. La célula puede ser in vivo o ex vivo en los casos de organismos multicelulares, particularmente animales o plantas. En el caso en que la célula está en cultivo, se puede establecer una línea celular si se cumplen las condiciones de cultivo apropiadas y preferiblemente si la célula está adaptada adecuadamente para este propósito (por ejemplo, una célula madre). También se contemplan líneas celulares bacterianas producidas por la invención. Por lo tanto, también se contemplan líneas celulares.
En algunos métodos, el modelo de enfermedad puede utilizarse para estudiar los efectos de mutaciones en el animal o célula y el desarrollo y/o progreso de la enfermedad utilizando medidas comúnmente utilizadas en el estudio de la enfermedad. Alternativamente, dicho modelo de enfermedad es útil para estudiar el efecto de un compuesto farmacéuticamente activo sobre la enfermedad.
En algunos métodos, el modelo de enfermedad puede utilizarse para evaluar la eficacia de una estrategia potencial de terapia génica. Es decir, un gen o polinucleótido asociado con la enfermedad puede modificarse de manera que el desarrollo y/o el progreso de la enfermedad se inhiban o reduzcan. En particular, el método comprende modificar un gen o polinucleótido asociado con la enfermedad de modo que se produzca una proteína alterada y, como resultado, el animal o la célula tienen una respuesta alterada. Por consiguiente, en algunos métodos, un animal genéticamente modificado puede compararse con un animal predispuesto al desarrollo de la enfermedad, de modo que se pueda evaluar el efecto del evento de terapia génica.
En otra realización, esta invención se refiere a un método para desarrollar un agente biológicamente activo que modula un evento de señalización celular asociado con un gen de enfermedad. El método comprende poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que comprende uno o más vectores que impulsan la expresión de uno o más de una enzima CRISPR, una secuencia guía enlazada a una secuencia tracr mate y una secuencia tracr; y detectar un cambio en una lectura que sea indicativo de una reducción o un aumento de un evento de señalización celular asociado con, p.ej., una mutación en un gen de enfermedad contenido en la célula.
Se puede construir un modelo celular o modelo animal en combinación con el método de la invención para rastrear un cambio de función celular. Un modelo de este tipo puede utilizarse para estudiar los efectos de una secuencia genómica modificada por el complejo CRISPR de la divulgación sobre una función celular de interés. Por ejemplo, se puede utilizar un modelo de función celular para estudiar el efecto de una secuencia del genoma modificada sobre la señalización intracelular o la señalización extracelular. Alternativamente, se puede utilizar un modelo de función celular para estudiar los efectos de una secuencia genómica modificada en la percepción sensorial. En algunos de estos modelos se modifican una o más secuencias del genoma asociadas con una vía bioquímica de señalización en el modelo.
Varios modelos de enfermedades han sido específicamente investigados. Estos incluyen genes de riesgo de autismo de novo CHD8, KATNAL2 y SCN2A; y el gen del síndrome autista sindrómico (síndrome de Angelman) UBE3A. Por supuesto, se prefieren estos genes y los modelos de autismo resultantes, pero sirven para mostrar la amplia aplicabilidad de la invención a través de genes y modelos correspondientes.
Una expresión alterada de una o más secuencias del genoma asociadas con una ruta bioquímica de señalización se puede determinar mediante el ensayo de una diferencia en los niveles de ARNm de los genes correspondientes entre la célula modelo de ensayo y una célula de control, cuando se ponen en contacto con un agente candidato. Alternativamente, la expresión diferencial de las secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización se determina detectando una diferencia en el nivel del polipéptido codificado o producto génico.
Para ensayar una alteración inducida por el agente en el nivel de transcritos de ARNm o polinucleótidos correspondientes, el ácido nucleico contenido en una muestra se extrae primero de acuerdo con métodos estándar en la técnica. Por ejemplo, el ARNm se puede aislar utilizando diversas enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos recogidos en Sambrook et al.(1989), o se puede extraer mediante resinas de unión a ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes. El ARNm contenido en la muestra de ácido nucleico extraído se detecta luego mediante procedimientos de amplificación o ensayos de hibridación convencionales (p.ej., análisis de transferencia Northern) de acuerdo con métodos ampliamente conocidos en la técnica o basados en los métodos ejemplificados en esta memoria.
Para el propósito de esta invención, amplificación significa cualquier método que emplee un cebador y una polimerasa capaz de replicar una secuencia diana con una fidelidad razonable. La amplificación puede llevarse a cabo mediante ADN polimerasas naturales o recombinantes, tales como TaqGold™, ADN polimerasa T7, fragmento Klenow de ADN polimerasa de E.coli y transcriptasa inversa. Un método de amplificación preferido es la PCR. En particular, el ARN aislado puede someterse a un ensayo de transcripción inversa que se combina con una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-PCR) con el fin de cuantificar el nivel de expresión de una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización.
La detección del nivel de expresión génica se puede realizar en tiempo real en un ensayo de amplificación. En un aspecto, los productos amplificados se pueden visualizar directamente con agentes de unión a ADN fluorescentes que incluyen, pero no se limitan a intercaladores de ADN y aglutinantes de ranura de ADN. Debido a que la cantidad de intercaladores incorporados en las moléculas de ADN de doble cadena es típicamente proporcional a la cantidad de productos de ADN amplificados, se puede determinar convenientemente la cantidad de productos amplificados cuantificando la fluorescencia del colorante intercalado utilizando sistemas ópticos convencionales en la técnica. El colorante de unión al ADN adecuado para esta aplicación incluye SYBR verde, SYBR azul, DAPI, yoduro de propidio, Hoeste, SYBR oro, bromuro de etidio, acridinas, proflavina, naranja de acridina, acriflavina, fluorcoumanina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, homidio, mitramicina, rutenio, polipiridilos, antramicina y similares.
En otro aspecto, se pueden emplear otros marcadores fluorescentes tales como sondas específicas para secuencia en la reacción de amplificación para facilitar la detección y cuantificación de los productos amplificados. La amplificación cuantitativa basada en la sonda se basa en la detección específica de secuencia de un producto amplificado deseado. Utiliza sondas fluorescentes específicas para la diana (p.ej., sondas TaqMan®) que dan como resultado una mayor especificidad y sensibilidad. Métodos para realizar la amplificación cuantitativa basada en sonda están bien establecidos en la técnica y se enseñan en la Patente de EE.UU.N25.210.015.
En aún otro aspecto, se pueden realizar ensayos de hibridación convencionales que utilizan sondas de hibridación que comparten homología de secuencia con secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización. Típicamente, se permite que las sondas formen complejos estables con las secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización contenida dentro de la muestra biológica derivada del sujeto de ensayo en una reacción de hibridación. Un experto en la técnica apreciará que cuando se utiliza antisentido como ácido nucleico de sonda, los polinucleótidos diana proporcionados en la muestra se eligen para ser complementarios a las secuencias de los ácidos nucleicos antisentido. Por el contrario, cuando la sonda de nucleótidos es un ácido nucleico sentido, el polinucleótido diana se selecciona para que sea complementario a las secuencias del ácido nucleico sentido.
La hibridación se puede realizar en condiciones de diversa rigurosidad. Las condiciones de hibridación adecuadas para la práctica de la presente invención son tales que la interacción de reconocimiento entre la sonda y las secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización es tanto suficientemente específica como suficientemente estable. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica. Véase, por ejemplo, (Sambrook, et al., (1989); Manual de aplicación de hibridación in situ no radiactivo, Boehringer Mannheim, segunda edición). El ensayo de hibridación puede formarse utilizando sondas inmovilizadas en cualquier soporte sólido, que incluyen, pero no se limitan a nitrocelulosa, vidrio, silicio y una diversidad de conjuntos de genes. Se realiza un ensayo de hibridación preferido en chips de genes de alta densidad como se describe en la Patente de EE.UU.N25.445.934.
Para una detección conveniente de los complejos sonda-diana formados durante el ensayo de hibridación, las sondas de nucleótidos se conjugan con un marcador detectable. Marcadores detectables adecuados para su uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable por medios fotoquímicos, bioquímicos, espectroscópicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. En la técnica se conoce una amplia variedad de marcadores detectables apropiados, que incluyen marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes, marcadores de isótopos radiactivos, ligandos enzimáticos u otros. En realizaciones preferidas, probablemente se deseará emplear un marcador fluorescente o una etiqueta enzimática, tal como digoxigenina, p-galactosidasa, ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, complejo de avidina/biotina.
Los métodos de detección utilizados para detectar o cuantificar la intensidad de hibridación dependerán típicamente del marcador seleccionada anteriormente. Por ejemplo, los radiomarcadores pueden detectarse utilizando una película fotográfica o un aparato fosfoimager. Los marcadores fluorescentes pueden detectarse y cuantificarse utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan típicamente proporcionando a la enzima un sustrato y midiendo el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato; y finalmente los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando el marcador coloreado.
También se puede determinar un cambio inducido por el agente en la expresión de secuencias asociadas con una ruta bioquímica de señalización examinando los productos génicos correspondientes. La determinación del nivel de proteína típicamente implica a) poner en contacto la proteína contenida en una muestra biológica con un agente que se une específicamente a una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización; y (b) identificar cualquier agente: complejo proteico así formado. En un aspecto de esta realización, el agente que se une específicamente a una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
La reacción se realiza poniendo en contacto el agente con una muestra de las proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización derivada de las muestras de prueba en condiciones que permitirán que se forme un complejo entre el agente y las proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización. La formación del complejo se puede detectar directa o indirectamente de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica. En el método de detección directa, los agentes se suministran con un marcador detectable y los agentes que no han reaccionado pueden separarse del complejo; la cantidad de marcador restante indicando así la cantidad de complejo formado. Para un método de este tipo, es preferible seleccionar marcadores que permanezcan fijados a los agentes incluso durante condiciones de lavado rigurosas. Es preferible que el marcador no interfiera con la reacción de unión. Como alternativa, un procedimiento de detección indirecta puede utilizar un agente que contiene un marcador introducido química o enzimáticamente. Un marcador deseable generalmente no interfiere con la unión o la estabilidad del complejo agente:polipéptido resultante. Sin embargo, el marcador está diseñado típicamente para que sea accesible a un anticuerpo para una unión efectiva y, por lo tanto, generar una señal detectable.
En la técnica se conoce una amplia diversidad de marcadores adecuados para detectar niveles de proteínas. Ejemplos no limitantes incluyen radioisótopos, enzimas, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos bioluminiscentes y compuestos quimioluminiscentes.
La cantidad de complejos de agente:polipéptido formados durante la reacción de unión puede cuantificarse mediante ensayos cuantitativos estándar. Tal como se ilustra arriba, la formación del complejo agente:polipéptido se puede medir directamente por la cantidad de marcador que permanece en el sitio de unión. En una alternativa, la proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización se testa para determinar su capacidad de competir con un análogo marcado para sitios de unión en el agente específico. En este ensayo competitivo, la cantidad de marcador capturado es inversamente proporcional a la cantidad de secuencias de proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización presente en una muestra de ensayo.
Un cierto número de técnicas para el análisis de proteínas basadas en los principios generales esbozados anteriormente están disponibles en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunorradiométricos ligados a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos in situ (utilizando, p.ej., oro coloidal, marcadores de enzimas o radioisótopos), análisis de transferencia western, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunofluorescentes.y SDS-PAGE.
Anticuerpos que reconocen específicamente o se unen a proteínas asociadas con una ruta bioquímica de señalización son preferibles para realizar los análisis de proteínas mencionados anteriormente. Cuando se desee, se pueden utilizar anticuerpos que reconocen un tipo específico de modificaciones post-traduccionales (p.ej., modificaciones inducibles de la ruta bioquímica de señalización). Las modificaciones post-traduccionales incluyen, pero no se limitan a glicosilación, lipidación, acetilación y fosforilación. Estos anticuerpos se pueden adquirir de vendedores comerciales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen específicamente las proteínas fosforiladas en tirosina están disponibles de un cierto número de proveedores, incluidos Invitrogen y Perkin Elmer. Los anticuerpos antifosfotirosina son particularmente útiles en la detección de proteínas que se fosforilan diferencialmente en sus residuos de tirosina en respuesta a un estrés ER. Dichas proteínas incluyen, pero no se limitan al factor de iniciación de la traducción eucariota 2 alfa (eIF-2a). Alternativamente, estos anticuerpos pueden generarse utilizando tecnologías de anticuerpos policlonales o monoclonales convencionales, inmunizando un animal huésped o una célula productora de anticuerpos con una proteína diana que exhibe la modificación post-traduccional deseada.
Al poner en práctica el método en cuestión, puede ser deseable discernir el patrón de expresión de una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización en diferentes tejidos corporales, en diferentes tipos de células y/o en diferentes estructuras subcelulares. Estos estudios se pueden realizar con el uso de anticuerpos específicos para tejidos, específicos para células o de estructuras subcelulares capaces de unirse a marcadores de proteínas que se expresan preferentemente en determinados tejidos, tipos de células o estructuras subcelulares.
Una expresión alterada de un gen asociado con una ruta bioquímica de señalización también se puede determinar examinando un cambio en la actividad del producto génico en relación con una célula de control. El ensayo para un cambio inducido por el agente en la actividad de una proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización dependerá de la actividad biológica y/o la ruta de transducción de señales que se está investigando. Por ejemplo, cuando la proteína es una quinasa, un cambio en su capacidad para fosforilar el o los sustratos aguas abajo puede determinarse mediante una variedad de ensayos conocidos en la técnica. Los ensayos representativos incluyen, pero no se limitan a inmunotransferencia e inmunoprecipitación con anticuerpos tales como anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen proteínas fosforiladas. Además, la actividad de la quinasa se puede detectar mediante ensayos quimioluminiscentes de alto rendimiento tales como AlphaScreen™ (disponible de Perkin Elmer) y el ensayo eTag™ (Chan-Hui, et al.(2003) Clinical Immunology 111: 162-174).
En los casos en los que la proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización es parte de una cascada de señalización que conduce a una fluctuación de la condición del pH intracelular, moléculas sensibles al pH, tales como los colorantes fluorescentes de pH, pueden utilizarse como moléculas informadoras. En otro ejemplo, en los casos en los que la proteína asociada con una ruta bioquímica de señalización es un canal de iones, pueden controlarse las fluctuaciones en el potencial de membrana y/o la concentración de iones intracelulares. Un cierto número de kits comerciales y dispositivos de alto rendimiento son particularmente adecuados para un rastreo rápido y robusto de moduladores de canales de iones. Instrumentos representativos incluyen FLIPRTM (Molecular Devices, Inc.) y VIPR (Aurora Biosciences). Estos instrumentos son capaces de detectar reacciones en más de 1000 pocillos de muestra de una microplaca simultáneamente, y proporcionan mediciones en tiempo real y datos funcionales en un segundo o incluso un minisegundo.
En la puesta en práctica de cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, se puede introducir un vector adecuado en una célula o un embrión a través de uno o más métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, microinyección, electroporación, sonoporación, biolística, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección catiónica, transfección de liposomas, transfección de dendrímeros, transfección de choque térmico, transfección de nucleofección, magnetofección, lipofección, impalefección, transfección óptica, captación de ácidos nucleicos potenciada por agentes de propiedad y suministro a través de liposomas, inmunoliposomas, virosomas o viriones artificiales. En algunos métodos, el vector se introduce en un embrión por microinyección. El vector o los vectores pueden microinyectarse en el núcleo o el citoplasma del embrión. En algunos métodos, el vector o los vectores se pueden introducir en una célula por nucleofección.
El polinucleótido diana de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariótica. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que reside en el núcleo de la célula eucariótica. El polinucleótido diana puede ser una secuencia que codifica un producto génico (p.ej., una proteína) o una secuencia no codificante (p.ej., un polinucleótido regulador o un ADN basura).
Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización, p.ej., un gen o polinucleótido asociado a la ruta bioquímica de señalización. Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado con la enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado con la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que proporciona productos de transcripción o traducción a un nivel anormal o en una forma anormal en células derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparación con tejidos o células de un control sin enfermedad. Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en que la expresión alterada se correlaciona con la aparición y/o el progreso de la enfermedad. Un gen asociado con una enfermedad también se refiere a un gen que posee mutación o mutaciones o variación genética que es directamente responsable o está en desequilibrio de enlace con uno o más genes que son responsables de la etiología de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos, y pueden estar en un nivel normal o anormal.
El polinucleótido diana de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariótica. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que reside en el núcleo de la célula eucariótica. El polinucleótido diana puede ser una secuencia que codifica un producto génico (p.ej., una proteína) o una secuencia no codificante (p.ej., un polinucleótido regulador o un ADN basura).
Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una ruta bioquímica de señalización, p.ej., un gen o polinucleótido asociado a la ruta bioquímica de señalización. Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado con la enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado con la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que proporciona productos de transcripción o traducción a un nivel anormal o en una forma anormal en células derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparación con tejidos o células de un control sin enfermedad. Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en que la expresión alterada se correlaciona con la aparición y/o el progreso de la enfermedad. Un gen asociado con una enfermedad también se refiere a un gen que posee mutación o mutaciones o variación genética que es directamente responsable o está en desequilibrio de enlace con uno o más genes que son responsables de la etiología de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos, y pueden estar en un nivel normal o anormal.
Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados con la enfermedad se enumeran en las Tablas A y B. La información específica de la enfermedad está disponible en el Instituto de Medicina Genética McKusick-Nathans, Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Md) y Centro Nacional de Información Biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, Md), disponible en la World Wide Web. En la Tabla C se enumeran ejemplos de señalización de genes y polinucleótidos asociados con la ruta bioquímica.
Las mutaciones en estos genes y rutas pueden provocar la producción de proteínas inadecuadas o proteínas en cantidades inadecuadas que afectan a la función.
Estos genes, proteínas y rutas pueden ser el polinucleótido diana de un complejo CRISPR.
Tabla A
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Tabla B:
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Tabla C:
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Realizaciones de la invención también se refieren a métodos y composiciones relacionadas con la inactivación de genes, la amplificación de genes y la reparación de mutaciones particulares asociadas con la inestabilidad repetida del ADN y los trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edición, Academic Press, 13 de oct de 2011 - Medical). Se ha descubierto que los aspectos específicos de las secuencias de repetición en tándem son responsables de más de veinte enfermedades humanas (New insights into repeat instability: role of RNA^DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. Sep-oct de 2010: 7(5):551-8). El sistema CRISPR-Cas puede aprovecharse para corregir estos defectos de inestabilidad genómica.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a la utilización del sistema CRISPR-Cas para corregir defectos en los genes EMP2A y EMP2B que se han identificado como asociados con la enfermedad de Lafora. La enfermedad de Lafora es una afección autosómica recesiva que se caracteriza por una epilepsia mioclónica progresiva que puede comenzar como convulsiones epilépticas en la adolescencia. Algunos casos de la enfermedad pueden ser provocados por mutaciones en genes aún por identificar. La enfermedad provoca convulsiones, espasmos musculares, dificultad para caminar, demencia y finalmente la muerte. Actualmente no existe una terapia que haya demostrado su eficacia contra la progresión de la enfermedad. El sistema CRISPR-Cas también puede fijar como objetivo otras anormalidades genéticas asociadas con la epilepsia y la genética subyacente se describe con más detalle en Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009).
En aún otro aspecto de la invención, el sistema CRISPR-Cas puede utilizarse para corregir defectos oculares que surgen de varias mutaciones genéticas descritas adicionalmente en Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edición, editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.
Varios aspectos adicionales de la invención se refieren a corregir defectos asociados con una amplia gama de enfermedades genéticas que se describen adicionalmente en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud bajo la subsección del tema Trastornos Genéticos (sitio web en health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). Las enfermedades genéticas del cerebro pueden incluir, pero no se limitan a Adrenoleucodistrofia, Agenesia del Cuerpo Calloso, Síndrome de Aicardi, Enfermedad de Alpers, Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Barth, Enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneración Cerebelosa, Enfermedad de Fabry, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Enfermedad de Huntington y otros Trastornos de Repetición de Triplete, Enfermedad de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Enfermedad de Menkes, Miopatías Mitocondriales y Colpocefalia NINDS. Estas enfermedades se describen adicionalmente en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud bajo la subsección Trastornos Cerebrales Genéticos.
En algunas realizaciones, la afección puede ser neoplasia. En algunas realizaciones, en donde la afección es neoplasia, los genes a fijar como objetivo son cualquiera de los enumerados en la Tabla A (en este caso, PTEN, etcétera). En algunas realizaciones, la afección puede ser Degeneración Macular relacionada con la Edad. En algunas realizaciones, la afección puede ser un T rastorno Esquizofrénico. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno por Repetición de Trinucleótidos. En algunas realizaciones, la afección puede ser el Síndrome X Frágil. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Relacionado con Secretasa. En algunas realizaciones, la afección puede ser un un trastorno relacionado con el Prión. En algunas realizaciones, la afección puede ser ALS. En algunas realizaciones, la afección puede ser una adicción a las drogas. En algunas realizaciones, la afección puede ser Autismo. En algunas realizaciones, la afección puede ser la Enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afección puede ser Inflamación. En algunas realizaciones, la afección puede ser la Enfermedad de Parkinson.
Ejemplos de proteínas asociadas con la enfermedad de Parkinson incluyen, pero no se limitan a a-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Sinfilina-1 y NURR1.
Ejemplos de proteínas relacionadas con la adicción pueden incluir ABAT, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas relacionadas con la inflamación pueden incluir la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimiocina C-C tipo 5 (CCR5) codificado por el gen Ccr5, el receptor de IgG IIB (FCGR2b, también denominado CD32) codificado por el gen Fcgr2b, o la proteína Fc epsilon R1g (FCER1g) codificada por el gen Fcer1g, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleuquina 1, beta), XDH (xantina deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleuquina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, subfamilia G (w H iTE), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la proteína del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR) codificada por el gen VLDLR, la enzima activadora del modificador similar a la ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la proteína subunidad catalítica E1 de la enzima activadora NEDD8 E1 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.
Ejemplos del Trastorno del Espectro Autista asociado a proteínas pueden incluir la proteína 1 (BZRAP1) asociada al receptor de benzodiazapina (periférica) codificada por el gen BZRAP1, la proteína miembro 2 de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominado MFR2), la proteína de homólogo 1 autosómica de retraso mental X frágil (FXR1) codificada por el gen FXR1 o la proteína de homólogo 2 autosómica de retraso mental X frágil (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.
Ejemplos de Degeneración Macular asociada a proteínas pueden incluir el casete de unión a ATP, la proteína miembro 4 de la subfamilia A (ABC1) (ABCA4) codificada por el gen ABCR, la proteína de la apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE o la quimioquina (motivo C-C) proteína del Ligando 2 (CCL2) codificada por el gen CCL2, por ejemplo.
Ejemplos de esquizofrenia asociada a proteínas pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B y combinaciones de los mismos.
Ejemplos de proteínas implicadas en la supresión del tumor pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 (v-erbb2 homólogo oncogén viral 2 de la leucemia eritroblástica), ERBB3 ( v-erb-b2 homólogo 3 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica), ERBB4 (v-erb-b2 homólogo 4 del oncogen viral de la leucemia eritroblástica), Notch 1, Notch2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas con un trastorno de secretasa pueden incluir PSENEN (homólogo de potenciador de presenilina 2 (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora de beta amiloide beta (A4)), APH1B (homólogo B de la faringe anterior defectuosa 1 (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima de escisión de APP del sitio beta 1), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas con la Esclerosis Lateral Amiotrófica pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión al ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A), VAGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B) y VAGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), y cualquier combinación de los mismos.
Ejemplos de proteínas asociadas con enfermedades priónicas pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión al ADN TAR), VAGFA ( factor de crecimiento endotelial vascular A), VAGFB ( factor de crecimiento endotelial vascular B) y VAGFC (factor de crecimiento endotelial vascular C), y cualquier combinación de los mismos.
Ejemplos de proteínas relacionadas con afecciones neurodegenerativas en los trastornos priónicos pueden incluir A2M (alfa-2-macroglobulina), AATF (factor de transcripción antagonista de la apoptosis), ACPP (fosfatasa ácida de próstata), ACTA2 (actina alfa 2 de la aorta de músculo liso), ADAM22 (dominio de metalopeptidasa de ADAM), ADORA3 (receptor de Adenosina A3) o ADRA1D (receptor adrenérgico Alfa-ID para el receptor adrenérgico alfa-1 D), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas con la inmunodeficiencia pueden incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 2]; o ABCA3 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas con los Trastornos por Repetición de Trinucleótidos incluyen AR (receptor de andrógenos), FMR1 (retraso mental X frágil 1), HTT (huntingtina) o DMPK (distrofia miotonica-proteína quinasa), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas con los Trastornos de Neurotransmisión incluyen SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor adrenérgico, alfa-2A), ADRA2C (receptor adrenérgico, alfa-2C), TACR1 (receptor de taquiquinina 1), o HTR2c (receptor de 5-hidroxitriptamina (serotonina) 2C), por ejemplo.
Ejemplos de secuencias asociadas al desarrollo neurológico incluyen A2BP1 [proteína 1 de unión a ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1], o ABCA13 [casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 13], por ejemplo.
Se pueden seleccionar ejemplos adicionales de afecciones preferibles tratables con el presente sistema de: Síndrome de Aicardi-Goutieres; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos Relacionados con POLG; Alfa-manosidosis (tipo II y III); Síndrome de Alstrom; Angelman; Síndrome; Ataxia-telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroides Neuronal; Beta-talasemia; Atrofia Óptica Bilateral y Atrofia Óptica (infantil) tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome Cerebrooculofacioesquelético 1 [COFS1]; Xantomatosis cerebrotendinosa; Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Genéticas por Priones; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Brote Temprano; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Orgánicas; Linfohistiocitosis Hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico Libre Infantil; Neurodegeneración Asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermólisis Bullosa de la Unión; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh Asociado a ADN Mitocondrial y NARP; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad de la Orina por Jarabe de Arce; Síndrome de Duplicación MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionados con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de Biogénesis de Peroxisomas, Espectro del Síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con Trastornos de Acumulación de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de Esfingomielinasa Ácida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatía por Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogénesis Imperfecta Relacionada con COL1A1 / 2; Síndromes de Deleción de ADN Mitocondrial; Trastornos Relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Enfermedad de Almacenamiento de Glucógeno Tipo II (enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Rizomelica Punctata Tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler - Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Desaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular en la Columna; Ataxia Espinocerebelosa de Inicio Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia Tanatofórica tipo 1; Trastornos Relacionados con el Colágeno Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de Lipasa Ácida Lisosómica; y Xeroderma Pigmentoso.
Como resultará evidente, se prevé que el presente sistema pueda utilizarse para fijar como objetivo cualquier secuencia de polinucleótidos de interés. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que podrían tratarse de manera útil utilizando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y allí también se proporcionan ejemplos de genes actualmente asociados con esas afecciones. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.
Por ejemplo, "StCas9 de tipo salvaje" se refiere a Cas9 de tipo salvaje de S thermophilus, cuya secuencia de proteínas se proporciona en la base de datos SwissProt con el número de acceso G3ECR1. Del mismo modo, Cas9 de S. pyogenes está incluida en SwissProt con el número de acceso Q99ZW2.
La capacidad de utilizar los sistemas CRISPR-Cas para realizar una edición y manipulación de genes eficiente y rentable permitirá la selección y comparación rápidas de manipulaciones genéticas simples y multiplexadas para transformar dichos genomas para una producción mejorada y rasgos potenciados. A este respecto, se hace referencia a las patentes y publicaciones de Ee .UU. : Patente de EE.UU. N° 6.603.061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; Patente de EE.UU. N° 7.868, 149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof y documento US 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits. En la práctica de la invención, los contenidos y la divulgación de Morrell et al "Crop genomics: advances and applications" Nat Rev Genet. 29 diciembre de 2011; 13(2):85-96.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en esta memoria son actualmente representativos de realizaciones preferidas, son ilustrativos y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención.
E jem plo 1: M ejora m etodológica para s im plificar la clonación y e l sum inistro.
En lugar de codificar el promotor U6 y el ARN guía en un plásmido, las solicitantes amplificaron el promotor U6 con un oligo de ADN a añadir al ARN guía. El producto de PCR resultante se puede transfectar en células para impulsar la expresión del ARN guía.
Ejemplo de par de cebadores que permite la generación de un producto de PCR que consiste en el promotor U6::ARN guía que fija como objetivo al locus Emx1 humano:
Cebador Directo: AAACTCTAGAgagggcctatttcccatgattc
Cebador inverso (que porta el ARN guía, que está subrayado):
CTT ATTTT AACTT GCT AT GCT GTTTT GTTTCC AAAACAGC AT AGCTCT AAAACCCC TAGTCATTGGAGGTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACaag
E jem plo 2 : M ejora m etodológica para m ejorar la actividad:
En lugar de utilizar promotores pol3, en particular ARN polimerasa III (p. ej., promotores U6 o H1), para expresar ARN guía en células eucarióticas, las solicitantes expresan la polimerasa T7 en células eucarióticas para impulsar la expresión de ARN guía utilizando el promotor T7.
Un ejemplo de este sistema puede implicar la introducción de tres trozos de ADN:
1. vector de expresión para Cas9
2. vector de expresión para T7 polimerasa
3. vector de expresión que contiene ARN guía fusionado al promotor T7
E jem plo 3: M ejora m etodológica para red u cir la toxicidad de Cas9: Sum inistro de C as9 en form a de A RNm .
El suministro de Cas9 en forma de ARNm permite la expresión transitoria de Cas9 en las células, para reducir la toxicidad. Por ejemplo, SpCas9 humanizada puede amplificarse utilizando el siguiente par de cebadores: Cebador Directo (para añadir el promotor T7 para la transcripción in vitro): TAATACGACTCACTATAGGAAGTGCGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGG
Cebador Inverso (para añadir en la cola poliA): GGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTttcttaCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCG
Las solicitantes transfectan el ARNm de Cas9 en células con ARN guía en forma de casetes de ARN o ADN para impulsar la expresión de ARN guía en células eucariotas.
E jem plo 4 : M ejora m etodológica para red u cir la toxicidad de Cas9: Uso de un p rom otor inducible
Las solicitantes activan transitoriamente la expresión de Cas9 solo cuando es necesario para llevar a cabo la modificación del genoma. Ejemplos de sistemas inducibles incluyen promotores inducibles por tetraciclina (Tetactivado o Tet-desactivado), sistemas de activación de transcripción de dos híbridos de molécula pequeña (FKBP, ABA, etc.) o sistemas inducibles por la luz (Fitocromo, dominios de LOV o criptocromo).
Ejem plo 5 : M ejora d e l sistem a C as9 para aplicación in vivo
Las solicitantes realizaron una búsqueda Metagenómica de una Cas9 con pequeño peso molecular. La mayoría de los homólogos de Cas9 son bastante grandes. Por ejemplo, la SpCas9 tiene alrededor de 1368 aa de largo, que es demasiado grande para ser empaquetado fácilmente en vectores virales para su suministro. Se genera un gráfico que representa la distribución de longitud de los homólogos de Cas9 a partir de secuencias depositadas en GenBank (Figura 5). Algunas de las secuencias pueden haber sido anotadas erróneamente y, por lo tanto, la frecuencia exacta para cada longitud puede no ser necesariamente precisa. Sin embargo, proporciona una idea de la distribución de las proteínas Cas9 y sugiere que hay homólogos Cas9 más cortos.
A través del análisis computacional, las solicitantes encontraron que en la cepa bacteriana Campylobacter hay dos proteínas Cas9 con menos de 1000 aminoácidos. La secuencia para una Cas9 de Campylobacter jejuni se presenta a continuación. Con esta longitud, CjCas9 se puede empaquetar fácilmente en AAV, lentivirus, adenovirus y otros vectores virales para un suministro robusto a las células primarias e in vivo en modelos animales. En una realización preferida de la invención, se utiliza la proteína Cas9 de S. aureus.
>Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)
MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLAR
SARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLTSPYELRFRALN ELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYK EYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVL S VAFYKRALKDF SHL V GNCS FFTDEKR APKN S PLAFMF VALTRIINLLNNLKNTEGIL YTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKAL GEHNLSQDDLNE1AKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKAL
KLVTPLM LEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPW LRAIKE YRKVLNALLKKYGKVHKTNIELAREVGKNHSQRAKTEKEQNENYKAKKDAELECEK LGLK1N SKMJLKLRLFKEQKEFCAY SGEK1KISDLQDEKMLEIDH1YPY SRSFDDS YMN
KVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAK.NLPTKKQ1CRÍLDKNYKDKEQ
KNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGM LTSALRHTW GFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAK KISELD YKNKRKFFEPF S GFRQKVLDKIDE1F VSKPERKKPS G ALHEETFRKEEEF YQS
YGGKEGVLKALELGK1RKVNGK1VKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALK
VLPNKAVARSKKGEIKD WILMDEN YEE CFSLYKDSLILIQTKDMQEPEEVY YNAETS S TVSLIVSKHDNKFETLSKNQKJLFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKA EFRQREDFKK.
El putativo elemento ARNtracr para esta CjCas9 es:
TATAATCTCATAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAATAAAGAGTTTGCG
GGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTAAAATT
La secuencia de Repetición Directa es:
ATTTT ACCATAAAGAAATTT AAAAAGGGACT AAAAC
Un ejemplo de un ARN guía quimérico para CjCas9 es:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG UUUUAG UCCCG AAAG G G ACUAAAAU
AAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU
Ejem plo 6: Optim ización de Cas9
Para potenciar la función o para desarrollar nuevas funciones, las solicitantes generan proteínas Cas9 quiméricas combinando fragmentos de diferentes homólogos de Cas9. Por ejemplo, dos ejemplos de proteínas Cas9 quiméricas:
Por ejemplo, las solicitantes fusionaron el extremo N de St1Cas9 (el fragmento de esta proteína está en negrita) con el extremo C de SpCas9 (el fragmento de esta proteína está subrayado).
>St1 (N)Sp(C)Cas9
MSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTN
RQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEE LFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERY QTYGQLRGDFTVEKDGKKHRLINVFPTSAYRSEALR1LQTQQEFNPQ1TDEFINR
YLETLTGKRKYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILTGKCTFYPDEFRAAK ASYTAQEFNLLNDLNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAK LLSCDVADIKGYR1DKSGKAE1HTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLT
LNTEREGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMME LIPELYETSEEQMTTLTRLGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPWAKSVRQAIK IVNAAIKEYGDFDNIVIEMARENOTTOKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSOILKEHPVE NTOLONEKLYLYYLONGRDMYVDOELDINRLSDYDVDHIVPOSFLKDDSIDNKVLT RSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKMYWROLLNAKL1TORKFDNLTKAERGGLSELDK
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GAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATL1HQSlTGLYETRiDLSOLGGD
>Sp(N)St1 (C)Cas9
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LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRRNR1CYL0E1FSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVE
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El beneficio de hacer Cas9 quiméricas incluye:
toxicidad reducida
expresión mejorada en células eucarióticas
especificidad potenciada
peso molecular reducido de la proteína, hace que la proteína sea más pequeña al combinar los dominios más pequeños de diferentes homólogos de Cas9.
alterando el requisito de secuencia PAM.
Ejem plo 7: U tilización de Cas9 com o prote ína genérica de unión a l A D N
Las solicitantes utilizaron Cas9 como una proteína genérica de unión al ADN mediante la mutación de los dos dominios catalíticos (D10 y H840) responsables de escindir ambas cadenas de la diana de ADN. Con el fin de regular al alza la transcripción génica en un lugar diana, las solicitantes fusionaron el dominio de activación transcripcional (VP64) a Cas9. Las solicitantes plantearon la hipótesis de que sería importante ver una fuerte localización nuclear de la proteína de fusión Cas9-VP64 porque la fuerza de activación del factor de transcripción es una función del tiempo pasado en la diana. Por lo tanto, las solicitantes clonaron un conjunto de construcciones Cas9-VP64-GFP, las transfectaron en células 293 y evaluaron su localización bajo un microscopio fluorescente 12 horas después de la transfección.
Las mismas construcciones se clonaron como una 2A-GFP en lugar de una fusión directa con el fin de testar funcionalmente las construcciones sin interferir una GFP voluminosa presente. Las solicitantes eligieron fijar como objetivo al locus Sox2 con el transactivador Cas9 porque podría ser útil para la reprogramación celular y el locus ya ha sido validado como una diana para la activación transcripcional mediada por TALE-TF. Para el locus Sox2, las solicitantes eligieron ocho dianas cerca del sitio de inicio de la transcripción (TSS). Cada una de las dianas tenía 20 pb de largo con un motivo adyacente protoespaciador NGG adyacente (PAM). Cada una de las construcciones Cas9-VP64 se co-transfectó con cada uno de los ARN crispr quiméricos (ARNqui) generados por PCR en células 293. 72 horas después de la transfección, la activación transcripcional se evaluó utilizando RT-qPCR.
Para optimizar adicionalmente el activador transcripcional, las solicitantes valoraron la relación de ARNqui (Sox2.1 y Sox2.5) a Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS), se transfectaron en células 293 y se cuantificaron utilizando RT- qPCR. Estos resultados indican que Cas9 puede utilizarse como un dominio genérico de unión al ADN para regular al alza la transcripción génica en un locus diana.
Las solicitantes diseñaron una se unda eneración de construcciones. Tabla que fi ura a continuación .
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Las solicitantes utilizan estas construcciones para evaluar la activación transcripcional (construcciones fusionadas VP64) y la represión (solo Cas9) por RT-qPCR. Las solicitantes evalúan la localización celular de cada una de las construcciones utilizando el anticuerpo anti-His, la actividad nucleasa utilizando un ensayo de nucleasa Surveyor y la afinidad de unión al ADN utilizando un ensayo de cambio de gel. En una realización preferida de la divulgación, el ensayo de desplazamiento de gel es un ensayo de desplazamiento de gel EMSA.
Ejem plo 8 : Cas9 transgénico e inserción en ratones
Para generar un ratón que exprese la nucleasa Cas9, las solicitantes presentan dos estrategias generales, transgénicas y de inserción. Estas estrategias pueden aplicarse para generar cualquier otro organismo modelo de interés, p. ej., para Rata. Para cada una de las estrategias generales, las solicitantes hicieron una Cas9 constitutivamente activa y una Cas9 que se expresa condicionalmente (dependiente de la recombinasa Cre. La nucleasa Cas9 constitutivamente activa se expresa en el siguiente contexto: pCAG-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpoliA. pCAG es el promotor, NLS es una señal de localización nuclear, P2A es la secuencia de escisión de péptidos, EGFP es una proteína fluorescente verde potenciada, WPRE es el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota, y bGHpoliA es la secuencia de señal poli-A de la hormona de crecimiento bovina (Figuras 7A-B). La versión condicional tiene un elemento de casete de parada adicional, loxP-SV40 poliA x3-loxP, detrás del promotor y delante de NLS-Cas9-NLS (es decir, pCAG-loxP-SV40poliAx3-loxP-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpoliA). Los elementos de expresión importantes se pueden visualizar como en la Figura 8. La construcción constitutiva debería expresarse en todos los tipos de células durante el desarrollo, mientras que la construcción condicional solo permitirá la expresión de Cas9 cuando la misma célula esté expresando la recombinasa Cre. Esta última versión permitirá la expresión específica de tejido de Cas9 cuando Cre está bajo la expresión de un promotor específico para tejidos. Además, la expresión de Cas9 podría inducirse en ratones adultos poniendo Cre bajo la expresión de un promotor inducible tal como el sistema TET activado o desactivado.
Validación de construcciones Cas9: Cada uno de los plásmidos fue validado funcionalmente de tres maneras: 1) transfección transitoria en células 293, seguido de la confirmación de la expresión de GFP; 2) transfección transitoria en células 293 seguida de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo que reconoce la secuencia P2A; y 3) transfección transitoria seguida de ensayo de nucleasa Surveyor. Las células 293 pueden ser células 293FT o 293T dependiendo de que las células sean de interés. En una realización preferida, las células son células 293FT. Los resultados del Surveyor se agotaron en la fila superior e inferior del gel para las construcciones condicionales y constitutivas, respectivamente. Cada uno se testó en presencia y ausencia de ARN quimérico fijado como objetivo al locus hEMX1 (ARN quimérico hEMX1.1). Los resultados indican que la construcción puede fijar con éxito como objetivo al locus hEMX1 solo en presencia de ARN quimérico (y Cre en el caso condicional). El gel se cuantificó y los resultados se presentan como eficiencia de corte media y desviación estándar para tres muestras.
Ratón Cas9 transgénico: Para generar ratones transgénicos con construcciones, las solicitantes inyectan ADN lineal puro en el pronúcleo de un cigoto de una hembra CB56 pseudo-embarazada. Los fundadores se identifican, genotipan y retrocruzan con ratones CB57. Las construcciones fueron clonadas y verificadas con éxito por secuenciación de Sanger.
Ratón con inserción de Cas9: Para generar inserciones de Cas9 en ratones, las solicitantes fijan como objetivo las mismas construcciones constitutivas y condicionales al locus Rosa26. Las solicitantes hicieron esto clonando cada uno en un vector que fija como objetivo Rosa26 con los siguientes elementos: brazo de homología corto Rosa26 -casete de expresión constitutivo/condicional de Cas9 - brazo de homología largo pPGK-Neo-Rosa26 - pPGK- DTA. pPGK es el promotor del marcador de selección positiva Neo, que confiere resistencia a la neomicina, un brazo corto de 1 kb, un brazo largo de 4,3 kb y una toxina diftérica de selección negativa (DTA) impulsada por PGK.
Las dos construcciones se electroporaron en mESC R1 y se dejaron crecer durante 2 días antes de que se aplicara la selección de neomicina. Las colonias individuales que habían sobrevivido entre los días 5 y 7 fueron recogidas y cultivadas en pocillos individuales. 5-7 días después, se recolectaron las colonias, la mitad se congeló y la otra mitad se utilizó para el genotipado. El genotipado se realizó por PCR genómica, en donde un cebador reasociado dentro del plásmido donante (AttpF) y el otro fuera del brazo de homología corto (Rosa26-R). De las 22 colonias recolectadas para el caso condicional, 7 fueron positivas (Izquierda). De las 27 colonias recolectadas para el caso constitutivo, cero fueron positivas (Derecha). Es probable que Cas9 provoque algún nivel de toxicidad en el mESC y por esta razón no hubo clones positivos. Para testar esto, las solicitantes introdujeron un plásmido de expresión Cre en células Cas9 condicionales correctamente fijadas como objetivo y encontraron una toxicidad muy baja después de muchos días en cultivo. El número reducido de copias de Cas9 en células Cas9 condicionales correctamente fijadas como objetivo (1 -2 copias por célula) es suficiente para permitir una expresión estable y relativamente sin citotoxicidad. Además de ello, estos datos indican que el número de copias Cas9 determina la toxicidad. Después de la electroporación, cada una de las células debería obtener varias copias de Cas9 y es probable que esta sea la razón por la que no se encontraron colonias positivas en el caso de la construcción constitutiva de Cas9. Esto proporciona una fuerte evidencia de que la utilización de una estrategia condicional dependiente de Cre debería mostrar una toxicidad reducida. Las solicitantes inyectan células correctamente fijadas como objetivo en un blastocisto y las implantan en un ratón hembra. Los quiméricos se identifican y retrocruzan. Los fundadores están identificados y genotipados.
Utilidad del ratón Cas9 condicional: Las solicitantes han demostrado en células 293 que la construcción de expresión condicional de Cas9 se puede activar mediante la co-expresión con Cre. Las solicitantes también demuestran que las mESC R1 correctamente fijadas como objetivo pueden tener Cas9 activo cuando se expresa Cre. Debido a que Cas9 es seguido por la secuencia de escisión del péptido P2A y luego EGFP, las solicitantes identifican con éxito la expresión observando EGFP. Este mismo concepto es lo que hace que el ratón Cas9 condicional sea tan útil. Las solicitantes pueden cruzar su ratón Cas9 condicional con un ratón que exprese ubicuamente Cre (línea ACTB-Cre) y pueden llegar a un ratón que exprese Cas9 en cada una de las células. Solo debería tomar el suministro de ARN quimérico para inducir la edición del genoma en ratones embrionarios o adultos. Curiosamente, si el ratón condicional Cas9 se cruza con un ratón que expresa Cre bajo un promotor específico para el tejido, solo debería haber Cas9 en los tejidos que también expresan Cre. Este enfoque puede utilizarse para editar el genoma solo en tejidos precisos mediante el suministro de ARN quimérico al mismo tejido.
Ejem plo 9: D iversidad de C as9 y A R N quim éricos
El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo inmunitario adaptativo contra el ADN exógeno invasor empleado por diversas especies a través de bacterias y arqueas. El sistema CRISPR-Cas tipo II consiste en un conjunto de genes que codifican proteínas responsables de la "adquisición" de ADN extraño en el locus CRISPR, así como un conjunto de genes que codifican la "ejecución" del mecanismo de escisión del ADN; estos incluyen la nucleasa de ADN (Cas9), un ARNcr transactivador no codificante (ARNtrac) y una serie de espaciadores extraños derivados del ADN flanqueados por repeticiones directas (ARNcr). Tras la maduración por Cas9, el dúplex ARNtracr y ARNcr guía la nucleasa Cas9 a una secuencia de ADN diana especificada por las secuencias de guía espaciadoras, y media en las roturas de doble cadena en el ADN cerca de un motivo de secuencia corta en el ADN diana que se requiere para la escisión y que es específico para cada sistema CRISPR-Cas. Los sistemas CRISPR-Cas tipo II se encuentran en todo el reino bacteriano y son muy diversos en cuanto a la secuencia y el tamaño de la proteína Cas9, la secuencia de repetición directa de ARNtracr y ARNcr, la organización del genoma de estos elementos y el requisito de motivo para la escisión de la diana. Una especie puede tener múltiples sistemas CRISPR-Cas distintos.
Las solicitantes evaluaron 207 supuestas Cas9 de especies bacterianas identificadas en base a la homología de secuencia con Cas9 conocidas y estructuras ortólogas a subdominios conocidos, incluidos el dominio de endonucleasa HNH y los dominios de endonucleasa RuvC [información de Eugene Koonin y Kira Makarova]. El análisis filogenético basado en la conservación de la secuencia de proteínas de este conjunto reveló cinco familias de Cas9, incluidos tres grupos de Cas9 grandes (~ 1400 aminoácidos) y dos de Cas9 pequeños (~ 1100 aminoácidos) (Figuras 3 y 4A-F).
Las solicitantes también han optimizado el ARN guía Cas9 utilizando métodos in vitro.
Ejem plo 10: m utaciones de Cas9
En este ejemplo, las solicitantes demuestran que las siguientes mutaciones pueden convertir SpCas9 en una enzima melladora: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A, D986A.
Las solicitantes proporcionan secuencias que muestran dónde se encuentran los puntos de mutación dentro del gen SpCas9 (Figura 6A-M). Las solicitantes también demuestran que las nickasas aún pueden mediar en la recombinación homóloga. Además, las solicitantes demuestran que SpCas9 con estas mutaciones (individualmente) no inducen la rotura de la doble cadena.
Ortólogos de Cas9 comparten todos la organización general de 3-4 dominios RuvC y un dominio HNH. El dominio RuvC más 5’ escinde la cadena no complementaria, y el dominio HNH escinde la cadena complementaria. Todas las anotaciones hacen referencia a la secuencia guía.
El residuo catalítico en el dominio RuvC 5’ se identifica mediante la comparación de homología de la Cas9 de interés con otros ortólogos de Cas9 (de S. pyogenes tipo II CRISPR locus, S. thermophilus CRISPR locus 1, S. thermophilus CRISPR locus 3 y Franciscilla novicida CRISPR locus tipo II), y el residuo Asp conservado se muta a alanina para convertir Cas9 en una enzima melladora de cadena complementaria. De manera similar, los residuos His y Asn conservados en los dominios HNH se mutan a Alanina para convertir Cas9 en una enzima melladora de cadena no complementaria.
Ejem plo 11: A ctivación Transcripcional de C as9 y R epresor de Cas9
Activación Transcripcional de Cas9
Se diseñó una segunda generación de construcciones y están en proceso de ser testadas (Tabla 1). Estas construcciones se utilizarán para evaluar la activación transcripcional (construcciones fusionadas VP64) y la represión (solo Cas9) por RT-qPCR. Las solicitantes también evaluarán la localización celular de cada una de las construcciones utilizando el anticuerpo anti-His, la actividad de nucleasa utilizando un ensayo de nucleasa Surveyor, y la afinidad de unión al ADN utilizando un ensayo de desplazamiento de gel.
Represor de Cas
Se ha demostrado previamente que dCas9 puede utilizarse como un dominio genérico de unión al ADN para reprimir la expresión génica. Las solicitantes informan de un diseño mejorado de dCas9, así como fusiones de dCas9 a los dominios de represor KRAB y SID4x. De la colección de plásmidos creada para modular la transcripción utilizando Cas9 en la Tabla 1, los siguientes plásmidos represores se caracterizaron funcionalmente por qPCR: pXRP27, pXRP28, pXRP29, pXRP48, pXRP49, pXRP50, pXRP51, pXRP52, pXRP53, pXRP56, pXRP58, pXRP59, pXRP61 y pXRP62.
Cada uno de los plásmidos represores de dCas9 se co-transfectó con dos ARN guía fijados como objetivo a la cadena codificante del gen beta-catenina. El ARN se aisló 72 horas después de la transfección y la expresión génica se cuantificó por RT-qPCR. El gen de control endógeno fue GAPDH. Se utilizaron dos ARNhs validados como controles positivos. Los controles negativos fueron determinados plásmidos transfectados sin ARNg, estos se denominan "control pXRP ##". Los plásmidos pXRP28, pXRP29, pXRP48 y pXRP49 podrían reprimir el gen beta-catenina cuando se utiliza la estrategia de fijación como objetivo especificada. Estos plásmidos corresponden a dCas9 sin un dominio funcional (pXRP28 y pXRP28) y a dCas9 fusionada a SID4x (pXRP48 y pXRP49).
El trabajo adicional investiga: repetir el experimento anterior, fijar como objetivo diferentes genes, utilizar otros ARNg para determinar la posición óptima de fijación como objetivo y represión multiplexada.
Tabla 1
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E jem plo 12: Deleción fijada com o objetivo de genes im plicados en la b iosíntesis d e l colesterol, b iosíntesis de ácidos grasos y otros trastornos m etabólicos, genes que codifican prote ínas m al p legadas im plicadas en am ilo ide y otras enferm edades, oncogenes que conducen a la transform ación celular, genes virales latentes y genes que conducen a trastornos dom inante-negativos, entre otros trastornos.
Las solicitantes demuestran el suministro de genes de un sistema CRISPR-Cas al tejido del hígado, cerebro, ocular, epitelial, hematopoyético u otro tejido de un sujeto o un paciente que lo necesite, que padece trastornos metabólicos, amiloidosis y enfermedades relacionadas con la agregación de proteínas, transformación celular derivada de mutaciones genéticas y translocaciones, efectos negativos dominantes de mutaciones génicas, infecciones virales latentes y otros síntomas relacionados, utilizando el sistema de suministro viral o de nanopartículas.
Diseño del Estudio: Sujetos o pacientes que lo necesitan que padecen trastornos metabólicos, amiloidosis y enfermedades relacionadas con la agregación de proteínas que incluyen, pero no se limitan a seres humanos, no primates humanos, caninos, felinos, bovinos, equinos, otros animales domésticos y mamíferos relacionados. El sistema CRISPR-Cas está guiado por un ARN guía quimérico y fija como objetivo un sitio específico de los loci genómicos humanos que se han de escindir. Después de la escisión y la reparación mediada por unión en los extremos no homóloga, la mutación de desplazamiento de marco da como resultado la inactivación de genes.
Las solicitantes seleccionan los ARN guía que fijan como objetivo a los genes implicados en los trastornos arriba mencionados para que sean específicos de los loci endógenos con una actividad mínima fuera de diana. Dos o más ARN guía pueden codificarse en una única matriz CRISPR para inducir roturas de doble cadena simultáneas en el ADN que conducen a micro-deleciones de genes afectados o regiones cromosómicas.
Identificación y diseño de dianas de genes
Para cada uno de los genes de la enfermedad candidato, las solicitantes seleccionan secuencias de ADN de interés que incluyen exones que codifican proteínas, secuencias que incluyen y flanquean sitios de mutación negativos dominantes conocidos, secuencias que incluyen y que flanquean secuencias repetitivas patológicas. Para los enfoques de inactivación de genes, los primeros exones codificantes más cercanos al codón de inicio ofrecen las mejores opciones para lograr la inactivación completa y minimizar la posibilidad de que los productos proteicos truncados retengan una función parcial.
Las solicitantes analizan secuencias de interés para todas las posibles secuencias de 20 pb fijables como objetivo inmediatamente en la posición 5’ a un motivo NGG (para el sistema SpCas9) o un motivo NNAGAAW (para el sistema StlCas9). Las solicitantes eligen secuencias para el reconocimiento único de Cas9 guiado por ARN sencillo en el genoma para minimizar los efectos fuera de diana basados en el algoritmo computacional para determinar la especificidad.
Clonación de secuencias guía en un sistema de entrega
Las secuencias guía se sintetizan como oligonucleótidos de doble cadena de 20-24 pb. Después del tratamiento con 5'-fosforilación de oligos y reasociación para formar dúplex, los oligos se ligan en un vector adecuado dependiendo del método de suministro:
Métodos de suministro basados en virus
Los vectores basados en AAV (PX260, 330, 334, 335) se han descrito en otra parte.
Los vectores basados en lentivirales utilizan una estrategia de clonación similar de ligar directamente secuencias guía en un solo vector que lleva un armazón de ARN quimérico impulsado por el promotor U6 y una Cas9 impulsada por el promotor EFla o nickasa Cas9.
La producción de virus se describe en otra parte
Métodos de suministro de ARN basados en nanopartículas
1. Las secuencias guía se sintetizan como un oligonucleótido dúplex que codifica el ARN quimérico secuenciador del promotor T7. Se añade un promotor T7 en 5’ de Cas9 por el método de PCR.
2. Cas9 impulsado por T7 y ARN quimérico guía se transcriben in vitro, y el ARNm de Cas9 se remata y se provee de una cola A utilizando kits comerciales. Los productos de ARN se purifican según las instrucciones del kit.
Métodos de suministro en la vena de la cola hidrodinámicos (para ratón)
Las secuencias guía se clonan en plásmidos de AAV tal como se describe anteriormente y en otra parte de esta solicitud.
Validación In vitro en líneas celulares.
Transfección
1. Transfección de plásmidos de ADN
Los plásmidos que portan secuencias guía se transfectan en riñón embrionario humano (HEK293T) o células madre embrionarias humanas (hES), otros tipos de células relevantes utilizando métodos basados en lípidos, químicos o de electroporación. Para una transfección de 24 pocillos de células HEK293T ( ~ 260.000 células), se transfectan 500 ng de ADN total en cada uno de los pocillos utilizando Lipofectamine 2000. Para una transfección de 12 pocillos de células hES, se transfecta 1 ug de ADN total en un solo pocillo utilizando Fugene HD.
2. Transfección de ARN
El ARN purificado arriba descrito se utiliza para la transfección en células HEK293T. Se pueden transfectar 1 -2 gg de ARN en ~ 260.000 utilizando Lipofectamine 2000 según las instrucciones del fabricante. El suministro de ARN de Cas9 y ARN quimérico se muestra en la Figura 10.
Ensayo de formación de indeles in vitro
Las células se recolectan 72 horas después de la transfección y se analizan para determinar la formación de indeles como una indicación de roturas de doble cadena.
Brevemente, la región genómica alrededor de la secuencia diana se amplifica por PCR ( ~ 400-600 pb de tamaño de amplicón) utilizando polimerasa de alta fidelidad. Los productos se purifican, normalizan a igual concentración y se reasocian lentamente de 95°C a 4°C para permitir la formación de heterodúplex de ADN.. Después de la reasociación, la enzima Cel-I se utiliza para escindir heterodúplex, y los productos resultantes se separan en un gel de poliacrilamida y se calcula la eficiencia de indeles.
Prueba de principio in vivo en animales
Mecanismos de suministro
La producción de AAV o Lentivirus se describe en otra parte.
Formulación de nanopartículas: ARN mezclado en formulación de nanopartículas
Las inyecciones hidrodinámicas en la vena de la cola con plásmidos de ADN en ratones se realizan utilizando un kit comercial.
Cas9 y las secuencias guía se suministran como virus, mezcla de ARN recubierto con nanopartículas o plásmidos de ADN, y se inyectan en animales sujeto. Se inyecta un conjunto paralelo de animales de control con solución salina estéril, Cas9 y GFP, o secuencia guía y GFP solo.
Tres semanas después de la inyección, los animales se testan para mejorar los síntomas y se sacrifican. Sistemas de órganos relevantes analizados para la formación de indeles. Los ensayos fenotípicos incluyen niveles sanguíneos de HDL, LDL, lípidos,
Ensayo de formación de indeles
El ADN se extrae del tejido utilizando kits comerciales; el ensayo de indeles se realizará tal como se describe para la demostración in vitro.
Aplicaciones terapéuticas del sistema CRISPR-Cas son susceptibles de lograr la deleción fijada como objetivo específica para el tejido y controlada temporalmente de genes candidatos de la enfermedad. Ejemplos incluyen genes implicados en el metabolismo del colesterol y los ácidos grasos, enfermedades amiloides, enfermedades negativas dominantes, infecciones virales latentes, entre otros trastornos.
Ejem l n l ARN í r inr ir in l fi m iv n n l l n
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Ejempl n r ARN í r inr ir mir l i n r m mi n n l l n
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E jem plo 13: In tegración fijada com o objetivo de reparación para genes que portan m utaciones que p rovocan enferm edades; reconstitución de defic iencias enzim áticas y otras enferm edades relacionadas.
Diseño del Estudio
I. identificación y diseño de dianas de genes
Descrito en el Ejemplo 16
II. Clonación de secuencias guía y moldes de reparación en un sistema de suministro
Descrito arriba en el Ejemplo 16
Las solicitantes clonan moldes de reparación de ADN para incluir brazos de homología con alelo enfermo, así como un molde de reparación de tipo salvaje
III. Validación In vitro en líneas celulares
a. La transfección se describe arriba en el Ejemplo 16; Cas9, ARN guía y molde de reparación se co-transfectan en tipos de células relevantes.
b. Ensayo de reparación in vitro
i. Las solicitantes recolectan células 72 horas después de la transfección y el ensayo para la reparación.
ii. Brevemente, las solicitantes amplifican la región genómica alrededor del molde de reparación por PCR utilizando polimerasa de alta fidelidad. Las solicitantes secuencian productos para disminuir la incidencia de alelos mutantes. IV. Prueba de principio In vivo en animales
a. Los mecanismos de suministro se describen arriba en los Ejemplos 16 y 29.
b. Ensayo de reparación in vivo
i. Las solicitantes realizan el ensayo de reparación tal como se describe en la demostración in vitro.
V. Aplicaciones terapéuticas
El sistema CRISPR-Cas es susceptible de lograr la deleción fijada como objetivo específica para el tejido y controlada temporalmente de genes candidatos de la enfermedad. Ejemplos incluyen genes implicados en el metabolismo del colesterol y los ácidos grasos, enfermedades amiloides, enfermedades negativas dominantes, infecciones virales latentes, entre otros trastornos.
Ejemplo de una sola mutación de sentido erróneo con molde de reparación:
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V30M
alelo CCTGCCATCAATGTGGCCATGCATGTGTTCAGAAAGGCT
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alelo CCTGCCATCAAT GTGGCCGTGCAT GT GTTCAGAAAGGCT
E jem plo 14: A plicación terapéutica d e l sistem a CRISPR-Cas en Glaucom a, A m ilo idosis y enferm edad de H untington
Glaucoma Las solicitantes diseñan ARN guía para fijar como objetivo al primer exón del gen de la micilina (MYOC). Las solicitantes utilizan vectores de adenovirus (Ad5) para empaquetar tanto Cas9 como un ARN guía que fija como objetivo al gen MYOC. Las solicitantes inyectan vectores adenovirales en la malla trabecular en donde las células han sido implicadas en la fisiopatología del glaucoma. Las solicitantes inicialmente testan esto en modelos de ratón que portan el gen MYOC mutado para ver si mejoran la agudeza visual y disminuye la presión en los ojos. La aplicación terapéutica en seres humanos emplea una estrategia similar.
Amiloidosis: Las solicitantes diseñan ARN guía para fijar como objetivo al primer exón del gen transtiretina (TTR) en el hígado. Las solicitantes utilizan AAV8 para empaquetar Cas9, así como ARN guía para fijar como objetivo al primer exón del gen TTR. Se ha demostrado que AAV8 tiene una fijación como objetivo eficaz del hígado y se administrará por vía intravenosa. Cas9 puede ser impulsada utilizando promotores específicos para el hígado, tal como el promotor de albúmina, o utilizando un promotor constitutivo. Un promotor pol3 impulsa el ARN guía.
Alternativamente, las solicitantes utilizan el suministro hidrodinámico de ADN plasmídico para inactivar el gen TTR. Las solicitantes suministran un plásmido que codifica Cas9 y el ARN guía que fija como objetivo al Exón1 de TTR.
Como un enfoque alternativo adicional, las solicitantes administran una combinación de ARN (ARNm para Cas9 y ARN guía). El ARN puede empaquetarse utilizando liposomas tal como Invivofectamine de Life Technologies y suministrarse por vía intravenosa. Para reducir la inmunogenicidad inducida por ARN, aumentar el nivel de expresión de Cas9 y la estabilidad del ARN guía, las solicitantes modifican el ARNm de Cas9 utilizando un remate en 5'. Las solicitantes también incorporan nucleótidos de ARN modificados en el ARNm de Cas9 y ARN guía para aumentar su estabilidad y reducir la inmunogenicidad (p. ej., activación de TLR). Para aumentar la eficiencia, las solicitantes administran múltiples dosis del virus, ADN o ARN.
Enfermedad de Huntington: Las solicitantes diseñan el ARN guía en base a mutaciones específicas de alelos en el gen HTT de los pacientes. Por ejemplo, en un paciente que es heterocigoto para HTT con repetición CAG expandida, las solicitantes identifican secuencias de nucleótidos únicas para el alelo HTT mutante y lo utilizan para diseñar ARN guía. Las solicitantes se aseguran de que la base mutante se encuentre dentro de los últimos 9 pb del ARN guía (que las solicitantes han comprobado que tiene la capacidad de discriminar entre emparejamientos erróneos de bases de ADN individuales entre el tamaño diana y el ARN guía).
Las solicitantes empaquetan el ARN guía específico para el alelo HTT mutante y Cas9 en AAV9 y lo suministran al cuerpo estriado de los pacientes de Huntington. El virus se inyecta en el cuerpo estriado estereotácticamente a través de una craneotomía. Se sabe que AAV9 transduce neuronas de manera eficiente. Las solicitantes manejan Cas9 utilizando un promotor específico para neuronas tal como Sinapsina I.
Ejem plo 15: A plicación terapéutica d e l s istem a C RISPR-Cas en e l VIH
La infección viral crónica es una fuente de morbilidad y mortalidad significativas. Si bien existe para muchos de estos virus, las terapias antivirales convencionales que se fijan efectivamente como objetivo a diversos aspectos de la replicación viral, las modalidades terapéuticas actuales no son habitualmente de naturaleza curativa debido a la "latericia viral". Por su naturaleza, la latencia viral se caracteriza por una fase inactiva en el ciclo de vida viral sin producción viral activa. Durante este período, el virus es ampliamente capaz de evadir tanto la vigilancia inmune como la terapéutica convencional, lo que le permite establecer depósitos virales de larga duración dentro del huésped, desde los cuales la reactivación posterior pueda permitir la propagación y transmisión continua del virus. La clave para la latencia viral es la capacidad de mantener de manera estable el genoma viral, logrado a través de la latencia episomal o proviral, que almacena el genoma viral en el citoplasma o lo integra en el genoma del huésped, respectivamente En ausencia de vacunas efectivas que prevengan la infección primaria, las infecciones virales crónicas caracterizadas por depósitos latentes y episodios de actividad lítica pueden tener consecuencias significativas: el virus del papiloma humano (VPH) puede provocar cáncer cervical, el virus de la hepatitis C (VHC) predispone al carcinoma hepatocelular y el virus de inmunodeficiencia humana destruye finalmente el sistema inmunitario del huésped, lo que resulta en susceptibilidad a infecciones oportunistas. Como tal, estas infecciones requieren el uso de por vida de agentes terapéuticos antivirales actualmente disponibles. Para complicar aún más las cosas, la alta mutabilidad de muchos de estos genomas virales conduce a la evolución de cepas resistentes para las cuales no existe una terapia efectiva.
El sistema CRISPR-Cas es un sistema inmune adaptativo bacteriano capaz de inducir roturas de ADN de doble cadena (DSB) de una manera multiplex y específica para la secuencia y recientemente se ha reconstituido dentro de los sistemas celulares de mamíferos. Se ha demostrado que fijar como objetivo el ADN con uno o numerosos ARN guía puede resultar tanto en indeles como en deleciones de las secuencias intermedias, respectivamente. Como tal, esta nueva tecnología representa un medio por el cual la mutagénesis de ADN fijada como objetivo y multiplexada se puede lograr dentro de una sola célula con alta eficiencia y especificidad. En consecuencia, el suministro del sistema CRISPR-Cas dirigido contra secuencias de ADN virales podría permitir la interrupción fijada como objetivo y la deleción de genomas virales latentes incluso en ausencia de producción viral en curso.
Como ejemplo, la infección crónica por VIH-1 representa un problema de salud global con 33 millones de personas infectadas y una incidencia anual de 2,6 millones de infecciones. El uso de la terapia antirretroviral multimodal altamente activa (HAART), que fija simultáneamente como objetivo a múltiples aspectos de la replicación viral, ha permitido que la infección por el VIH se gestione en gran medida como una enfermedad crónica, no terminal. Sin tratamiento, la progresión del VIH al SIDA se produce generalmente dentro de los 9-10 años, lo que resulta en el agotamiento del sistema inmune del huésped y la aparición de infecciones oportunistas que habitualmente conducen a la muerte poco después. Secundario a la latencia viral, la interrupción de1HAART invariablemente conduce a un rebote viral. Además, incluso las interrupciones temporales en la terapia pueden seleccionar cepas resistentes del VIH incontrolables por los medios disponibles. Adicionalmente, los costes de la terapia HAART son significativos: dentro de los US $ 10.000-15.000 por persona por año. Como tal, los enfoques de tratamiento dirigidos directamente al genoma del VIH en lugar del proceso de replicación viral representan un medio por el cual la erradicación de los depósitos latentes podría permitir una opción terapéutica curativa.
El desarrollo y la entrega de un sistema CRISPR-Cas fijado como objetivo al VIH-1 representa un enfoque único diferenciable de los medios existentes de mutagénesis de ADN fijada como objetivo, es decir, ZFN y TALEN, con numerosas implicaciones terapéuticas. La interrupción y la deleción fijadas como objetivo del genoma del VIH-1 por DSB mediado por CRISPR e indeles en unión con HAART podrían permitir la prevención simultánea de la producción viral activa, así como el agotamiento de los depósitos virales latentes dentro del huésped.
Una vez integrado en el sistema inmune del huésped, el sistema CRISPR-Cas permite la generación de una subpoblación resistente al VIH-1 que, incluso en ausencia de una erradicación viral completa, podría permitir el mantenimiento y la reconstitución de la actividad inmune del huésped. Potencialmente, esto podría prevenir la infección primaria al interrumpir el genoma viral evitando la producción e integración viral, lo que representa un medio para la "vacunación". La naturaleza multiplexada del sistema CRISPR-Cas permite la fijación como objetivo de múltiples aspectos del genoma simultáneamente dentro de las células individuales.
Como en el HAART, el escape viral por mutagénesis se minimiza al requerir la adquisición de múltiples mutaciones adaptativas al mismo tiempo. Múltiples cepas del VIH-1 pueden ser fijadas simultáneamente como objetivo, lo que minimiza la posibilidad de super-infección y evita la posterior creación de nuevas cepas recombinantes. La especificidad de secuencia mediada por nucleótidos, en lugar de proteínas, del sistema CRISPR-Cas permite la generación rápida de agentes terapéuticos sin necesidad de alterar significativamente el mecanismo de suministro.
Con el fin de lograr esto, las solicitantes generar ARN guía de CRISPR-Cas que fijan como objetivo a la gran mayoría del genoma del VIH-1, teniendo en cuenta al mismo tiempo variantes de la cepa del VIH-1 para una cobertura y efectividad máximas. Los análisis de secuencia de la conservación genómica entre subtipos y variantes del VIH-1 deberían permitir fijar como objetivo las regiones conservadas flanqueantes del genoma con el objetivo de eliminar secuencias virales intermedias o la inducción de mutaciones de cambio de marco que alterarían las funciones génicas virales.
Las solicitantes logran el suministro del sistema CRISPR-Cas mediante una infección adenoviral convencional o mediada por lentivirales del sistema inmunitario del huésped. Dependiendo del enfoque, las células inmunes del huésped podrían a) aislarse, transducirse con CRISPR-Cas, seleccionarse y re-introducirse en el huésped o b) transducirse in vivo mediante el suministro sistémico del sistema CRISPR-Cas. El primer enfoque permite la generación de una población inmune resistente, mientras que el segundo tiene más probabilidades de fijar como objetivo a los depósitos virales latentes dentro del huésped.
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E jem plo 16: Corrección fijada com o objetivo de deltaF508 u o tras m utaciones en la fibrosis quística
Un aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que puede comprender una partícula de terapia génica CRISPR-Cas y un soporte farmacéutico biocompatible. De acuerdo con otro aspecto, un método de terapia génica para el tratamiento de un sujeto que tiene una mutación en el gen CFTR comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una partícula de terapia génica CRISPR-Cas a las células de un sujeto.
Este Ejemplo demuestra la transferencia génica o el suministro de genes de un sistema CRISPR-Cas en las vías respiratorias del sujeto o un paciente que lo necesite, que padece fibrosis quística o síntomas relacionados con la fibrosis quística, utilizando partículas de virus adeno-asociados (AAV).
Diseño del Estudio: Sujetos o pacientes que lo necesiten: Seres humanos, humanos no primates, caninos, felinos, bovinos, equinos y otros animales domésticos relacionados. Este estudio testa la eficacia de la transferencia génica de un sistema CRISPR-Cas por un vector AAV. Las solicitantes determinan niveles transgénicos suficientes para la expresión génica y utilizan un sistema CRISPR-Cas que comprende una enzima Cas9 para fijar como objetivo deltaF508 u otras mutaciones inductoras de CFTR.
Los sujetos tratados reciben una cantidad farmacéuticamente efectiva de sistema de vector de AAV en aerosol por pulmón administrado endobronquialmente mientras respiran espontáneamente. Los sujetos de control reciben una cantidad equivalente de un sistema de vector AAV pseudotipado con un gen de control interno. El sistema de vectores puede administrarse junto con un soporte farmacéutico farmacéuticamente aceptable o biocompatible. Tres semanas o un intervalo de tiempo apropiado después de la administración del vector, los sujetos tratados son testados para mejorar los síntomas relacionados con la fibrosis quística.
Las solicitantes utilizan un adenovirus o una partícula de AAV.
Las solicitantes clonan las siguientes construcciones génicas, cada una operativamente enlazada a una o más secuencias reguladoras (promotor Cbh o EFla para el promotor Cas9, U6 o H1 para el ARN guía quimérico), en uno o más vectores de adenovirus o AAV o cualquier otro vector compatible: A CFTRdelta508 que fija como objetivo al ARN guía quimérico (Figura 13B), un molde de reparación para la mutación deltaF508 (Figura 13C) y una enzima Cas9 optimizada en codones con opcionalmente una o más señales o secuencias de localización nuclear (NLS), p. ej., dos (2 ) NLS.
Identificación del sitio diana de Cas9
Las solicitantes analizaron el locus genómico CFTR humano e identificaron el sitio diana Cas9 (Figura 13A). (PAM puede contener un motivo NGG o NNAGAAW).
Estrategia de Reparación de Genes
Las solicitantes introducen un sistema de vector de adenovirus/AAV que comprende una Cas9 (o Cas9 nickasa) y el ARN guía junto con un sistema de vector de adenovirus/AAV que comprende el molde de reparación de homología que contiene el residuo F508 en el sujeto a través de uno de los métodos de suministro discutidos anteriormente. El sistema CRISPR-Cas está guiado por el ARN guía quimérico CFTRdelta 508 y fija como objetivo un sitio específico del locus genómico CFTR para ser mellado o escindido. Después de la escisión, el molde de reparación se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga, corrigiendo la deleción que da como resultado una fibrosis quística o provoca síntomas relacionados con la fibrosis quística. Esta estrategia para dirigir el suministro y proporcionar la introducción sistémica de sistemas CRISPR con los ARN guía apropiados puede emplearse para fijar como objetivo mutaciones genéticas para editar o manipular de otra manera genes que provocan enfermedades y trastornos metabólicos, hepáticos, renales y proteicos tales como los de la Tabla B.
E jem plo 17: Generación de la Colección de C élulas de Inactivación de Genes
Este ejemplo demuestra cómo generar una colección de células, en donde cada una de las células tiene un solo gen inactivado:
Las solicitantes hacen una colección de células ES, en donde cada una de las células tiene un solo gen inactivado, y toda la colección de células ES tendrá cada uno de los genes inactivados. Esta colección es útil para el rastreo de la función génica en procesos celulares, así como en enfermedades.
Para hacer esta colección de células, las solicitantes integran Cas9 impulsada por un promotor inducible (p. ej., promotor inducible por doxiciclina) en la célula ES. Además, las solicitantes integran un único ARN guía que fija como objetivo un gen específico en la célula ES. Para hacer la colección de células ES, las solicitantes mezclan simplemente células ES con una genoteca que codifica los ARN guía que fijan como objetivo a cada uno de los genes en el genoma humano. Las solicitantes introducen primero un único sitio BxB1 attB en el locus AAVS1 de la célula ES humana. Luego, las solicitantes utilizan la integrasa BxB1 para facilitar la integración de genes de ARN guía individuales en el sitio BxB1 attB en el locus AAVS1. Para facilitar la integración, cada uno de los genes de ARN guía está contenido en un plásmido que porta un único sitio attP. De esta manera, BxB1 recombinará el sitio attB en el genoma con el sitio attP en el plásmido que contiene ARN guía.
Para generar la colección de células, las solicitantes toman la colección de células que tienen ARN guía únicos integrados e inducen la expresión de Cas9. Después de la inducción, Cas9 media en la ruptura de la doble cadena en los sitios especificados por el ARN guía. Para verificar la diversidad de esta colección de células, las solicitantes llevan a cabo una secuenciación completa del exoma para asegurar que las solicitantes sean capaces de observar mutaciones en cada uno de los genes fijados como objetivo. Esta colección de células se puede utilizar para una diversidad de aplicaciones, incluidas los rastreos basados en la colección, o se puede clasificar en clones celulares individuales para facilitar la generación rápida de líneas celulares clonales con genes humanos individuales inactivados.
E jem plo 18: M odificación de M icroalgas utilizando Cas9
Métodos de suministrar Cas9
Método 1: Las solicitantes suministran Cas9 y ARN guía utilizando un vector que expresa Cas9 bajo el control de un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o Beta2-tubulina.
Método 2: Las solicitantes suministran Cas9 y T7 utilizando vectores que expresan Cas9 y la polimerasa T7 bajo el control de un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o Beta2-tubulina. El ARN guía será suministrado utilizando un vector que contiene el promotor T7 que impulsa el ARN guía.
Método 3: Las solicitantes suministran ARNm de Cas9 y ARN guía transcrito in vitro a células de algas. El ARN puede ser transcrito in vitro. El ARNm de Cas9 consistirá en la región codificante para Cas9, así como 3’ UTR de Cop1 para asegurar la estabilización del ARNm de Cas9.
Para la recombinación homóloga, las solicitantes proporcionan un molde de reparación dirigida por homología adicional.
Secuencia para un casete que impulsa la expresión de Cas9 bajo el control del promotor beta-2 tubulina, seguido por el 3‘ UTR de Cop1.
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Secuencia para un casete que impulsa la expresión de la polimerasa T7 bajo el control del promotor beta-2 tubulina, seguido por el 3 'UTR de Cop1.
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGA GACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTC CTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATA GCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAAC ACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGC TAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACatgcctaagaagaaga ggaaggttaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccatt acggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttga gcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgc atcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccgga agccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgca atcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaa caactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcg gtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccgg aatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggct atcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattac tggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagac gtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgcc aacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaaga catcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcg ccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcg cggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaaccegcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaacca atcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgacaaggttccgttccctgagcgcatca agttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctcc gttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgac gggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaac cgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagta gttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggct
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Secuencia de ARN guía impulsado por el promotor T7 (promotor T7, Ns representa la secuencia de fijación de objetivo): aaaatTAATACGACTCACTATANW^Nlsnsn^NT^MNn^NNNNNNNiJttttaiJaiJc
taGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt
Suministro de genes:
Las cepas Chlamydomonas reinhardtii CC-124 y CC-125 del Centro de Recursos Chlamydomonas se utilizarán para la electroporación. El protocolo de electroporación sigue el protocolo estándar recomendado del kit de Modificación GeneArt Chlamydomonas.
Además, las solicitantes generan una línea de Chlamydomonas reinhardtii que expresa Cas9 constitutivamente. Esto se puede hacer utilizando pChlamyl (linearizado utilizando PvuI) y seleccionando colonias resistentes a la higromicina. La secuencia para pChlamyl que contiene Cas9 figura abajo. De esta manera, para lograr la inactivación de genes, simplemente se necesita suministrar ARN para el ARN guía. Para la recombinación homóloga, las solicitantes suministran ARN guía, así como un molde de recombinación homóloga linearizada.
pChlamyl-Cas9:
TGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGC GCG G AACCCCTATTTG TTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATG TATCCG CTCATG A
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Para todas las células de Chlamydomonas reinhardtii modificadas, las solicitantes utilizan PCR, ensayo de nucleasa SURVEYOR y secuenciación de ADN para verificar una modificación exitosa.
Ejem plo 19: Uso de C as9 para fija r com o objetivo una d iversidad de tipos de enferm edades
Enfermedades que implican mutaciones en la secuencia codificante de proteínas:
Los trastornos dominantes pueden fijarse como objetivo desactivando el alelo negativo dominante. Las solicitantes utilizan Cas9 para fijar como objetivo una secuencia única en el alelo dominante negativo e introducir una mutación a través de NHEJ. El indel inducido por NHEJ puede ser capaz de introducir una mutación de desplazamiento de marco en el alelo dominante negativo y eliminar la proteína dominante negativa. Esto puede funcionar si el gen es suficientemente haplo (p. ej., glaucoma inducido por mutación MYOC y enfermedad de Huntington).
Los trastornos recesivos se pueden tratar reparando la mutación de la enfermedad en ambos alelos. Para dividir las células, las solicitantes utilizan Cas9 para introducir roturas de doble cadena cerca del sitio de mutación y aumentar la tasa de recombinación homóloga utilizando una plantilla de recombinación exógena. Para dividir las células, esto puede lograrse utilizando actividad de nickasa multiplexada para catalizar el reemplazo de la secuencia mutante en ambos alelos a través del ligamiento mediado por NHEJ de un fragmento de ADN exógeno que lleva colgantes complementarios.
Las solicitantes también utilizan Cas9 para introducir mutaciones protectoras (p. ej., inactivación de CCR5 para prevenir la infección por el VIH, inactivación de PCSK9 para reducir el colesterol o introducción de A673T en la APP para reducir la probabilidad de enfermedad de Alzheimer).
Enfermedades que implican secuencias no codificantes
Las solicitantes utilizan Cas9 para alterar las secuencias no codificantes en la región del promotor, para alterar los sitios de unión del factor de transcripción y alterar los elementos potenciadores o represores. Por ejemplo, Cas9 puede utilizarse para escindir el potenciador Klfl EHS1 en células madre hematopoyéticas para reducir los niveles de BCL11 a y reactivar la expresión del gen de la globina fetal en eritrocitos diferenciados.
Las solicitantes también utilizan Cas9 para alterar motivos funcionales en las regiones no traducidas 5’ o 3'. Por ejemplo, para el tratamiento de la distrofia miotónica, Cas9 puede utilizarse para separar las expansiones repetidas de CTG en el gen DMPK.
E jem plo 20 : N ickasa M ultip lexada
Aspectos de optimización y las enseñanzas de Cas9 detalladas en esta solicitud también pueden utilizarse para generar nickasas Cas9. Las solicitantes utilizan nickasas Cas9 en combinación con pares de ARN guía para generar roturas de doble cadena de ADN con colgantes definidos. Cuando se utilizan dos pares de ARN guía, es posible escindir un fragmento de ADN intermedio. Si un trozo exógeno de ADN es escindido por los dos pares de ARN guía para generar colgantes compatibles con el ADN genómico, entonces el fragmento de ADN exógeno puede unirse al ADN genómico para reemplazar el fragmento escindido. Por ejemplo, esto puede utilizarse para eliminar la expansión repetida de trinucleótidos en el gen huntintina (HTT) para tratar la Enfermedad de Huntington.
Si se proporciona un ADN exógeno que porta menos repeticiones CAG, entonces puede generar un fragmento de ADN que porte los mismos colgantes y pueda ligarse al locus genómico HTT y reemplazar el fragmento escindido.
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El ligamiento del fragmento de ADN exógeno en el genoma no requiere mecanismos de recombinación homólogos y, por lo tanto, este método puede utilizarse en células post-mitóticas tales como neuronas.
Ejem plo 21 : Sum inistro d e l sistem a CRISPR
Cas9 y su ARN guía quimérico, o combinación de ARNtracr y ARNcr pueden suministrarse como ADN o ARN. El suministro de Cas9 y ARN guía tanto como moléculas de ARN (normal o que contiene modificaciones de la base o de la cadena principal) puede utilizarse para reducir la cantidad de tiempo que la proteína Cas9 persiste en la célula. Esto puede reducir el nivel de actividad de escisión fuera de diana en la célula diana. Dado que el suministro de Cas9 como ARNm necesita tiempo para traducirse en proteína, podría ser ventajoso suministrar el ARN guía varias horas después del suministro del ARNm de Cas9, para maximizar el nivel de ARN guía disponible para la interacción con la proteína Cas9.
En situaciones en las que la cantidad de ARN guía es limitante, puede ser conveniente introducir Cas9 como ARNm y ARN guía en forma de un casete de expresión de ADN con un promotor que impulsa la expresión del ARN guía. De esta forma, la cantidad de ARN guía disponible se amplificará mediante transcripción.
Se puede introducir una diversidad de sistemas de suministro para introducir Cas9 (ADN o ARN) y ARN guía (ADN o ARN) a la célula huésped. Estos incluyen el uso de liposomas, vectores virales, electroporación, nanopartículas, nanocables (Shalek et al., Nano Letters, 2012), exosomas. Los liposomas de caballos troyanos moleculares (Pardridge et al., Cold Spring Harb Protoc; 2010; doi: 10.1101/pdb.prot5407) pueden utilizarse para administrar Cas9 y ARN guía a través de la barrera hematoencefálica.
Ejem plo 22 : Ortólogos de Cas9
Las solicitantes analizaron ortólogos de Cas9 (Figuras 3 y 4A-F) para identificar las secuencias PAM relevantes y los ARN guía quiméricos correspondientes. Este conjunto ampliado de PAM puede proporcionar una fijación como objetivo más amplia en todo el genoma y también aumenta significativamente el número de sitios diana únicos y brinda el potencial para identificar nuevas Cas9 con mayores niveles de especificidad en el genoma. Las solicitantes determinaron que el PAM para Cas9 de Staphylococcus aureus sp. Aureusera NNGRR de Cas9 de Staphylococcus aureus sp. Aureus,también conocida como SaCas9.
La especificidad de ortólogos de Cas9 se puede evaluar testando la capacidad de cada una de las Cas9 de tolerar emparejamientos erróneos entre el ARN guía y su diana de ADN. Por ejemplo, la especificidad de SpCas9 se ha caracterizado testando el efecto de mutaciones en el ARN guía sobre la eficacia de la escisión. Las colecciones de ARN guía se realizaron con emparejamientos erróneos únicos o múltiples entre la secuencia guía y el ADN diana. En base a estos hallazgos, los sitios diana para SpCas9 se pueden seleccionar en base a las siguientes directrices:
Para maximizar la especificidad de SpCas9 para editar un gen en particular, se debe elegir un sitio diana dentro del locus de interés de tal manera que las secuencias genómicas 'fuera de diana' potenciales cumplan con las siguientes cuatro restricciones: Primero y ante todo, no deben ser seguidas por un PAM con secuencias 5'-NGG o NAG. En segundo lugar, se debe minimizar su similitud de secuencia global con la secuencia diana. Tercero, un número máximo de emparejamientos erróneos debe estar dentro de la región proximal PAM del sitio fuera de diana. Finalmente, un número máximo de emparejamientos erróneos debe ser consecutivo o espaciado a menos de cuatro bases de distancia.
Se pueden utilizar métodos similares para evaluar la especificidad de otros ortólogos de Cas9 y establecer criterios para la selección de sitios diana específicos dentro de los genomas de especies diana.
E jem plo 23 : Estrategias terapéuticas para los trastornos p o r repetic ión de Trinucleótidos
Como se mencionó anteriormente en la solicitud, el polinucleótido diana de un complejo CRISPR puede incluir un cierto número de genes y polinucleótidos asociados a la enfermedad y algunos de estos genes asociados a la enfermedad pueden pertenecer a un conjunto de trastornos genéticos denominados trastornos por repetición de Trinucleótidos (a los que se alude también como trastornos de expansión repetida de trinucleótidos, trastornos de expansión repetida de tripletes o trastornos de reiteración de codones).
Estas enfermedades son provocadas por mutaciones en las cuales las repeticiones de trinucleótidos de determinados genes exceden el umbral normal y estable que generalmente puede diferir en un gen. El descubrimiento de más trastornos de expansión repetidos ha permitido clasificar estos trastornos en un cierto númerro de categorías basadas en características similares subyacentes. La enfermedad de Huntington (HD) y las ataxias espinocerebelosas provocadas por una expansión repetida de CAG en porciones codificantes de proteínas de genes específicos se incluyen en la Categoría I. Enfermedades o trastornos con expansiones que tienden a hacerlas fenotípicamente diversas e incluyen expansiones habitualmente son pequeñas en magnitud y también se encuentran en exones de genes incluidos en la Categoría II. La Categoría III incluye trastornos o enfermedades que se caracterizan por expansiones repetidas mucho más grandes que las de la Categoría I o II y que generalmente se encuentran fuera de las regiones codificantes de proteínas. Ejemplos de enfermedades o trastornos de la Categoría III incluyen, pero no se limitan al síndrome X frágil, la distrofia miotónica, dos de las ataxias espinocerebelosas, la epilepsia mioclónica juvenil y la ataxia de Friedreich.
Se pueden adoptar estrategias terapéuticas similares tal como la mencionada para la ataxia de Friedreich a continuación para abordar también otros trastornos de repetición o expansión de trinucleótidos. Por ejemplo, otra enfermedad de repetición triple que puede tratarse utilizando una estrategia casi idéntica es la distrofia miotónica 1 (DM1), en donde hay un motivo CTG expandido en 3’ UTR. En la ataxia de Friedreich, la enfermedad resulta de la expansión de trinucleótidos GAA en el primer intrón de frataxina (FXN). Una estrategia terapéutica utilizando CRISPR es escindir la repetición GAA del primer intrón. Se cree que la repetición de GAA expandida afecta la estructura del ADN y conduce a reclutar la formación de heterocromatina que desactiva el gen de la frataxina (Figura 14A).
La Ventaja Competitiva sobre otras estrategias terapéuticas se enumeran a continuación:
La inactivación de ARNip no es aplicable en este caso, ya que la enfermedad se debe a la expresión reducida de frataxina. La terapia génica viral se está explorando actualmente. Se utilizaron vectores basados en HSV-1 para suministrar el gen frataxina en modelos animales y han demostrado un efecto terapéutico. Sin embargo, la eficacia a largo plazo del suministro de frataxina basada en virus tiene varios problemas: en primer lugar, es difícil regular la expresión de frataxina para que coincida con los niveles naturales en individuos sanos, y en segundo lugar, la sobre­ expresión a largo plazo de frataxina conduce a la muerte de la célula.
Las nucleasas se pueden utilizar para escindir la repetición de GAA para restaurar el genotipo sano, pero las estrategias de nucleasa con Dedos de Zinc y TALEN requieren la entrega de dos pares de nucleasas de alta eficacia, lo cual es difícil tanto para la entrega como para la modificación de nucleasas (una escisión eficiente del ADN genómico por ZFN o TALEN es difícil de lograr).
A diferencia de las estrategias anteriores, el sistema CRISPR-Cas tiene claras ventajas. La enzima Cas9 es más eficiente y más flexible, lo que significa que se pueden establecer uno o más dianas al mismo tiempo. Hasta ahora, la escisión eficiente de ADN genómico es > 30% por Cas9 en células humanas y puede ser tan alta como 30%, y puede mejorarse en el futuro. Además, con respecto a determinados trastornos de repetición de trinucleótidos tales como la enfermedad de Huntington (HD), las repeticiones de trinucleótidos en la región codificante pueden abordarse si existen diferencias entre los dos alelos. Específicamente, si un paciente con HD es heterocigoto para HTT mutante y existen diferencias de nucleótidos tales como SNP entre los alelos HTT wt y mutante, entonces Cas9 puede utilizarse para fijar específicamente como objetivo el alelo HTT mutante. ZFN o TALEN no tendrán la capacidad de distinguir dos alelos basados en diferencias de base única.
Al adoptar una estrategia que utiliza la enzima CRISPR-Cas 9 para abordar la ataxia de Friedreich, las solicitantes diseñan un cierto número de sitios de orientación de ARN guía que flanquean la expansión de GAA y se eligen los más eficientes y específicos (Figura 14B).
Las solicitantes suministran una combinación de ARN guía que fijan como objetivo el intrón 1 de FXN junto con Cas9 para mediar en la escisión de la región de expansión de GAA. AAV9 puede utilizarse para mediar en la entrega eficiente de Cas9 y en la médula espinal.
Si el elemento Alu adyacente a la expansión de GAA se considera importante, puede haber restricciones en el número de sitios que pueden ser fijados como objetivo, pero las solicitantes pueden adoptar estrategias para evitar interrumpirlo.
Estrategias Alternativas:
En lugar de modificar el genoma utilizando Cas9, las solicitantes también pueden activar directamente el gen FXN utilizando el dominio de unión al ADN basado en Cas9 (deficiente en la actividad nucleasa) para fijar como objetivo un dominio de activación de la transcripción al gen FXN.
E jem plo 24 : Estrategias p ara m in im izar la escisión fuera de diana utilizando nickasa Cas9
Como se mencionó anteriormente en la solicitud, Cas9 puede mutar para mediar en la escisión de una sola cadena a través de una o más de las siguientes mutaciones: D10A, E762A y H840A.
Para mediar en la inactivación de genes a través de NHEJ, las solicitantes utilizan una versión de nickasa de Cas9 junto con dos ARN guía. La mella fuera de diana por cada ARN guía individual pueden repararse principalmente sin mutación, las roturas de doble cadena (que pueden conducir a mutaciones a través de NHEJ) solo se producen cuando los sitios diana son adyacentes entre sí. Dado que las roturas de doble cadena introducidas por doble mella no son romas, la co-expresión de enzimas de procesamiento final tales como TREX1 aumentará el nivel de actividad de NHEJ. La siguiente lista de dianas en forma tabular son para genes implicados en las siguientes enfermedades:
Enfermedad de Lafora - diana GSY1 o PPP1R3C (PTG) para reducir el glucógeno en las neuronas.
Hipercolesterolemia - diana PCSK9
Las secuencias diana se enumeran en pares (L y R) con un número diferente de nucleótidos en el espaciador (0 a 3 pb). Cada uno de los espaciadores también se puede utilizar por sí mismo con Cas9 de tipo salvaje para introducir la rotura de doble cadena en el locus diana.
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Estrategias alternativas para mejorar la estabilidad del ARN guía y aumentar la especificidad.
1. Los nucleótidos en el 5’ del ARN guía pueden enlazarse a través de enlaces tioléster en lugar de enlaces fosfoéster tal como en el ARN natural. El enlace de tioléster puede evitar que el ARN guía sea digerido por la maquinaria de degradación de ARN endógeno.
2. Los nucleótidos en la secuencia guía (5’ 20 pb) del ARN guía pueden utilizar ácidos nucleicos puenteados (BNA) como bases para mejorar la especificidad de la unión.
Ejem plo 25 : C R ISPR-Cas para la edición ráp ida y m últip le d e l genom a
Aspectos de la invención se refieren a protocolos y métodos mediante los cuales la eficacia y la especificidad de la modificación génica pueden testarse en el espacio de los 3-4 días posteriores al diseño de la diana, y las líneas celulares clonales modificadas pueden derivarse en el espacio de 2-3 semanas.
Las nucleasas programables son tecnologías poderosas para mediar en la alteración del genoma con alta precisión. La nucleasa Cas9 guiada por ARN del sistema inmunitario adaptativo de CRISPR microbiano se puede utilizar para facilitar la edición eficiente del genoma en células eucariotas simplemente especificando una secuencia de fijación de objetivo de 20 nt en su ARN guía. Las solicitantes describen un conjunto de protocolos para aplicar Cas9 para facilitar la edición eficiente del genoma en células de mamíferos y generar líneas celulares para estudios funcionales posteriores. Comenzando con el diseño diana, se puede lograr una modificación genética eficiente y específica en el espacio de 3-4 días, y se pueden derivar líneas celulares clonales modificadas en el espacio de 2-3 semanas.
La capacidad de modificar sistemas y organismos biológicos tiene un enorme potencial para aplicaciones en la ciencia básica, la medicina y la biotecnología. Las endonucleasas programables específicas para la secuencia que facilitan la edición precisa de loci genómicos endógenos permiten ahora la interrogación sistemática de elementos genéticos y variaciones genéticas causales en una amplia gama de especies, incluidas aquellas que no han sido genéticamente tratables anteriormente. En los últimos años ha surgido un cierto número de tecnologías de edición del genoma, incluidas las nucleasas de dedo de zinc (ZFN), las nucleasas efectoras de activación de la transcripción (TALEN) y el sistema de nucleasa CRISPR-Cas guiado por ARN. Las dos primeras tecnologías utilizan una estrategia común de unir dominios catalíticos de endonucleasa a proteínas modulares de unión a ADN para inducir roturas de doble cadena de ADN (DSB) en loci genómicos específicos. Por el contrario, Cas9 es una nucleasa guiada por pequeños ARN a través del apareamiento de bases de Watson-Crick con ADN diana, presentando un sistema que es fácil de diseñar, eficiente y adecuado para la edición de genes multiplexados y de alto rendimiento para una diversidad de tipos de células y organismos. Aquí, las solicitantes describen un conjunto de protocolos para aplicar la nucleasa Cas9 recientemente desarrollada para facilitar la edición eficiente del genoma en células de mamíferos y generar líneas celulares para estudios funcionales posteriores.
Al igual que ZFN y TALEN, Cas9 fomenta la edición del genoma estimulando DSB en los loci genómicos diana. Tras la escisión por Cas9, el locus diana se somete a una de las dos rutas principales para la reparación del daño del ADN, la unión del extremo no homólogo propenso a errores (NHEJ) o la ruta de reparación dirigida por homología de alta fidelidad (HDR). Ambas vías se pueden utilizar para lograr el resultado de edición deseado.
NHEJ: en ausencia de un molde de reparación, el proceso NHEJ vuelve a ligar los DSB, lo que puede dejar una cicatriz en forma de mutaciones de indel. Este proceso puede aprovecharse para lograr la inactivación de genes, ya que los indeles que se producen dentro de un exón codificante pueden conducir a mutaciones de desplazamiento de marco y un codón de parada prematuro. Múltiples DSB también pueden explotarse para mediar en deleciones más grandes en el genoma.
HDR: la reparación dirigida por homología es una vía alternativa de reparación del ADN hacia el NHEJ. Aunque HDR se produce típicamente a frecuencias más bajas que NHEJ, puede aprovecharse para generar modificaciones precisas y definidas en un locus diana en presencia de un molde de reparación introducida de manera exógena. El molde de reparación puede estar en forma de ADN de doble cadena, diseñado de manera similar a las construcciones de fijación como objetivo de ADN convencionales con brazos de homología que flanquean la secuencia de inserción, u oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla (ODNss). Este último proporciona un método efectivo y simple para realizar pequeñas ediciones en el genoma, tal como la introducción de mutaciones de un solo nucleótido para explorar variaciones genéticas causales. A diferencia de NHEJ, HDR generalmente está activo solo en células en división y su eficiencia varía según el tipo y el estado de la célula.
Descripción general de CRISPR: El sistema CRISPR-Cas, por el contrario, es como mínimo un sistema de dos componentes que consiste en la nucleasa Cas9 y un ARN guía corto. La reorientación de Cas9 a diferentes loci o la edición simultánea de múltiples genes simplemente requiere la clonación de un oligonucleótido de 20 pb diferente. Aunque la especificidad de la nucleasa Cas9 aún no se ha dilucidado por completo, el apareamiento de bases de Watson-Crick simple del sistema CRISPR-Cas es probablemente más predecible que el de los dominios ZFN o TALEN.
El CRISPR-Cas de tipo II (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) es un sistema inmunitario adaptativo bacteriano que utiliza Cas9 para escindir elementos genéticos extraños. Cas9 es guiado por un par de ARN no codificantes, un ARNcr variable y un ARNtracr auxiliar requerido. El ARNcr contiene una secuencia guía de 20 nt que determina la especificidad localizando el ADN diana a través del apareamiento de bases de Watson-Crick. En el sistema bacteriano nativo, múltiples ARNcr se co-transcriben para dirigir Cas9 contra diversas dianas.
En el sistema CRISPR-Cas derivado de Streptococcus pyogenes, el ADN diana debe preceder inmediatamente a un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) 5'-NGG/NRG, que puede variar para otros sistemas CRISPR.
CRISPR-Cas se reconstituye en células de mamífero a través de la expresión heteróloga de Cas9 optimizada en codones humana y los componentes de ARN necesarios. Además, el ARNcr y el ARNtracr pueden fusionarse para crear un ARN guía quimérico sintético (ARNgs). Por lo tanto, Cas9 puede ser redirigido hacia cualquier diana de interés alterando la secuencia guía de 20 nt dentro del ARNgs.
Dada su facilidad de implementación y su capacidad multiplex, Cas9 se ha utilizado para generar células eucarióticas modificadas que llevan mutaciones específicas a través de NHEJ y HDR. Además, la inyección directa de ARNgs y ARNm que codifica Cas9 en embriones ha permitido la generación rápida de ratones transgénicos con múltiples alelos modificados; estos resultados son prometedores para la edición de organismos que de otro modo serían genéticamente intratables.
Una Cas9 mutante que lleva una interrupción en uno de sus dominios catalíticos ha sido diseñada para mellar en lugar de escindir el ADN, lo que permite roturas de la cadena sencilla y reparación preferencial a través de HDR, lo que podría mejorar las mutaciones indeseadas indeseadas de los DSB fuera de diana. Además, un mutante Cas9 con ambos residuos catalíticos de escisión del ADN mutados se ha adaptado para permitir la regulación transcripcional en E. coli, lo que demuestra el potencial de funcionalizar Cas9 para diversas aplicaciones. Determinados aspectos de la invención se refieren a la construcción y aplicación de Cas9 para la edición multiplexada de células humanas.
Las solicitantes han proporcionado una Cas9 flanqueada por secuencia de localización nuclear optimizada en codones humana para facilitar la edición de genes eucarióticos. Las solicitantes describen consideraciones para diseñar la secuencia guía de 20 nt, protocolos para la construcción rápida y la validación funcional de ARNgs y, finalmente, el uso de la nucleasa Cas9 para mediar en las modificaciones del genoma basadas en NHEJ y HDR en el riñón embrionario humano (HEK-293FT) y líneas de células madre humanas (HUES9). Este protocolo también puede aplicarse a otros tipos de células y organismos.
Selección de diana para ARNgs: Existen dos consideraciones principales en la selección de la secuencia guía de 20 nt para la fijación como objetivo de genes: 1) la secuencia diana debe preceder al 5'-NGG PAM para Cas9 de S. pyogenes, y 2) las secuencias guía deben elegirse para minimizar la actividad fuera de diana. Las solicitantes proporcionaron una herramienta de diseño de fijación como objetivo de Cas9 en línea que toma una secuencia de entrada de interés e identifica sitios de destino adecuados. Para evaluar experimentalmente las modificaciones fuera de diana para cada uno de los ARNgs, las solicitantes también proporcionan sitios fuera de diana pronosticados por computadora para cada diana prevista, clasificados de acuerdo con el análisis de especificidad cuantitativa de las solicitantes sobre los efectos de la identidad, posición y distribución de emparejamientos erróneos de bases.
La información detallada sobre sitios fuera de diana pronosticados por computadora es la siguiente:
Consideraciones para Actividades de Escisión Fuera de diana: Similar a otras nucleasas, Cas9 puede escindir dianas de ADN fuera de diana en el genoma a frecuencias reducidas. El grado en el que una secuencia guía dada muestra una actividad fuera de diana depende de una combinación de factores que incluyen la concentración de enzimas, la termodinámica de la secuencia guía específica empleada y la abundancia de secuencias similares en el genoma diana. Para la aplicación rutinaria de Cas9, es importante considerar formas de minimizar el grado de escisión fuera de diana y también poder detectar la presencia de escisión fuera de diana.
Minimizar la actividad fuera de diana: Para la aplicación en líneas celulares, las solicitantes recomiendan seguir dos pasos para reducir el grado de modificación del genoma fuera de diana. Primero, utilizando la herramienta de selección de dianas CRISPR en línea de las solicitantes, es posible evaluar por computadora la probabilidad de que una secuencia guía dada tenga sitios fuera de diana. Estos análisis se realizan a través de una búsqueda exhaustiva en el genoma de secuencias fuera de diana que son secuencias similares a la secuencia guía. La investigación experimental exhaustiva del efecto del emparejamiento erróneo de bases entre el ARNgs y su ADN diana reveló que la tolerancia de emparejamiento erróneo es 1) dependiente de la posición - los 8-14 pb en el extremo 3’ de la secuencia guía son menos tolerantes a los emparejamientos erróneos de las bases en 5' 2) depende de la cantidad: - en general, no se toleran más de 3 emparejamientos erróneos, 3) depende de la secuencia guía - algunas secuencias guía son menos tolerantes a los emparejamientos erróneos que otras y 4) depende de la concentración - la escisión fuera de diana es muy sensible a la cantidad de ADN transfectado. La herramienta web de análisis del sitio diana de las solicitantes (disponible en el sitio web genome-engineering.org/tools) integra estos criterios para proporcionar predicciones para los sitios probables fuera de diana en el genoma diana. En segundo lugar, las solicitantes recomiendan valorar la cantidad de plásmido de expresión Cas9 y ARNgs para minimizar la actividad fuera de diana.
Detección de actividades fuera de diana: Utilizando la herramienta web que fija como objetivo CRISPR de las solicitantes, es posible generar una lista de los sitios más probablemente fuera de diana, así como cebadores que realizan análisis SURVEYOR o análisis de secuencia de esos sitios. Para los clones isogénicos generados utilizando Cas9, las solicitantes recomiendan encarecidamente la secuenciación de estos sitios candidatos fuera de diana para verificar cualquier mutación no deseada. Vale la pena señalar que puede haber modificaciones fuera de diana en sitios que no están incluidos en la lista de candidatos pronosticados y se debe realizar una secuencia completa del genoma para verificar completamente la ausencia de sitios fuera de diana. Además, en los ensayos multiplex en donde se inducen varios DSB dentro del mismo genoma, puede haber tasas bajas de eventos de translocación y se pueden evaluar utilizando una diversidad de técnicas tal como la secuenciación profunda.
La herramienta en línea proporciona las secuencias para todos los oligos y cebadores necesarios para 1) preparar las construcciones de ARNgs, 2) evaluar la eficacia de la modificación de la diana y 3) evaluar la escisión en sitios potenciales fuera de diana. Vale la pena señalar que debido a que el promotor de la ARN polimerasa III U6 utilizado para expresar el ARNgs prefiere un nucleótido de guanina (G) como la primera base de su transcrito, se añade un G adicional en el 5‘ del ARNgs donde la guía de 20 nt la secuencia no comienza con G.
Enfoques para la construcción y el suministro de ARNgs: Dependiendo de la aplicación deseada, los ARNgs pueden administrarse como 1) amplicones de PCR que contienen un casete de expresión o 2) plásmidos que expresan ARNgs. El suministro de ARNgs basado en la PCR agrega la secuencia de ARNgs personalizada en el cebador de PCR inverso utilizado para amplificar un molde de promotor U6. El amplicón resultante puede co-transfectarse con un plásmido que contiene Cas9 (PX165). Este método es óptimo para la detección rápida de múltiples ARNgs candidatos, ya que las transfecciones celulares para pruebas funcionales se pueden realizar pocas horas después de obtener los cebadores que codifican ARNgs. Debido a que este método simple evita la necesidad de clonación basada en plásmidos y la verificación de la secuencia, es muy adecuado para testar o co-transfectar un gran número de ARNgs para generar grandes colecciones inactivadas u otras aplicaciones sensibles a la escala. Téngase en cuenta que los cebadores que codifican ARNgs tienen más de 100 pb, en comparación con los oligos de ~ 20 pb requeridos para el suministro de ARNgs basado en plásmidos.
La construcción de un plásmido de expresión para ARNgs también es simple y rápida, implicando una sola etapa de clonación con un par de oligonucleótidos parcialmente complementarios. Después de reasociar los pares oligo, las secuencias guía resultantes pueden insertarse en un plásmido que porta tanto Cas9 como un armazón invariante que porta el resto de la secuencia de ARNgs (PX330). Los plásmidos de transfección también pueden modificarse para permitir la producción de virus para el suministro in vivo.
Además de la PCR y los métodos de suministro basados en plásmidos, tanto Cas9 como ARNgs pueden introducirse en las células como ARN.
Diseño del molde de reparación: Tradicionalmente, las modificaciones de ADN fijado como objetivo han requerido el uso de moldes de reparación de donantes basadas en plásmidos que contienen brazos de homología que flanquean el sitio de alteración. Los brazos de homología en cada lado pueden variar en longitud, pero típicamente son más largos que 500 pb. Este método puede utilizarse para generar grandes modificaciones, incluida la inserción de genes informadores, tales como proteínas fluorescentes o marcadores de resistencia a antibióticos. El diseño y la construcción de plásmidos de fijación de objetivo se han descrito en otra parte.
Más recientemente, se han utilizado oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla (ODNss) en lugar de fijar como objetivo a plásmidos para realizar modificaciones cortas dentro de un locus definido sin clonación. Para lograr unas altas eficiencias HDR, los ODNss contienen secuencias flanqueantes de al menos 40 pb en cada uno de los lados que son homólogas a la región diana y pueden orientarse en la dirección sentido o antisentido en relación con el locus diana.
Ensayo funcional
Ensayo de nucleasa SURVEYOR: Las solicitantes detectaron mutaciones indeles mediante el ensayo de nucleasa SURVEYOR (o secuenciación de amplicón de PCR). La herramienta de diseño de dianas CRISPR en línea de las solicitantes proporciona cebadores recomendados para ambos enfoques. Sin embargo, SURVEYOR o cebadores de secuenciación también pueden diseñarse manualmente para amplificar la región de interés del ADN genómico y para evitar amplicones no específicos utilizando Primer-BLAST de la NCBI. Los cebadores SURVEYOR deben diseñarse para amplificar 300-400 pb (para un amplicón total de 600-800 pb) a cada uno de los lados de la diana Cas9 para permitir una visualización clara de las bandas de escisión por electroforesis en gel. Para evitar la formación excesiva de dímeros de cebadores, los cebadores SURVEYOR deben diseñarse para que tengan típicamente menos de 25 nt de largo con temperaturas de fusión de ~ 60 ° C. Las solicitantes recomiendan testar cada uno de los pares de cebadores candidatos para amplicones de PCR específicos, así como para la ausencia de escisión no específica durante el proceso de digestión de nucleasa SURVEYOR.
HDR mediado por plásmidos u ODNss: HDR puede detectarse mediante amplificación por PCR y secuenciación de la región modificada. Los cebadores de PCR para este propósito deben reasociarse fuera de la región abarcada por los brazos de homología para evitar la detección falsa del molde de reparación residual (HDR Dir. e Inv, Figura 12). Para HDR mediada por ODNss, se pueden utilizar cebadores SURVEYOR PCR.
Detección de indeles o HDR por secuenciación: Las solicitantes detectaron modificaciones específicas para el genoma por Sanger o por la secuenciación profunda de próxima generación (NGS). Para el primero, el ADN genómico de la región modificada puede amplificarse utilizando cebadores SURVEYOR o HDR. Los amplicones deben subclonarse en un plásmido tal como pUC19 para transformación; se pueden secuenciar colonias individuales para revelar el genotipo clonal.
Las solicitantes diseñaron cebadores de secuenciación de próxima generación (NGS) para amplicones más cortos, típicamente en el intervalo de tamaño de 100-200 pb. Para detectar mutaciones NHEJ, es importante diseñar cebadores con al menos 10-20 pb entre las regiones de cebado y el sitio diana de Cas9 para permitir la detección de indeles más largos. Las solicitantes proporcionan directrices para un método de PCR de dos etapas para conectar adaptadores con código de barras para la secuenciación profunda multiplex. Las solicitantes recomiendan la plataforma Illumina, debido a sus niveles generalmente bajos de indeles positivos falsos. El análisis fuera de diana (descrito previamente) se puede realizar a través de programas de alineamiento de lectura, tales como ClustalW, Geneious o secuencias de comandos de análisis de secuencia simple.
Materiales y Reactivos
Preparación de ARNgs:
Agua destilada UltraPure libre de DNasaRNasa (Life Technologies, n° cat. 10977-023)
Polimerasa de fusión Herculasa II (Agilent Technologies, n° cat. 600679)
CRÍTICA La polimerasa Taq estándar, que carece de actividad de corrección de pruebas de exonucleasa 3'-5', tiene una fidelidad baja y puede conducir a errores de amplificación. Herculasa II es una polimerasa de alta fidelidad (fidelidad equivalente a Pfu) que produce altos rendimientos de producto de PCR con una optimización mínima. Se pueden sustituir otras polimerasas de alta fidelidad.
Tampón de reacción Herculasa II (5x; Agilent Technologies, incluido con polimerasa)
Mezcla de solución de dNTP (25 mM cada uno; Enzimática, n° cat. N205L)
MgCl2 (25 mM; ThermoScientific, n° cat. R0971)
Kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, n° cat. 28704)
Kit QIAprep spin miniprep (Qiagen, n° cat. 27106)
Tampón TBE UltraPure (10X; Life Technologies, n° cat. 15581 -028)
SeaKem LE agarosa (Lonza, n° cat. 50004)
Tinción de ADN SYBR Safe (10.000x; Life Technologies, n° cat. S33102)
Escalera de ADN de 1 kb Plus (Life Technologies, n° cat. 10787-018)
Tampón de carga TrackIt CyanOrange (Life Technologies, n° cat. 10482-028)
FastDigest BbsI (BpiI) (Fermentas/ThermoScientific, n° cat. FD1014)
Tampón Fermentas Tango (Fermentas/ThermoScientific, n° cat. BY5)
DL-ditiotreitol (DTT; Fermentas/ThermoScientific, n° cat. R0862)
ADN ligasa de T7 (Enzymatics, n° cat. L602L)
Crítico: no sustituir la ligasa T4 más comúnmente utilizada. La ligasa T7 tiene una actividad 1.000 veces mayor en los extremos pegajosos que en los extremos romos y una actividad general más alta que las ligasas T4 concentradas disponibles comercialmente.
Tampón de ligamiento rápido T72X (incluido con la ADN ligasa de T7, Enzymatics, n° cat. L602L)
Polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs, n° cat. M0201S)
Tampón de Reacción de T4 ADN Ligasa (10X; New England Biolabs, n° cat. B0202S)
Adenosina 5'-trifosfato (10 mM; New England Biolabs, n° cat. P0756S)
DNasa dependiente de ATP PlasmidSafe (Epicentro, n° cat. E3101K)
Escherichia coli (E. coli) One Shot Stbl3 químicamente competente (Life Technologies, n° cat. C7373-03)
Medio SOC (New England Biolabs, n° cat. B9020S)
Medio LB (Sigma, n° cat. L3022)
Medio de agar LB (Sigma, n° cat. L2897)
Ampicilina, filtrada en condiciones estériles (100 mg ml-1; Sigma, n° cat. A5354)
Cultivo de células de mamíferos:
Células HEK293FT (Life Technologies, n° cat. R700-07)
Medio de Eagle mínimo de Dulbecco (DMEM, IX, alto contenido en glucosa; Life Technologies, n° cat. 10313-039)
Medio de Eagle mínimo de Dulbecco (DMEM, IX, alto contenido en glucosa, sin fenol rojo; Life Technologies, n° cat.
31053-028)
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1X; Life Technologies, n° cat. 14190-250)
Suero fetal bovino, calificado e inactivado por calor (Life Technologies, n° cat. 10438-034)
Medio de suero reducido Opti-MEM I (FBS; Life Technologies, n° cat. 11058-021)
Penicilina-estreptomicina (100x; Life Technologies, n° cat. 15140-163)
TrypLE ™ Express (1X, sin Rojo Fenol; Life Technologies, n° cat. 12604-013)
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies, n° cat. 11668027)
Línea Celular Amaxa SF Kit S 4D-Nucleofector® X (32 RCT; Lonza, n° cat. V4XC-2032)
Línea celular HUES 9 (HARVARD STEM CELL SCIENCE)
Matriz de Membrana Basal de Factor de Crecimiento Reducido Libre de LDEV Geltrex (Life Technologies, n° cat. A1413201)
Medio mTeSRl (Stemcell Technologies, n° cat. 05850)
Solución de desprendimiento de células Accutase (Stemcell Technologies, n° cat. 07920)
Inhibidor ROCK (Y-27632; Millipore, n° cat. SCM075)
Línea Celular P3 Primary Cell Kit S 4D-Nucleofector® X (32 RCT; Lonza, n° cat. V4XP-3032)
Análisis de genotipado:
Solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre, n° cat. QE09050)
Cebadores de PCR para SURVEYOR, análisis RFLP o secuenciación (véase la tabla de Cebadores)
Polimerasa de fusión Herculasa II (Agilent Technologies, n° cat. 600679)
CRÍTICA Dado que el ensayo Surveyor es sensible a los emparejamientos erróneos de una sola base, es particularmente importante utilizar una polimerasa de alta fidelidad. Se pueden sustituir otras polimerasas de alta fidelidad.
Tampón de reacción Herculasa II (5x; Agilent Technologies, incluido con polimerasa)
Mezcla de solución de dNTP (25 mM cada uno; Enzimática, n° cat. N205L)
Kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, n° cat. 28704)
Tampón Taq (10x; Genscript, n° cat. B0005)
Kit de detección de mutaciones SURVEYOR para electroforesis en gel estándar (Transgenomic, n° cat. 706025)
Tampón TBE UltraPure (10x; Life Technologies, n° cat. 15581-028)
SeaKem LE agarosa (Lonza, n° cat. 50004)
Geles TBE al 4-20% 1,0 mm, 15 Pocillos (Life Technologies, n° cat. EC62255BOX)
Tampón de Muestra TBE de alta densidad Novex® (5X; Life Technologies, n° cat. LC6678)
Tinción de Gel de Ácido Nucleico Dorado SYBR (10.000x; Life Technologies, n° cat. S-11494)
Escalera de ADN de 1 kb Plus (Life Technologies, n° cat. 10787-018)
Tampón de carga TrackIt CyanOrange (Life Technologies, n° cat. 10482-028)
FastDigest HindlII (Fermentas/ThermoScientific, n° cat. FD0504)
Equipo
Puntas de pipeta estériles filtradas (Corning)
Tubos de microcentrífuga estándar de 1,5 ml (Eppendorf, n° cat. 0030 125.150)
Placas de PCR de 96 pocillos Axygen (VWR, n° cat. PCR-96M2-HSC)
Tubos de PCR de 8 tiras Axygen (Fischer Scientific, n° cat. 14-222-250)
Tubos Falcon, polipropileno, 15 ml (BD Falcon, n° cat. 352097)
Tubos Falcon, polipropileno, 50 ml (BD Falcon, n° cat. 352070)
Tubo de fondo redondo con tapa del filtro de células, 5 ml (BD Falcon, n° cat. 352235)
Placas de Petri (60 mm x 15 mm; BD Biosciences, n° cat. 351007)
Placa de cultivo de tejidos (24 pocillos; BD Falcon, n° cat. 353047)
Placa de cultivo de tejidos (96 pocillos; fondo plano; BD Falcon, n° cat. 353075)
Plato de cultivo de tejidos (100 mm; BD Falcon, 353003)
Termociclador de 96 pocillos con funcionalidad de escalonamiento de temperatura programable (Applied Biosystems Veriti, n2 cat. 4375786).
Microcentrífugas de escritorio 5424, 5804 (Eppendorf)
Sistema de electroforesis en gel (fuente de alimentación básica PowerPac, Bio-Rad, n° cat. 164-5050, y bandeja de gel del sistema Sub-Cell GT, Bio-Rad, n° cat. 170-4401)
Novex XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies, n° cat. EI0001)
Sistema digital de imágenes de gel (GelDoc EZ, Bio-Rad, n° cat. 170-8270, y bandeja de muestras azul, Bio-Rad, n° cat. 170-8273)
Transiluminador de luz azul y gafas de filtro naranja (Safelmager 2.0; Invitrogen, n° cat. G6600)
Software de cuantificación de gel (Bio-Rad, ImageLab, incluido con GelDoc EZ, o ImageJ de código abierto de los Institutos Nacionales de Salud, disponible en el sitio web rsbweb.nih.gov/ij/) Espectrofotómetro UV (NanoDrop 2000c, Thermo Scientific)
Configuración de Reactivos
Solución de electroforesis con tris-borato EDTA (TBE) Diluir el tampón TBE en agua destilada en una solución de trabajo 1X para moldear geles de agarosa y para utilizar como tampón para la electroforesis en gel. El tampón se puede almacenar a temperatura ambiente (18 - 22°C) durante al menos 1 año.
ATP, 10 mM Dividir el ATP 10 mM en partes alícuotas de 50 gl y almacenar a - 20°C durante hasta 1 año; evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
DTT, 10 mM Preparar una solución de DTT 10 mM en agua destilada y almacenar en partes alícuotas de 20 gl a -70°C durante hasta 2 años; para cada una de las reacciones, utilizar una nueva parte alícuota, ya que la DTT se oxida fácilmente.
Medio de cultivo D10 Para el cultivo de células HEK293FT, preparar el medio de cultivo D10 complementando DMEM con 1X GlutaMAX y suero bovino fetal al 10% (vol / vol). Como se indica en el protocolo, este medio también se puede complementar con penicilina-estreptomicina 1X. El medio D10 puede prepararse con anticipación y almacenarse a 4°C durante hasta 1 mes.
Medio de cultivo mTeSR1 Para el cultivo de células madre embrionarias humanas, preparar el medio mTeSRl complementando el complemento 5X (incluido con el medio basal mTeSR1) y Normocina 100 ug/ml.
Procedimiento
Diseño de componentes de fijación como objetivo y uso de la herramienta en línea • Tiempo 1 d
11 Secuencia de ADN genómico diana de entrada. Las solicitantes proporcionan una herramienta de fijación como objetivo de Cas9 en línea que toma una secuencia de entrada de interés, identifica y clasifica los sitios diana adecuados y predice por computadora los sitios fuera de diana para cada una de las dianas previstas. Alternativamente, se puede seleccionar manualmente la secuencia de guía identificando la secuencia de 20 pb directamente aguas arriba de cualquier 5'-NGG.
2| Solicitar los oligos y cebadores necesarios según lo especificado por la herramienta en línea. Si el sitio se elige manualmente, se deben diseñar los oligos y los cebadores.
Preparación de la construcción de expresión de ARNgs
3| Para generar la construcción de expresión de ARNgs, puede utilizarse el protocolo basado en PCR o en el plásmido.
(A) mediante amplificación por PCR • Tiempo 2 h
(i) Las solicitantes preparan un molde de PCR U6 diluido. Las solicitantes recomiendan utilizar PX330 como molde de PCR, pero cualquier plásmido que contenga U6 también puede utilizarse como molde de PCR. Las solicitantes diluyeron el molde con ddH2Ü a una concentración de 10 ng/ul. Téngase en cuenta que si un plásmido o casete que ya contiene un ARNgs impulsado por U6 se utiliza como molde, se debe realizar una extracción de gel para garantizar que el producto contenga solo el ARNgs deseado y no se acumule rastro de ARNgs del molde.
(ii) Las solicitantes prepararon oligos de PCR diluidos. Los cebadores U6 -Dir. y U6 -ARNgs-Inv se diluyen a una concentración final de 10 uM en ddH2Ü (añadir 10 ul de cebador 100 uM a 90 ul de ddH2Ü).
(iii) reacción PCR U6 -ARNgs. Las solicitantes configuran la siguiente reacción para cada cebador y mezcla maestra de U6 -ARNgs-Inv según sea necesario:
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
(iv) Las solicitantes realizaron una reacción PCR en las reacciones de la etapa (iii) utilizando las siguientes condiciones de ciclación:
Figure imgf000117_0002
(v) Después de completar la reacción, las solicitantes procesaron el producto en un gel para verificar la amplificación con éxito de una sola banda. Echar un gel de agarosa al 2% (peso/vol) en tampón 1X TBE con colorante 1X SYBR Safe. Ejecutar 5 ul del producto de PCR en el gel a 15 V cm-1 durante 20-30 min. Los amplicones exitosos deberían proporcionar un solo producto de 370 pb y el molde debería ser invisible. No debería ser necesario extraer en gel el amplicón de PCR.
(vi) Las solicitantes purificaron el producto de PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Eluir el ADN en 35 ul de Tampón EB o agua. Los productos de PCR purificados pueden almacenarse a 4°C o -20°C.
(B) Clonación de ARNgs en un vector de expresión bicistrónico que contiene Cas9 • Tiempo 3 d
(i) Preparar los insertos de oligo ARNgs. Las solicitantes resuspendieron las cadenas superior e inferior de oligos para cada uno de los diseños de ARNgs a una concentración final de 100 pM. Fosforilar y reasociar el oligo de la siguiente manera:
Figure imgf000117_0003
(ii) Reasociar en un termociclador utilizando los siguientes parámetros:
37°C durante 30 min
95°C durante 5 min
Descenso a 25°C a 5°C por min
(iii) Las solicitantes diluyeron oligos fosforilados y reasociados en la relación 1: 200 añadiendo 1 ul de oligo a 199 ul de ddhbO a temperatura ambiente.
(iv) Clonar el oligo ARNgs en PX330. Las solicitantes configuraron la reacción de Golden Gate para cada uno de los ARNgs. Las solicitantes recomiendan también configurar un control negativo sin inserto, PX330 solo.
Figure imgf000117_0004
Figure imgf000118_0001
(v) Incubar la reacción de Golden Gate durante un total de 1 h:
Condición del número de ciclos
1 -6 37°C durante 5 min, 21 °C durante 5 min
(vi) Las solicitantes trataron la reacción de Golden Gate con la exonucleasa PlasmidSafe para digerir cualquier ADN linearizado residual. Esta etapa es opcional, pero muy recomendable.
Figure imgf000118_0002
(vii) Las solicitantes incubaron la reacción de PlasmidSafe a 37°C durante 30 min, seguido de la inactivación a 70°C durante 30 min. Punto de pausa: después de completarse, la reacción puede congelarse y continuarse más tarde. El ADN circular debe ser estable durante al menos 1 semana.
(viii) Transformación. Las solicitantes transformaron el plásmido tratado con PlasmidSafe en una cepa de E. coli competente, de acuerdo con el protocolo suministrado con las células. Las solicitantes recomiendan Stbl3 para una transformación rápida. Brevemente, las solicitantes añadieron 5 ul del producto de la etapa (vii) en 20 ul de células Stbl3 químicamente competentes heladas. Luego se incuba en hielo durante 10 min, se calienta a 42°C durante 30 s, se devuelve inmediatamente a hielo durante 2 min, se añaden 100 ul de medio SOC y se coloca en una placa LB que contiene ampicilina 100 ug/ml con incubación durante la noche a 37°C.
(ix) Día 2: Las solicitantes inspeccionaron las placas en busca de crecimiento de colonias. Típicamente, no hay colonias en las placas de control negativo (ligamiento de PX330 digerido con BbsI solamente, sin oligo ARNgs reasociaido), y decenas a cientos de colonias en las placas de clonación de ARNgs PX330.
(x) De cada una de las placas, las solicitantes recogieron 2-3 colonias para verificar la inserción correcta de ARNgs. Las solicitantes utilizaron una punta de pipeta estéril para inocular una sola colonia en un cultivo de 3 ml de medio LB con ampicilina 100 ug/ml. Incubar y agitar a 37°C durante la noche.
(xi) Día 3: Las solicitantes aislaron el ADN plasmídico de los cultivos nocturnos utilizando un kit de minipreparación QiAprep Spin de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(xii) La secuencia valida el plásmido CRISPR. Las solicitantes verificaron la secuencia de cada una de las colonias mediante la secuenciación del promotor U6 utilizando el cebador U6 -Dir. Opcional: secuenciar el gen Cas9 utilizando los cebadores enumerados en la siguiente tabla de Cebadores.
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
Las solicitantes hicieron referencia a los resultados de secuenciación frente a la secuencia del vector de clonación PX330 para verificar que la secuencia guía de 20 pb se insertó entre el promotor U6 y el resto del armazón de ARNgs. Detalles y la secuencia del mapa PX330 en formato de mapa vectorial GenBank (archivo *.gb) se pueden encontrar en el sitio web crispr.genome-engineering.org.
(Opcional) Diseño de molde ODNss • Tiempo 3 d planificación anticipada
3| Diseño y orden de ODNss. ODNss sentido o antisentido se puede adquirir directamente del proveedor. Las solicitantes recomiendan diseñar brazos de homología de al menos 40 pb a cada lado y de 90 pb para una eficiencia HDR óptima. En la experiencia de las solicitantes, los oligos antisentido tienen eficiencias de modificación ligeramente más altas.
4| Las solicitantes resuspendieron y diluyeron ultrámeros de ODNss a una concentración final de 10 pM. No combinar ni reasociar los ODNss sentido y antisentido. Almacenar a -20°C.
5| Nota para aplicaciones HDR, las solicitantes recomiendan clonar ARNgs en el plásmido PX330.
Validación funcional de ARNgs: cultivo celular y transfecciones • Tiempo 3-4 d
El sistema CRISPR-Cas se ha utilizado en un cierto número de líneas celulares de mamíferos. Las condiciones pueden variar para cada línea celular. Los protocolos que figuran a continuación detallan las condiciones de transfección para las células HEK239FT. Nota para las transfecciones HDR mediadas por ODNss, el kit Amaxa SF Cell Line Nucleofector se utiliza para el suministro óptimo de ODNss. Esto es descrito en la siguiente sección.
7| Mantenimiento de HEK293FT. Las células se mantienen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen, las solicitantes cultivaron células en medio D10 (GlutaMax DMEM complementado con Suero de Bovino Fetal al 10%), a 37°C y 5% de CO2.
8 | Para el paso, las solicitantes retiraron medio y aclararon una vez añadiendo suavemente DPBS al lado del recipiente, para no desalojar las células. Las solicitantes añadieron 2 ml de TrypLE a un matraz T75 e incubaron durante 5 min a 37°C. Se añaden 10 ml de medio D10 caliente para inactivar y se transfieren a un tubo Falcon de 50 ml. Las solicitantes disociaron las células triturándolas suavemente y volvieron a sembrar nuevos matraces según fuera necesario. Típicamente, las solicitantes hacen pasar células cada 2-3 d en una proporción dividida de 1:4 o 1:8 , no permitiendo nunca que las células alcancen más del 70% de confluencia. Las líneas celulares se reinician al alcanzar el paso número 15.
9| Preparar células para la transfección. Las solicitantes colocaron células bien disociadas en placas de 24 pocillos en medio D10 sin antibióticos 16-24 h antes de la transfección a una densidad de siembra de 1,3 x 105 células por pocillo y un volumen de siembra de 500 ul. Escalar hacia arriba o hacia abajo de acuerdo con el manual del fabricante según sea necesario. Se sugiere no sembrar más células que la densidad recomendada, ya que esto puede reducir la eficiencia de la transfección.
10| El día de la transfección, las células son óptimas con una confluencia del 70-90%. Las células se pueden transfectar con Lipofectamine 2000 o el kit Amaxa SF Cell Line Nucleofector de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.
(A) Para los ARNgs clonados en PX330, las solicitantes transfectaron 500 ng de plásmido CRISPR verificado en la secuencia; si transfecta más de un plásmido, mezclar en proporción equimolar y no más de 500 ng en total.
(B) Para ARNgs amplificado por PCR, las solicitantes mezclaron lo siguiente:
Figure imgf000121_0001
Las solicitantes recomiendan transfectar en triplicados técnicos para una cuantificación fiable e incluir controles de transfección (p. ej., plásmido GFP) para controlar la eficiencia de la transfección. Además, el plásmido de clonación PX330 y/o el amplicón de ARNgs pueden transfectarse solos como control negativo para ensayos funcionales posteriores.
111 Las solicitantes añadieron complejo de Lipofectamine a las células suavemente, ya que las células HEK293FT pueden desprenderse fácilmente de la placa y dar como resultado una eficiencia de transfección más baja.
12| Las solicitantes comprobaron la eficacia de las células 24 h después de la transfección estimando la fracción de células fluorescentes en la transfección de control (p. ej., GFP) utilizando un microscopio de fluorescencia. Típicamente, las células se transfectan más del 70%.
13| Las solicitantes complementaron el medio de cultivo con 500 ul adicionales de medio D10 caliente. Añadir D10 muy lentamente al costado del pocillo y no utilizar medio frío, ya que las células pueden desprenderse fácilmente.
14| Las células se incuban durante un total de 48-72 h después de la transfección antes de ser recogidas para un análisis de indeles. La eficacia de indel no aumenta notablemente después de 48 h.
(Opcional) Co-transfección de plásmidos CRISPR y ODNss o plásmidos que fijan objetivo para HR • Tiempo 3-4 d
15| Linearizarplásmido que fija objetivo. El vector de fijación de objetivo se lineariza, si es posible, cortando una vez en un sitio de restricción en la cadena principal del vector cerca de uno de los brazos de homología o en el extremo distal de cualquiera de los brazos de homología.
16| Las solicitantes procesaron una pequeña cantidad del plásmido linearizado junto con el plásmido sin cortar en un gel de agarosa al 0,8-1% para verificar la linearización exitosa. El plásmido linearizado debe desplazarse por encima del plásmido superenrollado.
17| Las solicitantes purificaron plásmido linearizado con el kit de purificación por PCR QIAQuick.
18| Preparar células para la transfección. Las solicitantes cultivaron HEK293FT en matraces T75 o T225. Se planea un recuento de células suficiente antes del día de la transfección. Para el formato de tira-cubeta Amaxa, se utilizan 2 x 106 células por transfección.
19| Preparar placas para la transfección. Las solicitantes añadieron 1 ml de medio D10 caliente a cada uno de los pocillos de una placa de 12 pocillos. Las placas se colocan en la incubadora para mantener el calor medio.
20| Nucleofección Las solicitantes transfectaron células HEK293FT de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit Amaxa SF Cell Line Nucleofector 4D, adaptadas en los pasos que figuran a continuación.
a. Para la cotransfección de ODNss y CRISPR, mezclar previamente el siguiente ADN en tubos de PCR:
Figure imgf000121_0002
b. Para el plásmido de fijación de objetivo HDR y la cotransfección de CRISPR, mezclar previamente el siguiente ADN en tubos de PCR:
Figure imgf000121_0003
Para los controles de transfección, véase la sección anterior. Además, las solicitantes recomiendan transfectar ODNss o fijar como objetivo el plásmido solo como control negativo.
211 Disociar a células individuales. Las solicitantes separaron el medio y aclararon una vez suavemente con DPBS, teniendo cuidado de no desalojar las células. Se añaden 2 ml de TrypLE a un matraz T75 y se incuban durante 5 min a 37°C. Se añaden 10 ml de medio D10 caliente para inactivar y se tritura suavemente en un tubo Falcon de 50 ml. Se recomienda que las células se trituren suavemente y se disocien en células individuales. Grupos grandes reducirán la eficiencia de transfección. Las solicitantes tomaron una parte alícuota de 10 ul de la suspensión y la diluyeron en 90 ul de medio D10 para el recuento. Las solicitantes contaron las células y calcularon el número de células y el volumen de suspensión necesarios para la transfección. Las solicitantes transfectaron típicamente 2 x 105 células por condición utilizando las tiras de Amaxa Nucleocuvette y recomiendan calcular un 20% más de células de las necesarias para ajustar la pérdida de volumen en los pasos de pipeteo posteriores. El volumen necesario se transfiere a un nuevo tubo Falcon.
23| Las solicitantes centrifugaron el tubo nuevo a 200 x g durante 5 min.
Las solicitantes prepararon la solución de transfección mezclando la solución SF y el suplemento S1 según lo recomendado por Amaxa. Para las cubetas de tira Amaxa, se necesita un total de 20 ul de solución de SF complementada por transfección. Del mismo modo, las solicitantes recomiendan calcular un 20% más de volumen del requerido.
25| Las solicitantes retiraron el medio completamente de las células sedimentadas del paso 23 y le resuspendieron suavemente en un volumen apropiado (20 ul por 2 x 105 células) de solución de SF complementada con S1. No dejar células en solución SF durante un período prolongado de tiempo.
26| Se pipetean 20 ul de células resuspendidas en cada premezcla de ADN del paso 20. Pipetear suavemente para mezclar y transferir a la cámara de la tira de Nucleocuvette. Esto se repite para cada una de las condiciones de transfección.
Electroporar células utilizando el programa Nucleofector 4D recomendado por Amaxa, CM-130.
28 | Las solicitantes pipetearon suave y lentamente 100 ul de medio D10 caliente en cada una de las cámaras de tiras de Nucleocuvette, y transfirieron todo el volumen a la placa precalentada desde el paso 19. CRÍTICA. Las células son muy frágiles en esta fase y el pipeteo fuerte puede provocar la muerte de las células. Incubar durante 24 h. En este punto, la eficiencia de transfección puede estimarse a partir de la fracción de células fluorescentes en el control de transfección positivo. La nucleofección resulta típicamente en una eficiencia de transfección mayor del 70-80%. Las solicitantes añadieron lentamente 1 ml de medio D10 caliente a cada uno de los pocillo sin desalojar las células. Incubar las células durante un total de 72 h.
Cultivo y transfección de células madre embrionarias humanas (HUES 9) • Tiempo 3-4 d
Mantener la línea hESC (HUES9). Las solicitantes mantienen rutinariamente la línea celular HUES9 en condiciones sin alimentador con medio mTesRl. Las solicitantes prepararon el medio mTeSR1 añadiendo el complemento 5X incluido con el medio basal y Normocina 100 ug/ml. Las solicitantes prepararon una parte alícuota de 10 ml de medio mTeSR1 complementado adicionalmente con inhibidor de Rock 10 pM. Recubrir la placa de cultivo de tejidos. Diluir GelTrex 1:100 frío en DMEM frío y cubrir toda la superficie de una placa de cultivo de tejidos de 100 mm.
Colocar la placa en la incubadora durante al menos 30 min a 37°C. Descongele un vial de células a 37°C en un tubo Falcon de 15 ml, añadir 5 ml de medio mTeSR1 y sedimentar a 200 x g durante 5 min. Aspirar del recubrimiento GelTrex y sembrar ~ 1 x 106 células con 10 ml de medio mTeSRl que contiene inhibidor de Rock. Cambiar a medio mTeSRl normal 24 h después de la transfección y re-alimentar diariamente. Células de paso Re-alimentar las células con medio mTeSRl reciente diariamente y hacer pasar antes de alcanzar el 70% de confluencia. Aspirar del medio mTeSR1 y lavar las células una vez con DPBS. Disociar las células añadiendo 2 ml de Accutase e incubar a 37°C durante 3 - 5 min. Añadir 10 ml de medio mTeSRl a las células separadas, transferir a un tubo Falcon de 15 ml y resuspender suavemente. Volver a colocar la placa en placas recubiertas con GelTrex en medio mTeSRl con inhibidor de Rock 10 uM. Cambiar a medio mTeSRl normal 24 h después de la siembra en placas.
Transfección. Las solicitantes recomiendan cultivar células durante al menos 1 semana después de la descongelación antes de transfectar utilizando el kit de Nucleofector 4-D de Células Primarias Amaxa P3 (Lonza). Re-alimentar las células en crecimiento en fase logarítmica con medio reciente 2 h antes de la transfección. Disociar en células individuales o grupos pequeños de no más de 10 células con accutase y resuspensión suave. Contar el número de células necesarias para la nucleofección y centrifugar a 200 x g durante 5 min. Retirar el medio por completo y resuspender en el volumen recomendado de solución de nucleofección P3 complementada con S1. Colocar suavemente las células electroporadas en placas recubiertas en presencia de inhibidor de 1X Rock.
Verificar el éxito de la transfección y re-alimentar diariamente con medio mTeSRl regular, comenzando 24 h después de la nucleofección. Típicamente, las solicitantes observan más del 70% de eficiencia de transfección con Amaxa Nucleofection. Cosechar ADN. 48-72 h después de la transfección, disociar las células utilizando accutase e inactivar añadiendo 5 x volumen de mTeSRI. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Las células sedimentadas pueden procesarse directamente para la extracción de ADN con la solución QuickExtract. Se recomienda no disociar mecánicamente las células sin accutase. Se recomienda no centrifugar sin desactivar accutase o por encima de la velocidad recomendada; hacerlo puede provocar que las células se lisen
Aislamiento de líneas celulares clónales por FACS. Tiempo • 2-3 h práctica; 2-3 semanas de expansión
El aislamiento clonal puede realizarse 24 h después de la transfección por FACS o por dilución en serie.
54| Preparar tampón FACS. Las células que no necesitan clasificación utilizando fluorescencia coloreada pueden clasificarse en medio D10 regular complementado con penicilina/estreptinomicina 1X. Si también se requiere una clasificación de fluorescencia coloreada, un DMEM o DPBS sin fenol se sustituye por DMEM normal. Complementar con penicilina/estreptinomicina 1X y filtrar a través de un filtro Steriflip de.22 um.
55| Preparar placas de 96 pocilios. Las solicitantes añadieron 100 ul de medio D10 complementado con penicilina/estreptinomicina 1X por pocillo y prepararon el número de placas según sea necesario para el número deseado de clones.
56| Preparar células para FACS. Las solicitantes disociaron las células aspirando el medio por completo y añadiendo 100 ul de TrypLE por pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar durante 5 min y añadir 400 ul de medio D10 caliente.
57| Las células resuspendidas se transfieren a un tubo Falcon de 15 ml y se trituran suavemente 20 veces. Se recomienda verificar bajo el microscopio para garantizar la disociación de las células individuales.
58| Centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos.
59| Las solicitantes aspiraron los medios y resuspenden las células en 200 ul de medios FACS.
60| Las células se filtran a través de un filtro de malla de 35 um en tubos FACS etiquetados. Las solicitantes recomiendan utilizar el tubo BD Falcon de 12 x 75 mm con tapa del filtro de células. Colocar las células en hielo hasta su clasificación.
611 Las solicitantes clasificaron células individuales en placas de 96 pocillos preparadas a partir del paso 55. Las solicitantes recomiendan que en un solo pocillo designado en cada una de las placas se clasifiquen 100 células como control positivo.
NOTA. El resto de las células pueden conservarse y utilizarse para genotipar a nivel de la población para medir la eficiencia general de la modificación.
62| Las solicitantes devolvieron las células a la incubadora y les permitieron expandirse durante 2-3 semanas. Se añaden 100 ul de medio D10 caliente 5 d después de la clasificación. Cambiar 100 ul de medio cada 3-5 d según sea necesario.
63| Las colonias se inspeccionan en cuanto a la apariencia "clonal" 1 semana después de la clasificación: colonias redondeadas que irradian desde un punto central. Marcar los pocillos que estén vacíos o que hayan sido sembrados con dobletes o multipletes.
64| Cuando las células tienen más del 60% de confluencia, las solicitantes prepararon un conjunto de placas de réplica para el paso. Se añaden 100 ul de medio D10 a cada uno de los pocillos en las placas de réplica. Las solicitantes disociaron las células directamente pipeteando vigorosamente 20 veces hacia arriba y hacia abajo. El 20% del volumen resuspendido se colocó en placas preparadas para mantener las líneas clonales. Cambiar el medio cada 2­ 3 d a partir de entonces y pasar en consecuencia.
65| Utilizar el 80% restante de las células para el aislamiento y genotipado del ADN.
Opcional: Aislamiento de líneas celulares clonales por dilución. Tiempo • 2-3 h práctica; 2-3 semanas de expansión
66| Las solicitantes disociaron células de placas de 24 pocillos como se describió arriba. Asegurarse de disociar a las células individuales. Se puede utilizar un filtro de células para evitar la acumulación de células.
67| El número de células se cuentan en cada condición. Diluir en serie cada una de las condiciones en medio D10 hasta una concentración final de 0,5 células por 100 ul. Para cada una de las placas de 96 pocillos, las solicitantes recomiendan diluir hasta un recuento final de 60 células en 12 ml de D10. Se recomienda un recuento exacto del número de células para una dilución clonal adecuada. Las células se pueden volver a contar en una etapa de dilución en serie intermedia para garantizar la precisión.
68 | Se utilizó una pipeta multicanal para pipetear 100 ul de células diluidas a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos.
NOTA. El resto de las células pueden conservarse y utilizarse para genotipar a nivel de la población para medir la eficiencia general de la modificación.
69| Las solicitantes inspeccionan colonias en cuanto a la apariencia "clonal" ~ 1 semana después de la siembra en placas, colonias redondeadas que irradian desde un punto central. Marcar los pocillos que puedan haber sido sembrados con dobletes o multipletes.
70| Las solicitantes devolvieron células a la incubadora y las permitieron expandirse durante 2-3 semanas. Re­ alimentar las células según sea necesario como se detalla en la sección anterior.
Ensayo SURVEYOR para la eficiencia de escisión CRISPR. Tiempo - 5-6 h
Antes de analizar la eficiencia de escisión de las células transfectadas, las solicitantes recomiendan testar cada nuevo cebador SURVEYOR en muestras de control negativas (no transfectadas) a través del paso de digestión con nucleasa SURVEYOR utilizando el protocolo descrito a continuación. Ocasionalmente, incluso los productos de PCR SURVEYOR limpios de una sola banda pueden proporcionar bandas de escisión de nucleasa SURVEYOR inespecíficas y pueden interferir potencialmente con el análisis preciso de indeles.
711 Recolectar células para ADN. Disociar las células y centrifugar a 200 x g durante 5 min. NOTA. Replicar la placa en esta fase según sea necesario para mantener las líneas celulares transfectadas.
72 | Aspirar el sobrenadante por completo.
73| Las solicitantes utilizaron la solución de extracción de ADN QuickExtract de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las solicitantes utilizaron típicamente 50 ul de la solución para cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos y 10 ul para una placa de 96 pocillos.
74| Las solicitantes normalizaron el ADN extraído a una concentración final de 100-200 ng/ul con ddH2O. Punto de pausa: El ADN extraído puede almacenarse a -20°C durante varios meses.
75| Configurar la SURVEYOR PCR. Mezcla maestra de lo siguiente utilizando los cebadores SURVEYOR proporcionados por la herramienta de algoritmo en línea/computacional de las solicitantes:
Figure imgf000124_0001
76| Las solicitantes añadieron 100-200 ng de molde de ADN genómico normalizado del paso 74 para cada una de las reacciones.
77| La reacción PCR se realizó utilizando las siguientes condiciones de ciclación, durante no más de 30 ciclos de amplificación:
Figure imgf000124_0002
Figure imgf000125_0001
78| Las solicitantes procesaron 2-5 ul de producto de PCR en un gel al 1% para verificar el producto de banda única. Aunque estas condiciones de PCR están diseñadas para funcionar con la mayoría de los pares de cebadores SURVEYOR, algunos cebadores pueden necesitar una optimización adicional ajustando la concentración del molde, la concentración de MgCl2 y/o la temperatura de recocido.
79| Las solicitantes purificaron las reacciones PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick y eluyente normalizado a 20 ng/ul. Punto de pausa: El producto de PCR purificado puede almacenarse a -20°C.
80| Formación de heteroduplex de ADN. La reacción de reasociación se configuró como sigue:
Figure imgf000125_0002
811 Reasociar la reacción utilizando las siguientes condiciones:
Figure imgf000125_0003
82| Digestión de nucleasa S por SURVEYOR. Las solicitantes prepararon una mezcla maestra y añadieron los siguientes componentes en hielo a heterodúplex reasociados del paso 81 para un volumen final total de 25 ul:
Figure imgf000125_0004
83| Vortizar bien y centrifugar. Incubar la reacción a 42°C durante 1 h.
84| Opcional: Se pueden añadir 2 ul de la Solución de Parada del kit SURVEYOR. Punto de pausa. El producto digerido puede almacenarse a -20°C para su posterior análisis.
85| Visualizar la reacción SURVEYOR. Los productos de digestión de nucleasa de SURVEYOR pueden visualizarse en un gel de agarosa al 2%. Para una mejor resolución, los productos pueden procesarse en un gel TBE de poliacrilamida con gradiente de 4-20%. Las solicitantes cargaron 10 ul de producto con el tampón de carga recomendado y procesaron el gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Típicamente, las solicitantes procesan hasta que el colorante azul de bromofenol haya migrado al fondo del gel. Incluye escalera de ADN y controles negativos en el mismo gel.
86 | Las solicitantes tiñeron el gel con colorante 1X SYBR Gold Dye diluido en TBE. El gel se sacudió suavemente durante 15 min.
87| Las solicitantes tomaron imágenes del gel utilizando un sistema de formación de imágenes cuantitativo sin sobre­ exponer las bandas. Los controles negativos deben tener solo una banda correspondiente al tamaño del producto de PCR, pero ocasionalmente pueden tener bandas de escisión no específicas de otros tamaños. Estos no interferirán con el análisis si son diferentes en tamaño de las bandas de escisión diana. La suma de los tamaños de las bandas de escisión diana, proporcionada por la herramienta de algoritmo informático/en línea de las solicitantes, debe ser igual al tamaño del producto de PCR.
88 | Estimar la intensidad de la escisión. Las solicitantes cuantificaron la intensidad integrada de cada una de las bandas utilizando ImageJ u otro software de cuantificación en gel.
89| Para cada una de las pistas, las solicitantes calcularon la fracción del producto de PCR escindido (fcut) utilizando la siguiente fórmula: fcut = (b + c) / (a + b + c), donde a es la intensidad integrada del producto de PCR no digerido y b y c son las intensidades integradas de cada uno de los productos de escisión. 90| La eficiencia de escisión puede estimarse utilizando la siguiente fórmula, basada en la distribución de probabilidad binomial de la formación de dúplex:
Secuenciación de Sanger para evaluar la eficiencia de la escisión CRISPR. Tiempo - 3 d
Los pasos iniciales son idénticos a los pasos 71-79 del ensayo SURVEYOR. Nota: Los cebadores SURVEYOR pueden utilizarse para la secuenciación de Sanger si se añaden sitios de restricción apropiados a los cebadores Directo e Inverso. Para la clonación en la cadena principal recomendada de pUC19, EcoRI puede utilizarse para el cebador Dir. y HindIII para el cebador Inv.
92| Digestión del amplicón. Configurar la reacción de digestión de la siguiente manera:
Figure imgf000126_0001
93| Digestión de la cadena principal de pUC19. Configurar la reacción de digestión de la siguiente manera:
Figure imgf000126_0002
Figure imgf000127_0001
94| Las solicitantes purificaron las reacciones de digestión utilizando el kit de purificación por PCR QIAQuick. Punto de pausa: El producto de PCR purificado puede almacenarse a -20°C.
95| Las solicitantes ligaron la cadena principal de pUC19 digerida y los amplicones de Sanger en una relación vector:inserto 1:3 de la siguiente manera:
Figure imgf000127_0002
96| Transformación. Las solicitantes transformaron el plásmido tratado con PlasmidSafe en una cepa de E. coli competente, de acuerdo con el protocolo suministrado con las células. Las solicitantes recomiendan Stbl3 para una transformación rápida. Brevemente, se añaden 5 ul del producto del paso 95 en 20 ul de células Stbl3 químicamente competentes enfriadas con hielo, se incuban en hielo durante 10 min, se calientan a 42°C durante 30 s, se devuelven inmediatamente a hielo durante 2 min, se añaden 100 ul de medio SOC y se siembra en una placa LB que contiene 100 ug/ml de ampicilina. Esto se incuba durante la noche a 37°C.
97| Día 2: Las solicitantes inspeccionaron las placas en busca de crecimiento de colonias. Típicamente, no hay colonias en las placas de control negativo (ligamiento de pUC19 digerido con EcoRI-HindIII solamente, sin inserto de amplicón de Sanger), y decenas a cientos de colonias en las placas de clonación de amplicón de Sanger pUC19.
98| Día 3: Las solicitantes aislaron ADN plasmídico de los cultivos nocturnos utilizando un kit de minipreparación QiAprep Spin de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
99| Secuenciación de Sanger. Las solicitantes verificaron la secuencia de cada una de las colonias mediante la secuenciación de la cadena principal de pUC19 utilizando el cebador pUC19-Dir. Las solicitantes hicieron referencia a los resultados de secuenciación contra la secuencia de ADN genómico esperada para verificar la presencia de mutaciones de NHEJ inducidas por Cas9. % de eficiencia de edición = (n° clones modificados) / (n° clones totales). Es importante elegir un número razonable de clones (> 24) para generar eficiencias de modificación precisas.
Genotipado para microdeleción. Tiempo • 2-3 d práctica; 2-3 semanas de expansión
100| Las células se transfectaron tal como se describe arriba con un par de ARNgs que fijan como objetivo la región que se ha de eliminar.
101124 h después de la transfección, las líneas clonales se aíslan mediante FACS o dilución en serie tal como se describe arriba.
102| Las células se expanden durante 2-3 semanas.
103| Las solicitantes recolectaron ADN de las líneas clonales tal como se describe arriba utilizando 10 ul de solución QuickExtract y ADN genómico normalizado con ddH2O a una concentración final de 50-100 ng/ul.
104| Amplificar por PCR la región modificada. La reacción PCR se configura como sigue:
Figure imgf000127_0003
Figure imgf000128_0001
Nota: si el tamaño de la deleción es superior a 1 kb, configurar un conjunto paralelo de reacciones PCR con los cebadores Dentro-Dir. y Dentro-Inv, para detectar la presencia del alelo wt.
105| Para rastrear inversiones, se configura una reacción PCR de la siguiente manera:
Figure imgf000128_0002
Nota: los cebadores se emparejan como Fuera-Dir. Dentro Dir, o Fuera Inv Dentro-Inv.
106| Las solicitantes añadieron 100-200 ng de molde de ADN genómico normalizado del paso 103 para cada una de las reacciones.
107| La reacción de PCR se realizó utilizando las siguientes condiciones de ciclación:
Figure imgf000128_0003
108| Las solicitantes procesaron 2-5 ul de producto de PCR en un gel al 1 -2% para verificar el producto. Aunque estas condiciones de PCR están diseñadas para funcionar con la mayoría de los cebadores, algunos cebadores pueden necesitar una optimización adicional ajustando la concentración del molde, la concentración de MgCl2 y/o la temperatura de reasociación.
Genotipado para modificaciones fijadas como objetivo a través de HDR. Tiempo • 2-3 d, 2-3 h de práctica 109| Las solicitantes recolectaron ADN tal como se describe arriba utilizando solución QuickExtract y ADN genómico normalizado con TE a una concentración final de 100-200 ng/ul.
110| Amplificar por PCR la región modificada. La reacción PCR se configura como sigue:
Figure imgf000128_0004
Figure imgf000129_0001
111| Las solicitantes añadieron 100-200 ng de molde de ADN genómico del paso 109 para cada una de las reacciones y procesaron el siguiente programa.
Figure imgf000129_0002
112| Las solicitantes procesaron 5 ul de producto de PCR en un gel al 0,8 -1% para verificar el producto de banda única. Los cebadores pueden necesitar una optimización adicional mediante el ajuste de la concentración del molde, concentración de MgCl2 y/o la temperatura de reasociación.
113| Las solicitantes purificaron las reacciones PCR utilizando el kit de purificación por PCR QIAQuick.
114| En el ejemplo de HDR, se inserta un sitio de restricción HindIII en el gen EMX1. Estos se detectan mediante una digestión de restricción del amplicón de PCR:
Figure imgf000129_0003
i. El ADN se digiere durante 10 min a 37°C;
ii. Las solicitantes procesaron 10 ul del producto digerido con colorante de carga en un gel TBE de poliacrilamida con un gradiente de 4-20% hasta que la banda de xileno cianol había migrado al fondo del gel.
iii. Las solicitantes tiñeron el gel con colorante 1X SYBR Gold al tiempo que sacudían durante 15 min.
iv. Los productos de escisión se representan en imágenes y se cuantifican tal como se describe anteriormente en la sección de ensayo SURVEYOR. La eficiencia de HDR se estima mediante la fórmula: (b c)/(a b c), en que a es la intensidad integrada para el producto de PCR HDR no digerido, y b y c son las intensidades integradas para los fragmentos cortados con HindIII.
115| Alternativamente, los amplicones de PCR purificados del paso 113 pueden clonarse y genotiparse utilizando la secuenciación Sanger o NGS.
Secuenciación profunda y análisis fuera de diana • Tiempo 1 - 2 d
La herramienta de diseño de dianas CRISPR en línea genera sitios genómicos candidatos fuera de diana para cada uno de los sitios diana identificados. El análisis fuera de diana en estos sitios se puede realizar mediante el ensayo de nucleasa SURVEYOR, la secuenciación de Sanger o la secuenciación profunda de próxima generación. Dada la probabilidad de tasas de modificación bajas o indetectables en muchos de estos sitios, las solicitantes recomiendan una secuenciación profunda con la plataforma Illumina Miseq para una alta sensibilidad y precisión. Los protocolos variarán con la plataforma de secuenciación; aquí, las solicitantes describen brevemente un método de PCR de fusión para conectar adaptadores de secuenciación.
116| Diseño de cebadores de secuenciación profunda. Los cebadores de secuenciación de próxima generación (NGS) se diseñan para amplicones más cortos, típicamente en el intervalo de tamaño de 100-200 pb. Los cebadores pueden diseñarse manualmente utilizando NCBI Primer-Blast o generarse con herramientas de diseño de dianas CRISPR en línea (sitio web en genome-engineering.org/tools).
117| Recolectar ADN genómico de células fijadas como objetivo por Cas9. Normalizar el ADN genómico QuickExtract a 100-200 ng/ul con ddH2O.
118| PCR de preparación de colección inicial. Utilizando los cebadores NGS del paso 116, preparar la PCR de preparación inicial de la colección
Figure imgf000130_0001
119| Añadir 100-200 ng de molde de ADN genómico normalizado para cada una de las reacciones.
120| Realizar la reacción PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclación, durante no más de 20 ciclos de amplificación:
Figure imgf000130_0002
1211 Procesar 2-5 ul de producto de PCR en un gel al 1 % para verificar el producto de banda única. Al igual que todas las PCR de ADN genómico, los cebadores de NGS pueden necesitar una optimización adicional mediante el ajuste de la concentración del molde, concentración de MgCl2 y/o la temperatura de reasociación.
122| Purificar las reacciones PCR utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick y eluyente normalizado a 20 ng/ul.
Punto de pausa: El producto de PCR purificado puede almacenarse a -20°C.
123| Kit de Preparación de Muestras de ADN Nextera XT. Siguiendo el protocolo del fabricante, generar colecciones listas para secuenciar Miseq con códigos de barras únicos para cada una de las muestras.
124| Analizar los datos de la secuenciación. El análisis fuera de diana se puede realizar a través de programas de alineamiento de lectura, tales como ClustalW, Geneious o secuencias de comandos de análisis de secuencia simple.
Tiempo
Pasos 1 - 2 Diseño y síntesis de oligos ARNgs y ODNss: 1 -5 d, variable dependiendo del proveedor
Pasos 3 - 5 Construcción del plásmido CRISPR o casete de expresión de PCR: 2 h a 3 d
Pasos 6 - 53 Transfección en líneas celulares: 3 d (1 h de tiempo de práctica)
Pasos 54 - 70 Derivación opcional de líneas clonales: 1 -3 semanas, variable dependiendo del tipo de célula Pasos 71 - 91 Validación funcional de NHEJ a través de SURVEYOR: 5-6 h
Pasos 92-124 Genotipado a través de Sanger o secuenciación profunda de la próxima generación: 2-3 d (3-4 h de tiempo de práctica)
Abordar Situaciones Relacionadas con Ejemplos en esta Memoria
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Discusión
CRISPR-Cas puede multiplexarse fácilmente para facilitar la modificación simultánea de varios genes y mediar en microdeleciones cromosómicas a altas eficiencias. Las solicitantes utilizaron dos ARNgs para demostrar la fijación como objetivo simultánea de los loci humanos GRIN2B y DYRK1A a eficiencias de hasta 68% en células HEK293FT. Del mismo modo, se puede utilizar un par de ARNgs para mediar en microdeleciones, tales como la escisión de un exón, que se puede genotipar por PCR a nivel clonal. Téngase en cuenta que la ubicación precisa de las uniones de exón puede variar. Las solicitantes también demostraron el uso de ODNss y el vector de fijación de objetivo para mediar en HDR con mutantes tanto de tipo salvaje como de nickasa de Cas9 en células HEK 293FT y HUES9 (Figura 12). Téngase en cuenta que las solicitantes no han sido capaces de detectar HDR en las células HUES9 utilizando la nickasa Cas9, lo que puede deberse a una baja eficiencia o una diferencia potencial en las actividades de reparación en las células HUES9. Aunque estos valores son típicos, existe cierta variabilidad en la eficacia de escisión de un ARNgs dado, y en raras ocasiones determinados ARNgs pueden no funcionar por razones aún desconocidas. Las solicitantes recomiendan diseñar dos ARNgs para cada uno de los locus, y testar sus eficiencias en el tipo de célula deseado.
Ejem plo 26 : NLS
Modulador Transcripcional de Cas9: Las solicitantes se propusieron convertir el sistema Cas9/ARNg CRISPR en un sistema de unión de ADN generalizado en el que se pueden ejecutar funciones más allá de la escisión del ADN. Por ejemplo, al fusionar dominios funcionales en una Cas9 catalíticamente inactiva, las solicitantes han impartido nuevas funciones, tales como activación/represión transcripcional, metilación/desmetilación o modificaciones de cromatina. Para lograr este objetivo, las solicitantes hicieron un mutante Cas9 catalíticamente inactivo cambiando dos residuos esenciales para la actividad nucleasa, D10 y H840, a alanina. Al mutar estos dos residuos, la actividad nucleasa de Cas9 se elimina, al tiempo que se mantiene la capacidad de unirse al ADN diana. Los dominios funcionales en los que las solicitantes decidieron enfocarse para probar la hipótesis de las solicitantes son el activador transcripcional VP64 y los represores transcripcionales SID y KRAB.
Localización nuclear de Cas9: Las solicitantes plantearon la hipótesis de que el modulador transcripcional de Cas9 más eficaz estaría fuertemente localizado en el núcleo en donde tendría su mayor influencia sobre la transcripción. Además, cualquier Cas9 residual en el citoplasma podría tener efectos no deseados. Las solicitantes determinaron que Cas9 de tipo salvaje no se localiza en el núcleo sin incluir múltiples señales de localización nuclear (NLS) (aunque un sistema CRISPR no necesita tener una o más NLS, pero ventajosamente tiene al menos una o más NLS). Debido a que se requerían múltiples secuencias NLS, se razonó que es difícil introducir Cas9 en el núcleo y que cualquier dominio adicional que esté fusionado con Cas9 podría interrumpir la localización nuclear. Por lo tanto, las solicitantes realizaron cuatro construcciones de fusión Cas9-VP64-GFP con diferentes secuencias NLS (pXRP02- pLenti2-EF1a-NLS-hSpCsn1 (10A,840A)-NLS-VP64-EGFP, pXRP04-pLenti2-EF1 a-NLS-hSpCsn1 (10A,840A)-NLS-VP64-2A-EGFP-NLS, pXRP06- pLenti2-EFla-NLS-EGFP-VP64-NLS-hSpCsn1 (10A,840A)-NLS, pXRP08- pLenti2-EF1 a-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP-NLS). Estas construcciones se clonaron en una cadena principal lenti bajo la expresión del promotor EF1a humano. El elemento WPRE también se añadió para una expresión proteica más robusta. Cada una de las construcciones se transfectó en células HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000 y se representó en imágenes 24 horas después de la transfección. La mejor localización nuclear se obtiene cuando las proteínas de fusión tienen secuencias NLS en el extremo N y C de la proteína de fusión. La localización nuclear más alta observada se produjo en la construcción con cuatro elementos NLS.
Para comprender de manera más robusta la influencia de los elementos NLS sobre Cas9, las solicitantes realizaron 16 fusiones Cas9-GFP añadiendo la misma secuencia alfa importina NLS en el extremo N o C mirando a cero a tres repeticiones en tándem. Cada una de las construcciones se transfectó en células HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000 y se representó en imágenes 24 horas después de la transfección. En particular, el número de elementos NLS no se correlaciona directamente con el grado de la localización nuclear. Añadir una NLS en el extremo C tiene una mayor influencia sobre la localización nuclear que el añadir en el extremo N.
Activador Transcripcional de Cas9: Las solicitantes testaron funcionalmente la proteína Cas9-VP64 al fijar como objetivo el locus Sox2 y cuantificar la activación transcripcional por RT-qPCR. Se eligieron ocho sitios diana de ADN para abarcar el promotor de Sox2. Cada una de las construcciones se transfectó en células HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000 y 72 horas después de la transfección el ARN total se extrajo de las células. 1 ug de ARN se transcribió inversamente en ADNc (qScript Supermix) en una reacción de 40 ul. Se añadieron 2 ul de producto de reacción en una única reacción de qPCR de ensayo TaqMan de 20 ul. Cada uno de los experimentos se realizó por triplicado biológico y técnico. Ningún control de RT ni reacciones de control del molde mostraron amplificación. Las construcciones que no muestran una fuerte localización nuclear, pXRP02 y pXRP04, no producen activación. Para la construcción que mostró una fuerte localización nuclear, pXRP08, se observó una activación moderada. Se observó una activación estadísticamente significativa en el caso de los ARN guía Sox2.4 y Sox2.5.
E jem plo 27 : Datos de Raton In Vivo
Material y reactivos
Polimerasa de fusión Herculasa II (Agilent Technologies, n° cat. 600679)
Tampón 10x NE 4 (NEB, n° cat. B7004S)
Bsal HF (NEB, n2 cat. R3535S)
ADN ligasa de T7 (Enzymatics, n° cat. L602L)
Tampón Fast Digest, 10X (ThermoScientific, n° cat. B64)
FastDigest Notl (ThermoScientific, n° cat. FD0594)
Fosfatasa Alcalina FastAP (ThermoScientific, n° cat. EF0651)
Lipofectamine 2000 (Life Technologies, n° cat. 11668-019)
Tripsina (Life Technologies, n° cat. 15400054)
Fórceps n° 4 (Sigma, n° cat. Z168777-1EA)
Fórceps n° 5 (Sigma, n° cat. F6521 -1 EA)
Solución Salina Equilibrada de Hank 10x (Sigma, n° cat. H4641-500ML)
Solución de Penicilina/¡Estreptomicina (Life Technologies, n° cat. P4333)
Neurobasal (Life Technologies, n° cat. 21103049)
Complemento B27 (Life Technologies, n° cat. 17504044)
L-glutamina (Life Technologies, n° cat. 25030081)
Glutamato (Sigma, n° cat. RES5063G-A7)
p-mercaptoetanol (Sigma, n° cat. M6250-100ML)
Anticuerpo de conejo HA (Cell Signaling, n° cat. 3724S)
Kit de Formación de Imágenes de Células LIVE/DEAD® (Life Technologies, n° cat. R37601)
Jeringa World Precision Instrument de 30G (World Precision Instruments, n° cat. NANOFIL) Aparato estereotáxico (Kopf Instruments)
UltraMicroPump3 (World Precision Instruments, n° cat. UMP3-4)
Sacarosa (Sigma, n° cat. S7903)
Cloruro de calcio (Sigma, n° cat. C1016)
Acetato de magnesio (Sigma, n° cat. M0631)
Tris-HCl (Sigma, n° cat. T5941)
EDTA (Sigma, n° cat. E6758)
NP-40 (Sigma, n° cat. NP40)
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (Sigma, n° cat. 78830)
Cloruro de magnesio (Sigma, n° cat. M8266)
Cloruro de potasio (Sigma, n° cat. P9333)
p-glicerofosfato (Sigma, n° cat. G9422)
Glicerol (Sigma, n° cat. G9012)
Tinción Ruby Vybrant® DyeCycle™ (Life technologies, n° cat. S4942)
Clasificador de células FACS Aria Flu-act (Koch Institute of MIT, Cambridge EE.UU.)
Kit de Sangre y Tejido DNeasy (Qiagen, n° cat. 69504)
Procedimiento
Construcción de m ultip lexes de A R N g para u tilizar in vivo en e l cerebro
Las solicitantes diseñaron y amplificaron por PCR ARNg individuales que fijan como objetivo miembros de la familia TET y DNMT de ratón (tal como se describe en esta memoria). La eficacia de la fijación de objetivo se evaluó en la línea celular N2a (Figura 15). Para obtener la modificación simultánea de varios genes in vivo, se multiplexó un ARNg eficiente en un vector de empaquetamiento de AAV (Figura 16). Para facilitar el análisis adicional de la eficiencia del sistema, las solicitantes se añadieron al casete de expresión del sistema consistente con la proteína de fusión del dominio GFP-KASH bajo el control del promotor de Sinapsina I humana (Figura 16). Esta modificación permite un análisis adicional de la eficiencia del sistema en la población neuronal (procedimiento más detallado en la sección Clasificación de núcleos y resultados in vivo ).
Las 4 partes del sistema se amplificaron por PCR utilizando la polimerasa de fusión Herculase II utilizando los siguientes cebadores:
1er U6 dir.:
gagggtctcgtccttgcggccgcgctagcgagggcctatttcccatgattc 1er ARNg Inv:
ctcggtctcggtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagc
cttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTTC
GTCCTTTCCAC
2° U6 dir.:
gagggtctcTTTaccggtgagggcctatttcccatgattcc 2° ARNg Inv:
ctcggtctcctcAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggacta
ge cttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTTC
GTCCTTTCCAC
3er U6 dir.:
gagggtctcTTTgagctcgagggcctatttcccatgattc 3er ARNg Inv:
ctcggtctcgcgtAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggact
ag ccttattttaacttgctaTTTCtagctctaaaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTTT
CGTCCTTTCCA
hSyn_GFP-kash Dir.: gagggtctcTTacgcgtgtgtctagac
hSyn_GFP-kash Inv: ctcggtctcAaggaCAGGGAAGGGAGCAGTGGTTCACGCCTGTAATCCCAGCAATTTGG GA GGCCAAGGTGGGTAGATCACCTGAGATTAGGAGTTGC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN es una secuencia genómica de cumplimiento inversa)
Las solicitantes utilizaron la estrategia Golden Gate para ensamblar todas las partes (relación molecular 1:1) del sistema en una reacción de una sola etapa:
Figure imgf000134_0001
El producto de reacción Golden Gate se amplificó por PCR utilizando la polimerasa de fusión Herculase II y los siguientes cebadores:
Figure imgf000135_0001
El producto de PCR se clonó en la cadena principal de AAV, entre secuencias ITR utilizando sitios de restricción NotI:
Digestión del producto por PCR:
Figure imgf000135_0002
Digestión de la cadena principal de AAV
Figure imgf000135_0003
Después de 20 min de incubación a 37°C, las muestras se purificaron utilizando el kit de purificación por PCR QIAQuick. Las muestras estandarizadas se ligaron a una relación vector: inserto 1: 3 como sigue:
Figure imgf000135_0004
Después de la transformación de bacterias con el producto de reacción de ligamiento, las solicitantes confirmaron los clones obtenidos con la secuenciación de Sanger.
Los clones de ADN positivos se testaron en células N2a después de la co-transfección con la construcción Cas9 (Figuras 17 y 18).
D iseño de nuevas construcciones Cas9 p ara e l sum inistro de AA V
El sistema de suministro de AAV, a pesar de sus características únicas, tiene limitaciones de empaquetamiento - para suministrar con éxito un casete de expresión in vivo, debe tener un tamaño < 4,7 kb. Para disminuir el tamaño del casete de expresión de SpCas9 y facilitar el suministro, las solicitantes testaron varias alteraciones: diferentes promotores, señal de poliA más corta y finalmente una versión más pequeña de Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9) (Figuras 19 y 20). Todos los promotores testados se testaron previamente y se publicó que eran activos en neuronas, incluido Mecp2 de ratón (Gray et al., 2011), M aplb de rata M aplb de rata truncado (Liu y Fischer, 1996). La secuencia de poliA sintética alternativa también se demostró previamente que era funcional (Levitt et al., 1989; Gray et al., 2011). Todas las construcciones clonadas se expresaron en células N2a después de la transfección con Lipofectamine 2000, y se testaron con el método de transferencia Western (Figura 21).
Prueba d e l sistem a m ultip lex AA V en neuronas p rim arias
Para confirmar la funcionalidad del sistema desarrollado en las neuronas, las solicitantes utilizan cultivos neuronales primarios in vitro. Las neuronas corticales de ratón se prepararon de acuerdo con el protocolo publicado previamente por Banker y Goslin (Banker y Goslin, 1988).
Las células neuronales se obtienen del día embrionario 16. Los embriones se extraen de la hembra embarazada sacrificada y se decapitan, y las cabezas se colocan en HBSS helado. Luego se extraen los cerebros de los cráneos con unas pinzas (n° 4 y n° 5) y se transfieren a otro cambio de HBSS helado. Se realizan pasos adicionales con la ayuda de un microscopio estereoscópico en una placa de Petri llena de HBSS helado y pinzas n° 5. Los hemisferios se separan entre sí y del tronco encefálico y se eliminan las meninges. Luego, los hipocampos se disecan con mucho cuidado y se colocan en un tubo cónico de 15 ml lleno de HBSS helado. Las cortices que quedan después de la disección del hipocampo pueden utilizarse para un aislamiento adicional de células mediante un protocolo análogo después de eliminar los residuos de vapor cerebral y los bulbos olfatorios. Los hipocampos aislados se lavan tres veces con 10 ml de HBSS helado y se disocian mediante incubación durante 15 min con tripsina en HBSS (4 ml de HBSS con la adición de 10 ql de tripsina al 2,5% por hipocampo) a 37°C. Después de la tripsinización, los hipocampos se lavan cuidadosamente tres veces para separar cualquier rastro de tripsina con HBSS precalentado a 37°C y disociado en HBSS tibio. Las solicitantes generalmente disocian células obtenidas de 10-12 embriones en 1 ml de HBSS utilizando puntas de pipeta de 1 ml y células disociadas diluidas de hasta 4 ml. Las células se siembran en placas a una densidad de 250 células/mm2 y se cultivan a 37°C y 5% de CO2 durante hasta 3 semanas.
HBSS
435 ml de H2O
50 ml de Solución Salina Equilibrada de Hank 10x
16,5 ml de HEPES 0,3 M pH 7,3
5 ml de solución de penicilina-estreptomicina
Filtrar (0,2 qm) y almacenar 4°C
Medio de recubrimiento neuronal (100 ml)
97 ml de Neurobasal
2 ml de Complemento B27
1 ml de solución de penicilina-estreptomicina
250 ql de glutamina
125 ql de glutamato
Las neuronas se transducen con virus concentrado AAV1/2 o virus AAV1 a partir de medio filtrado de células HEK293FT, entre 4-7 días en cultivo y se mantienen durante al menos una semana en cultivo después de la transducción para permitir la expresión de genes suministrados.
Expresión d e l s istem a im pulsada p o r AA V
Las solicitantes confirmaron la expresión de SpCas9 y SaCas9 en cultivos neuronales después de la administración de AAV utilizando el método de transferencia Western (Figura 24). Una semana después de la transducción, las neuronas se recogieron en tampón de carga NuPage SDS con p-mercaptoetanol para desnaturalizar proteínas a 95°C durante 5 min. Las muestras se separaron en gel SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF para la detección de proteínas WB. Las proteínas Cas9 se detectaron con el anticuerpo HA.
La expresión de Syn-GFP-kash de ARNg multiplex AAV se confirmó con microscopía fluorescente (Figura 32).
Toxicidad
Para evaluar la toxicidad del AAV con el sistema CRISPR, las solicitantes testaron la morfología general de las neuronas una semana después de la transducción del virus (Figura 27). Además, las solicitantes testaron la toxicidad potencial del sistema diseñado con el kit de Formación de Imágenes de Células LIVE/DEAD®, que permite distinguir células vivas y muertas en cultivo. Se basa en la presencia de actividad de esterasa intracelular (según lo determinado por la conversión enzimática de la calceína no fluorescente AM a la calceína fluorescente intensamente verde). Por otro lado, el componente rojo del kit que no deja pasar las células ingresa a las células con membranas dañadas y se une al ADN que genera fluorescencia en las células muertas. Ambos fluoróforos se pueden visualizar fácilmente en células vivas con microscopía fluorescente. La expresión impulsada por AAV de proteínas Cas9 y construcciones de ARNg multiplex en las neuronas corticales primarias fue bien tolerada y no tóxica (Figuras 25 y 26), lo que indica que el sistema de AAV diseñado es adecuado para pruebas in vivo.
Producción d e l virus
El virus concentrado se produjo de acuerdo con los métodos descritos en McClure et al., 2011. La producción de virus sobrenadante se produjo en células HEK293FT.
C irugías d e l cerebro
Para las inyecciones de vectores virales, se anestesiaron ratones C57BL/6N machos de 10-15 semanas de edad con un cóctel de ketamina/xilazina (dosis de ketamina de 100 mg/kg y dosis de xilazina de 10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. La administración intraperitoneal de Buprenex se utilizó como analgésico preventivo (1 mg/kg). Los animales se inmovilizaron en un aparato estereotáxico de Kopf utilizando pernos de posicionamiento intra-aural y barra de dientes para mantener un cráneo inmóvil. Utilizando un taladro manual, se hizo un agujero (1-2 mm) a -3,0 mm posterior a Bregma y 3,5 mm lateral para inyección en la región CA1 del hipocampo. Usando una jeringa World Precision Instrument de 30G a una profundidad de 2,5 mm, se inyectó la solución de partículas virales de AAV en un volumen total de 1 ul. La inyección fue controlada por una bomba de inyección 'World Precision Instruments UltraMicroPump3' a un caudal de 0,5 ul/min para prevenir el daño del tejido. Cuando se completó la inyección, la aguja de inyección se retiró lentamente, a una velocidad de 0,5 mm/min. Después de la inyección, la piel se selló con suturas Ethilon 6-0. Los animales se hidrataron después de la operación con 1 ml de Ringer lactato (vía subcutánea) y se alojaron en un entorno de temperatura controlada (37°C) hasta lograr una recuperación ambulatoria. 3 semanas después de la cirugía, los animales fueron sacrificados mediante anestesia profunda seguida de extracción de tejido para la clasificación de núcleos o con perfusión de paraformaldehído al 4% para inmunoquímica.
C lasificación de núcleos y resultados in vivo
Las solicitantes diseñaron un método para etiquetar genéticamente de forma específica los núcleos de células neuronales fijadas como objetivo a ARNg con GFP para la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) de los núcleos celulares marcados y se procesaron posteriormente el ADN, ARN y la proteínas nucleares. Para ese fin, el vector de fijación como objetivo multiplex de las solicitantes se diseñó para expresar tanto una proteína de fusión entre GFP y el dominio de proteína de membrana nuclear de ratón KASH (Starr DA, 2011, Current biology) como los 3 ARNg para fijar como objetivo loci de genes específicos de interés (Figura 16). GFP-KASH se expresó bajo el control del promotor de Sinapsina humano para marcar específicamente las neuronas. El aminoácido de la proteína de fusión GFP-KASH fue:
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT
TGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGN
YKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGMLGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIK
VNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMV
LLEFVTAAGITLGMDELYKSGLRSREEEEETDSRMPHLDSPGSSQPRRSFLSRVIRAAL
PLQLLLLLLLLLACLLPASEDDYSCTQANNFARSFYPMLRYTNGPPPT
Una semana después del suministro mediado por AAV1/2 al cerebro, se observó una expresión robusta de GFP-KASH. Para el FACS y el procesamiento posterior de los núcleos marcados, los hipocampos se diseccionaron 3 semanas después de la cirugía y se procesaron para la purificación de los núcleos celulares utilizando una etapa de centrifugación en gradiente. Para ese fin, el tejido se homogeneizó en sacarosa 320 mM, CaCl 5 mM, Mg(Ac)23 mM, Tris 10 mM pH 7,8, EDTA 0,1 mM, NP40 al 0,1%, fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMs F) 0,1 mM, p-mercaptoetanol 1 mM, utilizando 2 ml de homogeneizador Dounce (Sigma).El homogenizado se centrifugó en un gradiente Optiprep® del 25% al 29% de acuerdo con el protocolo del fabricante durante 30 min a 3.500 rpm a 4°C. El sedimento nuclear se resuspendió en Sacarosa 340 mM, MgCl22 mM, KCl 25 mM, glicerofosfato 65 mM, 5% de glicerol, PMSF 0,1 mM, p-mercaptoetanol 1 mM y Tinción Ruby Vybrant® DyeCycle™ (Life technologies) se añadió para marcar núcleos celulares (ofrece emisión de infrarrojo cercano para el ADN). Los núcleos marcados y purificados se clasificaron mediante FACS utilizando un clasificador de células Aria Flu-act-cell y el software BDFACS Diva. Los núcleos clasificados GFP y GFP- se utilizaron finalmente para purificar el ADN genómico utilizando el kit DNAeasy Blood & Tissue (Qiagen) para el análisis del ensayo Surveyor de las regiones genómicas fijadas como objetivo. El mismo enfoque se puede utilizar fácilmente para purificar ARN nuclear o proteína de las células fijadas como objetivo para el procesamiento posterior. Debido al sistema de 2 vectores (Figura 16), se esperaba que las solicitantes que utilizaban en este enfoque una escisión de ADN mediada por Cas9 eficiente solo se produjera en un pequeño subconjunto de células en el cerebro (células que estaban co-infectadas con el vector de direccionamiento múltiple y el vector de codificación Cas9). El método descrito aquí permite a las solicitantes purificar específicamente ADN, a Rn y proteínas nucleares de la población celular que expresa los 3 ARNg de interés y, por lo tanto, se supone que deben someterse a la escisión de ADN mediada por Cas9. Mediante el uso de este método, las solicitantes pudieron visualizar la escisión eficaz del ADN in vivo que se produce solo en un pequeño subconjunto de células.
Esencialmente, lo que las solicitantes han demostrado aquí es la escisión fijada como objetivo in vivo. Además, las solicitantes utilizaron un enfoque múltiple, con varias secuencias diferentes fijadas como objetivo al mismo tiempo, pero de forma independiente. El sistema presentado se puede aplicar para estudiar afecciones patológicas del cerebro (inactivación de genes, p. ej., enfermedad de Parkinson) y también abre un campo para un desarrollo adicional de herramientas de edición del genoma en el cerebro. Al reemplazar la actividad nucleasa con reguladores de transcripción génica o reguladores epigenéticos, será posible responder a todo el espectro de preguntas científicas sobre el papel de la regulación génica y los cambios epigenéticos en el cerebro, no solo en las condiciones patológicas sino también en el proceso fisiológico tal como el aprendizaje y la formación de la memoria. Finalmente, la tecnología presentada puede aplicarse en sistemas de mamíferos más complejos como primates, lo que permite superar las limitaciones tecnológicas actuales.
Ejem plo 28 : Datos d e l M odelo
Varios modelos de enfermedades han sido específicamente investigados. Estos incluyen genes de riesgo de autismo de novo CHD8, KATNAL2 y SCN2A; y el gen del síndrome autista sindrómico (síndrome de Angelman) UBE3A. Por supuesto, se prefieren estos genes y los modelos de autismo resultantes, pero demuestran que la invención puede aplicarse a cualquier gen y, por lo tanto, es posible cualquier modelo.
Las solicitantes han creado estas líneas celulares utilizando la nucleasa Cas9 en células madre embrionarias humanas (hESC). Las líneas fueron creadas por transfección transitoria de hESCs con Cbh-Cas9-2A-EGFP y pU6-sgRNA. Se diseñaron dos ARNgs para cada uno de los genes que fijan como objetivo con mayor frecuencia a los mismos exones en los que se han descrito recientemente mutaciones sin sentido (inactivadas) de pacientes a partir de estudios de secuenciación de exomas completos de pacientes autistas. Los plásmidos Cas9-2A-EGFP y pU6 se crearon específicamente para este proyecto.
Ejem plo 29 : S istem a o protocolo de producción de AA V
En esta memoria se proporciona un sistema o protocolo de producción de AAV que se desarrolló para, y funciona particularmente bien con usos de cribado de alto rendimiento, pero también tiene una aplicabilidad más amplia en la presente invención. La manipulación de la expresión génica endógena presenta diversos desafíos, ya que la tasa de expresión depende de muchos factores, incluidos los elementos reguladores, el procesamiento de ARNm y la estabilidad de la transcripción. Para superar este desafío, las solicitantes desarrollaron un vector basado en virus adeno-asociado (AAV) para el suministro. El AAV tiene un genoma basado en ssDNA y, por lo tanto, es menos susceptible a la recombinación.
AAV1/2 (serotipo AAV 1/2, es decir, híbrido o mosaico AAV1 / AAV2 cápside AAV) protocolo de virus concentrado purificado con heparina
Medios D10 HEPES
Frasco de 500 ml DMEM con alto contenido en glucosa Glutamax (GIBCO)
50 ml de Hyclone FBS (inactivado por calor) (Thermo Fischer)
5,5 ml de solución de HEPES (1 M, GIBCO)
Células: HEK293FT de pasada baja (pasada <10 en el momento de la producción del virus, descongelar nuevas células de pasadas 2-4 para la producción de virus, crecer durante 3-5 pasadas)
Reactivo de transfección Polietilenimina (PEI) "Max"
Disolver 50 mg de PEI "Max" en 50 ml de Ultrapure H20 estéril
Ajustar pH a 7,1
Filtrar con filtro fliptop de 0,22 um
Sellar el tubo y envolverlo con parafilm.
Congelar partes alícuotas a -20°C (para el almacenamiento, también se puede utilizar de inmediato)
Cultivo Celular
Cultivar HEK293FT de baja pasada en D10 HEPES
Pasada todos los días entre 1:2 y 1:2,5
Ventajosamente, no permitir que las células alcancen más del 85% de confluencia
Para T75
Calentar 10 ml de HBSS (-Mg2 , -Ca2 , GIBCO) 1ml de TrypLE Express (GIBCO) por matraz a 37°C (baño de agua)
Aspirar los medios completamente
Añadir 10 ml de HBSS tibio suavemente (para separar completamente por lavado los medios)
Añadir 1 ml de TrypLE por matraz
Colocar el matraz en la incubadora (37°C) durante 1 min
Sacudir el matraz para separar células
Añadir 9 ml de D10 medio HEPES (37°C)
Pipetee hacia arriba y hacia abajo 5 veces para generar una suspensión de células individuales
Dividir a una relación de 1:2 - 1:2,5 (12 ml de medio para T75) (si las células crecen más lentamente, desechar y descongelar un nuevo lote, no están en un crecimiento óptimo)
Transferir a T225 tan pronto como haya suficientes células (para facilitar la manipulación de grandes cantidades de células)
Producción de AAV (escala de placa de 5 * 15 cm por construcción):
Sembrar 10 millones de células en 21,5 ml de medio en una placa de 15 cm
Incubar durante 18-22 horas a 37°C.
La transfección es ideal al 80% de confluencia
Por placa
Precalentar 22 ml de medio (D10 HEPES)
Preparar el tubo con la mezcla de ADN (utilizar ADN endofree maxiprep):
5,2 ug de vector de plásmido de interés
4.35 ug de plásmido de serotipo AAV 1
4.35 ug de plásmido de serotipo AAV 2
10,4 ug de plásmido pDF6 (genes helper de adenovirus) □ Vórtice para mezclar
Añadir 434 pl de DMEM (¡sin suero!)
Añadir 130 pl de solución de PEI
Vortizar durante 5-10 segundos
Añadir la mezcla de ADN/DMEM/PEI a los medios precalentados
Vortizar brevemente para mezclar
Reemplazar los medios en una placa de 15 cm con una mezcla de ADN/DMEM/PEI
Regresar a la incubadora a 37°C
Incubar 48 horas antes de recolectar (asegurarse de que el medio no se esté volviendo demasiado ácido) Recolección de virus:
1. aspirar los medios cuidadosamente de las placas de 15 cm (ventajosamente no expulsar las células)
2. Añadir 25 ml de RT DPBS (Invitrogen) a cada una de las placas y retirar suavemente las células con un raspador de células. Recoger la suspensión en tubos de 50 ml.
3. Sedimentar las células a 800 x g durante 10 minutos.
4. Desechar el sobrenadante
punto de pausa: congelar el sedimento celular a -80aC si se desea
5. resuspender el sedimento en NaCl 150 mM, Tris 20 mM pH 8.0, utilizar 10 ml por placa de cultivo de tejidos.
6. Preparar una solución reciente de desoxicolato de sodio al 10% en dH2O. Añadir 1,25 ml de esto por placa de cultivo de tejidos para una concentración final de 0,5%. Añadir nucleasa benzonasa a una concentración final de 50 unidades por ml. Mezclar el tubo a fondo.
7. Incubar a 37°C durante 1 hora (baño de agua).
8. Separar los restos celulares mediante centrifugación a 3000 x g durante 15 min. Transferir a un tubo nuevo de 50 ml y asegurarse de que se hayan separado todos los restos celulares para evitar el bloqueo de las columnas de heparina.
Purificación en columna de heparina de AAV1/2:
1. Configurar columnas de heparina HiTrap utilizando una bomba peristáltica de modo que las soluciones fluyan a través de la columna a 1 ml por minuto. Es importante asegurarse de que no se introduzcan burbujas de aire en la columna de heparina.
2. Equilibrar la columna con 10 ml de NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 8, utilizando la bomba peristáltica.
3. Unión de virus: Aplicar 50 ml de solución de virus a la columna y dejar que fluya.
4. Etapa de lavado 1: columna con 20 ml de NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 (utilizando la bomba peristáltica) 5. Etapa de lavado 2: Utilizando una jeringa de 3 ml o 5 ml, continuar lavando la columna con 1 ml de NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8.0, seguido de 1 ml de NaCl 300 mM, Tris 20 mM, pH 8.0.
Desechar el flujo continuo.
(preparar las jeringas con diferentes tampones durante el flujo continuo durante 50 min de la solución de virus anterior) 6. EluciónUtilizando jeringas de 5 ml y presión suave (caudal de < 1 ml/min) eluir el virus de la columna aplicando: 1.5 ml de NaCl 400 mM, Tris 20 mM, pH 8,0
3,0 ml de NaCl 450 mM, Tris 20 mM, pH 8,0
1.5 ml de NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 8,0
Recoger estos en un tubo de centrífuga de 15 ml.
Concentración de AAV1/2:
1. Etapa de concentración 1: Concentrar el virus eluido utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon ultra de 15 ml con un corte de peso molecular de 100.000. Cargar el material eluido de la columna en el concentrador y centrifugar a 2000 x g durante 2 minutos (a temperatura ambiente. Comprobar el volumen concentrado - debe ser de aproximadamente 500 gl. Si es necesario, centrifugar a intervalos de 1 min hasta alcanzar el volumen correcto. 2. cambio de tampón: Añadir 1 ml de DPBS estéril a la unidad de filtro, centrifugar a intervalos de 1 min hasta alcanzar el volumen correcto (500 ul).
3. Etapa de concentración 2: Añadir 500 ul de concentrado a una unidad de filtro Amicon Ultra 0,5ml 100K. Centrifugar a 6000 g durante 2 min. Comprobar el volumen concentrado - debe ser de aproximadamente 100 gl. Si es necesario, centrifugar a intervalos de 1 min hasta alcanzar el volumen correcto.
4. Recuperación: Invertir el inserto del filtro e insertarlo en un tubo de recolección nuevo. Centrifugar a 1000g durante 2 min.
Dividir en partes alícuotas y congelar a -80°C.
Por lo general, se requiere 1 gl por sitio de inyección; por lo tanto, se recomiendan pequeñas partes alícuotas (p. ej., 5 ul) (evitar la congelación y descongelación del virus).
Determinar el título de partículas GC resistente a DNasal utilizando qPCR (véase el protocolo separado) Materiales
Amicon Ultra, 0,5 ml, 100 K; MILLIPORE; UFC510024
Amicon Ultra, 15 ml, 100 K; MILLIPORE; UFC910024
Nucleasa benzonasa; Sigma-Aldrich, E1014
Cartucho de heparina HiTrap, Sigma-Aldrich; 54836
Desoxicolato de sodio; Sigma-Aldrich, D5670
Protocolo de producción de sobrenadante de AAV1
Medios D10 HEPES
Frasco de 500 ml DMEM con alto contenido en glucosa Glutamax (Invitrogen)
50 ml de Hyclone FBS (inactivado por calor) (Thermo Fischer)
5,5 ml de solución de HEPES (1 M, GIBCO)
Células: HEK293FT de pasada baja (pasada <10 en el momento de la producción del virus)
Descongelar las nuevas células da las pasadas 2-4 para la producción de virus, crecer durante 2-5 pasadas Reactivo de transfección Polietilenimina (PEI) "Max"
Disolver 50 mg de PEI "Max" en 50 ml de Ultrapure H20 estéril
Ajustar pH a 7,1
Filtrar con filtro fliptop de 0,22 um
Sellar el tubo y envolverlo con parafilm.
Congelar partes alícuotas a -20°C (para el almacenamiento, también se puede utilizar de inmediato)
Cultivo Celular
Cultivar HEK293FT de pasada baja en D10 HEPES Pasada todos los días entre 1:2 y 1:2,5 Ventajosamente dejar que las células alcancen más del 85% de confluencia
Para T75
Calentar 10 ml de HBSS (-Mg2 , -Ca2 , GIBCO) 1ml de TrypLE Express (GIBCO) por matraz a 37°C (baño de agua)
Aspirar los medios completamente
Añadir 10 ml de HBSS tibio suavemente (para separar completamente por lavado los medios)
Añadir 1 ml de TrypLE por matraz
Colocar el matraz en la incubadora (37°C) durante 1 min
Sacudir el matraz para separar células
Añadir 9 ml de D10 medio HEPES (37°C)
Pipetee hacia arriba y hacia abajo 5 veces para generar una suspensión de células individuales
Dividir a una relación de 1:2 - 1:2,5 (12 ml de medio para T75) (si las células crecen más lentamente, desechar y descongelar un nuevo lote, no están en un crecimiento óptimo)
Transferir a T225 tan pronto como haya suficientes células (para facilitar la manipulación de grandes cantidades de células)
Producción de AAV (escala de placa individual de 15 cm)
Sembrar 10 millones de células en 21,5 ml de medio en una placa de 15 cm
Incubar durante 18-22 horas a 37°C.
La transfección es ideal al 80% de confluencia por placa
Precalentar 22 ml de medio (D10 HEPES)
Preparar el tubo con la mezcla de ADN (utilizar ADN endofree maxiprep):
5,2 ug de vector de plásmido de interés
8,7 ug de plásmido de serotipo AAV 1
10,4 ug de plásmido DF6 (genes helper de adenovirus)
Vortizar para mezclar
Añadir 434 gl de DMEM (¡sin suero!) Añadir 130 gl de solución de PEI
Vortizar durante 5-10 segundos
Añadir la mezcla de ADN/DMEM/PEI a los medios precalentados
Vortizar brevemente para mezclar
Reemplazar los medios en una placa de 15 cm con una mezcla de ADN/DMEM/PEI
Regresar a la incubadora a 37°C
Incubar 48 h antes de recolectar (ventajosamente, controlar que el medio no se esté volviendo demasiado ácido) Recolección de virus:
Separar sobrenadante de placa de 15 cm
Filtrar con un filtro de 0,45 um (baja unión a proteínas) Dividir en partes alícuotas y congelar a -80°C Transducción (cultivos de neuronas primarias en formato de 24 pocillos, 5DIV)
Reemplazar los medios neurobasales completos en cada uno de los pocilios de neuronas a transducir con neurobasal reciente (habitualmente se reemplazan 400 ul de 500 ul por pocillo)
Descongelar el sobrenadante de AAV en un baño de agua a 37°C
Dejar equilibrar en la incubadora durante 30 min
Añadir 250 ul de sobrenadante de AAV a cada uno de los pocillos
Incubar durante 24 h a 37°C
Retirar los medios/el sobrenadante y reemplazarlos por neurobasales completos recientes.
La expresión comienza a ser visible después de 48 h, se satura alrededor de 6-7 días después de la infección Las construcciones para el plásmido pAAV con GOI no deben exceder 4,8 kb incluyendo ambos ITRS.
Ejemplo de una secuencia humana optimizada en codones (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos): Se proporciona SaCas9 a continuación:
ACCGGTGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGC TTCG CCGAAGAAAAAG CG CAAGG TCGAAGCGTCCATGAAAAGGAACTACATTCT GGGGCTGGACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAAC AAGGGACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAA CAATGAGGGACGGAGAAGCAAGAGGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAA GGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCTGCTGACCG ACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAAGGCCTGA GTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACCTGGCTAAGC GCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTG TCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAG CTCTGGAAGAGAAGTATGTC GCAGAGCT GC AGCT GGAACGGCT G AAG AAAG AT GGCGAGGT GAGAGGGTCAATT
AATAGGTT C A AGACAAGCGACT ACGT C AAAGAAGCC AAGC AGCT GCT GAAAGTG CAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGC TGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGAT GGAAAGACATCAAGGAATGGTACGAGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCC AGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTTATAACGCAGATCTGTACAACGCCCT GAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATA CTAT GAGAAGTT CCAGATCATCGAAAACGT GTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTAC ACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTA CCGGGT GAC AAGC AC T GGA AAACC AGAGTT C ACC AAT CT GAAAGT GT AT C ACG A TATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGA TCAGATTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAG CTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGTAAT CT G AAGGGGT ACACCGGAAC ACAC AACCTGTCCCT GAAAGCT AT CAATCT G ATTC TGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAA GCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCAGCAGAAAGAGATCCCAACCACACT GGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAGCTTCATCCAGAGCATCAA AGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCT GGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCACAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAA CGAAACCGGCAGACCA ATGAACGCATTGAAGAGATT ATCCGAACT ACCGGGAAAGA GAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGT GTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACT ACGAGGTCGAT C AT ATT ATCCCC AGAAGCGT GT CCTTC G AC AATTCCTTT AAC AACA AGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCCAG TACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTG AATCTGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGG AAGAGCGGGACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTG GTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGATCCTATTTCCGG GTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTG AGGCGCAAATGGAAGTTTAAAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCG AAG ATG CTCTGATT AT CGC AAAT GCCG ACTT CATCTTT AAGG AGTGG AAAAAGCT G G ACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATC T ATGCCCG AAAT CG AGAC AG AAC AGGAGT AC AAGGAGATTTT C ATC ACTCCT C ACC
AGAT CAAGC AT AT CAAGG ATTT CAAGGACTAC AAGTACT CT CACCGGGTGGAT AAA
AAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTACAAGAAAAGACGATAA
GGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGATAATGACA
AGCT GAA AAAG CTG AT C AAC AAAAGT CCCG AGAAGCT GCT GAT GT ACC AC CAT GAT
CCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAA
CCCACTGTAT AAGTACT ATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACCAAGTATAGCAAAA
AGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCC
CATCTGGACATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTC
ACTGAAGCCATACAGATTCGATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGAC
T GTC AAG AAT CT GGAT GTC ATC AAAAAGG AG AACT ACTATG AAGT G AAT AGCAAGT
GCTACGAAGAGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCC
TCCTTTT AC A AC A ACGACCTGATT AAGATC A ATGGCGA ACT GT AT AGGGTCATCGGG
GTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACTTACCGA
GAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGC
CTCT AAGACTCAG AGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATT CTGGGAAACCT GTAT G A
GGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCAAAAAGGGCTAAGAATTC
Ejem plo 30: M inim ización de la escisión fuera de d iana utilizando nickasa Cas9 y dos A R N gu ía
Cas9 es una nucleasa de ADN guiada por ARN que puede ser fijada como objetivo a ubicaciones específicas en el genoma con ayuda de un ARN guía de 20 pb. Sin embargo, la secuencia guía puede tolerar algunos emparejamientos erróneos entre la secuencia guía y la secuencia de ADN diana. La flexibilidad no es deseable debido al potencial de escisión fuera de diana, cuando el ARN guía fija como objetivo Cas9 a una secuencia fuera de diana que tiene unas pocas bases diferentes de la secuencia guía. Para todas las aplicaciones experimentales (fijación como objetivo de genes, modificación de cultivos, aplicaciones terapéuticas, etc.) es importante poder mejorar la especificidad de la fijación como objetivo de genes mediada por Cas9 y reducir la probabilidad de que Cas9 modifique fuera de diana.
Las solicitantes desarrollaron un método para utilizar un mutante de la nickasa Cas9 en combinación con dos ARN guía para facilitar la rotura de doble cadena fijada como objetivo en el genoma sin modificaciones fuera de diana. El mutante nickasa Cas9 puede generarse a partir de una nucleasa Cas9 deshabilitando su actividad de escisión de modo que, en lugar de escindir ambas cadenas del dúplex de ADN, solo se escinde una cadena. La nickasa Cas9 puede generarse induciendo mutaciones en uno o más dominios de la nucleasa Cas9, p. ej., Ruvcl o HNH. Estas mutaciones pueden incluir, pero no se limitan a mutaciones en un dominio catalítico Cas9, p. ej., en SpCas9, estas mutaciones pueden estar en las posiciones D10 o H840. Estas mutaciones pueden incluir, pero no se limitan a D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A en SpCas9, pero las nickasas pueden generarse induciendo mutaciones en las posiciones correspondientes en otras enzimas CRISPR u ortólogos Cas9. En una realización más preferida de la invención, el mutante de la nickasa Cas9 es una nickasa SpCas9 con una mutación D10A.
La forma de que esto funciona es que cada ARN guía en combinación con nickasa Cas9 induciría la rotura de una sola cadena fijada como objetivo de una diana de ADN dúplex. Dado que cada uno de los ARN guía mella una cadena, el resultado neto es una rotura de cadena doble. La razón por la cual este método elimina las mutaciones fuera de diana es porque es muy poco probable que tenga un sitio fuera de diana que tenga altos grados de similitud para ambas secuencias guía (20 pb 2 pb (PAM) = especificidad de 22 pb para cada una de las guías, y dos guías significan cualquier sitio fuera de diana tendrá que tener cerca de 44 pb de secuencia homóloga). Aunque todavía es probable que las guías individuales puedan tener dianas fuera de diana, pero esos dianas fuera de diana solo serán melladas, lo que es poco probable que sean reparadas por el proceso mutagénico de NHEJ. Por lo tanto, la multiplexación de la mella de doble cadena de ADN proporciona una forma poderosa de introducir roturas de doble cadena de ADN diana sin efectos mutagénicos fuera de diana.
Las solicitantes llevaron a cabo experimentos que implican la co-transfección de células HEK293FT con un plásmido que codifica la nickasa Cas9(D10A) así como casetes de expresión de ADN para una o más guías. Las solicitantes transfectaron células utilizando Lipofectamine 2000, y las células transfectadas se recolectaron 48 o 72 horas después de las transfecciones. El NHEJ inducido por doble mella se detectó utilizando el ensayo de nucleasa SURVEYOR tal como se describe anteriormente en esta memoria (Figuras 33, 34 y 35).
Las solicitantes han identificado además parámetros que se relacionan con la escisión eficiente por el mutante de la nickasa Cas9 cuando se combina con dos ARN guía y estos parámetros incluyen, pero no se limitan a, la longitud del colgante 5'. Se informa una escisión eficiente para un colgante en 5’ de al menos 26 pares de bases. En una realización preferida de la invención, el colgante en 5’ tiene al menos 30 pares de bases y más preferiblemente al menos 34 pares de bases. Los colgantes de hasta 200 pares de bases pueden ser aceptables para la escisión, mientras que se prefieren colgantes en 5’ inferiores a 100 pares de bases y los colgantes en 5’ inferiores a 50 pares de bases son los más preferidos (Figuras 36 y 37).
E jem plo 31: A R N de g u ía única en tándem (ARNtgs)
El sistema bacteriano CRISPR-Cas es una endonucleasa guiada por ARN que las solicitantes han demostrado que puede inducir una modificación fijada como objetivo del genoma eucariótico de forma predecible, precisa y eficiente. Los componentes mínimos necesarios para reconstituir este sistema en células de mamífero consisten en la administración de la endonucleasa Cas9, así como un ARN guía que lleva una secuencia de especificidad de 20 pb complementaria al sitio diana de interés. Hasta ahora, se requería el suministro de múltiples ARN guía individuales para lograr la edición del genoma multiplex. Si bien la cotransfección de múltiples guías es relativamente simple en el cultivo de tejidos, muchas aplicaciones in vivo y terapéuticas para el sistema CRISPR-Cas se beneficiarían de un sistema de un solo vector que aún podría permitir la edición múltiple.
Las solicitantes mutagenizaron diferentes partes de la arquitectura original del ARN guía quimérico para determinar qué partes del ARN guía quimérico serían susceptibles de alteración o mejora. A partir de estos estudios, las solicitantes encontraron que las dos horquillas distales parecen funcionar principalmente en la estabilización del ARN quimérico. La alteración de la región dúplex de repetición directa y ARNtracr, así como la región no estructurada entre el dúplex y la primera horquilla del ARNtracr abolió la actividad de escisión. Sin embargo, la mayor estabilización de las dos horquillas de la cola de ARNtracr mediante la introducción de pares G-C (Arquitecturas A y B en la Figura 38A) no disminuyó la capacidad de Cas9 de inducir indeles fijados como objetivo.
En el sistema CRISPR bacteriano nativo, Cas9 procesa un transcrito repetitivo continuo de espaciadores flanqueados por DR en unidades discretas tras el ensamblaje con ARNtracr. Las solicitantes razonaron que múltiples ARNgs pre­ ensamblados también podrían procesarse en unidades funcionales discretas. Para crear ARNgs en tándem (ARNtgs), se introdujo un enlazador de 8 nt entre el extremo del ARNtracr del primer ARNgs y el espaciador del siguiente ARNgs (Figura 38B). Las solicitantes testaron el ARNtgs en dos ensayos: inducción por microdeleción con Cas9 de tipo salvaje (Figura 38C) y formación de indeles con nickasa Cas9n (Figura 38D). Las solicitantes encontraron que ambos ARNtgs creados con armazones de Arquitectura A o B fueron capaces de lograr una modificación fijada como objetivo a niveles equiparables al suministro individual de ambos ARN guía.
Los ARNgs en tándem se sintetizan en una PCR de 2 rondas de la siguiente manera:
Ronda 1: Amplificación utilizando el promotor U6 como molde, cebador U6-Dir (como en experimentos de casetes de expresión de PCR previos para el suministro de ARNgs) y un cebador Inverso modificado que contiene de 5’ a 3' (en dirección inversa del complemento): espaciador-2, armazón modificado con ARNgs, espaciador-1, región de cebado U6.
Ronda 2: Se amplifica utilizando el producto de la ronda 1 como molde, utilizando el cebador U6-Dir como se describió anteriormente, y un cebador inverso de 5’ a 3' (en dirección inversa del complemento): armazón modificado, espaciador-2. (Figura 38).
Después de 2 rondas de PCR, el producto ARNtgs de longitud completa se purifica y co-transfecta con Cas9 para testar en células.
E jem plo 32: A R N de g u ía única en tándem (ARNtgs)
La capacidad de suministrar simultáneamente más de un ARN guía en un solo vector es particularmente manejable para las metodologías de rastreo lentivirales. La propensión del lentivirus a recombinarse ha limitado la capacidad de impulsar la expresión de múltiples ARN cortos a partir de un solo vector con el requisito de utilizar múltiples promotores únicos. Un enfoque en tándem puede permitir que un único promotor impulse la expresión de al menos dos ARN guía. Además de permitir fijar como objetivo a combinaciones de dianas genómicas, colocar dos ARN guía inmediatamente adyacentes entre sí facilita la clonación en una sola etapa de alto rendimiento (Fig. 39A). Para disminuir aún más la homología entre armazones adyacentes para disminuir la recombinación viral y aumentar la estabilidad de la guía dentro de la matriz en tándem, las solicitantes han creado y están validando secuencias de armazones divergentes que conservan la estructura secundaria (Fig. 39B). Finalmente, a través de análisis de transferencia Northern utilizando una sonda dirigida contra una combinación particular de espaciador-armazón, las solicitantes han observado que los ARN guía en tándem se procesan en unidades de ARNgs individuales y que la eficiencia del procesamiento aumenta con los armazones modificados en relación con el armazón de tipo salvaje 85 (Fig. 39C). El ensamblaje de las guías en tándem se puede lograr mediante la reasociación de ultrámeros que contienen Espaciadorl-Armazón-Espaciador 2 (Fig. 39A), PCR de dos pasos, o mediante el ensamblaje Golden Gate, que sería más adecuado para la construcción de matrices más largas.
Ejem plo 33: Caracterización y optim ización d e l sistem a C RISPR/Cas para aplicaciones en m odificación de l genom a.
Estudios recientes de la especificidad de Cas9 han demostrado que, aunque cada una de las bases dentro de la secuencia guía de 20 nt contribuye a la especificidad global, se pueden tolerar múltiples emparejamientos erróneos entre el ARN guía y su ADN complementario de una manera sensible a la cantidad, la posición y la identidad de la base. Como resultado, Cas9 puede escindir loci genómicos que comparten una homología imperfecta con la secuencia guía de 20 nt diana, lo que conduce a DSB fuera de diana y reparación de NHEJ. La formación de indeles posterior en sitios de escisión fuera de diana puede conducir a niveles significativos de mutaciones no deseadas, lo que limita la utilidad de Cas9 para aplicaciones de edición del genoma que requieren altos niveles de precisión, incluida la generación de líneas celulares isogénicas para testar variaciones genéticas causales, así como terapias basadas en la edición del genomain vivo y ex vivo.
Para mejorar la especificidad de la edición del genoma mediada por Cas9, las solicitantes desarrollaron una nueva estrategia que combina la versión de nickasa mutante D10A de Cas9 (Cas9n) con un par de ARNgs compensados que fijan como objetivo cadenas opuestas del sitio diana. El mellado de ambas cadenas de ADN en el sitio diana por un par de nickasas Cas9 conduce a DSB específicos para el sitio, mientras que las mellas individuales son reparadas predominantemente por la ruta de reparación de escisión de bases (BER) de alta fidelidad en lugar de NHEJ propenso a errores. Esta estrategia minimizaría la mutagénesis fuera de diana por cada complejo de Cas9n-ARNgs al tiempo que maximiza el NHEJ en la diana equiparable a la Cas9 de tipo salvaje y sería análoga a las nucleasas de dedos de zinc diméricas (ZFN) y las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN), en que la escisión del ADN se basa en la interacción sinérgica de dos módulos independientes de codificación de especificidad. ZFN y TALEN generan DSB a través de la dimerización inducida por proximidad de dos monómeros FokI, cada uno de los cuales mella una cadena de ADN. De manera similar, las solicitantes emparejaron Cas9n con dos ARNgs dirigidos a cadenas opuestas de un locus deseado. Esta estrategia de 'doble mella' magnificaría efectivamente la especificidad de fijación como objetivo de Cas9 al requerir la fijación como objetivo simultánea por parte de dos ARNgs.
Finalmente, para facilitar el suministro conjunto de múltiples ARNgs, las solicitantes han desarrollado un sistema para expresar pares de ARNgs bajo un único promotor. Las solicitantes estudiaron primero los componentes estructurales de ARNgs críticos para la función, y en segundo lugar utilizaron este conocimiento para informar sobre el diseño de nuevos armazones de ARNgs secuencia-divergentes que facilitan la transcripción en tándem de ARNgs.
Materiales y Métodos
Amplificación por PCR de ARNgs y ARNgs en tándem impulsados por el promotor U6.
La selección del espaciador para la fijación como objetivo por Cas9 y la posterior generación de amplicón de PCR se realizó como se describe en Ran et al. Brevemente, IDT sintetizó oligo ultrámeros que consisten en el sitio de cebado U6, la secuencia de espaciador y el armazón de ARN guía para la amplificación de casetes de PCR impulsados por U6 para transfecciones celulares. En ambos casos, se utilizaron columnas de centrifugación QiaQuick (Qiagen) o EconoSpin (Epoch Life Sciences) para limpiar las reacciones PCR antes de las transfecciones. Los ARNgs en tándem se sintetizan en una PCR de 2 rondas de la siguiente manera: Ronda 1: Amplificación utilizando el promotor U6 como molde, cebador U6-Dir (como en experimentos de casetes de expresión de PCR previos para el suministro de ARNgs) y un cebador Inverso modificado que contiene de 5’ a 3' (en dirección inversa del complemento): espaciador-2, armazón modificado con ARNgs, espaciador-1, región de cebado U6. Ronda 2: Se amplifica utilizando el producto de la ronda 1 como molde, utilizando el cebador U6-Dir como se describió anteriormente, y un cebador inverso de 5’ a 3' (en dirección inversa del complemento): armazón modificado, espaciador-2. Después de 2 rondas de PCR, el producto ARNtgs de longitud completa se purifica y co-transfecta con Cas9 para testar en células. En ambos casos, se utilizaron columnas de centrifugación QiaQuick (Qiagen) o EconoSpin (Epoch Life Sciences) para limpiar las reacciones PCR antes de las transfecciones. Se puede encontrar una lista de los ARNgs utilizados y sus dianas genómicos en la Tabla E.
Cultivo celular y transfección
La línea celular de riñón embrionario humano (HEK) 293FT (Life Technologies) se mantuvo en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementada con suero bovino fetal al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), penicilina 100U/mL y 100 pg/mL de estreptomicina a 37°C con incubación con 5% de CO2. Las células se hicieron pasar a intervalos regulares y se sembraron en placas de 24 pocillos (Corning) a una densidad de 120.000 células/pocillo 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) a una confluencia del 80-90% según el protocolo recomendado por el fabricante: Se transfectó un total de 400 ng de plásmido Cas9 y 100 ng de producto de PCR U6-ARNgs por pocillo de una placa de 24 pocillos. Para experimentos de doble mella o transfecciones que implican más de una sola guía, se transfectaron 100 ng de cada uno de los ARNgs. En el caso de ARNgs en tándem, se transfectaron 200 ng de producto de PCR U6-ARNtgs purificado por pocillo.
La línea de células madre embrionarias humanas HUES62 (núcleo del Harvard Stem Cell Institute) se mantuvo en condiciones libres de alimentación en GelTrex (Life Technologies) en medio mTesR (Stemcell Technologies) complementado con 100 ug/ml de Normocina (InvivoGen). Las células HUES62 se transfectaron con el kit Amaxa P3 Primary Cell 4-D Nucleofector (Lonza) siguiendo el protocolo del fabricante.
Ensayo de nucleasa SURVEYOR para la modificación del genoma
Células 293FT y HUES62 se transfectaron con ADN tal como se describe arriba. Las células se incubaron a 37°C durante 72 horas post-transfección antes de la extracción del ADN genómico. El ADN genómico se extrajo utilizando la Solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células sedimentadas se resuspendieron en solución QuickExtract y se incubaron a 65°C durante 15 minutos, a 68°C durante 15 minutos y a 98°C durante 10 minutos.
La región genómica que flanquea el sitio diana CRISPR para cada uno de los genes se amplificó por PCR (cebadores enumerados en la Tabla G), y los productos se purificaron utilizando la Columna de Centrifugación QiaQuick (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Un total de 400 ng de los productos de PCR purificados se mezclaron con 2 pl de tampón PCR 10X Taq ADN Polimerasa (Enzymatics) y agua ultrapura hasta un volumen final de 20 pl, y se sometieron a un proceso de reasociación para permitir la formación de heteroduplex: 95°C durante 10 min, rampa de 95°C a 85°C a - 2°C/s, 85°C a 25°C a - 0,25°C/s, y 25°C se mantienen durante 1 minuto. Después de la reasociación, los productos se trataron con nucleasa SURVEYOR y potenciador S SURVEYOR (Transgenomics) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, y se analizaron en geles de poli-acrilamida Novex TBE al 4-20% (Life Technologies). Los geles se tiñeron con tinción de ADN SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos y se formaron imágenes con un sistema de formación de imágenes de gel Gel Doc (Bio-rad). La cuantificación se basó en intensidades de banda relativas. El porcentaje de indeles se determinó mediante la fórmula 100 x (1 - (1 - (b c) / (a b c))1/2), en que a es la intensidad integrada del producto de PCR no digerido, y b y c son las intensidades integradas de cada uno de los productos de escisión.
Secuenciación profunda para evaluar la especificidad de fijación como objetivo
Células HEK 293FT se sembraron en placas y se transfectaron tal como se describe arriba, 72 horas antes de la extracción del ADN genómico. La región genómica que flanquea el sitio diana CRISPR para cada uno de los genes se amplificó (cebadores enumerados en la Tabla H) mediante un método de fusión por PCR para unir los adaptadores Illumina P5, así como códigos de barras únicos específicos de la muestra a la diana. Los productos de PCR se purificaron utilizando placas de filtro EconoSpin de 96 pocillos (Epoch Life Sciences) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.
Las muestras de ADN purificadas y con códigos de barras se cuantificaron mediante fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies) y se agruparon en una relación equimolar. Las colecciones de secuenciación se secuenciaron luego con el secuenciador personal Illumina MiSeq (Life Technologies).
Análisis de datos de la secuencia, detección de indeles y detección de recombinación homóloga
Las lecturas de MiSeq se filtraron al requerir una calidad de Phred media (puntuación Q) de al menos 30, así como coincidencias de secuencia perfectas con códigos de barras y cebadores directos de amplicón. Las lecturas de los loci dentro y fuera de diana se analizaron realizando una comparación de cadenas Ratcliff-Obershelp, tal como se implementa en el módulo Python difflib, frente a secuencias de loci que incluían 30 nucleótidos aguas arriba y aguas abajo del sitio diana (un total de 80 pb). Las operaciones de edición resultantes se analizaron y las lecturas se contaron como indeles si se encontraron operaciones de inserción o deleción. Las regiones diana analizadas se descartaron si parte de su alineamiento quedaba fuera de la lectura de MiSeq o si no se llamaban más de 5 bases.
Los controles negativos para cada una de las muestras proporcionaron un indicador para la inclusión o exclusión de indeles como supuestos eventos de corte. Para la cuantificación de la recombinación homóloga, las lecturas se procesaron primero como en el flujo de trabajo de detección de indeles, y luego se verificó la presencia del molde de recombinación homóloga CCAGGCTTGG.
Análisis de citometría de flujo para la inducción de indeles que auto-fijan como objetivo Cas9
Las células se transfectaron como arriba utilizando el plásmido Cas9 PX475 que codifica SpCas9-t2a-GFP en presencia de ARN guía que fijan como objetivo la propia Cas9. Tres días después de la transfección, las células se lavaron una vez con PBS, se tripsinizaron y se trituraron hasta formar una suspensión celular única, y se resuspendieron en tampón PBS complementado con FBS al 5% y EDTA 2 mM. La intensidad fluorescente se midió posteriormente utilizando el citómetro de flujo Accuri C6.
Análisis de transferencia Northern de células que procesan ARNgs. Las células se transfectaron tal como se describe arriba y se incubaron durante 72 h a 37°C. Posteriormente, se extrajo el ARN de las células según el protocolo del kit de aislamiento de ARNmi mirVana (Life Technologies) para enriquecer los ARN pequeños. Los ARN pequeños purificados se resolvieron en un gel desnaturalizante, se transfirieron a una membrana de nailon cargada positivamente BrightStar (Ambion) y se sondearon durante la noche utilizando oligonucleótidos radiactivos o biotinilados que fijan como objetivo secuencias espaciadoras de ARNgs específicas. La visualización se realizó mediante el uso de un formador de imágenes Typhoon o una máquina Li-Cor CLx dependiendo de la modalidad de la sonda.
Resultados
La nickasa Cas9 genera NHEJ eficiente con ARN guía duales estrechamente aproximados
La especificidad de fijación de objetivo y la actividad de la nucleasa Cas9 dependen de la interacción de apareamiento de bases entre la secuencia guía de 20nt dentro del ARNgs y el ADN diana. Por lo tanto, las solicitantes razonaron que alargar la secuencia guía podría aumentar el apareamiento de bases de la diana guía y aumentar la especificidad de fijación como objetivo de Cas9. Sin embargo, esto no pudo mejorar la especificidad de la fijación como objetivo de Cas9, ya que la mayoría de la secuencia guía alargada se procesa nuevamente a una longitud de 20 nt. Por lo tanto, las solicitantes exploraron una estrategia alternativa para aumentar la longitud total del apareamiento de bases entre la secuencia guía y la diana de ADN basándose en el mellado simultáneo de ambas cadenas de ADN por dos complejos de Cas9-ARNgs separados. Las mellas de cadena sencilla de Cas9n son reparadas preferentemente por la ruta BER, que típicamente produce niveles extremadamente bajos de mutagénesis. Las solicitantes razonaron que dos enzimas melladoras dirigidas por un par de ARNgs que fijan como objetivo cadenas opuestas de un locus diana, que requieren el doble del número de bases de ARNgs apareadas con el ADN diana, aún podrían mediar en los DSB, mientras que los loci mellados por un solo dúplex ARNgs-Cas9 estarían perfectamente reparados (esquematizado en la Figura 40A). Al co-transfectar los ARNgs y la nickasa Cas9D10A (Cas9), que mella la cadena de ADN de forma complementaria al ARNgs, en células de riñón embrionario humano (HEK293FT), las solicitantes observaron que mientras que Cas9n en combinación con pares de guías podría inducir eficientemente la formación de indeles, Cas9n con guías individuales por sí solo no dio lugar a una modificación detectable del locus diana mediante el ensayo SURVEYOR (Figura 40B).
Dado que la estrategia de doble mella requiere dos complejos Cas9n-ARNgs para fijar simultáneamente como objetivo al mismo locus, es probable que el impedimento estérico sea motivo de preocupación para determinar si se puede utilizar cualquier par de ARNgs que fijen como objetivo cadenas opuestas de ADN para generar DSB. Para caracterizar a fondo los parámetros de los ARN guía emparejados, que serían susceptibles de formación de indeles, las solicitantes diseñaron sistemáticamente emparejamientos de ARNgs que fijan como objetivo tres genes humanos diferentes separados por un intervalo de distancias de desplazamiento de -200 a 200 pb, creando productos colgantes tanto 5’ como 3’ y testaron cada uno en cuanto a NHEJ (pares enumerados en la Tabla D). Significativamente, en los tres genes, las solicitantes observaron una frecuencia de indeles sustancial (hasta 40%) para las compensaciones de pares de ARNgs de -4 a 20 pb (Figura 41A). En particular, los indeles formados por doble mella con ARN guía emparejados pueden dar como resultado tipos de mutaciones más grandes y más variados (indeles representativos observados por secuenciación profunda que se muestran en la Figura 41B) que los observados habitualmente con guías individuales, que generalmente resultan en pequeñas deleciones en la secuencia diana 4-6 pb aguas arriba del PAM. Ocasionalmente, se observó que los ARNgs compensados por hasta 100 pb median en la modificación de la diana, lo que sugiere una amplia gama de posibles espacios para la fijación de objetivo. Es importante destacar que todas las transfecciones de ARNgs individuales con Cas9n de tipo salvaje, pero no Cas9n, mediaron en la formación eficiente de indeles (resumida en la Tabla D), consistente con el espaciamiento relativo entre pares de guías que es el determinante principal de la modificación del genoma inducida por doble nickasa. Impresionantemente, las frecuencias de indeles por doble nickasa fueron generalmente equiparables a las mediadas por la nucleasa Cas9 de tipo salvaje que fija como objetivo el mismo locus. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la doble mella puede servir como una solución generalizable y predecible para mediar de manera eficiente en los DSB fijados con precisión como objetivo.
La doble mella permite una recombinación homóloga de alta eficiencia
Si bien la inducción de roturas de ADN de doble cadena puede introducir indeles mutagénicos en loci genómicos fijados como objetivo y mediar en la inactivación de genes, también puede ser un mecanismo por el cual se facilita la reparación dirigida por homología (HDR) para permitir la edición o reemplazo de genes altamente preciso de los sitios diana. Dada la gran cantidad de datos de SNP que se están generando y la creciente asociación y apreciación de las mutaciones de pares de bases pequeñas o únicas en los tejidos enfermos a través de los esfuerzos de secuenciación del genoma o del exoma, la capacidad de alterar de manera fiable y eficiente pequeñas regiones genómicas para las pruebas funcionalesaguas abajo o el modelado de enfermedades resultarían enormemente útiles.
Anteriormente, las solicitantes han demostrado que Cas9n, cuando se utiliza con un solo ARNgs para mellar ADN, puede iniciar la HDR. Sin embargo, la HDR se produce a una frecuencia mucho más baja cuando está mediada por mellas en lugar de DSB, lo cual puede variar adicionalmente entre los tipos de células. Para testar la eficiencia de la HDR con el uso de una estrategia de doble mella, las solicitantes fijaron como objetivo al locus EMX1 humano con dos pares de ARNgs compensados por -3 y 17 pb (generando colgantes en 5‘ de 31 y 52 pb, respectivamente) e introdujeron un oligonucleótido de cadena sencilla (ODNss) que porta un sitio de restricción HindIII como molde de reparación de la HDR para introducir un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) en el locus genómico (Figura 42A). La posterior RFLP demostró que ambos pares de ARNgs pudieron introducir con éxito el molde HR a frecuencias significativamente más altas que las de las transfecciones Cas9n de una sola guía y equiparables a las de Cas9 de tipo salvaje (Figura 42B).
El creciente interés y desarrollo en las células madre (ESC) o la biología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas del paciente representa simultáneamente una oportunidad clave para generar nuevos paradigmas de enfermedades y desarrollar nuevos agentes terapéuticos, así como una creciente necesidad de desarrollar medios cada vez más precisos y eficientes de modificación del genoma. Si bien se ha demostrado que las roturas de doble cadena facilitan de manera eficiente la HDR en ESC e iPSCs, todavía hay mucho interés en utilizar enfoques de mellado para la HDR en estas aplicaciones sensibles debido a su menor actividad fuera de diana. Sin embargo, los enfoques de una sola mella para inducir la HDR en células madre embrionarias humanas utilizando el sistema CRISPR-Cas han tenido un éxito limitado. Para mejorar la eficiencia de la HDR en células ES, las solicitantes intentaron posteriormente la HDR inducido por doble mella en la línea celular HUES62 y observaron tasas significativamente mayores de incorporación del molde de HDR (Figura 42C).
De manera análoga a la definición del espaciamiento óptimo de ARNgs para la generación de indeles mediante doble mella, las solicitantes buscaron luego determinar los parámetros ideales para potenciar la HDR. Las solicitantes postularon que para facilitar de manera más eficiente la invasión de cadenas y la conversión posterior, al menos uno de los ARN emparejados con ARNgs debe der fijado como objetivo cerca del sitio de integración. Las solicitantes testaron una diversidad de pares de ARNgs en los que al menos uno de los sitios de escisión fijados como objetivo estaba cerca del sitio de recombinación (Figura 43). Las solicitantes observaron que los pares de ARNgs predichos para generar un colgante en 5‘ con al menos un diana dentro de los 22 pb del sitio de integración pudieron incorporar el molde de la HDR proporcionada a frecuencias equiparables a la HDR mediada por nucleasa Cas9 de tipo salvaje. Por el contrario, los pares de ARNgs que se fijaban como objetivo la misma cadena de ADN, separados por compensaciones negativas, o que no tenían ni ARNgs cerca del sitio de integración, eran incapaces de facilitar la HDR a niveles detectables.
La doble mella media en la edición de genomas altamente específicos
Habiendo demostrado que la doble mella media en la inducción de alta eficiencia tanto de NHEJ como de HDR a niveles equiparables a los inducidos por Cas9 de tipo salvaje, las solicitantes buscaron determinar si este enfoque da como resultado una especificidad mejorada frente a Cas9 a través de la cuantificación de actividades fuera de diana. Las solicitantes suministraron conjuntamente Cas9n con dos ARNgs separados por un desplazamiento de 23 pb para fijar como objetivo el locus EMX1 humano (Figura 44A). Como se esperaba, esta configuración de ARNgs emparejados dio como resultado niveles indeles en diana equiparables a los de Cas9 de tipo salvaje transfectados con cualquiera de los ARNgs individualmente (Figura 44B, panel izquierdo). Sorprendentemente, las solicitantes no detectaron ninguna modificación mediante el ensayo SURVEYOR en uno de los sitios fuera de diana de ARNgs 1 (OT-4) en el caso de doble mella, en donde la Cas9 de tipo salvaje mostró una modificación del 10% (Figura 43, panel derecho). Posteriormente, las solicitantes utilizaron la secuenciación profunda para evaluar la modificación en 5 loci diferentes fuera de diana de ARNgs 1 y observaron una mutagénesis significativa en todos los sitios con ARNgs 1 Cas9 de tipo salvaje solo (Figura 43). Por el contrario, la escisión fuera de diana por Cas9n era apenas detectable y difícil de distinguir del error de secuenciación. Normalizado a una relación de especificidad (relación de porcentaje indel dentro-fuera de diana), Cas9n con dos ARNgs podría lograr una especificidad más de 100 veces mayor en relación con Cas9 de tipo salvaje (Figura 43).
En resumen, la estrategia de utilizar la nickasa Cas9n con pares de ARN guía muy aproximados es eficiente para inducir NHEJ y facilitar la HDR como la nucleasa de tipo salvaje, al tiempo que logra una especificidad de fijación de objetivo mucho más alta. Además, el intervalo relativamente amplio de distancias de desplazamiento entre las guías dobles que es compatible con una actividad robusta hace que la doble mella sea un método atractivo y fácil de implementar.
La mutagénesis sistemática de la arquitectura de ARNgs identifica regiones para una optimización adicional.
Uno de los elementos críticos del sistema de nucleasa CRISPR-Cas tipo II es el ARNcr transactivante (ARNtracr), que comparte homología de secuencia parcial y pares de bases con la región repetida del ARNcr y se requiere para el ensamblaje del complejo Cas9-ARNcr-ARNtracr final. Si bien los elementos de ARNtracr y ARNcr se han adaptado para formar un solo ARNgs enlazado artificialmente (en lo sucesivo, a lo que se alude como el armazón sp85 de tipo salvaje) (Jinek Science, HSU), los efectos de la modificación del armazón ARNgs y la tolerancia hacia la mutagénesis en general no han sido completamente estudiados.
El armazón de ARNgs se puede dividir funcional y estructuralmente en varios componentes. La porción de ARNcr incluye la secuencia guía y las regiones de repetición directa. El ARNtracr comienza con una anti-repetición de 14 nt que se aparea en bases parcialmente con la repetición directa para formar un tallo-bucle (tallo-bucle 1) y, además, contiene un enlazador de 18 pb a dos tallos-bucle adicionales (tallos-bucle 2 y 3). Es importante destacar que existen varias bases no apareadas dentro de la repetición directa y el tallo-bucle 1 anti-repetición y ARNtrac, que crean una protuberancia que separa las regiones de repetición directa proximal y distal (Figura 45A). Las solicitantes plantearon la hipótesis de que la optimización de la arquitectura de ARNgs podría mejorar la actividad de edición del genoma de Cas9 y posteriormente realizaron una interrogación sistemática del armazón de ARNgs para obtener una mejor comprensión funcional de cada uno de los componentes.
Las solicitantes identificaron primero las regiones del ARNgs probablemente importantes para la unión y el reconocimiento por parte de Cas9. Sorprendentemente, el reemplazo de la protuberancia del tallo-bucle 1 con secuencias de apareamiento de bases perfectamente abolió por completo la actividad de los indeles mediada por Cas9, mientras que la sustitución de otros nucleótidos de apareamiento no base y, por lo tanto, la retención de la estructura de la protuberancia aún permitía el mantenimiento de una actividad modesta. Dentro del tallo-bucle 1, las mutaciones en la repetición directa proximal no se toleraron de manera uniforme: mientras que el acortamiewwnto del dúplex de repetición directa proximal o la mutación del tracto poli-T a pirimidinas y purinas mixtas abolió la actividad de Cas9, la mutación del tracto poli-T a pirimidinas solo fue bueno -tolerado (Figura 45B). Finalmente, el truncamiento, la combinación aleatoria o la aleatorización de la secuencia del enlazador de 18 pb también dio como resultado una pérdida completa de la actividad. Sin embargo, es posible que este enlazador más largo forme estructuras secundarias adicionales no predichas por el plegamiento de ARN, y se necesitarán más experimentos de mutagénesis de mapeo más fino para dilucidar su papel estructural.
De acuerdo con estudios previos que muestran que los tallos-bucle 2 y 3 no son críticos para la actividad de Cas9 a pesar de que mejoran significativamente la eficiencia de escisión, las alteraciones de las horquillas distales son en gran medida bien toleradas. Por ejemplo, ambos tallos-bucle 2 y 3 podrían reemplazarse en gran medida por pares de bases G-C o extenderse en longitud sin afectar negativamente la actividad (Figura 45B). Juntos, estos hallazgos sugieren que si bien la repetición directa proximal, la protuberancia y el enlazador pueden estar implicados en el reconocimiento y la unión de Cas9, las dos horquillas distales son probablemente más importantes para el plegamiento y la estabilidad de ARNgs. De hecho, la estabilización simultánea de ambas horquillas distales junto con la mutación de la región de repetición directa distal fue bien tolerada, produciendo una actividad indel equiparable al armazón original (Figura 46).
Los ARN guía en tándem impulsados por U6 son capaces de suministrar dos ARNgs funcionales
La naturaleza programable del sistema CRISPR-Cas por pequeños ARN lo hace intrínsecamente más manejable que las herramientas basadas en herramientas basadas en módulos puramente proteicos, tales como ZFN y TALEN para aplicaciones que requieren dianas múltiples. De hecho, las solicitantes y otros ya han demostrado que esto se puede lograr fácilmente mediante el suministro conjunto de múltiples ARNgs en una diversidad de aplicaciones. Si bien este enfoque funciona bien para estudios in vitro, las aplicaciones in vivo o terapéuticas se beneficiarían del uso de un sistema de vector único tal como el AAV. Una de las principales limitaciones de sistemas de este tipo es la cantidad de información genética que se puede suministrar ( ~ 4,8kb para AAV), por encima de la cual la eficiencia del ensamblaje de partículas de AAV disminuye rápidamente. Además, el enfoque alternativo de utilizar el suministro agrupada de ARNgs transcritos independientemente es de naturaleza estocástica y menos reproducible que un sistema de vector único, especialmente en aplicaciones en donde la saturación diana puede no ser deseable o alcanzable. Muchos sistemas CRISPR microbianos endógenos se producen de forma natural como una matriz impulsada por un solo promotor de repeticiones directas intercaladas por protoespaciadores, que se transcriben como un solo transcrito antes de su procesamiento en ARNcr maduros individuales. Sin embargo, dado que el sistema de ARNgs quimérico funciona mucho más eficientemente que el dúplex ARNcr:ARNtracr nativo, las solicitantes buscaron desarrollar un sistema mediante el cual un único promotor pueda impulsar la expresión de múltiples ARNgs dispuestos en tándem, de manera similar a los loci CRISPR microbianos nativos.
Las solicitantes plantearon la hipótesis de que los armazones de ARNgs estructuralmente estables tendrían más probabilidades de plegarse en unidades independientes funcionalmente activas cuando se transcriben varias unidades juntas en el mismo transcrito. Para testar esto, las solicitantes comenzaron insertando un enlazador de 8 nt entre ARNgs adyacentes en tándem (Figura 47A); para cada uno de los armazones de ARNgs invariante (región no guía), utilizaron pares de ARNgs sp85 originales o armazones con horquillas distales estabilizadas (4558 y 4561). Sorprendentemente, las solicitantes observaron que cuando los ARNtgs fijaban como objetivo loci genómicos muy aproximados, que previamente mostraron inducir indeles con nickasa Cas9, los armazones estabilizados 4558 y 4561 fueron capaces de inducir indeles a frecuencias similares a las inducidas por ARNgs individuales co-transfectados (Figura 47B). Además, cuando se emparejan con la nucleasa Cas9 de tipo salvaje, los ARNtgs fueron igualmente capaces de inducir microdeleciones genómicas en el locus EMX1 humano a niveles equiparables a los ARNgs individuales multiplexados (Figura 47C).
Optimización de la arquitectura de armazón del ARNgs en tándem
Habiendo demostrado que los ARNgs transcritos en tándem son capaces de fijar como objetivo simultáneamente a dos loci genómicos, las solicitantes buscaron determinar el enlazador óptimo para conectar los armazones guía adyacentes. Las solicitantes diseñaron ARNtgs utilizando secuencias de enlazadoras de diferentes longitudes en un ensayo de microdeleción genómica con dos ARNgs. Dado que los protoespaciadores individuales endógenos están separados por secuencias de repetición directa de 36 nt de longitud, también testaron enlazadores que codificaban la mitad de una repetición directa o una repetición directa de longitud completa. Curiosamente, las solicitantes observaron que no había una fuerte correlación entre la longitud de la secuencia del enlazador y la eficiencia de la modificación del genoma, incluso en los casos en que no había un enlazador que separara el extremo distal del ARNgs de la secuencia guía del segundo (Figura 48). Sin embargo, parecía que la inclusión de secuencias de repetición directa afectaba negativamente la actividad, mientras que existe una modesta preferencia hacia la longitud del enlazador de 12 nt para la eficiencia de la escisión, aunque se necesitan más estudios para confirmar estas observaciones.
El procesamiento de ARNgs en tándem en subunidades individuales se produce en función de la posición
Una pregunta obvia para transcribir múltiples ARNgs bajo el mismo promotor es si los ARNgs en tándem co-transcritos se procesan o no en unidades individuales de armazón guía. Para responder a esto, las solicitantes diseñaron ARNgs en tándem que llevaban la misma guía en la primera o segunda posición (Figura 49A). Análisis posteriores de transferencia Northern de células transfectadas mostraron tres especies distintas de ARN, que corresponden a más de 200 nt (transcrito de ARN en tándem probablemente sin procesar), un transcrito de ~ 140 nt (consistente con la terminación transcripcional prematura señalada por el tracto poli-U en el segundo armazón) y un ARNgs completamente procesado de ~ 100 nt (Figura 49B).
Cuando el espaciador diana está en la primera posición en el ARNtsg, las solicitantes observaron abundantes ARNgs completamente procesados del mismo tamaño que los ARNgs transcritos individualmente en U6. Sin embargo, cuando se colocó en la segunda posición, solo había pequeñas cantidades de ARNgs completamente procesado. De acuerdo con esto, las solicitantes observaron que invertir el orden del espaciador en los ensayos de microdeleción podría alterar significativamente la eficiencia de la modificación genómica (datos no mostrados). Además, al testar otros pares de ARNgs que fijan como objetivo diferentes loci genómicos, las solicitantes observaron que la misma secuencia guía tiene típicamente una mejor actividad cuando se coloca en la primera posición que en la segunda (Figura 49C). Estas observaciones sugieren que, si bien la mayoría de los espaciadores son compatibles con un único transcrito guía, la secuencia del segundo espaciador puede tener más probabilidades de influir en la actividad del segundo ARNgs en el contexto de un ARNgs en tándem.
El emparejamiento de armazones de secuencia divergente da como resultado una mejor actividad del segundo espaciador
Para optimizar la actividad del segundo espaciador, las solicitantes idearon un ensayo para evaluar su actividad por citometría de fluorescencia. Al fijar como objetivo la segunda guía frente a Cas9 en un plásmido que expresa Cas9-2A-GFP, las solicitantes pueden evaluar la actividad de los indeles midiendo la fracción de fluorescencia y la intensidad de las células transfectadas (Figura 50A). Las solicitantes observaron que la transfección de células con ARNgs individuales que fijan como objetivo Cas9 o el co-suministro de ARNgs que fija como objetivo Cas9 con otro ARNgs redujo significativamente la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la fracción GFP-positiva transfectada con Cas9-2A-GFP, mientras que las células transfectadas con Cas9- 2A-EGFP y un ARNgs que no fija como objetivo Cas9 mantuvieron una MFI alta (Figura 50B).
Dado que cada uno de los armazones de ARNgs necesita plegarse en una estructura secundaria estable, las solicitantes plantearon la hipótesis de que una razón potencial para la disminución de la actividad del segundo espaciador puede deberse a interacciones de estructura secundaria no dentro de un solo armazón, sino entre los dos armazones de ARNgs. Las solicitantes suponían que el uso de armazones de ARNgs divergentes y mínimamente homólogos que tienen menos probabilidades de aparearse en bases entre sí podría reducir las interacciones entre los pares y ayudar al plegamiento individual. Para probar esta hipótesis, las solicitantes diseñaron un conjunto de doce armazones de ARNgs distintos, cada uno con la primera guía que fija como objetivo GRIN2B y el segundo que fija como objetivo Cas9, y realizaron una comparación por pares de todas las combinaciones de armazones. Los análisis de citometría de flujo posteriores identificaron cinco posibles armazones de ARNgs candidatos que redujeron significativamente tanto la MFI de la fracción GFP-positiva como el porcentaje general de células GFP-positivas; los niveles de reducciones son similares a los obtenidos al transfectar ARNgs que fija como objetivo Cas9 transcrita individualmente (Figura 50C). De acuerdo con la noción de que las interacciones entre armazones pueden estar interrumpiendo el plegamiento y el procesamiento de ARNgs adecuados, la mayoría de los cinco armazones mostraron una actividad relativamente pobre cuando se transcribieron en tándem con ARNgs altamente homólogos. De hecho, el análisis de alineamiento de la secuencia de los doce armazones demostró que los pares de armazones en tándem que mostraban la mayor actividad tenían la mayor divergencia de secuencia entre los dos ARNgs (Figura 51). En resumen, los ARNgs agrupados en tándem representan un enfoque potencialmente útil para el suministro conjunto de dos ARNgs en un único transcrito de ARN. Si bien algunas secuencias guía parecen funcionar bien en la segunda posición, la optimización de la arquitectura de ARNgs para maximizar la divergencia de secuencias entre armazones y mejorar la estabilidad estructural probablemente ayudará al procesamiento y la actividad de los ARNgs en tándem, una vez con PBS, tripsinizado y triturado en suspensión de células individuales y re-suspendido en tampón PBS complementado con FBS al 5% y EDTA 2 mM. La intensidad fluorescente se midió posteriormente utilizando el citómetro de flujo Accuri C6.
Discusión
Enfoque de doble mella para la edición del genoma con CRISPR
La especificidad es de suma importancia cuando se introducen alteraciones genómicas permanentes, especialmente para aplicaciones altamente sensibles tales como la terapia génica o estudios destinados a vincular las variantes genéticas causales con procesos biológicos o fenotipos de enfermedades. Las nucleasas de diseño, tales como ZFNs62 y TALENs63, han informado de actividades fuera de diana en más del 15%. Dado que ambos enfoques se basan en interacciones complejas y evolucionadas de proteína-ADN, la predicción u optimización de la especificidad a través de la modificación de proteínas puede resultar bastante desafiante. No obstante, se han realizado esfuerzos para aumentar la especificidad de TALEN, tal como extender el número de bases reconocidas por los monómeros de proteínas.
Las estrategias para mejorar la precisión de la fijación como objetivo del sistema CRISPR-Cas pueden optimizar cualquiera de sus dos componentes esenciales - la nucleasa Cas9 o ARNgs. Si bien el trabajo de las solicitantes ha demostrado que extender la longitud de la guía no mejora la especificidad, recientemente se informó que las longitudes de guía más cortas podrían disminuir significativamente la actividad no específica en sitios conocidos fuera de diana. Sin embargo, dado que la secuencia guía más corta también aumenta el número de posibles dianas similares en un genoma, queda por ver si esta estrategia disminuirá las frecuencias de mutación fuera de diana en todo el genoma. Aquí, las solicitantes han demostrado que la combinación de dos ARNgs con nickasas Cas9 es capaz de generar efectivamente DSBs, al tiempo que se evitan eventos mutagénicos que surgen de mutaciones de rotura de ADN de cadena sencilla, ya que típicamente se reparan con alta fidelidad.
En el contexto del suministro de moldes de reparación o reemplazo de genes, se ha demostrado previamente que el mellado de ADN de Cas9n con un solo ARNgs facilita la HDR sin generar indeles. Sin embargo, es sustancialmente menos eficiente al hacerlo en relación con Cas9 de tipo salvaje, y puede ser susceptible a las diferencias en la eficiencia de la HDR entre los diferentes tipos de células 48,52. Sin embargo, las solicitantes han demostrado que el uso de dos guías muy estrechamente aproximadas para fijar como objetivo la nickasa Cas9n al mismo locus genómico puede mediar en la HDR a altas eficiencias, al tiempo que se mantienen modificaciones fuera de diana a los niveles de fondo. Además, la caracterización de los parámetros de espaciamiento que gobiernan con éxito la fijación como objetivo de genes mediada por la doble nickasa Cas9 revela una ventana efectiva de más de 100 pb en la que los ARNgs que fijan como objetivo cadenas opuestas se pueden combinar para aplicaciones de doble mella, lo que permite un alto grado de flexibilidad en su diseño. Las solicitantes también han demostrado que las frecuencias de indeles mediadas por mellas dobles son equiparables a las de la modificación de Cas9 de tipo salvaje en múltiples loci tanto en células humanas como de ratón, confirmando la reproducibilidad de esta estrategia para la modificación del genoma de alta precisión.
Aunque la capacidad de potenciar mutaciones de indeles específicas y fijadas como objetivo permite en gran medida análisis funcionales por inactivación de genes, el uso de doble mella para fijar como objetivo con precisión la recombinación homóloga tiene implicaciones prácticas en la generación de sistemas y organismos modelo. Se ha informado que la inyección de blastocistos de la nucleasa Cas9 con ARNgs y el molde de la HDR puede generar ratones condicionales y reporteros en una sola etapa. Si bien este hallazgo agiliza enormemente un proceso laborioso y prolongado, la dosis relativamente alta de ARNm de Cas9 y el ARN guía inyectado en cada uno de los blastocistos puede convertirse en una preocupación real para las modificaciones fuera de diana. De hecho, el trabajo concurrente de colaboradores y otros miembros del laboratorio ya ha demostrado que el suministro de blastocistos análogo de Cas9n con dos ARNgs puede inducir una modificación de los genes fijada como objetivo eficiente en el locus Mecp2 de ratón. Otros estudios que investigan la eficiencia y la especificidad del enfoque de doble mella para facilitar la recombinación homóloga en el contexto de la generación del modelo de ratón serán inmensamente informativos.
Si bien se ha informado previamente sobre una importante mutagénesis fuera de diana para las nucleasas Cas9 en células humanas, el enfoque de doble mella proporciona una solución generalizable para la edición rápida y precisa del genoma. Incluso aunque la doble mella es conceptualmente similar a los sistemas de edición del genoma basados en ZFN y TALEN, que utilizan dominios de hemi-nucleasas para inducir DSB, la facilidad, flexibilidad y la mejora previsible del uso de un sistema de selección de ADN guiado por ARN aumenta significativamente su potencial de aplicaciones posteriores. Dado que se ha observado que el mellado cooperativo en sitios fuera de diana todavía puede producirse en el contexto de ZFN y TALEN, la caracterización significativa y exhaustiva de la verdadera actividad fuera de diana del genoma completo del sistema CRISPR-Cas sigue siendo un requisito previo para su mayor desarrollo como medio de edición eficiente del genoma de precisión ultra-alta. Aun así, las solicitantes creen que la doble mella con Cas9n representa un sólido paso adelante en el establecimiento del sistema CRISPR-Cas como una herramienta versátil para la manipulación del genoma tanto en la investigación científica básica como en medicina.
Optimización de ARNgs y creación de ARN guía en tándem
T ras la derivación inicial del ARNgs41 quimérico a partir de elementos de ARNtracr y ARNcr, el subsiguiente armazón 40,48 de ARNgs sp85 se desarrolló a partir de ARNtracr de longitud completa y se ha convertido en la arquitectura más comúnmente utilizada para aplicaciones de edición del genoma. Sin embargo, aparte de relativamente pocos estudios destinados a mejorar la estabilidad de ARNgs, todavía no se ha informado de un mapeo preciso de las relaciones estructura-función de ARNgs o de la optimización de la arquitectura de ARNgs a través del reemplazo de secuencia. Los estudios funcionales fijados como objetivo que realizaron las solicitantes han identificado un cierto número de regiones dentro del ARNgs que pueden ser susceptibles de modificaciones adicionales o la adición de grupos funcionales que pueden ampliar el intervalo de aplicaciones para el sistema CRISPR-Cas9. En particular, a pesar de haber testado una amplia gama de modificaciones del armazón, las solicitantes observaron pocos cambios que mejoran significativamente la actividad del indel de Cas9. El esclarecimiento adicional de la relación estructurafunción del ARNgs que interactúa con su nucleasa será informativo para realizar cambios más específicos tanto en el ARNgs como en Cas9 simultáneamente que pueden permitir mayores ganancias en la eficiencia en diana.
Se ha demostrado que la ribonucleasa RNAsaIII es necesaria para el procesamiento y la maduración del ARNcr después de la unión al ARNtracr en los sistemas CRISPR de tipo II. Sin embargo, el procesamiento en el extremo 5’ sigue siendo desconocido en gran medida en contextos tanto microbianos como eucarióticos. Un informe reciente investiga el procesamiento de Neisseria spp. El procesamiento de ARN de CRISPR identificó promotores transcripcionales ubicados en la repetición directa que precede a cada una de las secuencias espaciadoras que impulsa la transcripción de unidades de ARNcr individuales. Las solicitantes han observado previamente que el alargamiento de la secuencia espaciadora a 30 nt no da como resultado un ARNgs más largo: el análisis de la transferencia Northern muestra todavía la misma longitud del transcrito que con los ARNgs con secuencias guía de 20 nt. Además, la observación de las solicitantes de que las unidades de ARNgs pueden procesarse completamente - aunque a niveles bajos - desde la segunda posición del ARNtgs podría indicar la existencia de endonucleasas potenciales implicadas en la maduración final de ARNgs.
Los análisis de secuenciación de ARN han demostrado que los espaciadores ubicados en el extremo proximal del promotor de las matrices CRISPR tienden a ser de mayor abundancia que los ubicados más distalmente, lo que sugiere que la procesividad transcripcional puede ser un parámetro importante para determinar la eficiencia relativa de las unidades de ARNcr maduras. De acuerdo con los hallazgos de las solicitantes, este estudio también informa que determinadas secuencias de espaciadores predichas para formar interacciones secundarias con ARN adyacente a menudo están sub-representadas. Por lo tanto, mientras se desarrollan matrices CRISPR sintéticas, la consideración de la secuencia de espaciador es cada vez más importante.
Se han realizado una serie de estudios recientes que utilizan colecciones lentivirales de CRISPR-Cas9 para rastreos de inactivación de todo el genoma que han demostrado una mayor reproducibilidad y sensibilidad que las colecciones de ARNi análogas. La capacidad de suministrar simultáneamente más de un ARN guía en un solo vector sería particularmente interesante en el contexto de las metodologías de rastreo lentivirales, que abrirían la puerta tanto para la deleción de alto rendimiento como para los rastreos por pares. En el contexto de las colecciones de ARNhs comúnmente utilizadas, la propensión del lentivirus a recombinarse ha limitado la capacidad de realizar la expresión de múltiples ARN cortos a partir de un solo vector con el requisito de utilizar múltiples promotores únicos. Aunque queda por ver cuántos ARNgs se pueden agrupar de manera eficiente en tándem, este enfoque permite que un solo promotor impulse la expresión de al menos dos ARNgs. Además, el conocimiento de que los armazones de ARNgs de secuencia divergente pero estructuralmente similares pueden permanecer activos será útil en una diversidad de aplicaciones en donde la recombinación entre elementos estructurales ha sido una limitación.
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Tabla F. Lista de armazones deARNgs utilizados en este estudio
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Tabla G C ebadores utilizados p ara ensayos SUR VEYO R
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Tabla H. C ebadores utilizados para g en erar am plicones p ara NGS
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Si bien se han mostrado y descrito en esta memoria realizaciones preferidas de la presente invención, resultará obvio para los expertos en la técnica que estas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Ahora se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en esta memoria en la puesta en práctica de la invención.
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que se produce de forma no natural o modificada para la expresión en una célula, que comprende: un único polinucleótido que comprende secuencias para la expresión de dos o más guías del sistema CRISPR-Cas9 de un solo promotor, en donde cada una de las guías del sistema es un ARN quimérico (ARNqui) y comprende de 5’ a 3' una secuencia guía que se hibrida con una diana de ADN en un locus de interés, una secuencia tracr mate y una secuencia tracr, y en donde la secuencia tracr de un primer ARNqui está enlazada a la secuencia guía de un segundo ARNqui por una secuencia de enlazador.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la secuencia de enlazador comprende al menos 5 nucleótidos, preferiblemente al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente al menos 20 nucleótidos, o en donde el enlazador tiene 8 o 12 nucleótidos.
3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende, además, una Cas9 o una secuencia de polinucleótidos optimizada en codones que codifica la Cas9.
4. La composición de la reivindicación 3, en donde Cas9 comprende una o más secuencias de localización nuclear.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en donde la Cas9 es SaCas9 o SpCas9.
6. La composición de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la Cas9 es una nickasa.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde la Cas9 comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, preferiblemente en donde la una o más mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y D986A de SpCas9, o posiciones correspondientes en otras Cas9, y lo más preferiblemente en donde la Cas9 tiene la mutación D10A.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera secuencia guía es capaz de dirigir la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía es capaz de dirigir la escisión de la otra cadena cerca de la segunda secuencia diana y las secuencias guía primera y segunda están configuradas para generar un colgante en 5'.
9. La composición de la reivindicación 8, en donde:
(a) el colgante en 5’ es a lo sumo de 200 pares de bases, o es a lo sumo de 100 pares de bases, o es a lo sumo de 50 pares de bases; o
(b) el colgante en 5’ es al menos de 26 pares de bases, o es al menos 30 pares de bases, o es de 34-50 pares de bases.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera secuencia guía es capaz de dirigir la escisión de una cadena del dúplex de ADN cerca de la primera secuencia diana y la segunda secuencia guía es capaz de dirigir la escisión de la otra cadena cerca de la segunda secuencia diana y las secuencias guía primera y segunda están configuradas para generar un colgante en 3'.
11. La composición de la reivindicación 10, en donde:
(a) el colgante en 3’ es a lo sumo de 150 pares de bases, o es a lo sumo de 100 pares de bases, o es a lo sumo de 25 pares de bases; o
(b) el colgante en 3’ es al menos de 10 pares de bases, o es al menos de 15 pares de bases.
12. Un método para modificar un locus genómico de interés en una célula, o para modificar un organismo no humano, o para modificar un dúplex de ADN en un locus de interés en una célula, comprendiendo el método suministrar la composición que se produce de forma no natural o modificada que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
en el que el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia practicada en el cuerpo humano o animal, y
en el que el método no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
13. El método de la reivindicación 12, en el que el único polinucleótido que comprende secuencias para la expresión de dos o más guías del sistema CRISPR-Cas9 de un único promotor se proporciona como una primera secuencia de ADN, y en el que la composición comprende una secuencia de polinucleótidos optimizada en codones que codifica la Cas9 y el polinucleótido se proporciona como una secuencia de ADN,
en el que cada una de la primera secuencia de ADN y la segunda secuencia de ADN se proporciona en un vector.
14. El método de la reivindicación 13, en el que cada una de la primera secuencia de ADN y la segunda secuencia de ADN se proporciona en el mismo o en un vector diferente.
15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en terapia.
16. Una célula huésped que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la célula huésped no es una célula germinal humana ni un embrión humano.
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