CN112899306B - Crispr系统及其在构建gabrg2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用 - Google Patents

Crispr系统及其在构建gabrg2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪GABRG2基因编辑的CRISPR/cas9系统，包含序列如SEQ ID NO.2所示的Cas9高效表达载体pKG‑GE3和针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体，该载体以序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达序列如SEQ ID NO.35所示的gRNA。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞 中的应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用。
背景技术
抑郁症(Depression)又称抑郁障碍(Mood disorder)，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。
癫痫(Epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍等症状。癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，其中50％～60％的患者经2～5年的治疗可以痊愈，患者可以和正常人一样地工作和生活。癫痫的发病机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一类重要的中枢和外周神经系统的内源性神经递质,在维持大脑的兴奋-抑制平衡中起到重要作用。已有研究表明，GABA能神经元(以GABA为递质的神经细胞)活动不足与焦虑、重度抑郁(Major depressivedisorder,MDD)和失眠等疾病相关，磁共振波谱研究也表明抑郁症患者脑内、脑脊液、血浆中GABA水平显著下降,抗抑郁药物可使之显著升高。GABA有三类受体亚型，GABAA(GABAARs)和GABAC(GABACRs)是离子型受体(也称为配体-门控离子通道)，而GABAB(GABABRs)是代谢型受体(也称G-蛋白藕联受体)。GABA通常与GABAA和GABAB两类受体相结合，其中GABAA作为快速抑制性突触传递的主要介质，其亚基突变可引起抑郁、焦虑、癫痫等疾病。GABAA受体通常由2个α亚基、2个β亚基和1个γ或δ亚基组装形成异戊二烯，构成氯离子通道，其中γ2亚基(GABRG2)对于GABAA受体转运和突触功能具有重要的意义。γ2亚基合成后存在于内质网中，并与其他亚基寡聚化，进一步组装成五聚体受体，只有正确组装的受体才能通过内质网进入反式高尔基体和内体，最终到达细胞膜和突触，从而构成氯离子通道发挥抑制作用，而没有到达细胞膜和突触的受体亚基则没有此功能。GABRG2基因突变通过影响受体蛋白在细胞内的正确折叠和转运以及降解和聚集等过程，降低了通道功能，可引起包括重度抑郁、Dravet综合征型癫痫、LGS型癫痫等疾病。
本发明基于GABRG2基因突变开发了克隆猪核移植供体细胞系，后期通过细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，再通过活体猪表型确定抑郁症系和癫痫系，可用于进行抑郁症或癫痫症的发病机制研究，进一步为相关药物的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类相关疾病提供有力的实验手段。
基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于GABRG2基因编辑的CRISPR系统。
本发明的另一目的是提供一种用于GABRG2基因编辑的gRNA表达载体。
本发明的又一目的是提供CRISPR系统的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于GABRG2基因编辑的CRISPR系统，包含Cas9表达载体和针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体的全序列如SEQ ID NO.2所示。
作为本发明的一种优选，针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的进一步优选，该表达载体表达SEQ ID NO.35所示的gRNA，gRNA靶点如SEQ ID NO.17所示。
作为本发明的更进一步优选，所述的针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体由SEQIDNO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。
作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。
一种重组细胞，由本发明所述的CRISPR系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
本发明所述的重组细胞在构建GABRG2基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建GABRG2基因敲除所致的抑郁症或癫痫症克隆猪中的应用。
针对猪GABRG2基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.34所示。
一种针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体，该表达载体表达SEQ ID NO.35所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的gRNA表达载体优选由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。
本发明所述的CRISPR系统、所述的gRNA表达载体在构建猪GABRG2基因突变的猪重组细胞中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。
(3)本发明针对GABRG2基因的不同靶点gRNA设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。采用本发明改造的Cas9系统进行基因编辑，得到的GABRG2基因编辑单细胞克隆的比率为45％，获得纯合突变的概率为25％，优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。
(4)利用本发明所得到的纯合突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。
图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。
图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。
图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。
图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。
图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。
图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组DNA为模板分别采用
GABRG2-E8g-F75/GABRG2-E8g-R541(组1)、GABRG2-E8g-F75/GABRG2-E8g-R582(组2)、GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R541(组3)、GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582(组4)组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组DNA为模板采用
GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图12为实施例4中步骤4.3.4以基因组DNA为模板采用
GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图13为实施例5中步骤5.4.4以基因组DNA为模板采用
GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图14为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。
图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型的示例性测序峰图。
图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。
图17为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型的示例性测序峰图。
具体实施方式
实施例1、质粒的构建
1.1构建质粒pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)
原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO.1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO.1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
质粒pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQIDNO.2所示，质粒图谱如图5所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
pKG-GE3质粒构建方法如下：
(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列
质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO.4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。
(2)改造启动子及增强子
对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO.5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。
(3)Cas9基因N端增加NLS序列
将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO.6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。
(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals
以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signals的片段(SEQ ID NO.7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。
SEQ ID NO.2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO.2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。
1.2构建pKG-U6gRNA载体
来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和gRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO.8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO.3)，SEQ ID NO.3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。所构建的pKG-U6gRNA载体图谱如图6。
实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
2.1靶点gRNA设计及构建
2.1.1使用Benchling对RAG1基因进行靶点gRNA设计
RAG1-g4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.9)
合成针对上述RAG1基因靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：
RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.10)
RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.11)
RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。
2.1.2设计用于扩增和检测包含RAG1 gRNA靶点片段的引物
RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO.12)
RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO.13)
2.1.3将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；
2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；
3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA Oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：
95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；
4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min
Figure GDA0004052094700000081
37℃反应60min；
5)转化
按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。
2.1.4gRNA载体构建
1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO.14所示的RAG1-gRNA4。
2.1.5gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。
2.2猪原代成纤维细胞制备
2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除外部组织，75﹪酒精浸泡30-40s；
2.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；
其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。
2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL 0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；
2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。
其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基
(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。
2.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；
2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，使用1mL完全培养基重悬细胞以备下一步核转染实验。
2.3质粒配比优化
2.3.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
2.3.2共转染操作方法
使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon)与Neon TM transfection system电转仪进行转染实验。
1)按照上述分组配制电转反应液，混匀过程中注意切勿产生气泡；
2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；
3)吸取10μL细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL EBuffer；
5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)的完全培养液；
6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；
7)电转后6-12h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
2.3.3基因编辑效率分析
提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。
2.4质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
2.4.1共转染分组情况
RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pX330摩尔比为3:1。
RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
2.4.2共转染操作方法
同本实施例中2.3.2。
2.4.3基因编辑效率分析
提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3GABRG2基因靶点gRNA的设计及构建
3.1基因组DNA的提取
使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01)分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。
3.2GABRG2基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
3.2.1猪GABRG2基因信息
γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基(gamma-aminobutyric acid type A receptorsubunit gamma2)；位于16号染色体；GeneID为100516405，Sus scrofa。猪GABRG2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。已有研究结果表明GABRG2对于GABAA受体转运和突触功能具有重要的意义，在猪基因组DNA中，GABRG2基因具有11个外显子，其中第8外显子序列(含部分第7内含子和部分第8内含子序列)如SEQ ID NO.16所示。
3.2.2GABRG2基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计
根据查到的猪GABRG2基因组序列
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010458.4？report＝genbank&from＝61441622&to＝61543375&strand＝true)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品GABRG2基因外显子8的位点。
使用Oligo7软件进行引物设计，设计结果如下：
GABRG2-E8g-JDF100：TATTCGTGGACAAAGTGAAAG
GABRG2-E8g-JDR582：CCAAACTCACACATTCCAATT
GABRG2-E8g-JDF75：TGATACATGGTAGGCAGACAA
GABRG2-E8g-JDR541：TTAAAGCTCAGCCTATAGACT
3.2.3GABRG2基因组PCR扩增引物筛选
使用猪(雌性1#)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游和两条下游组合，Max酶(Vazyme公司货号：P505)进行PCR，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1：GABRG2-E8g-F75/GABRG2-E8g-R541；组2：GABRG2-E8g-F75/GABRG2-E8g-R582；组3：GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R541；组4GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582；优选GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582引物对进行目的片段扩增。
3.2.4 18只猪GABRG2基因片段PCR扩增
分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582，Max酶进行GABRG2基因组片段的扩增，产物(482bp)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。
3.2.5GABRG2基因序列保守性分析
以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的GABRG2基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。
3.3靶点gRNA设计及构建
3.3.1使用Benchling进行靶点gRNA设计
设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：
https://benchling.com/
GABRG2基因敲除靶点设计如下：
GABRG2-E8-g1：CAGCAACCGGAAACCAAGCA(SEQ ID NO.17)
GABRG2-E8-g2：GGTGCCATACTCCACCAAAG(SEQ ID NO.18)
GABRG2-E8-g3：CTGTGACATAGGAGACCTTG(SEQ ID NO.19)
GABRG2-E8-g4：GTTGCTGACAAAATAATGCA(SEQ ID NO.20)
GABRG2-E8-g5：CCACCCTCAGCACCATTGCC(SEQ ID NO.21)
GABRG2-E8-g6：GGTCTCCTATGTCACAGCGA(SEQ ID NO.22)
合成的GABRG2基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：
GABRG2-E8-g1S：caccgCAGCAACCGGAAACCAAGCA(SEQ ID NO.23)
GABRG2-E8-g1A：aaacTGCTTGGTTTCCGGTTGCTGc(SEQ ID NO.24)
GABRG2-E8-g2S：caccGGTGCCATACTCCACCAAAG(SEQ ID NO.25)
GABRG2-E8-g2A：aaacCTTTGGTGGAGTATGGCACC(SEQ ID NO.26)
GABRG2-E8-g3S：caccgCTGTGACATAGGAGACCTTG(SEQ ID NO.27)
GABRG2-E8-g3A：aaacCAAGGTCTCCTATGTCACAGc(SEQ ID NO.28)
GABRG2-E8-g4S：caccGTTGCTGACAAAATAATGCA(SEQ ID NO.29)
GABRG2-E8-g4A：aaacTGCATTATTTTGTCAGCAAC(SEQ ID NO.30)
GABRG2-E8-g5S：caccgCCACCCTCAGCACCATTGCC(SEQ ID NO.31)
GABRG2-E8-g5A：aaacGGCAATGGTGCTGAGGGTGGc(SEQ ID NO.32)
GABRG2-E8-g6S：caccGGTCTCCTATGTCACAGCGA(SEQ ID NO.33)
GABRG2-E8-g6A：aaacTCGCTGTGACATAGGAGACC(SEQ ID NO.34)
GABRG2-E8-g1S、GABRG2-E8-g1A、GABRG2-E8-g2S、GABRG2-E8-g2A、GABRG2-E8-g3S、GABRG2-E8-g3A、GABRG2-E8-g4S、GABRG2-E8-g4A、GABRG2-E8-g5S、GABRG2-E8-g5A、GABRG2-E8-g6S、GABRG2-E8-g6A均为单链DNA分子。
3.3.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
同实施例2中2.1.3。
3.3.3gRNA载体构建
1)将合成的GABRG2-E8-g1S和GABRG2-E8-g1A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)。质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)将会表达SEQ ID NO.35所示的GABRG2-E8-gRNA1。
2)将合成的GABRG2-E8-g2S和GABRG2-E8-g2A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g2)。质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g2)将会表达SEQ ID NO.36所示的GABRG2-E8-gRNA2。
3)将合成的GABRG2-E8-g3S和GABRG2-E8-g3A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g3)。质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g3)将会表达SEQ ID NO.37所示的GABRG2-E8-gRNA3。
4)将合成的GABRG2-E8-g4S和GABRG2-E8-g4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g4)。质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g4)将会表达SEQ ID NO.38所示的GABRG2-E8-gRNA4。
5)将合成的GABRG2-E8-g5S和GABRG2-E8-g5A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g5)。质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g5)将会表达SEQ ID NO.39所示的GABRG2-E8-gRNA5。
6)将合成的GABRG2-E8-g6S和GABRG2-E8-g6A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g6)。质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g6)将会表达SEQ ID NO.40所示的GABRG2-E8-gRNA6。
3.3.3gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)、pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g2)、pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g3)、pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g4)、pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g5)、pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g6)载体均构建成功。
实施例4GABRG2基因不同靶点gRNA的编辑效率比较
4.1猪原代成纤维细胞制备
同实施例2中2.2。
4.2使用构建好的gRNA质粒、Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞
4.2.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第五组：将质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g5)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g5)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g5)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第六组：将质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g6)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g6)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g6)与pKG-GE3摩尔比为3:1。
第七组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。
4.2.2共转染操作方法
同实施例2中2.3.2。
4.3GABRG2基因不同靶点gRNA的编辑效率分析
4.3.1分别向步骤4.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer 1μL
Enzyme 0.2μL
ddH2O 8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
4.3.2采用前述针对GABRG2基因E5引物GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582进行检测突变，PCR目的产物长度为482bp；
4.3.3使用常规PCR反应扩增GABRG2靶点基因；
4.3.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出GABRG2-E8-g1、GABRG2-E8-g2、GABRG2-E8-g3、GABRG2-E8-g4、GABRG2-E8-g5、GABRG2-E8-g6不同靶点的编辑效率依次为33％、1％、8％、6％、0、8％。结果表明，GABRG2-E8-g1编辑效率最高，为最优靶点。
实施例5构建GABRG2基因敲除的单细胞克隆株
5.1猪原代成纤维细胞制备
同实施例2中2.2。
5.2使用构建好的pKG-U6gRNA(GABRG2-E8-g1)质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞
同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
5.3GABRG2基因敲除单细胞克隆株的筛选
5.3.1将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到100μL完全培养基的96孔板中；
5.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；
5.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中；
5.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
5.4GABRG2基因敲除的重组细胞鉴定
5.4.1将步骤5.3收集在1.5mL离心管中得到的细胞用10μL KAPA2G裂解液裂解，提取细胞基因组DNA。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10X extract Buffer 1μL
Enzyme 0.2μL
ddH2O 8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；
5.4.2采用前述针对GABRG2基因E5引物GABRG2-E8g-F100/GABRG2-E8g-R582进行检测突变，PCR目的产物长度为482bp；
5.4.3使用PCR常规反应扩增GABRG2靶点基因；
5.4.4将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图13，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收PCR扩增产物并测序。
5.4.5将测序结果与GABRG2靶点信息进行比对，从而判断该重组细胞是否为GABRG2基因敲除。
编号为3、9、15、18的单细胞克隆的基因型为双等位相同变异的纯合突变型。编号11的单细胞克隆的基因型为双等位不同变异的纯合突变型。编号为5、6、10、20的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为1、2、4、7、8、12、13、14、16、17、19的单细胞克隆的基因型为野生型。得到的GABRG2基因编辑单细胞克隆的比率为45％。
示例性的测序比对结果如图14至图17，其中图14是克隆号为GABRG2-1的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图15是克隆号为GABRG2-15的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位相同变异的纯合突变型；图16是克隆号为GABRG2-5的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变；图17是克隆号为GABRG2-11的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位不同变异的纯合突变型。
通过具体序列的分析，GABRG2各单细胞克隆基因型如表1：
表1GABRG2基因敲除的从江香猪单细胞克隆基因型鉴定结果
Figure GDA0004052094700000171
Figure GDA0004052094700000181
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200
ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080
taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140
acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200
agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260
ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320
cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440
taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980
aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040
tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700
ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880
ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940
atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500
ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460
tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484
<210> 2
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200
cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920
caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
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aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580
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cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060
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ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
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ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660
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tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
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tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020
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gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500
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tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740
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ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300
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tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600
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cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960
taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
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agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280
ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340
tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520
gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640
tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700
ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760
accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880
ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120
<210> 4
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175
<210> 5
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300
tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360
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tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540
caccatggac tata 554
<210> 6
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120
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caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240
cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300
catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360
ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420
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<210> 7
<211> 2727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60
ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120
ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180
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cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680
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ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860
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cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160
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ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640
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<210> 8
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agttatggca gaactcagtg 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccgagtta tggcagaact cagtg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaccactga gttctgccat aactc 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccccatccaa agtttttaaa gga 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtggcagat gtcacagttt agg 23
<210> 14
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 15
<211> 475
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 15
Met Ser Ser Thr Asn Ile Trp Ser Thr Gly Ser Ser Val Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Pro Val Phe Ser Gln Lys Met Thr Val Trp Ile Leu Leu Leu Leu Ser
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Gln Lys Ser Asp Asp Asp Tyr Glu Asp
35 40 45
Tyr Ala Ser Asn Lys Thr Trp Val Leu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Ile Leu Asn Asn Leu Leu Glu Gly Tyr Asp Asn Lys
65 70 75 80
Leu Arg Pro Asp Ile Gly Val Lys Pro Thr Leu Ile His Thr Asp Met
85 90 95
Tyr Val Asn Ser Ile Gly Pro Val Asn Ala Ile Asn Met Glu Tyr Thr
100 105 110
Ile Asp Ile Phe Phe Ala Gln Thr Trp Tyr Asp Arg Arg Leu Lys Phe
115 120 125
Asn Ser Thr Ile Lys Val Leu Arg Leu Asn Ser Asn Met Val Gly Lys
130 135 140
Ile Trp Ile Pro Asp Thr Phe Phe Arg Asn Ser Lys Lys Ala Asp Ala
145 150 155 160
His Trp Ile Thr Thr Pro Asn Arg Met Leu Arg Ile Trp Asn Asp Gly
165 170 175
Arg Val Leu Tyr Thr Leu Arg Leu Thr Ile Asp Ala Glu Cys Gln Leu
180 185 190
Gln Leu His Asn Phe Pro Met Asp Glu His Ser Cys Pro Leu Glu Phe
195 200 205
Ser Ser Tyr Gly Tyr Pro Arg Glu Glu Ile Val Tyr Gln Trp Lys Arg
210 215 220
Ser Ser Val Glu Val Gly Asp Thr Arg Ser Trp Arg Leu Tyr Gln Phe
225 230 235 240
Ser Phe Val Gly Leu Arg Asn Thr Thr Glu Val Val Lys Thr Thr Ser
245 250 255
Gly Asp Tyr Val Val Met Thr Val Tyr Phe Asp Leu Ser Arg Arg Met
260 265 270
Gly Tyr Phe Thr Ile Gln Thr Tyr Ile Pro Cys Thr Leu Ile Val Val
275 280 285
Leu Ser Trp Val Ser Phe Trp Ile Asn Lys Asp Ala Val Pro Ala Arg
290 295 300
Thr Ser Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Leu Ser Thr
305 310 315 320
Ile Ala Arg Lys Ser Leu Pro Lys Val Ser Tyr Val Thr Ala Met Asp
325 330 335
Leu Phe Val Ser Val Cys Phe Ile Phe Val Phe Ser Ala Leu Val Glu
340 345 350
Tyr Gly Thr Leu His Tyr Phe Val Ser Asn Arg Lys Pro Ser Lys Asp
355 360 365
Lys Asp Lys Lys Lys Lys Asn Pro Leu Leu Arg Met Phe Ser Phe Lys
370 375 380
Ala Pro Thr Ile Asp Ile Arg Pro Arg Ser Ala Thr Ile Gln Met Asn
385 390 395 400
Asn Ala Thr His Leu Gln Glu Arg Asp Glu Glu Tyr Gly Tyr Glu Cys
405 410 415
Leu Asp Gly Lys Asp Cys Ala Ser Phe Phe Cys Cys Phe Glu Asp Cys
420 425 430
Arg Thr Gly Ala Trp Arg His Gly Arg Ile His Ile Arg Ile Ala Lys
435 440 445
Met Asp Ser Tyr Ala Arg Ile Phe Phe Pro Thr Ala Phe Cys Leu Phe
450 455 460
Asn Leu Val Tyr Trp Val Ser Tyr Leu Tyr Leu
465 470 475
<210> 16
<211> 1500
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 16
cctggcatga ggatgttttc agtaaatatt acttattatt tctgagatat tttttctttg 60
ttaagtcttt aaagaatttg tccatcagaa cataccactc acacacaacc cacctcctct 120
atttaacata tttaaatgat ttctccttgc actttgaata aaatgcaaac tcctgtgcat 180
gttctgcatg atctaacgtc tatttatttc cctagcatca ccttgattcc cccacccatc 240
ccaagatgcc aggtattcta aaaattcaaa aacaagtagg tttccctttg tcagaatttc 300
cctttaattt atttagtgct aattgtccaa agattggttt cttctaattt catagctttg 360
cctctcacta aaatataaga gacatatgga cagggaccat gtctatttta tttctcagca 420
catattcagc acatttccca gcatacacag taaatgatac atggtaggca gacaatatgt 480
attcgtggac aaagtgaaag gagttatgcc tcctttcctg acaccgaggt tgcctcttag 540
atgttgcaaa acacgtcatc tgatttgctg atgtggtcac atgatctgtt ttattgtgcc 600
ttcctccagg gataaccact gtcctgacaa tgaccaccct cagcaccatt gcccggaagt 660
cgctccccaa ggtctcctat gtcacagcga tggatctctt tgtatctgtt tgcttcatct 720
ttgtcttctc cgctttggtg gagtatggca ccctgcatta ttttgtcagc aaccggaaac 780
caagcaagga caaagacaaa aagaagaaaa accctgtatg tatcacttct cactgggacc 840
tttgaaattt ttatgcagaa agatcacctg attttgtttt gttttggtct tgcttagcca 900
gtctataggc tgagctttaa aaccttgggc cccatgatga aattggaatg tgtgagtttg 960
gccaggccat tatggattca atatagccat cagttacttg gaaattactt gttattcatt 1020
aaggcagact ctttcccttt gtatttcatt gggaatagaa aaatggctga aaaatgcatt 1080
catattctga tcaatattat tttaggtttc attgattttc atctttctgc atctttacta 1140
aaatattttt aaattattga tgattcaaat tatgtttttc caaggctttc cattaggaag 1200
ccacaggttc ttaaagtttc agagatcaca atttgcaaat aacttaatgt gtgggtgtgt 1260
gctaccatag gacttctact ggttttatac tcaaaatgca ttttttaaat aatggtttac 1320
atactgtttg ggcaagttac ttagtctccc tgtgttttca ttttcacata tataaaatga 1380
gtattataaa aatatgttct tttacgaggt tgctgtgaga aataaatgta gcaatgtatg 1440
taaaaagcat tatacactac ctttcattta tagttgataa tgactgttga tgatttatac 1500
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagcaaccgg aaaccaagca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtgccatac tccaccaaag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgtgacata ggagaccttg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttgctgaca aaataatgca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccaccctcag caccattgcc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggtctcctat gtcacagcga 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caccgcagca accggaaacc aagca 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaactgcttg gtttccggtt gctgc 25
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caccggtgcc atactccacc aaag 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaacctttgg tggagtatgg cacc 24
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caccgctgtg acataggaga ccttg 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaaccaaggt ctcctatgtc acagc 25
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caccgttgct gacaaaataa tgca 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaactgcatt attttgtcag caac 24
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caccgccacc ctcagcacca ttgcc 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaacggcaat ggtgctgagg gtggc 25
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caccggtctc ctatgtcaca gcga 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaactcgctg tgacatagga gacc 24
<210> 35
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagcaaccgg aaaccaagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 36
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggugccauac uccaccaaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 37
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cugugacaua ggagaccuug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 38
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
guugcugaca aaauaaugca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 39
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ccacccucag caccauugcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 40
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggucuccuau gucacagcga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (4)

1.一种用于GABRG2基因编辑的CRISPR/cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体的全序列如SEQ ID NO.2所示；所述的针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；该表达载体表达SEQ ID NO.35所示的gRNA，gRNA靶点如SEQ ID NO.17所示；载体骨架pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为3:1。
2.一种敲除猪GABRG2基因的猪重组细胞，其特征在于由权利要求1所述的CRISPR/cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
3.权利要求2所述的重组细胞在构建GABRG2基因敲除的克隆猪中的应用。
4.权利要求1所述的CRISPR/cas9系统在构建猪GABRG2基因敲除的猪重组细胞中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106062197A (zh) * 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
WO2019191341A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid-based therapeutics
CN110885818A (zh) * 2018-09-11 2020-03-17 河南农业大学 基于aav病毒的基因编辑表达盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106062197A (zh) * 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
WO2019191341A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid-based therapeutics
CN110885818A (zh) * 2018-09-11 2020-03-17 河南农业大学 基于aav病毒的基因编辑表达盒

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model;Hu等;《Mol Ther Methods Clin Dev》;20180630;第9卷;第204页图1 *
analysis of an aggrecan knockout cell line.《Bone》.2014,第69卷第118-125页. *
GABRG2 Deletion Linked to Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus Affects the Expression of GABAA Receptor Subunits and Other Genes at Different Temperatures;Xinxiao Li等;《Neuroscience》;20200508;第438卷;摘要，第117页右栏第2段 *
Xinxiao Li等.GABRG2 Deletion Linked to Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus Affects the Expression of GABAA Receptor Subunits and Other Genes at Different Temperatures.《Neuroscience》.2020,第438卷第116-136页. *
Yang等."CRISPR/Cas9 mediated generation of stable chondrocyte cell lines with targeted gene knockouts *
γ-氨基丁酸B型受体基因与癫痫关系研究进展;和姬苓;《包头医学院学报》;20111015(第05期);第112-113页 *

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