CN113046388B - 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于猪APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪APOE和LDLR基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA‑eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO载体。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将猪的APOE和LDLR基因敲除，制备出APOE和LDLR基因双敲除的猪重组细胞，为进一步的通过体细胞克隆技术生产动脉粥样硬化克隆猪奠定坚实基础，进而为动脉粥样硬化疾病的治疗及发病机制的研究提供有力的实验工具。

Description

用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其在构建动脉粥样硬化猪核移植供体细胞中的应用。
背景技术
心血管疾病是目前我国居民所有疾病中的致死首因，据报道，心血管疾病死亡占居民疾病死亡构成的40％以上，远高于癌症及其他疾病。动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢异常和炎性反应为动脉粥样硬化的主要病变基础。
载脂蛋白E(APOE)是一个主要的乳糜微粒的辅基蛋白，可以与肝脏细胞或者周围细胞上的受体结合。APOE基因的缺陷可能导致由于乳糜微粒和极低密度脂蛋白无法被正常清除而引发血清胆固醇和甘油三酯升高。低密度脂蛋白受体(LDLR)主要作用是降解低密度脂蛋白LDL，这是一种受体介导的内吞作用。LDL被细胞膜表面有被小窝内的LDLR识别并结合，然后与膜逐渐分离形成内吞囊泡；LDL经内吞作用后，在溶酶体酶的作用下，被快速降解为游离胆固醇、脂肪酸和氨基酸。APOE和LDLR的异常均会造成脂质代谢异常，这两个基因的异常已被广泛认为与人动脉粥样硬化的发生密切相关。因此，迫切需要开发出基于APOE和LDLR突变导致的动脉粥样硬化动物模型以尽快解开动脉粥样硬化发病机制谜团并为进一步的治疗奠定基础。目前，常用的动物模型为小鼠模型，但是小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。而猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。
该发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将猪的APOE和LDLR基因敲除，制备出APOE和LDLR基因双敲除的猪重组细胞，为进一步的通过体细胞克隆技术生产动脉粥样硬化克隆猪奠定坚实基础，进而为动脉粥样硬化的治疗等研究提供有力的实验工具。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术上的不足，提供一种用于APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
本发明的另一目的是提供用于APOE和LDLR基因编辑的gRNA及其表达载体。
本发明的又一目的是提供所述的CRISPR/Cas9系统在构建APOE和LDLR基因突变的猪重组细胞中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于猪APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪APOE和LDLR基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。
为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：
1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；
2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；
3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；
4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；
5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：
1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；
2)启动子和增强子：EF1a启动子和CMV增强子；
3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；
6)转录终止信号：bGH polyA signal；
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。
作为本发明的一种优选,针对猪APOE和LDLR基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的一种优选,针对猪APOE基因的gRNA表达载体，表达SEQ ID NO.23所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.19所示；针对猪LDLR基因的gRNA表达载体表达SEQ IDNO.42所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.38所示。
作为本发明的进一步优选,所述的针对猪APOE基因的gRNA表达载体由SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪LDLR基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。
本发明所述的CRISPR/Cas9系统在构建APOE和LDLR基因突变的猪重组细胞中的应用。
一种重组细胞，由本发明所述的用于猪APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
本发明所述的重组细胞在构建APOE和LDLR基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建APOE和LDLR基因敲除的动脉粥样硬化克隆猪中的应用。
针对猪APOE基因的gRNA表达载体，表达SEQ ID NO.23所示的gRNA，其靶点如SEQID NO.19所示。
作为本发明的一种优选，所述的针对猪APOE基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。
针对猪LDLR基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.42所示的gRNA，其靶点如SEQ IDNO.38所示。
作为本发明的进一步优选,所述的针对猪LDLR基因的gRNA表达载体由SEQ IDNO.46和SEQ ID NO.47所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本也高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。
而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制方面等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。
(2)本发明针对猪APOE和LDLR基因分别设计了四个gRNA，从中筛选高效gRNA后再进行预设靶点的敲除，可有效降低后期鉴定筛选的工作量，并可直接用PCR产物测序来检测基因编辑效率。
(3)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。
(4)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型[纯合突变(包括双等位基因相同变异的突变和双等位基因不同变异的突变)、杂合突变或野生型]，获得纯合突变的概率为20％～40％，大大优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。
(5)利用本发明所得到的纯合突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期，并节省人力、物力、财力。
本发明为通过基因编辑手段获得动脉粥样硬化模型猪奠定了坚实的基础，将有助于研究并揭示由APOE和LDLR基因突变引起的动脉粥样硬化发病机制，进一步的可用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类因APOE和LDLR基因突变导致的动脉粥样硬化提供有力的实验手段。本发明对于动脉粥样硬化药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。
图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。
图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。
图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。
图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图8为质粒配比优化时的测序结果。
图9为质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较时的测序结果。
图10为实施例3中以18只猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增后的电泳图。
图11为实施例3的步骤四中的测序峰图。
图12为实施例4中以18只猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增后的电泳图。
图13为实施例4的步骤四中的测序峰图。
图14为实施例5中得到的APOE基因编辑单细胞克隆的PCR产物电泳图。
图15为实施例5中得到的LDLR基因单细胞克隆的PCR产物电泳图。
图16为编号APOE-1的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图17为编号为APOE-3的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图18为编号为APOE-10的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图19为编号为APOE-8的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图20为编号LDLR-1的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图21为编号为LDLR-2的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图22为编号为LDLR-13的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
图23为编号为LDLR-8的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，除毛，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液。
实施例1、质粒的制备
1.1制备质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)
原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO：1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(图5)，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQ ID NO：2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
pKG-GE3质粒构建方法如下：
(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列
质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。
(2)改造启动子及增强子
对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。
(3)Cas9基因N端增加NLS序列
将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。
(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals
以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signals的片段(SEQ ID NO：7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。
1.2构建pKG-U6gRNA载体
来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO：8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：3)，SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA(图7)，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。所构建的pKG-U6gRNA载体图谱如图6。
实施例2、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
选择位于RAG1基因的高效gRNA靶点：
RAG1-gRNA4的靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：9)。
用于扩增和检测包含靶点的片段的引物如下：
RAG1-nF126：5’-CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA-3’(SEQ ID NO：10)；
RAG1-nR525：5’-TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：11)
从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。
一、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。分别合成RAG1-4S和RAG1-4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
RAG1-4S：5’-caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：12)；
RAG1-4A：5’-aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc-3’(SEQ ID NO：13)。
RAG1-4S和RAG1-4A均为单链DNA分子。
二、质粒配比优化
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：1：1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：2：1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：3：1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。
电泳后回收目的条带并进行测序，测序结果见图8。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第三组的基因编辑效率依次为9％、53％、66％。第四组不发生基因编辑。结果表明，第三组编辑效率最高，确定单gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。
三、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
1、共转染
RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。
RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。RAG1-B组不发生基因编辑。RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率依次为28％、68％。测序结果示例性峰图见图9。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3、用于APOE基因敲除的靶点筛选
猪APOE基因信息：编码apolipoprotein E蛋白；位于猪6号染色体；
GeneID为397576，Sus scrofa。猪APOE基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSIONNO.NP_999473.1(linear CON 12-JAN-2018)所示。基因组DNA中，猪APOE基因具有3个外显子，其中第2外显子及其上下游各400bp序列如SEQ ID NO：14所示，其编码的蛋白质片段如SEQ ID NO：15所示。
一、APOE基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。
分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪APOE基因第2外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的APOE和LDLR基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：APOE-E2-F/APOE-E-R。采用APOE-E2-F/APOE-E2-R组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图10。
APOE-E2-F：5’-ACCTGATGGCTGTGAACTGG-3’(SEQ ID NO：16)；
APOE-E2-R：5’-GGCGACAAGGACAGAAGGAA-3’(SEQ ID NO：17)。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
4个靶点分别如下：
sgRNAAPOE-E2-g1靶点：5’-GTAATCCCAGAAGCGGCCCA-3’(SEQ ID NO：18)；
sgRNAAPOE-E2-g2靶点：5’-TGTGGTGGGAGGAGCCCAAG-3’(SEQ ID NO：19)；
sgRNAAPOE-E2-g3靶点：5’-CCTGTCTGACCAAGTGCAGG-3’(SEQ ID NO：20)；
sgRNAAPOE-E2-g4靶点：5’-CACCACACGTGCACCTCCGG-3’(SEQ ID NO：21)。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成APOE-E2-gRNA1-S和APOE-E2-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g1)。质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g1)表达SEQ ID NO：22所示的sgRNAAPOE-E2-g1。
分别合成APOE-E2-gRNA2-S和APOE-E2-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g2)。质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g2)表达SEQ ID NO：23所示的sgRNAAPOE-E2-g2。
分别合成APOE-E2-gRNA3-S和APOE-E2-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g3)。质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g3)表达SEQ ID NO：24所示的sgRNAAPOE-E2-g3。
分别合成APOE-E2-gRNA4-S和APOE-E2-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g4)。质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g4)表达SEQ ID NO：25所示的sgRNAAPOE-E2-g1。
APOE-E2-gRNA1-S：5’-caccGTAATCCCAGAAGCGGCCCA-3’(SEQ ID NO：26)；
APOE-E2-gRNA1-A：5’-aaacTGGGCCGCTTCTGGGATTAC-3’(SEQ ID NO：27)；
APOE-E2-gRNA2-S：5’-caccGTGTGGTGGGAGGAGCCCAAG-3’(SEQ ID NO：28)；
APOE-E2-gRNA2-A：5’-aaacCTTGGGCTCCTCCCACCACAc-3’(SEQ ID NO：29)；
APOE-E2-gRNA3-S：5’-caccGCCTGTCTGACCAAGTGCAGG-3’(SEQ ID NO：30)；
APOE-E2-gRNA3-A：5’-aaacCCTGCACTTGGTCAGACAGGc-3’(SEQ ID NO：31)；
APOE-E2-gRNA4-S：5’-caccGCACCACACGTGCACCTCCGG-3’(SEQ ID NO：32)；
APOE-E2-gRNA4-A：5’-aaacCCGGAGGTGCACGTGTGGTGc-3’(SEQ ID NO：33)。
APOE-E2-gRNA1-S、APOE-E2-gRNA1-A、APOE-E2-gRNA2-S、APOE-E2-gRNA2-A、APOE-E2-gRNA3-S、APOE-E2-gRNA3-A、APOE-E2-gRNA4-S、APOE-E2-gRNA4-A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用APOE-E2-F和APOE-E2-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图11。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为19％、61％、12％、8％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第二组编辑效率最高，sgRNAAPOE-E2-g2的靶点为最优靶点。
实施例4、用于LDLR基因敲除的靶点筛选
猪LDLR基因信息：编码low density lipoprotein receptor蛋白；位于猪2号染色体；GeneID为396801，Sus scrofa。猪LDLR基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.XP_020936111.1(linear CON 12-JAN-2018)所示。基因组DNA中，猪LDLR基因具有3个外显子，其中第20外显子及其上下游各400bp序列如SEQ ID NO：34所示，其编码的蛋白质片段如SEQID NO：35所示。
一、LDLR基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。
分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪LDLR基因第2外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的LDLR和LDLR基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：LDLR-E3-F/LDLR-E-R。采用LDLR-E3-F/LDLR-E3-R组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图12。
LDLR-E3-F：5’-CAAGGCAGGTTGGTCTTCCTA-3’(SEQ ID NO：36)；
LDLR-E3-R：5’-GGGACCCCACTTACAACAGC-3’(SEQ ID NO：37)。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
4个靶点分别如下：
sgRNALDLR-E3-g1靶点：5’-GATAGGGGACTTTAGCTGTG-3’(SEQ ID NO：38)；
sgRNALDLR-E3-g2靶点：5’-TCCAAGACTCAGGAATGCAG-3’(SEQ ID NO：39)；
sgRNALDLR-E3-g3靶点：5’-ATAGGGGACTTTAGCTGTGG-3’(SEQ ID NO：40)；
sgRNALDLR-E3-g4靶点：5’-CAGGAATGCAGCGGTTGACA-3’(SEQ ID NO：41)。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成LDLR-E3-gRNA1-S和LDLR-E3-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g1)。质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g1)表达SEQ ID NO：42所示的sgRNALDLR-E3-g1。
分别合成LDLR-E3-gRNA2-S和LDLR-E3-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g2)。质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g2)表达SEQ ID NO：43所示的sgRNALDLR-E3-g2。
分别合成LDLR-E3-gRNA3-S和LDLR-E3-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g3)。质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g3)表达SEQ ID NO：44所示的sgRNALDLR-E3-g3。
分别合成LDLR-E3-gRNA4-S和LDLR-E3-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g4)。质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g4)表达SEQ ID NO：45所示的sgRNALDLR-E3-g1。
LDLR-E3-gRNA1-S：5’-caccGATAGGGGACTTTAGCTGTG-3’(SEQ ID NO：46)；
LDLR-E3-gRNA1-A：5’-aaacCACAGCTAAAGTCCCCTATC-3’(SEQ ID NO：47)；
LDLR-E3-gRNA2-S：5’-caccgTCCAAGACTCAGGAATGCAG-3’(SEQ ID NO：48)；
LDLR-E3-gRNA2-A：5’-aaacCTGCATTCCTGAGTCTTGGAc-3’(SEQ ID NO：49)；
LDLR-E3-gRNA3-S：5’-caccgATAGGGGACTTTAGCTGTGG-3’(SEQ ID NO：50)；
LDLR-E3-gRNA3-A：5’-aaacCCACAGCTAAAGTCCCCTATc-3’(SEQ ID NO：51)；
LDLR-E3-gRNA4-S：5’-caccgCAGGAATGCAGCGGTTGACA-3’(SEQ ID NO：52)；
LDLR-E3-gRNA4-A：5’-aaacTGTCAACCGCTGCATTCCTGc-3’(SEQ ID NO：53)。
LDLR-E3-gRNA1-S、LDLR-E3-gRNA1-A、LDLR-E3-gRNA2-S、LDLR-E3-gRNA2-A、LDLR-E3-gRNA3-S、LDLR-E3-gRNA3-A、LDLR-E3-gRNA4-S、LDLR-E3-gRNA4-A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用LDLR-E3-F和LDLR-E3-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图13。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为39％、22％、33％、15％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNALDLR-E3-g1的靶点为最优靶点。
实施例4、制备APOE和LDLR基因编辑单细胞克隆
从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。
1、共转染
将质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g2)、pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.47μg质粒pKG-U6gRNA(APOE-E2-g2):0.47μg质粒pKG-U6gRNA(LDLR-E3-g1)：1.06μg质粒pKG-GE3。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，用完全培养液洗涤，再用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单细胞至96孔板的不同孔中(每个孔1个细胞，每个孔中装有100μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。
4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中用于后续的基因型测序检测)。
5、取步骤4的6孔板，培养至细胞长至80％汇合度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
6、取步骤4的离心管，取细胞，提取基因组DNA，采用APOE-E2-F/APOE-E2-R和LDLR-E3-F/LDLR-E3-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照。电泳图分别见图14和图15。图14中的泳道编号与表1中的细胞编号一致，图15中的泳道编号表2中的细胞编号一致。
7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。
猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为野生型。如果某一单细胞克隆的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为杂合突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单细胞克隆的基因型为野生型。
APOE基因的编辑结果见表1。编号为8、11的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型。编号为10、15的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型。编号为3、4、9、12、17的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。得到基因编辑单细胞克隆的比率为45％。
示例性的测序比对结果见图16至图19。图16是编号为APOE-1的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为野生型。图17是编号为APOE-3的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为杂合突变型。图18是编号为APOE-10的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。图19是编号为APOE-8的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型。
表1APOE基因敲除单细胞克隆的基因型
Figure BDA0002904076570000171
Figure BDA0002904076570000181
LDLR基因的编辑结果见表2。编号为8、11、20的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型。编号为13的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型。编号为2、3、9、16的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。得到基因编辑单细胞克隆的比率为40％。
示例性的测序比对结果见图20至图23。图20是编号为LDLR-1的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为野生型。图21是编号为LDLR-2的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为杂合突变型。图22是编号为LDLR-13的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。图23是编号为LDLR-8的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型。
表2LDLR基因敲除单细胞克隆的基因型
Figure BDA0002904076570000182
Figure BDA0002904076570000191
8、完成步骤7后，挑选APOE和LDLR双基因纯合敲除的单细胞克隆
通过分析，编号为8、11的单细胞克隆为APOE基因纯合敲除且LDLR基因纯合敲除的单细胞克隆。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的CRISPR 系统及其应用
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200
ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080
taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140
acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200
agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260
ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320
cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440
taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980
aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040
tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700
ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880
ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940
atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500
ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560
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gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460
tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484
<210> 2
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300
tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360
gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540
caccatggac tata 554
<210> 6
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120
ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180
caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240
cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300
catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360
ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420
gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447
<210> 7
<211> 2727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60
ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120
ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360
acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900
gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960
tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020
ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080
agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140
acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200
tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260
agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320
tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380
tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440
tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500
cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680
tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740
ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860
cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920
ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980
ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040
cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160
gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220
gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280
agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340
ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700
tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727
<210> 8
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240
tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360
ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agttatggca gaactcagtg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccccatccaa agtttttaaa gga 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtggcagat gtcacagttt agg 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caccgagtta tggcagaact cagtg 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaccactga gttctgccat aactc 25
<210> 14
<211> 990
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 14
atcgggtgtt gctgtggctg tggtgcaggc tggcagctat cgcttccatc ggacccctcg 60
cctgggaact tccacgtatg ccactggtgc agccctaaaa gacaaacaaa caaaaacgaa 120
agaaagagaa aagaaaggaa agggggcttc tgtttctaat gcgttgttgc ctggcagggc 180
gtgagcatta gatacgtgtc agctgtgact agcgtgcacg gagcacacaa tccatgcttg 240
tccagtaatt agacaggctg ggtgtccttc cacccctccc tgcccaccag tgctctagag 300
aagcccaccc accggggctg ggggagcacc tgctctgtac caggtaccgt gtgctgggag 360
ggggcagagg acctgatggc tgtgaactgg ctcggtgcag gatgccggac agaggacgag 420
ccggggccgc cgccggaggt gcacgtgtgg tgggaggagc ccaagtggca gggcagccag 480
ccctgggagc aggccctggg ccgcttctgg gattacctgc gctgggtgca gtccctgtct 540
gaccaagtgc aggaggagct gctcagcacc aaggtcaccc aggaactgac gtaagtgccc 600
acccgactcc cgccgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcct gaccctcctg gcgaaccgtg 660
tgttctggac cctcaggctc cacccgtccg ggtttccttc tgtccttgtc gccaactctt 720
gggggtctgg gtctctgttt cttttttttc cttcttcctt ttttgggggg agtttacttt 780
ttcttttttc tttcatttga cttcatgtct tgctttcttt ccatcttgag ctcctgcctt 840
cgcctgtctc tgggtcagtc ttgccgtcct tgctgtctct gaatctctgg cacgtcctgg 900
ccatcgccag ctcaggagcc ctccttctcc ccctccccgc ccccgccctc tctgcgccca 960
gggagctgat agaggagagc atgaaggagg 990
<210> 15
<211> 317
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 15
Met Arg Val Leu Trp Val Ala Leu Val Val Thr Leu Leu Ala Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Thr Glu Asp Glu Pro Gly Pro Pro Pro Glu Val His Val Trp Trp
            20                  25                  30
Glu Glu Ser Lys Trp Gln Gly Ser Gln Pro Trp Glu Gln Ala Leu Gly
        35                  40                  45
Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Ser Leu Ser Asp Gln Val
    50                  55                  60
Gln Glu Glu Leu Leu Ser Thr Lys Val Thr Gln Glu Leu Thr Glu Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Glu Ser Met Lys Glu Val Lys Ala Tyr Arg Glu Glu Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Thr Gln Ala Arg Leu Ser Lys
            100                 105                 110
Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Val Gly Ala Asp Met Glu Asp Val
        115                 120                 125
Arg Asn Arg Leu Val Leu Tyr Arg Ser Glu Val His Asn Met Leu Gly
    130                 135                 140
Gln Thr Thr Glu Glu Leu Arg Ser Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Asn
145                 150                 155                 160
Val Arg Lys Arg Leu Val Arg Asp Thr Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu
                165                 170                 175
Ala Val Tyr Gln Ala Gly Leu Arg Glu Gly Ala Glu Arg Ser Val Ser
            180                 185                 190
Ala Leu Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Leu Arg
        195                 200                 205
Ala Ala Thr Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gln Pro Leu Arg Glu Arg Ala
    210                 215                 220
Glu Ala Trp Gly Gln Lys Leu Arg Gly Arg Leu Glu Glu Met Gly Ser
225                 230                 235                 240
Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Met Arg Asp Glu Leu Glu Glu Val
                245                 250                 255
Arg Thr Lys Val Glu Glu Gln Gly Ser Gln Leu Arg Leu Gln Ala Glu
            260                 265                 270
Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Gly Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp
        275                 280                 285
Met Arg Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Arg Met Gln Ser Ala Val
    290                 295                 300
Ser Ile Ser Ser Ser Thr Ser Ala Pro Ser Asp Asn Gln
305                 310                 315
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acctgatggc tgtgaactgg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggcgacaagg acagaaggaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtaatcccag aagcggccca 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtggtggga ggagcccaag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cctgtctgac caagtgcagg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccacacgt gcacctccgg 20
<210> 22
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
guaaucccag aagcggccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 23
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ugugguggga ggagcccaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 24
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccugucugac caagugcagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 25
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caccacacgu gcaccuccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caccgtaatc ccagaagcgg ccca 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaactgggcc gcttctggga ttac 24
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caccgtgtgg tgggaggagc ccaag 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aaaccttggg ctcctcccac cacac 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caccgcctgt ctgaccaagt gcagg 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaaccctgca cttggtcaga caggc 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caccgcacca cacgtgcacc tccgg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaacccggag gtgcacgtgt ggtgc 25
<210> 34
<211> 923
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 34
agagccacag caaggcagga tctgagccgt gtctgtgacc tacaccacaa ctcacagcaa 60
caccagatcc ttaacccact gagcaaggcc agggatcgaa cccgcaacct catggttcct 120
agtcagattc gttaaccact gagccaccat gggaactcct ataattttta ttttattaaa 180
taaaatgtaa aggggagctc gctactcact tttggctgct cccacagcat gcagaagttc 240
ccaggccagc gatggaaccc tagccacagc agtgacaatg ccagatcctt aaccattagg 300
ccaccaggga actccaaggt tttttccttt gcaaagccca gactggcaag gcaggttggt 360
cttcctatga gttaagggtc aatgctgttt tctcccacag tgtctgtcac ctgcaagata 420
ggggacttta gctgtggggg ccgtgtcaac cgctgcattc ctgagtcttg gaggtgtgac 480
ggtcagcagg actgcgagaa tggctcagat gaggaaggct gttgtaagtg gggtccctca 540
cctcatgggc catgggcctc agccacgtcc aagtgacccg accagattct ggtctgaggt 600
cagaatttgt tcctccagct gagagttcca caaagaaaca aggctgatag tttcagatgg 660
gaaggcatgt ggcagctggc tctttgattt tattcattat ttataatttc cttttcagct 720
atataaactt tttttttttt tttttttttt ttggccgcat ctatggcatg tggaaattcc 780
tgggccaggg atcaaacctg tgccacagca gtgacaaccc tggatcatta acccactgag 840
ccactgggga actcttgtat agacatgtct ttcatgaagt gaggctcttt aaaaaaacaa 900
aaacctctgg acaggttgta ata 923
<210> 35
<211> 877
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 35
Met Lys Ser Thr Gly Trp Val Leu Arg Trp Ala Val Ala Leu Leu Ile
1               5                   10                  15
Ala Ala Val Ala Ala Ala Val Glu Glu Lys Cys Gly Arg Asn Glu Phe
            20                  25                  30
Gln Cys Arg Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Ile Cys Asp Gly
        35                  40                  45
Asn Thr Glu Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Ser Leu Glu Thr Cys Met
    50                  55                  60
Ser Val Thr Cys Lys Ile Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65                  70                  75                  80
Arg Cys Ile Pro Glu Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gln Gln Asp Cys Glu
                85                  90                  95
Asn Gly Ser Asp Glu Glu Gly Cys Ser Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
            100                 105                 110
Glu Phe Arg Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ala Pro Lys Phe Val Cys
        115                 120                 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
    130                 135                 140
Thr Pro Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145                 150                 155                 160
Ile Pro Glu Leu Trp Ala Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
                165                 170                 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln His Cys Arg Ser His Ser Ser Ser Leu Pro
            180                 185                 190
Glu Arg Ser Asn Asn Pro Cys Ser Ala Leu Glu Phe His Cys His Ser
        195                 200                 205
Gly Glu Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys
    210                 215                 220
Lys Asp Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Asp Val Ala Thr Cys Arg Pro
225                 230                 235                 240
Asp Glu Phe Gln Cys Ser Asp Gly Thr Cys Ile His Gly Ser Arg Gln
                245                 250                 255
Cys Asp Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Leu Ser Asp Glu Gln Gly Cys
            260                 265                 270
Val Asn Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys Gln Ser
        275                 280                 285
Gly Glu Cys Ile Ser Leu Asp Lys Val Cys Asn Ser Val Arg Asp Cys
    290                 295                 300
Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys
305                 310                 315                 320
Leu Asp Asn Lys Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Asn Asp Leu Lys Ile
                325                 330                 335
Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Asp Lys His
            340                 345                 350
Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Ala Cys Ser Gln
        355                 360                 365
Ile Cys Val Asn Leu Glu Gly Ser Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly
    370                 375                 380
Phe Gln Leu Glu Pro Leu Thr Lys Ala Cys Lys Ala Ile Gly Thr Ile
385                 390                 395                 400
Ala Tyr Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu
                405                 410                 415
Asp Arg Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Lys Asn Val Val
            420                 425                 430
Ala Leu Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu
        435                 440                 445
Ser Gln Arg Lys Ile Tyr Ser Thr Gln Ile Asn Arg Ala Pro Ser Phe
    450                 455                 460
Ser Ser Tyr Asp Thr Ile Ile Gly Glu Asp Leu Gln Ala Pro Asp Gly
465                 470                 475                 480
Leu Ala Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Ile
                485                 490                 495
Leu Gly Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr
            500                 505                 510
Leu Phe Gln Glu Lys Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro
        515                 520                 525
Val His Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile
    530                 535                 540
Lys Lys Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Val Tyr Ser Leu Val Thr Glu
545                 550                 555                 560
Asp Ile Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Ser Gly Gly Arg
                565                 570                 575
Leu Tyr Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val
            580                 585                 590
Asn Gly Gly Asn Arg Lys Thr Val Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ala
        595                 600                 605
His Pro Phe Ser Leu Ala Ile Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp
    610                 615                 620
Val Ile Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp
625                 630                 635                 640
Ile His Leu Met Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Ile Val Leu
                645                 650                 655
Phe His Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Lys Asp Gly Val Val Thr Pro
            660                 665                 670
Thr Ala Ser Ala Leu Glu Phe Ser Arg Asn Phe Leu Ile Ser Phe Leu
        675                 680                 685
Pro Cys Leu Pro Ala Phe Ser Thr Ser Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg
    690                 695                 700
Thr Ala Leu Gln Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro
705                 710                 715                 720
Gln Ile Asn Pro Arg Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly
                725                 730                 735
Met Leu Leu Ala Lys Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Thr Glu Pro
            740                 745                 750
Ala Gly Thr Thr Gln Gly Pro Ser Met Val Asn Ser Thr Ala Val Gly
        755                 760                 765
Pro Lys His Thr Ala Ser Ser Glu Leu Thr Thr Ala Glu Ser Val Thr
    770                 775                 780
Met Ser Gln His Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Val Thr Glu
785                 790                 795                 800
Lys Pro Gln Ser Val Gly Ala Leu Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ala Leu
                805                 810                 815
Leu Ile Leu Leu Phe Phe Gly Thr Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg
            820                 825                 830
Leu Lys Ser Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys
        835                 840                 845
Thr Thr Glu Asp Glu Val His Ile Cys Arg Ser Gln Asp Gly Tyr Thr
    850                 855                 860
Tyr Pro Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val
865                 870                 875
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caaggcaggt tggtcttcct a 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gggaccccac ttacaacagc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gataggggac tttagctgtg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tccaagactc aggaatgcag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ataggggact ttagctgtgg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caggaatgca gcggttgaca 20
<210> 42
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gauaggggac uuuagcugug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 43
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
uccaagacuc aggaaugcag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 44
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
auaggggacu uuagcugugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 45
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caggaaugca gcgguugaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caccgatagg ggactttagc tgtg 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aaaccacagc taaagtcccc tatc 24
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
caccgtccaa gactcaggaa tgcag 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aaacctgcat tcctgagtct tggac 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
caccgatagg ggactttagc tgtgg 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaacccacag ctaaagtccc ctatc 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
caccgcagga atgcagcggt tgaca 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aaactgtcaa ccgctgcatt cctgc 25

Claims (4)

1.一种用于猪APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包含Cas9表达载体、针对猪APOE基因的gRNA表达载体以及针对猪LDLR基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体；针对猪APOE基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.23所示的gRNA，其靶点如SEQ IDNO.19所示；针对猪LDLR基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.42所示的gRNA，其靶点如SEQID NO.38所示；所述的针对猪APOE基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪LDLR基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的载体骨架pKG-U6gRNA的全序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在构建APOE和LDLR基因突变的猪重组细胞中的应用。
3.一种猪APOE和LDLR基因敲除的猪重组细胞，其特征在于由权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
4.权利要求3所述的猪重组细胞在构建APOE和LDLR双基因敲除的克隆猪中的应用。
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A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model;Hu等;《Mol Ther Methods Clin Dev》;20180630;摘要，表1，图1，图3，第37752左栏第4段和右栏第1-2段，第37757页右栏第4段和第37758页左栏第一段 *
analysis of an aggrecan knockout cell line.《Bone》.2014,第119页左栏第2段，图1. *
CRISPR/Cas9-mediated ApoE-/- and LDLR-/- double gene knockout in pigs elevates serum LDL-C and TC levels;Lei Huang等;《Oncotarget》;20171231;第204页图1 *
Yang等.CRISPR/Cas9 mediated generation of stable chondrocyte cell lines with targeted gene knockouts *

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